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专题11 基因工程
考点 五年考情（2021-2025） 命题趋势
考点1 基因工程的基本操作程序 （5年6考） 2021江苏卷、2022江苏卷、2023江苏卷、2024江苏卷、2025江苏卷：基因工程的综合应用 1、基因工程的基本操作程序是考察中的 重点内容，主要考察基因工程的基本操作程序包括目的基因的筛选和获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定，要对这部分内容进行分析和理解，结合情境进行分析判断，主要以非选择题形式考察。 2、基因工程的应用部分主要考察基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用、基因诊断和基因治疗、基因芯片相关内容，主要考察对基因工程的理解以及在生活中的应用。
考点2 基因工程的应用 （5年1考） 2021江苏卷：基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用
考点01 基因工程的基本操作程序
1．（2025·江苏·高考真题）（多选）图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为，下列相关叙述正确的有（ ）
A．基因A突变为a是一种碱基增添的突变
B．用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末端类型不同
C．用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小一致
D．产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定
【答案】BD
【详解】A 、对比 A 基因和 a 基因的序列，A 基因中 “AAGCTT” 变为 a 基因中 “AAGCTG” ，是碱基替换（T→G），并非碱基增添，A 错误；
B、HindⅢ 切割产生黏性末端，AluⅠ 切割后产生的是平末端，二者末端类型不相同，B正确；
C、a基因中有2个Hind Ⅲ切割位点，切割后产生3个片段，有3个Alu Ⅰ切割位点，切割后产生4个片段，用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小不一致，C 错误；
D、因为正常基因 A 和致病基因 a 的 HindⅢ 切割位点数量不同，所以产前诊断时，该致病基因可选用 HindⅢ 限制酶开展酶切鉴定，D 正确。
故选BD。
2．（2025·江苏·高考真题）川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，为了更好地保护这一物种，研究者开展了以下研究。请回答下列问题：
(1)川金丝猴警戒行为具有监测捕食者和同种个体的功能，这说明生物之间的关系有 。川金丝猴的警戒行为依赖于环境中获取的信息，信息类型有 。川金丝猴根据这些信息及时作出反应，一方面可以降低被捕食风险，另一方面为争夺 获得更多机会。
(2)川金丝猴以植食为主，消化道中部分微生物直接参与高纤维食物的消化，这些微生物与川金丝猴构成 关系。
(3)研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA提取、扩增，部分实验过程如下。请完成下表：
实验目的 简要操作步骤
释放DNA 在去杂后的样本中加入裂解液
析出DNA 离心后取① ，加入乙醇
② 在沉淀物中加入纯水
扩增DNA 将③ 、引物、样本DNA、含有Mg 缓冲 液、超纯水等加入PCR管中，进行PCR
(4)为分析川金丝猴摄食的植物种类，研究者设计一对引物F和R，能同时扩增出不同种植物叶绿体中的rbeL基因片段，是因为引物F和R的碱基能与rbcL基因的保守序列的碱基 。用引物F和R对4种植物样本甲~丁的叶绿体基因组DNA进行扩增测序，结果如图所示。若对4个样本的扩增产物进行DNA电泳条带分析，能检出的样本是 。研究者用引物F和R对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序，得到的序列有图中的3种序列，据此可确定川金丝猴摄食的植物有 。若要更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物，参照叶绿体基因库，还需选用 的保守序列设计引物，对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析。
注：“·”表示与植物甲对应位置上相同的碱基：“……”表示省略200个碱基
(5)依据上述研究，保护川金丝猴可采取的措施有 （填字母）。
a．建立川金丝猴生态廊道，促进种群间基因交流
b．保护川金丝猴栖息地的植被和它喜食的植物
c．需用标记重捕法定期重捕，以精确监测种群数量
d．主要依赖迁地保护，扩大川金丝猴种群数量
【答案】(1)捕食和种内竞争 物理信息、化学信息、行为信息 食物和空间、配偶等
(2)互利共生
(3)上清液 溶解DNA 4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶
(4)互补配对 丁 丙丁 叶绿体基因组其他DNA 片段
(5)ab
【详解】（1）捕食者与川金丝猴是捕食关系，川金丝猴和同种个体之间是种内竞争关系。生态系统中信息的种类有物理信息、化学信息和行为信息。川金丝猴根据这些信息及时作出反应，一方面可以降低被捕食风险，另一方面为争夺食物和空间等资源获得更多机会。
（2）川金丝猴以植食为主，消化道中部分微生物直接参与高纤维食物的消化，这些微生物从川金丝猴胃内获取营养物质，又能为川金丝猴分解纤维素，两者构成互利共生关系。
（3）研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA提取、扩增，部分实验过程如下：释放DNA：在去杂后的样本中加入裂解液，细胞裂解，内容物释放，→析出DNA：DNA呈溶解状态，离心后取①上清液，再加入乙醇，DNA不溶于酒精→故在沉淀物中加入纯水，②再次溶解DNA→扩增DNA：PCR扩增DNA，需要将③4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、引物、样本DNA、含有Mg 缓冲 液、超纯水等加入PCR管中，进行PCR。
（4）为分析川金丝猴摄食的植物种类，研究者设计一对引物F和R，能同时扩增出不同种植物叶绿体中的rbeL基因片段，是因为引物F和R的碱基能与rbeL基因的保守序列的碱基互补配对，从而在耐高温的DNA聚合酶的作用下延伸子链。用引物F和R对4种植物样本甲~丁的叶绿体基因组DNA进行扩增测序，结果如图所示，可知植物甲乙丙的条带一样长，植物丁的短，对4个样本的扩增产物进行DNA电泳条带分析，只能区分不同长度的DNA片段，故能检出的样本是丁。研究者用引物F和R对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序，得到的序列有图中的3种序列，说明摄食的植物有三种，甲和乙的序列相同，不能确定，故据此可确定川金丝猴摄食的植物有丙和丁。选用叶绿体的其他基因的保守序列设计引物，对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析，能更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物。
（5） a、建立川金丝猴生态廊道，促进种群间基因交流，能够保护川金丝猴遗传多样性和物种多样性，a正确；
b、保护川金丝猴栖息地的植被和它喜食的植物，能够保护川金丝猴，b正确；
c、川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，不能用标记重捕法定期重捕，c错误；
d、保护川金丝猴主要依赖就地保护，d错误。
故选ab。
3．（2024·江苏·高考真题）为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达SOD-ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列-（GTTCCTGGTGTTGGC）50-限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题：

(1)步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是 。
(2)步骤②转化时，科研人员常用 处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有 的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是 。
(3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与 结合，驱动转录，翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是 （从图2的“A~D”中选填）。

(4)步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。

（ⅰ）20℃时，加入NaCl后实验结果是 。
（ⅱ）100℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是 。
（ⅲ）据图分析，融合表达SOD-ELP50蛋白的优点有 。
【答案】(1)EcoR I、Hind Ⅲ
(2) CaCl2 卡那霉素 S-F和P-R
(3)启动子 C
(4) SOD-ELP50组纯化蛋白数量更多 高温使蛋白变性 低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持
【详解】（1）目的基因应插入启动子和终止子之间，结合题意可知，ELP50应插入pET-SOD之后，由图可知，限制酶a和限制酶b分别是EcoR I、Hind Ⅲ。
（2）将目的基因导入细菌时常用CaCl2处理细菌，使其处于容易吸收外来DNA分子的状态。由图可知，重组DNA含有标记基因卡那霉素抗性基因，所以转化后的大肠杆菌采用含有卡那霉素的培养基进行筛选。成功导入pET-SOD-ELP50同时含有pET-SOD和ELP50，结合图示可知，引物S-F和P-R对应序列包含SOