资源简介 第3课时 目的基因的获取和基因表达载体的构建知识点一 目的基因的获取1.下列关于基因文库的说法中，正确的是（ ）A.cDNA文库中的基因也有启动子B.一种生物的cDNA文库只有一种C.基因组文库的基因都可以在物种间进行基因交流D.cDNA文库中只含有某种生物的部分基因2.下列叙述不正确的是（ ）A.目的基因可以从自然界中分离，也可以人工合成B.cDNA文库的构建过程需要用到逆转录酶C.基因文库就是基因组文库D.cDNA文库是包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合3.（多选）下列有关目的基因获取的叙述，错误的是（ ）A.半合成法合成目的基因时，添加的Klenow酶是一种能将双链DNA的突出3'端补平的DNA聚合酶B.欲从基因组文库中筛选目的基因，需采用该基因的已知片段作为筛选的探针C.构建基因组文库和cDNA文库均需要逆转录酶和DNA连接酶D.半合成法获取目的基因时，只需要已知目的基因的部分碱基排列顺序即可知识点二 DNA的粗提取和鉴定4.下列有关“DNA的粗提取和鉴定”实验的叙述，正确的是（ ）A.新鲜猪血、菜花等动植物材料均可用于DNA的粗提取B.选用洋葱作为实验材料时可以使用吸水涨破法破坏细胞C.DNA可溶于2 mol/L的NaCl溶液D.溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂后，颜色呈紫色5.下列有关 DNA 粗提取的实验操作中，经过离心或过滤后，取上清液或滤液的是（ ）A.在新鲜鸡血中加入适量的柠檬酸钠，混合均匀后离心B.在盛有血细胞的塑料烧杯中加蒸馏水，快速搅拌后过滤C.在含有DNA的2 mol/L的氯化钠溶液中加入蒸馏水，搅拌出现丝状物后过滤D.加入与滤液体积相等的冷却的乙醇溶液后得到的上清液知识点三 基因表达载体的构建6.如图是基因工程中基因表达载体的模式图，若结构X是表达载体所必需的，则X最可能是（ ）A.目的基因插入位点 B.启动子 C.标记基因 D.DNA聚合酶识别位点7.图中pUC18是一种常用质粒，其中ori为复制原点，Ap为青霉素抗性基因，lacZ基因能合成某种酶，该酶能将无色染料X-gal变成蓝色。已知目的基因插入的位置如图所示。为了快速筛选出获得目的基因的大肠杆菌，平板培养基内除了大肠杆菌生长所必需的营养物质和琼脂，还必须加入其他物质，下列叙述正确的是（ ）A.只需要加入青霉素B.lacZ基因是目的基因C.含有目的基因的重组质粒的大肠杆菌不能将X-gal变成蓝色D.ori可以启动目的基因的转录8.番茄作为一种常见的水果蔬菜，在日常生活中的需求量日益增大，但是在较低温度下运输或储存的过程中容易出现冻伤的现象，从而影响番茄的口感和品质。科学家利用基因工程技术培育出抗冻的转基因番茄。如图为外源DNA和质粒上标出的酶切位点及相关基因，其中AFPs基因为抗冻基因。下列相关叙述错误的是（ ）A.基因工程中常用的工具酶有限制酶和DNA连接酶B.获得的AFPs基因应插入质粒上的启动子与终止子之间C.应用BamHⅠ和HindⅢ切割目的基因和质粒以避免其自连或反接D.能在含四环素的培养基上生长的受体细胞中一定都含有AFPs基因9.（多选）第三代疫苗——DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因（如图甲）插入到适宜的质粒（如图乙）中得到的重组DNA分子，将其导入人体内，在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体免疫应答，且可持续一段时间。限制性内切核酸酶的切点分别是BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ。下列分析错误的是（ ）A.构建DNA疫苗时，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒B.图乙中只用EcoRⅠ切割后的质粒，含有1个游离的磷酸基团C.用EcoRⅠ切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，只产生1种连接产物D.抗原基因在体内表达时不需要解旋酶10.科研人员利用大肠杆菌构建了抗虫基因文库。最新研究发现漏斗蜘蛛中的AH基因控制合成的毒素肽具有显著的杀虫效果，现以p—B质粒为载体，构建AH基因的cDNA文库。图1表示p—B质粒，其中Cmlr表示氯霉素抗性基因，ccdB基因表达产物能抑制大肠杆菌DNA的复制。图中箭头表示相关限制酶的酶切位点，且不同种限制酶识别序列不同，其中AiuⅠ、XbaⅠ、SspⅠ和MfeⅠ识别的碱基序列和酶切位点分别是—AG↓CT—、—T↓CTAGA—、—AAT↓ATT—、—C↓AATTG—。请分析并回答下列问题：（1）为获得AH基因的cDNA，先要从漏斗蜘蛛毒素肽分泌细胞中提取 ，再通过 合成出AH基因的cDNA。若从漏斗蜘蛛其他组织细胞提取，则难以成功，原因是 。（2）若已知AH基因的cDNA两端部分序列为：5'—AACTATGCGC……CGTAGCCTCT—3'，请写出PCR扩增该cDNA时的两个引物对应的局部序列（前10个碱基序列），并标明5'端和3'端： 、 。一个初始双链cDNA经四轮循环后，共消耗这两种引物的数量为 个。（3）利用图中的质粒和AH基因构建重组质粒时，宜选用限制酶 双酶切割质粒，再选用限制酶 切割目的基因，将切割后获得的DNA片段混合，经 处理后，再与大肠杆菌混合培养。第3课时 目的基因的获取和基因表达载体的构建1.D cDNA文库中的基因都没有启动子，只包含基因中的外显子，A错误；由于cDNA文库中只含有某种生物的部分基因，因此该种基因文库可能有多种，而基因组文库中含有某种生物的全部基因，因此只有一种，B错误，D正确；由于生殖隔离，基因组文库的基因在不同物种之间不能进行基因交流，C错误。2.C 目的基因可以从自然界中分离，也可以通过人工合成的方法获取，A正确；cDNA文库的构建需要用到逆转录酶，以mRNA为模板，经逆转录酶催化形成cDNA，B正确；基因文库包括基因组文库和cDNA文库，C错误；cDNA文库只是包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合，D正确。3.AC Klenow酶是一种能将双链DNA的突出5'端补平的DNA聚合酶，A错误；构建cDNA文库需要逆转录酶，构建基因组文库不需要逆转录酶，C错误。4.C 猪是哺乳动物，其成熟的红细胞没有细胞核和各种细胞器，所以猪血不能用于DNA的粗提取，A错误；植物细胞含有细胞壁，不能使用吸水涨破法破坏细胞，B错误；溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，需沸水浴加热后冷却，再观察溶液颜色（呈蓝色），D错误。5.B 在新鲜鸡血中加入适量的柠檬酸钠，防止血液凝固，混合均匀后离心，取血细胞的沉淀物，A错误；在盛有血细胞的塑料烧杯中加蒸馏水，快速搅拌后过滤，取其含有DNA的滤液，B正确；在含有DNA的2 mol/L的氯化钠溶液中加入蒸馏水，搅拌出现丝状物后过滤，取其丝状物，C错误；析出DNA时应将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等的、冷却的、体积分数为95％的乙醇，静置后溶液中会析出DNA，D错误。6.B 基因表达载体由启动子、终止子、标记基因、复制原点和目的基因等组成。题图中有终止子、标记基因（抗生素抗性基因）、目的基因、复制原点等，还缺少启动子。启动子位于目的基因的上游，所以X最可能是启动子，B符合题意。7.C 图中Ap是青霉素抗性基因，lacZ基因控制合成某种酶能将无色染料X-gal变成蓝色，最终能在含无色染料X-gal的培养基上将含该基因的菌落染成蓝色，要快速筛选出获得目的基因的大肠杆菌，需要加入青霉素和无色染料X-gal，重组质粒中插入目的基因的大肠杆菌，破坏了lacZ基因，不能合成该酶，故无法将无色染料X-gal变成蓝色，没有破坏青霉素抗性基因，能在该培养基中生存，A错误；lacZ基因的作用为标记基因，B错误；重组质粒中插入目的基因的大肠杆菌，破坏了lacZ基因，不能合成该酶，故无法将无色染料X-gal变成蓝色，C正确；启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的识别、结合位点，能控制着转录的开始，只有启动子才能驱动目的基因的转录，D错误。8.D 基因工程中常用的工具酶有限制酶和DNA连接酶，A正确；为了保证目的基因正常表达，获得的目的基因应插入质粒上的启动子与终止子之间，B正确；用限制酶SmaⅠ切割会破坏目的基因，因此构建基因表达载体时不能选用该酶；为了防止目的基因和质粒的自身环化或反向连接，应该用两种限制酶切割目的基因和载体，结合图解可知，应用BamHⅠ和HindⅢ切割目的基因和质粒，C正确；能在含四环素的培养基上生长的受体细胞中不一定都含有AFPs基因，也有可能是导入普通质粒的受体细胞，D错误。9.BC 如果用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因，目的基因两端将形成不同的黏性末端，同样用BglⅡ和Sau3AⅠ切割质粒也形成这两种相同的黏性末端，因此它们可构成重组DNA，A正确；质粒为环状DNA，其上只含有一个EcoRⅠ的切点，因此用EcoRⅠ切割后，该环状DNA分子变为线性双链DNA分子，因每条链上含有一个游离的磷酸基团，因此切割后含有两个游离的磷酸基团，B错误；从图甲看出，用EcoRⅠ切割目的基因后两端各有一切口，与图乙中EcoRⅠ切口对接时，可有两种可能，即可产生两种重组DNA，C错误；基因表达包括转录和翻译，转录时不需要解旋酶，在RNA聚合酶的作用下，DNA即可解旋，D正确。10.（1）mRNA 逆转录 AH基因在其他组织细胞中不表达，提取不到AH基因的mRNA（2）5'—AACTATGCGC—3' 5'—AGAGGCTACG—3' 30 （3）AiuⅠ和MfeⅠ SspⅠ和MfeⅠ DNA连接酶解析：（1）AH基因的cDNA可以通过逆转录获得，因此需要先从漏斗蜘蛛毒素肽分泌细胞中提取mRNA，再逆转录合成出AH基因的cDNA。由于AH基因在其他组织细胞中是不表达的，因此若从漏斗蜘蛛其他组织细胞提取，则难以成功。（2）根据题意分析，已知AH基因的cDNA两端部分序列为：5'—AACTATGCGC……CGTAGCCTCT—3'，则其在利用PCR技术进行扩增时需要两种不同的引物，且引物与目的基因（双链）两侧的碱基序列是互补的，因此两个引物对应的局部序列（前10个碱基序列）为5'—AACTATGCGC—3'、5'—AGAGGCTACG—3'。PCR技术的原理是DNA的半保留复制，则一个初始双链cDNA经四轮循环后，共消耗这两种引物的数量为21＋22＋23＋24＝30（个）。（3）根据图示分析可知，若用XbaⅠ切割会破坏复制原点；由于ccdB基因表达产物能抑制大肠杆菌DNA的复制，因此构建基因表达载体时，应该破坏该基因，即需要用MfeⅠ切割；若用SphⅠ和MfeⅠ切割会导致启动子丢失，若用MfeⅠ和SacⅠ切割，则不能获取目的基因。综上，利用图中的质粒和AH基因构建重组质粒时，切割质粒的酶应该是AiuⅠ（产生平末端）和MfeⅠ，切割目的基因的酶应该是SspⅠ（产生平末端）和MfeⅠ。3 / 3第3课时 目的基因的获取和基因表达载体的构建导学 聚焦 1.简述目的基因的获取方法。 2.归纳基因表达载体构建对限制酶的选择依据。 3.尝试进行DNA的粗提取和鉴定知识点（一） 目的基因的获取1.基因工程的基本操作程序包括 、 、 ，以及目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。2.目的基因的获取（1）通过化学合成法直接人工合成（2）通过基因文库获取目的基因①基因组文库②cDNA文库（3）获得基因组DNA或mRNA的基本过程 细胞使核酸分子释放出来从释放出来的细胞成分中 核酸分子 获得核酸分子（4）质粒DNA的提取：先用 获取质粒，再提取质粒DNA。（5）纯化DNA的原理：通常利用了DNA与RNA、蛋白质等物质在 方面的差异。3.基于上述学习，判断下列相关表述的正误（1）构建基因组文库和cDNA文库时，都需要用到酶解法，但是所需酶的种类不同。（ ）（2）对于核苷酸序列已知且比较小的基因可通过化学合成法直接人工合成。（ ）（3）Klenow酶是一种能将双链DNA的突出5'端补平的DNA聚合酶。（ ）（4）一般采用核酸探针杂交的方法从基因组文库中筛选目的基因。（ ）（5）cDNA文库含有该生物的所有基因。（ ） 如图，基因在结构上分为编码区和非编码区，非编码区位于编码区的上游和下游，在对基因的表达调控中发挥重要作用（如启动子和终止子），不编码蛋白质。真核生物基因的编码区一般是不连续的，由外显子和内含子相间排列组成，整个编码区转录的产物为不成熟的mRNA，然后，不成熟的mRNA中的内含子转录的片段被剪切掉，外显子转录的片段拼接起来，形成成熟的mRNA；原核生物基因的编码区是连续的，转录的产物即为成熟的mRNA。根据以上资料和教材相关内容，分析回答下列问题：（1）cDNA文库为什么比基因组文库小，只含有某种生物的部分基因？（2）推测从cDNA文库中获取的人胰岛素基因与从基因组文库中获取的人胰岛素基因，结构上有什么不同？（3）将从基因组文库中获取的人胰岛素基因导入大肠杆菌细胞，能否实现成功表达？为什么？（4）如何构建含有人胰岛素基因的cDNA文库？ 基因组文库与cDNA文库的比较种类 基因组文库 cDNA文库含义 含有某种生物体全部基因片段的重组DNA的克隆群体 包含着细胞全部 mRNA信息的 cDNA克隆集合特点 含有某种生物的全部基因，基因结构完整 含有某种生物的部分基因，基因中不含有启动子、终止子、内含子等构建 方法 提纯的原核生物或真核生物的基因组DNA 限制酶↓ 合适长度的随机片段 体外重组↓ 重组后的载体 包装、转染↓ 宿主细胞 （基因组文库）1.甲、乙两图表示从细菌细胞中获取目的基因的两种方法，下列相关说法错误的是（ ）A.甲方法可建立该细菌的基因组文库B.乙方法可建立该细菌的cDNA文库C.甲方法中的b过程要以脱氧核苷酸为原料D.乙方法需要逆转录酶参与2.（多选）如图为某种cDNA的制作流程示意图，相关叙述错误的是（ ）A.催化①②过程的酶都能促进双链间氢键的形成B.核酸酶H能催化杂交双链中所有的磷酸二酯键的断裂C.cDNA文库的构建需要提前了解目的基因的有关信息D.该双链DNA 在PCR 仪中扩增时需要核酸酶H知识点（二） DNA的粗提取和鉴定1.DNA的粗提取（1）原理：利用DNA与RNA、蛋白质等物质在 方面的差异，提取DNA，去除其他成分。（2）步骤2.DNA的鉴定3.基于上述学习，判断下列相关表述的正误（1）DNA与蛋白质都溶于酒精（ ）（2）用玻璃棒搅拌时，动作要缓慢且沿同一方向进行，目的是防止DNA被破坏，但细胞破裂时应快速搅拌。（ ）（3）在DNA提取液中加入适量冷却的、体积分数为95％的乙醇溶液，可以使DNA析出。（ ）（4）DNA溶液中加入二苯胺试剂就会变蓝色。（ ）1.鸟类和哺乳动物的红细胞都适合用来提取DNA吗？请说明理由。2.如图表示DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度曲线。在DNA的粗提取中，两次加入蒸馏水的作用分别是什么？3.DNA与蛋白质等物质的物理和化学性质有差异，如DNA不溶于乙醇，但某些蛋白质溶于乙醇。分析如何将DNA和蛋白质进一步分离？1.DNA的粗提取与鉴定实验的注意事项（1）本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核（无DNA），可选用鸡血细胞作材料。（2）二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。（3）提取植物细胞的DNA，在研磨时加入NaCl的目的是溶解DNA。（4）在DNA进一步提纯时，选用冷却的、体积分数为95％的酒精的作用是溶解杂质和析出DNA。2.DNA与蛋白质在不同浓度NaCl溶液中的溶解度不同项目 溶解规律 物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液 物质的量浓度为0.14 mol/L 的NaCl溶液DNA 溶解 析出蛋白质 部分发生盐析沉淀 溶解总结 ①DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。当NaCl溶液的物质的量浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液物质的量浓度的增加而逐渐降低；当NaCl溶液的物质的量浓度为0.14 mol/L时，DNA的溶解度最小；当NaCl溶液的物质的量浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大； ②选择适当的盐溶液能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的1.下列与DNA粗提取和鉴定过程有关的叙述，正确的是（ ）A.将猪的成熟红细胞置于清水中，红细胞涨破后将DNA释放出来B.用2 mol/L的NaCl溶液溶解提取物并离心后，须保留上清液C.在提取液中加入冷却的、体积分数为75％的酒精后DNA会与蛋白质分离并析出D.将提取到的丝状物与二苯胺试剂充分混匀后溶液迅速变为蓝色2.图1、2分别为“DNA的粗提取和鉴定”实验中部分操作示意图，下列叙述错误的是（ ）A.图1中完成过滤后应向滤液中加入一定量的柠檬酸钠溶液B.图2完成后要将玻璃棒上丝状物重新溶解到2 mol·L－1的NaCl溶液中进行后续鉴定C.图1、2中加入蒸馏水的目的不同D.图1、2中搅拌的目的不同知识点（三） 基因表达载体的构建1.目的（1）使目的基因进入 并有效表达；（2）使目的基因稳定存在且 。2.基因表达载体的组成3.基于上述学习，判断下列相关表述的正误（1）构建基因表达载体需用到限制酶和DNA连接酶。（ ）（2）抗生素抗性基因或某些生化标记基因是基因表达载体上的标记基因。（ ）（3）基因表达载体中有的含有启动子和终止密码子。（ ）（4）标记基因不一定是抗生素抗性基因。（ ） 构建基因表达载体时，可以选择用同一种限制酶或两种能产生相同末端的限制酶分别切割载体和目的基因所在的DNA分子，这两种方法分别简称为“单酶切法”和“双酶分别切割法”。此外，还可以选择用两种能产生不同黏性末端的限制酶分别同时切割载体和含有目的基因的DNA分子，这种新的方法被称为“双酶同时切割法”。注：AmpR表示氨苄青霉素抗性基因。由图示可知，质粒经BamHⅠ和EcoRⅠ切割后，分别形成黏性末端1与2，目的基因所在的DNA分子经BamHⅠ和EcoRⅠ切割后，分别形成黏性末端3与4。请结合上述内容回答下列问题：（1）已知限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ识别的核苷酸序列和切割位点分别为：则DNA分子经BamHⅠ和EcoRⅠ切割后所形成的末端是否互补（相同）？（2）黏性末端1与2能否经DNA连接酶连接？3与4呢？为什么？这说明“双酶同时切割法”具有什么优点？（3）黏性末端1与4、2与3能否经DNA连接酶连接？这说明“双酶同时切割法”具有什么优点？1.启动子与起始密码子和终止子与终止密码子的区别位置 作用启动子 位于DNA分子上 RNA聚合酶识别结合位点，启动转录过程起始 密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的开始终止子 位于DNA分子上 决定转录的结束终止 密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的结束2.构建基因表达载体中限制酶的选择技巧（1）根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点，如图乙）。（2）根据质粒的特点确定限制酶的种类1.下列关于基因表达载体的说法，错误的是（ ）A.基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤B.基因表达载体包含启动子、目的基因、终止子、标记基因等C.启动子位于目的基因的上游，能够启动翻译D.不同的目的基因所需的启动子不一定相同2.限制酶的发现为DNA的切割和功能基因的获得创造了条件。限制酶Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ的识别序列及切割位点分别为、、。含某目的基因的DNA片段如图所示，若利用质粒A（含限制酶Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切割位点各1个）构建基因表达载体，为克服目的基因和质粒A的自身环化以及目的基因与质粒的任意连接等，应该如何选择限制酶（ ）A.用限制酶EcoRⅠ或BamHⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒AB.用限制酶Sau3AⅠ和BamHⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒AC.用限制酶Sau3AⅠ和EcoRⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒AD.用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒A3.如图是利用基因工程技术构建重组表达载体的过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制酶。下列相关叙述错误的是（ ）A.需要用限制酶PstⅠ和EcoRⅠ来切割质粒B.表达载体中的抗青霉素基因在受体细胞中能复制C.表达载体中抗原基因的终止子位于抗青霉素基因的下游D.表达载体中目的基因的上游有启动子 （1）基因工程的基本操作程序是 。（2）cDNA文库仅含有某生物的部分基因的原因是什么？（3）不用猪血作为实验材料提取DNA的理由是什么？（4）一个基因表达载体含有 和复制原点。1.在目的基因比较小、核苷酸序列又已知的情况下，获取目的基因最方便的方法是（ ）A.化学合成法 B.基因组文库法C.cDNA文库法 D.多聚酶链式反应法2.为了在大肠杆菌细胞中成功表达人胰岛素基因，首先需要提取细胞的mRNA，经逆转录等过程来获取目的基因。下列相关叙述错误的是（ ）A.用于逆转录的mRNA只能从胰岛B细胞中获取B.逆转录过程需要四种游离的核糖核苷酸作为原料C.经逆转录得到的目的基因不含启动子和内含子D.逆转录获取目的基因时遵循碱基互补配对原则3.下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是（ ）A.预冷的乙醇可使溶解于研磨液中的DNA沉淀析出B.用相同方法从等体积猪血和鸡血中提取的DNA量相近C.DNA析出后，可将溶液倒入离心管中进行离心，弃上清液，将管底的沉淀晾干D.用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行沸水浴加热4.下列有关基因表达载体的叙述，不正确的是（ ）A.具有复制原点，使目的基因能在受体细胞内扩增B.具有启动子，作为核糖体识别、结合的部位C.具有标记基因，有利于重组DNA的鉴定和选择D.具有目的基因，以获得特定的基因表达产物5.（多选）图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述正确的是（ ）A.在构建重组质粒时，可用PstⅠ和HindⅢ切割质粒和外源DNAB.在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因C.若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接D.导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长第3课时 目的基因的获取和基因表达载体的构建【核心要点·巧突破】知识点（一）自主学习1.目的基因的获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞2.（1）脱氧核苷酸序列 3'末端具有10～14个互补碱基 模板—引物 Klenow酶 DNA连接酶 （2）① 全部 限制酶 DNA连接酶 转染 核酸探针杂交 某基因的已知片段 ② 全部mRNA信息 逆转录酶 DNA连接酶 转染 （3）裂解 分离 纯化 （4）碱裂解法 （5）理化性质3.（1）√（2）√（3）√（4）√（5）× 提示：cDNA文库含有该生物的部分基因。互动探究 （1）提示：cDNA是以某种生物发育的某个时期的mRNA为模板逆转录产生的，而生物体内的基因是选择性表达的，故cDNA文库中只含有该生物在该时期发生特异性表达的那些基因。而基因组文库含有该生物的全部基因。（2）提示：从cDNA文库中获取的人胰岛素基因不含有启动子、终止子、内含子等结构。从基因组文库中获取的人胰岛素基因结构完整。（3）提示：不能。从基因组文库中获取的人胰岛素基因含有内含子，而大肠杆菌是原核生物，细胞内缺乏剪切内含子转录片段的系统，不能形成成熟的mRNA。（4）提示：从人的胰岛B细胞中提取mRNA，逆转录成cDNA，与适当载体连接后转化宿主细菌。宿主细胞群则是含有人胰岛素基因的cDNA文库。学以致用1.C 甲方法获取的是该细菌的全部DNA分子，因此用限制酶切割后可用于构建基因组文库，A正确；乙方法表示用逆转录法获得DNA分子，只包含该生物的部分基因，因此可建立该细菌的cDNA文库，B正确；甲方法中的b过程，只需要利用限制酶将其原有的DNA切断即可，不需要以脱氧核苷酸为原料，C错误；乙方法中d为逆转录过程，需要逆转录酶参与，D正确。2.ABD 催化①②过程的酶都能促进单链上磷酸二酯键的形成，但不能促进氢键的形成，A错误；核酸酶H只能催化杂交双链中RNA上的磷酸二酯键的断裂，B错误；cDNA文库的构建需要首先获得相应的mRNA，需要提前了解目的基因的有关信息，C正确；该双链DNA在PCR仪中扩增时不需要核酸酶H，D错误。知识点（二）自主学习1.（1）理化性质 （2）①柠檬酸钠溶液 4 ℃冰箱 沉淀 ②蒸馏水 搅拌 纱布 滤液 ③2 mol·L－1 NaCl 玻璃棒④蒸馏水 沿同一方向轻轻 丝状物 ⑤玻璃棒 DNA2. 酸性 二苯胺 蓝色 2 mol·L－1 二苯胺试剂 沸水浴 蓝色3.（1）× 提示：DNA不溶于酒精。（2）√（3）√（4）× 提示：DNA溶液中加入二苯胺试剂后需沸水浴加热数分钟后出现蓝色。互动探究1.提示：鸟类的红细胞适合用来提取DNA；哺乳动物的红细胞没有细胞核，不适合用来提取DNA。2.提示：第一次加入的目的是使鸡血细胞吸水涨破，释放出核物质，第二次加入的目的是稀释NaCl溶液，从而析出DNA。3.提示：向溶解有DNA和蛋白质的溶液中加入适量冷却的、体积分数为95％的乙醇溶液，溶液中会出现白色丝状物即DNA，而部分蛋白质会溶解在乙醇溶液中，这样可以对DNA起到进一步的纯化作用。学以致用1.B 猪属于哺乳动物，哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核，不能用于DNA的粗提取，A错误；DNA在2 mol/L的NaCl溶液中溶解度较大，故用2 mol/L的NaCl溶液溶解提取物并离心后，须保留上清液，B正确；在提取液中加入冷却的、体积分数为95％的酒精后DNA会与蛋白质分离并析出，C错误；将提取到的丝状物先溶解到2 mol/L的NaCl溶液中，再加入二苯胺试剂，沸水浴加热后溶液变为蓝色，D错误。2.A 在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液，A错误；图2完成后另取烧杯加2 mol·L－1NaCl溶液使丝状物重新溶解，进行后续鉴定，B正确；图1加入蒸馏水是使细胞吸水破裂，图2加入蒸馏水是析出DNA，C正确；图1搅拌是为了破碎鸡血细胞，图2用玻璃棒沿一个方向轻轻搅拌，卷起丝状物，获得含有一定杂质的DNA，图1、2中搅拌的目的不同，D正确。知识点（三）自主学习1.（1）受体细胞 （2）遗传给后代2.启动子 上游 RNA聚合酶 终止子 下游 转录 标记筛选 受体细胞 复制并遗传3.（1）√（2）√（3）× 提示：终止密码子位于mRNA上。（4）√互动探究 （1）提示：不互补（不相同）。（2）提示：均不能，因为这两种限制酶切割后形成的黏性末端不互补（不相同）。这说明“双酶同时切割法”能够避免载体和目的基因的自身环化。（3）提示：均不能，这说明“双酶同时切割法”能够避免载体与目的基因的反向连接。学以致用1.C 基因表达载体使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代，同时表达和发挥作用，故基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，A正确；基因表达载体包括启动子、终止子、目的基因、标记基因等，B正确；启动子位于目的基因的上游，是驱动转录的一段DNA序列，C错误；不同的目的基因具有不同的核苷酸序列，其启动子也不尽相同，D正确。2.D 限制酶Sau3AⅠ切割目的基因会破坏目的基因，质粒含有限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切割位点，获取目的基因也可以用限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ进行切割，但为了防止目的基因或质粒自身环化，需要使用不同种限制酶进行切割，则可以使用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ去切割质粒，也用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ去切割目的基因，则获得重组质粒会进行正常连接。3.C 限制酶SmaⅠ的识别序列位于目的基因中，因此表达载体构建时不能用限制酶SmaⅠ，应用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ，A正确；表达载体中的抗青霉素基因在受体细胞中能稳定存在且遗传给下一代，B正确；表达载体中抗原基因的终止子位于抗青霉素基因的上游，C错误；表达载体中目的基因的上游有启动子，是RNA聚合酶识别和结合的部位，D正确。【过程评价·勤检测】网络构建 （1）目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、以及目的基因及其表达产物的检测鉴定（2）提示：由于基因的选择性表达，某种生物的某一细胞中仅有部分基因转录出mRNA，所以由该细胞中的mRNA逆转录得到的基因文库仅（cDNA文库）含该生物的部分基因。（3）提示：猪属于哺乳动物，哺乳动物成熟的红细胞中不含有细胞核和各种细胞器，不含有DNA。（4）目的基因、标记基因、启动子、终止子课堂演练1.A 在目的基因比较小、核苷酸序列又已知的情况下常采用化学合成法人工合成目的基因。2.B 胰岛素基因只在胰岛B细胞中表达，因此只能从胰岛B细胞中获取，A正确；逆转录过程是以mRNA为模板合成DNA的过程，以四种游离的脱氧核糖核苷酸为原料，B错误；真核细胞的mRNA转录后通过加工剪切了内含子和启动子，因此逆转录得到的基因不含启动子和内含子，C正确；逆转录获取目的基因是利用碱基互补配对原则获得DNA链，D正确。3.B 在预冷的、体积分数为95％的乙醇溶液中DNA的溶解度最低，DNA的沉淀量最大，故预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提的DNA，A正确；猪是哺乳动物，哺乳动物的成熟红细胞中没有细胞核，不含DNA，而鸡的成熟红细胞中有细胞核，含DNA，因此用同样方法从等体积猪血和鸡血中提取的DNA量不是相近的，B错误；DNA析出后，由于DNA是大分子物质，可将溶液倒入离心管中进行离心，弃上清液，将管底的沉淀晾干，C正确；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂，D正确。4.B 基因表达载体具有启动子，启动子是RNA聚合酶识别、结合的部位，B错误。5.ABC 切割目的基因时，用BamHⅠ切割会破坏目的基因，只用PstⅠ切割目的基因和质粒载体，会出现目的基因和质粒的自身环化，或目的基因和质粒的反向连接，而用PstⅠ和HindⅢ进行酶切，能确保目的基因和质粒的正向连接，并且质粒上保留新霉素抗性基因作为标记基因，A、C正确；在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因，至少需保留其中的一个，B正确；用PstⅠ切割后，质粒上氨苄青霉素抗性基因被破坏了，导入重组质粒的大肠杆菌不能在含氨苄青霉素的培养基中生长，D错误。9 / 9(共92张PPT)第3课时 目的基因的获取和基因表达载体的构建导学 聚焦 1.简述目的基因的获取方法。2.归纳基因表达载体构建对限制酶的选择依据。3.尝试进行DNA的粗提取和鉴定核心要点·巧突破01过程评价·勤检测02课时训练·提素能03目录CONTENTS核心要点·巧突破01精准出击 高效学习知识点（一） 目的基因的获取1. 基因工程的基本操作程序包括 、 、 ，以及目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。目的基因的获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 2. 目的基因的获取（1）通过化学合成法直接人工合成cccccc（2）通过基因文库获取目的基因①基因组文库ccccccccc②cDNA文库ccccccc（3）获得基因组DNA或mRNA的基本过程 细胞使核酸分子释放出来从释放出来的细胞成分中 核酸分子 获得核酸分子（4）质粒DNA的提取：先用 获取质粒，再提取质粒DNA。（5）纯化DNA的原理：通常利用了DNA与RNA、蛋白质等物质在 方面的差异。裂解 分离 纯化 碱裂解法 理化性质 3. 基于上述学习，判断下列相关表述的正误（1）构建基因组文库和cDNA文库时，都需要用到酶解法，但是所需酶的种类不同。 （ √ ）（2）对于核苷酸序列已知且比较小的基因可通过化学合成法直接人工合成。 （ √ ）（3）Klenow酶是一种能将双链DNA的突出5'端补平的DNA聚合酶。 （ √ ）（4）一般采用核酸探针杂交的方法从基因组文库中筛选目的基因。 （ √ ）（5）cDNA文库含有该生物的所有基因。 （ × ）提示：cDNA文库含有该生物的部分基因。√√√√× 如图，基因在结构上分为编码区和非编码区，非编码区位于编码区的上游和下游，在对基因的表达调控中发挥重要作用（如启动子和终止子），不编码蛋白质。真核生物基因的编码区一般是不连续的，由外显子和内含子相间排列组成，整个编码区转录的产物为不成熟的mRNA，然后，不成熟的mRNA中的内含子转录的片段被剪切掉，外显子转录的片段拼接起来，形成成熟的mRNA；原核生物基因的编码区是连续的，转录的产物即为成熟的mRNA。根据以上资料和教材相关内容，分析回答下列问题：（1）cDNA文库为什么比基因组文库小，只含有某种生物的部分基因？提示：cDNA是以某种生物发育的某个时期的mRNA为模板逆转录产生的，而生物体内的基因是选择性表达的，故cDNA文库中只含有该生物在该时期发生特异性表达的那些基因。而基因组文库含有该生物的全部基因。（2）推测从cDNA文库中获取的人胰岛素基因与从基因组文库中获取的人胰岛素基因，结构上有什么不同？提示：从cDNA文库中获取的人胰岛素基因不含有启动子、终止子、内含子等结构。从基因组文库中获取的人胰岛素基因结构完整。（3）将从基因组文库中获取的人胰岛素基因导入大肠杆菌细胞，能否实现成功表达？为什么？提示：不能。从基因组文库中获取的人胰岛素基因含有内含子，而大肠杆菌是原核生物，细胞内缺乏剪切内含子转录片段的系统，不能形成成熟的mRNA。（4）如何构建含有人胰岛素基因的cDNA文库？提示：从人的胰岛B细胞中提取mRNA，逆转录成cDNA，与适当载体连接后转化宿主细菌。宿主细胞群则是含有人胰岛素基因的cDNA文库。 基因组文库与cDNA文库的比较种类 基因组文库 cDNA文库含义 含有某种生物体全部基因片段的重组DNA的克隆群体 包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合特点 含有某种生物的全部基因，基因结构完整 含有某种生物的部分基因，基因中不含有启动子、终止子、内含子等种类 基因组文库 cDNA文库构建 方法 提纯的原核生物或真核生物的基因组DNA 限制酶↓ 合适长度的随机片段 体外重组↓ 重组后的载体 包装、转染↓ 宿主细胞（基因组文库）1. 甲、乙两图表示从细菌细胞中获取目的基因的两种方法，下列相关说法错误的是（ ）A. 甲方法可建立该细菌的基因组文库B. 乙方法可建立该细菌的cDNA文库C. 甲方法中的b过程要以脱氧核苷酸为原料D. 乙方法需要逆转录酶参与解析： 甲方法获取的是该细菌的全部DNA分子，因此用限制酶切割后可用于构建基因组文库，A正确；乙方法表示用逆转录法获得DNA分子，只包含该生物的部分基因，因此可建立该细菌的cDNA文库，B正确；甲方法中的b过程，只需要利用限制酶将其原有的DNA切断即可，不需要以脱氧核苷酸为原料，C错误；乙方法中d为逆转录过程，需要逆转录酶参与，D正确。2. （多选）如图为某种cDNA的制作流程示意图，相关叙述错误的是（ ）A. 催化①②过程的酶都能促进双链间氢键的形成B. 核酸酶H能催化杂交双链中所有的磷酸二酯键的断裂C. cDNA文库的构建需要提前了解目的基因的有关信息D. 该双链DNA 在PCR 仪中扩增时需要核酸酶H解析： 催化①②过程的酶都能促进单链上磷酸二酯键的形成，但不能促进氢键的形成，A错误；核酸酶H只能催化杂交双链中RNA上的磷酸二酯键的断裂，B错误；cDNA文库的构建需要首先获得相应的mRNA，需要提前了解目的基因的有关信息，C正确；该双链DNA在PCR仪中扩增时不需要核酸酶H，D错误。知识点（二） DNA的粗提取和鉴定1. DNA的粗提取（1）原理：利用DNA与RNA、蛋白质等物质在 方面的差异，提取DNA，去除其他成分。理化性质 （2）步骤ccccccccccccccc2. DNA的鉴定ccccccc3. 基于上述学习，判断下列相关表述的正误（1）DNA与蛋白质都溶于酒精 （ × ）提示：DNA不溶于酒精。（2）用玻璃棒搅拌时，动作要缓慢且沿同一方向进行，目的是防止DNA被破坏，但细胞破裂时应快速搅拌。 （ √ ）（3）在DNA提取液中加入适量冷却的、体积分数为95％的乙醇溶液，可以使DNA析出。 （ √ ）（4）DNA溶液中加入二苯胺试剂就会变蓝色。 （ × ）提示：DNA溶液中加入二苯胺试剂后需沸水浴加热数分钟后出现蓝色。×√√×1. 鸟类和哺乳动物的红细胞都适合用来提取DNA吗？请说明理由。提示：鸟类的红细胞适合用来提取DNA；哺乳动物的红细胞没有细胞核，不适合用来提取DNA。2. 如图表示DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度曲线。在DNA的粗提取中，两次加入蒸馏水的作用分别是什么？提示：第一次加入的目的是使鸡血细胞吸水涨破，释放出核物质，第二次加入的目的是稀释NaCl溶液，从而析出DNA。3. DNA与蛋白质等物质的物理和化学性质有差异，如DNA不溶于乙醇，但某些蛋白质溶于乙醇。分析如何将DNA和蛋白质进一步分离？提示：向溶解有DNA和蛋白质的溶液中加入适量冷却的、体积分数为95％的乙醇溶液，溶液中会出现白色丝状物即DNA，而部分蛋白质会溶解在乙醇溶液中，这样可以对DNA起到进一步的纯化作用。1. DNA的粗提取与鉴定实验的注意事项（1）本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核（无DNA），可选用鸡血细胞作材料。（2）二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。（3）提取植物细胞的DNA，在研磨时加入NaCl的目的是溶解DNA。（4）在DNA进一步提纯时，选用冷却的、体积分数为95％的酒精的作用是溶解杂质和析出DNA。2. DNA与蛋白质在不同浓度NaCl溶液中的溶解度不同项目 溶解规律 物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液 物质的量浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液DNA 溶解 析出蛋白质 部分发生盐析沉淀 溶解2. DNA与蛋白质在不同浓度NaCl溶液中的溶解度不同项目 溶解规律 物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液 物质的量浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液总结 ①DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。当NaCl溶液的物质的量浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液物质的量浓度的增加而逐渐降低；当NaCl溶液的物质的量浓度为0.14 mol/L时，DNA的溶解度最小；当NaCl溶液的物质的量浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大； ②选择适当的盐溶液能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的1. 下列与DNA粗提取和鉴定过程有关的叙述，正确的是（ ）A. 将猪的成熟红细胞置于清水中，红细胞涨破后将DNA释放出来B. 用2 mol/L的NaCl溶液溶解提取物并离心后，须保留上清液C. 在提取液中加入冷却的、体积分数为75％的酒精后DNA会与蛋白质分离并析出D. 将提取到的丝状物与二苯胺试剂充分混匀后溶液迅速变为蓝色解析： 猪属于哺乳动物，哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核，不能用于DNA的粗提取，A错误；DNA在2 mol/L的NaCl溶液中溶解度较大，故用2 mol/L的NaCl溶液溶解提取物并离心后，须保留上清液，B正确；在提取液中加入冷却的、体积分数为95％的酒精后DNA会与蛋白质分离并析出，C错误；将提取到的丝状物先溶解到2 mol/L的NaCl溶液中，再加入二苯胺试剂，沸水浴加热后溶液变为蓝色，D错误。2. 图1、2分别为“DNA的粗提取和鉴定”实验中部分操作示意图，下列叙述错误的是（ ）A. 图1中完成过滤后应向滤液中加入一定量的柠檬酸钠溶液B. 图2完成后要将玻璃棒上丝状物重新溶解到2 mol·L－1的NaCl溶液中进行后续鉴定C. 图1、2中加入蒸馏水的目的不同D. 图1、2中搅拌的目的不同解析： 在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液，A错误；图2完成后另取烧杯加2 mol·L－1NaCl溶液使丝状物重新溶解，进行后续鉴定，B正确；图1加入蒸馏水是使细胞吸水破裂，图2加入蒸馏水是析出DNA，C正确；图1搅拌是为了破碎鸡血细胞，图2用玻璃棒沿一个方向轻轻搅拌，卷起丝状物，获得含有一定杂质的DNA，图1、2中搅拌的目的不同，D正确。知识点（三） 基因表达载体的构建1. 目的（1）使目的基因进入 并有效表达；（2）使目的基因稳定存在且 。受体细胞 遗传给后代 2. 基因表达载体的组成cccccccccc3. 基于上述学习，判断下列相关表述的正误（1）构建基因表达载体需用到限制酶和DNA连接酶。（ √ ）（2）抗生素抗性基因或某些生化标记基因是基因表达载体上的标记基因。 （ √ ）（3）基因表达载体中有的含有启动子和终止密码子。 （ × ）提示：终止密码子位于mRNA上。（4）标记基因不一定是抗生素抗性基因。 （ √ ）√√×√ 构建基因表达载体时，可以选择用同一种限制酶或两种能产生相同末端的限制酶分别切割载体和目的基因所在的DNA分子，这两种方法分别简称为“单酶切法”和“双酶分别切割法”。此外，还可以选择用两种能产生不同黏性末端的限制酶分别同时切割载体和含有目的基因的DNA分子，这种新的方法被称为“双酶同时切割法”。注：AmpR表示氨苄青霉素抗性基因。由图示可知，质粒经BamHⅠ和EcoRⅠ切割后，分别形成黏性末端1与2，目的基因所在的DNA分子经BamHⅠ和EcoRⅠ切割后，分别形成黏性末端3与4。请结合上述内容回答下列问题：（1）已知限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ识别的核苷酸序列和切割位点分别为：则DNA分子经BamHⅠ和EcoRⅠ切割后所形成的末端是否互补（相同）？提示：不互补（不相同）。（2）黏性末端1与2能否经DNA连接酶连接？3与4呢？为什么？这说明“双酶同时切割法”具有什么优点？提示：均不能，因为这两种限制酶切割后形成的黏性末端不互补（不相同）。这说明“双酶同时切割法”能够避免载体和目的基因的自身环化。（3）黏性末端1与4、2与3能否经DNA连接酶连接？这说明“双酶同时切割法”具有什么优点？提示：均不能，这说明“双酶同时切割法”能够避免载体与目的基因的反向连接。1. 启动子与起始密码子和终止子与终止密码子的区别位置 作用启动子 位于DNA分子上 RNA聚合酶识别结合位点，启动转录过程起始密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的开始终止子 位于DNA分子上 决定转录的结束终止密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的结束2. 构建基因表达载体中限制酶的选择技巧（1）根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点，如图乙）。（2）根据质粒的特点确定限制酶的种类1. 下列关于基因表达载体的说法，错误的是（ ）A. 基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤B. 基因表达载体包含启动子、目的基因、终止子、标记基因等C. 启动子位于目的基因的上游，能够启动翻译D. 不同的目的基因所需的启动子不一定相同解析： 基因表达载体使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代，同时表达和发挥作用，故基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，A正确；基因表达载体包括启动子、终止子、目的基因、标记基因等，B正确；启动子位于目的基因的上游，是驱动转录的一段DNA序列，C错误；不同的目的基因具有不同的核苷酸序列，其启动子也不尽相同，D正确。2. 限制酶的发现为DNA的切割和功能基因的获得创造了条件。限制酶Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ的识别序列及切割位点分别为 、 、 。含某目的基因的DNA片段如图所示，若利用质粒A（含限制酶Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切割位点各1个）构建基因表达载体，为克服目的基因和质粒A的自身环化以及目的基因与质粒的任意连接等，应该如何选择限制酶（ ）A. 用限制酶EcoRⅠ或BamHⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒AB. 用限制酶Sau3AⅠ和BamHⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒AC. 用限制酶Sau3AⅠ和EcoRⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒AD. 用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒A解析： 限制酶Sau3AⅠ切割目的基因会破坏目的基因，质粒含有限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切割位点，获取目的基因也可以用限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ进行切割，但为了防止目的基因或质粒自身环化，需要使用不同种限制酶进行切割，则可以使用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ去切割质粒，也用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ去切割目的基因，则获得重组质粒会进行正常连接。3. 如图是利用基因工程技术构建重组表达载体的过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制酶。下列相关叙述错误的是（ ）A. 需要用限制酶PstⅠ和EcoRⅠ来切割质粒B. 表达载体中的抗青霉素基因在受体细胞中能复制C. 表达载体中抗原基因的终止子位于抗青霉素基因的下游D. 表达载体中目的基因的上游有启动子解析： 限制酶SmaⅠ的识别序列位于目的基因中，因此表达载体构建时不能用限制酶SmaⅠ，应用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ，A正确；表达载体中的抗青霉素基因在受体细胞中能稳定存在且遗传给下一代，B正确；表达载体中抗原基因的终止子位于抗青霉素基因的上游，C错误；表达载体中目的基因的上游有启动子，是RNA聚合酶识别和结合的部位，D正确。过程评价·勤检测02反馈效果 筑牢基础 （1）基因工程的基本操作程序是 。目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、以及目的基因及其表达产物的检测鉴定 （2）cDNA文库仅含有某生物的部分基因的原因是什么？提示：由于基因的选择性表达，某种生物的某一细胞中仅有部分基因转录出mRNA，所以由该细胞中的mRNA逆转录得到的基因文库仅（cDNA文库）含该生物的部分基因。（3）不用猪血作为实验材料提取DNA的理由是什么？提示：猪属于哺乳动物，哺乳动物成熟的红细胞中不含有细胞核和各种细胞器，不含有DNA。（4）一个基因表达载体含有 和复制原点。目的基因、标记基因、启动子、终止子 1. 在目的基因比较小、核苷酸序列又已知的情况下，获取目的基因最方便的方法是（ ）A. 化学合成法 B. 基因组文库法C. cDNA文库法 D. 多聚酶链式反应法解析： 在目的基因比较小、核苷酸序列又已知的情况下常采用化学合成法人工合成目的基因。2. 为了在大肠杆菌细胞中成功表达人胰岛素基因，首先需要提取细胞的mRNA，经逆转录等过程来获取目的基因。下列相关叙述错误的是（ ）A. 用于逆转录的mRNA只能从胰岛B细胞中获取B. 逆转录过程需要四种游离的核糖核苷酸作为原料C. 经逆转录得到的目的基因不含启动子和内含子D. 逆转录获取目的基因时遵循碱基互补配对原则解析： 胰岛素基因只在胰岛B细胞中表达，因此只能从胰岛B细胞中获取，A正确；逆转录过程是以mRNA为模板合成DNA的过程，以四种游离的脱氧核糖核苷酸为原料，B错误；真核细胞的mRNA转录后通过加工剪切了内含子和启动子，因此逆转录得到的基因不含启动子和内含子，C正确；逆转录获取目的基因是利用碱基互补配对原则获得DNA链，D正确。3. 下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是（ ）A. 预冷的乙醇可使溶解于研磨液中的DNA沉淀析出B. 用相同方法从等体积猪血和鸡血中提取的DNA量相近C. DNA析出后，可将溶液倒入离心管中进行离心，弃上清液，将管底的沉淀晾干D. 用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行沸水浴加热解析： 在预冷的、体积分数为95％的乙醇溶液中DNA的溶解度最低，DNA的沉淀量最大，故预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提的DNA，A正确；猪是哺乳动物，哺乳动物的成熟红细胞中没有细胞核，不含DNA，而鸡的成熟红细胞中有细胞核，含DNA，因此用同样方法从等体积猪血和鸡血中提取的DNA量不是相近的，B错误；DNA析出后，由于DNA是大分子物质，可将溶液倒入离心管中进行离心，弃上清液，将管底的沉淀晾干，C正确；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂，D正确。4. 下列有关基因表达载体的叙述，不正确的是（ ）A. 具有复制原点，使目的基因能在受体细胞内扩增B. 具有启动子，作为核糖体识别、结合的部位C. 具有标记基因，有利于重组DNA的鉴定和选择D. 具有目的基因，以获得特定的基因表达产物解析： 基因表达载体具有启动子，启动子是RNA聚合酶识别、结合的部位，B错误。5. （多选）图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述正确的是（ ）A. 在构建重组质粒时，可用PstⅠ和HindⅢ切割质粒和外源DNAB. 在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因C. 若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接D. 导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长解析： 切割目的基因时，用BamHⅠ切割会破坏目的基因，只用PstⅠ切割目的基因和质粒载体，会出现目的基因和质粒的自身环化，或目的基因和质粒的反向连接，而用PstⅠ和HindⅢ进行酶切，能确保目的基因和质粒的正向连接，并且质粒上保留新霉素抗性基因作为标记基因，A、C正确；在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因，至少需保留其中的一个，B正确；用PstⅠ切割后，质粒上氨苄青霉素抗性基因被破坏了，导入重组质粒的大肠杆菌不能在含氨苄青霉素的培养基中生长，D错误。课时训练·提素能03分级练习 巩固提升知识点一 目的基因的获取1. 下列关于基因文库的说法中，正确的是（ ）A. cDNA文库中的基因也有启动子B. 一种生物的cDNA文库只有一种C. 基因组文库的基因都可以在物种间进行基因交流D. cDNA文库中只含有某种生物的部分基因12345678910解析： cDNA文库中的基因都没有启动子，只包含基因中的外显子，A错误；由于cDNA文库中只含有某种生物的部分基因，因此该种基因文库可能有多种，而基因组文库中含有某种生物的全部基因，因此只有一种，B错误，D正确；由于生殖隔离，基因组文库的基因在不同物种之间不能进行基因交流，C错误。123456789102. 下列叙述不正确的是（ ）A. 目的基因可以从自然界中分离，也可以人工合成B. cDNA文库的构建过程需要用到逆转录酶C. 基因文库就是基因组文库D. cDNA文库是包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合12345678910解析： 目的基因可以从自然界中分离，也可以通过人工合成的方法获取，A正确；cDNA文库的构建需要用到逆转录酶，以mRNA为模板，经逆转录酶催化形成cDNA，B正确；基因文库包括基因组文库和cDNA文库，C错误；cDNA文库只是包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合，D正确。123456789103. （多选）下列有关目的基因获取的叙述，错误的是（ ）A. 半合成法合成目的基因时，添加的Klenow酶是一种能将双链DNA的突出3'端补平的DNA聚合酶B. 欲从基因组文库中筛选目的基因，需采用该基因的已知片段作为筛选的探针C. 构建基因组文库和cDNA文库均需要逆转录酶和DNA连接酶D. 半合成法获取目的基因时，只需要已知目的基因的部分碱基排列顺序即可12345678910解析： Klenow酶是一种能将双链DNA的突出5'端补平的DNA聚合酶，A错误；构建cDNA文库需要逆转录酶，构建基因组文库不需要逆转录酶，C错误。12345678910知识点二 DNA的粗提取和鉴定4. 下列有关“DNA的粗提取和鉴定”实验的叙述，正确的是（ ）A. 新鲜猪血、菜花等动植物材料均可用于DNA的粗提取B. 选用洋葱作为实验材料时可以使用吸水涨破法破坏细胞C. DNA可溶于2 mol/L的NaCl溶液D. 溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂后，颜色呈紫色12345678910解析： 猪是哺乳动物，其成熟的红细胞没有细胞核和各种细胞器，所以猪血不能用于DNA的粗提取，A错误；植物细胞含有细胞壁，不能使用吸水涨破法破坏细胞，B错误；溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，需沸水浴加热后冷却，再观察溶液颜色（呈蓝色），D错误。123456789105. 下列有关 DNA 粗提取的实验操作中，经过离心或过滤后，取上清液或滤液的是（ ）A. 在新鲜鸡血中加入适量的柠檬酸钠，混合均匀后离心B. 在盛有血细胞的塑料烧杯中加蒸馏水，快速搅拌后过滤C. 在含有DNA的2 mol/L的氯化钠溶液中加入蒸馏水，搅拌出现丝状物后过滤D. 加入与滤液体积相等的冷却的乙醇溶液后得到的上清液12345678910解析： 在新鲜鸡血中加入适量的柠檬酸钠，防止血液凝固，混合均匀后离心，取血细胞的沉淀物，A错误；在盛有血细胞的塑料烧杯中加蒸馏水，快速搅拌后过滤，取其含有DNA的滤液，B正确；在含有DNA的2 mol/L的氯化钠溶液中加入蒸馏水，搅拌出现丝状物后过滤，取其丝状物，C错误；析出DNA时应将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等的、冷却的、体积分数为95％的乙醇，静置后溶液中会析出DNA，D错误。12345678910知识点三 基因表达载体的构建6. 如图是基因工程中基因表达载体的模式图，若结构X是表达载体所必需的，则X最可能是（ ）A. 目的基因插入位点 B. 启动子C. 标记基因 D. DNA聚合酶识别位点12345678910解析： 基因表达载体由启动子、终止子、标记基因、复制原点和目的基因等组成。题图中有终止子、标记基因（抗生素抗性基因）、目的基因、复制原点等，还缺少启动子。启动子位于目的基因的上游，所以X最可能是启动子，B符合题意。123456789107. 图中pUC18是一种常用质粒，其中ori为复制原点，Ap为青霉素抗性基因，lacZ基因能合成某种酶，该酶能将无色染料X-gal变成蓝色。已知目的基因插入的位置如图所示。为了快速筛选出获得目的基因的大肠杆菌，平板培养基内除了大肠杆菌生长所必需的营养物质和琼脂，还必须加入其他物质，下列叙述正确的是（ ）A. 只需要加入青霉素B. lacZ基因是目的基因C. 含有目的基因的重组质粒的大肠杆菌不能将X-gal变成蓝色D. ori可以启动目的基因的转录12345678910解析： 图中Ap是青霉素抗性基因，lacZ基因控制合成某种酶能将无色染料X-gal变成蓝色，最终能在含无色染料X-gal的培养基上将含该基因的菌落染成蓝色，要快速筛选出获得目的基因的大肠杆菌，需要加入青霉素和无色染料X-gal，重组质粒中插入目的基因的大肠杆菌，破坏了lacZ基因，不能合成该酶，故无法将无色染料X-gal变成蓝色，没有破坏青霉素抗性基因，能在该培养基中生存，A错误；lacZ基因的作用为标记基因，B错误；重组质粒中插入目的基因的大肠杆菌，破坏了lacZ基因，不能合成该酶，故无法将无色染料X-gal变成蓝色，C正确；启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的识别、结合位点，能控制着转录的开始，只有启动子才能驱动目的基因的转录，D错误。123456789108. 番茄作为一种常见的水果蔬菜，在日常生活中的需求量日益增大，但是在较低温度下运输或储存的过程中容易出现冻伤的现象，从而影响番茄的口感和品质。科学家利用基因工程技术培育出抗冻的转基因番茄。如图为外源DNA和质粒上标出的酶切位点及相关基因，其中AFPs基因为抗冻基因。下列相关叙述错误的是（ ）12345678910A. 基因工程中常用的工具酶有限制酶和DNA连接酶B. 获得的AFPs基因应插入质粒上的启动子与终止子之间C. 应用BamHⅠ和HindⅢ切割目的基因和质粒以避免其自连或反接D. 能在含四环素的培养基上生长的受体细胞中一定都含有AFPs基因12345678910解析： 基因工程中常用的工具酶有限制酶和DNA连接酶，A正确；为了保证目的基因正常表达，获得的目的基因应插入质粒上的启动子与终止子之间，B正确；用限制酶SmaⅠ切割会破坏目的基因，因此构建基因表达载体时不能选用该酶；为了防止目的基因和质粒的自身环化或反向连接，应该用两种限制酶切割目的基因和载体，结合图解可知，应用BamHⅠ和HindⅢ切割目的基因和质粒，C正确；能在含四环素的培养基上生长的受体细胞中不一定都含有AFPs基因，也有可能是导入普通质粒的受体细胞，D错误。123456789109. （多选）第三代疫苗——DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因（如图甲）插入到适宜的质粒（如图乙）中得到的重组DNA分子，将其导入人体内，在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体免疫应答，且可持续一段时间。限制性内切核酸酶的切点分别是BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ。下列分析错误的是（ ）12345678910A. 构建DNA疫苗时，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒B. 图乙中只用EcoRⅠ切割后的质粒，含有1个游离的磷酸基团C. 用EcoRⅠ切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，只产生1种连接产物D. 抗原基因在体内表达时不需要解旋酶12345678910解析： 如果用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因，目的基因两端将形成不同的黏性末端，同样用BglⅡ和Sau3AⅠ切割质粒也形成这两种相同的黏性末端，因此它们可构成重组DNA，A正确；质粒为环状DNA，其上只含有一个EcoRⅠ的切点，因此用EcoRⅠ切割后，该环状DNA分子变为线性双链DNA分子，因每条链上含有一个游离的磷酸基团，因此切割后含有两个游离的磷酸基团，B错误；从图甲看出，用EcoRⅠ切割目的基因后两端各有一切口，与图乙中EcoRⅠ切口对接时，可有两种可能，即可产生两种重组DNA，C错误；基因表达包括转录和翻译，转录时不需要解旋酶，在RNA聚合酶的作用下，DNA即可解旋，D正确。1234567891010. 科研人员利用大肠杆菌构建了抗虫基因文库。最新研究发现漏斗蜘蛛中的AH基因控制合成的毒素肽具有显著的杀虫效果，现以p—B质粒为载体，构建AH基因的cDNA文库。图1表示p—B质粒，其中Cmlr表示氯霉素抗性基因，ccdB基因表达产物能抑制大肠杆菌DNA的复制。图中箭头表示相关限制酶的酶切位点，且不同种限制酶识别序列不同，其中AiuⅠ、XbaⅠ、SspⅠ和MfeⅠ识别的碱基序列和酶切位点分别是—AG↓CT—、—T↓CTAGA—、—AAT↓ATT—、—C↓AATTG—。请分析并回答下列问题：12345678910（1）为获得AH基因的cDNA，先要从漏斗蜘蛛毒素肽分泌细胞中提取 ，再通过 合成出AH基因的cDNA。若从漏斗蜘蛛其他组织细胞提取，则难以成功，原因是 。mRNA逆转录AH基因在其他组织细胞中不表达，提取不到AH基因的mRNA12345678910解析： AH基因的cDNA可以通过逆转录获得，因此需要先从漏斗蜘蛛毒素肽分泌细胞中提取mRNA，再逆转录合成出AH基因的cDNA。由于AH基因在其他组织细胞中是不表达的，因此若从漏斗蜘蛛其他组织细胞提取，则难以成功。12345678910（2）若已知AH基因的cDNA两端部分序列为：5'—AACTATGCGC……CGTAGCCTCT—3'，请写出PCR扩增该cDNA时的两个引物对应的局部序列（前10个碱基序列），并标明5'端和3'端： 、 。一个初始双链cDNA经四轮循环后，共消耗这两种引物的数量为 个。5'—AACTATGCGC—3'5'—AGAGGCTACG—3'3012345678910解析： 根据题意分析，已知AH基因的cDNA两端部分序列为：5'—AACTATGCGC……CGTAGCCTCT—3'，则其在利用PCR技术进行扩增时需要两种不同的引物，且引物与目的基因（双链）两侧的碱基序列是互补的，因此两个引物对应的局部序列（前10个碱基序列）为5'—AACTATGCGC—3'、5'—AGAGGCTACG—3'。PCR技术的原理是DNA的半保留复制，则一个初始双链cDNA经四轮循环后，共消耗这两种引物的数量为21＋22＋23＋24＝30（个）。12345678910（3）利用图中的质粒和AH基因构建重组质粒时，宜选用限制酶 双酶切割质粒，再选用限制酶 切割目的基因，将切割后获得的DNA片段混合，经 处理后，再与大肠杆菌混合培养。AiuⅠ和MfeⅠSspⅠ和MfeⅠDNA连接酶12345678910解析： 根据图示分析可知，若用XbaⅠ切割会破坏复制原点；由于ccdB基因表达产物能抑制大肠杆菌DNA的复制，因此构建基因表达载体时，应该破坏该基因，即需要用MfeⅠ切割；若用SphⅠ和MfeⅠ切割会导致启动子丢失，若用MfeⅠ和SacⅠ切割，则不能获取目的基因。综上，利用图中的质粒和AH基因构建重组质粒时，切割质粒的酶应该是AiuⅠ（产生平末端）和MfeⅠ，切割目的基因的酶应该是SspⅠ（产生平末端）和MfeⅠ。12345678910感 谢 观 看! 展开更多...... 收起↑ 资源列表 第一节 第3课时 目的基因的获取和基因表达载体的构建.docx 第一节 第3课时 目的基因的获取和基因表达载体的构建.pptx 第一节 第3课时 目的基因的获取和基因表达载体的构建（练习，含解析）.docx
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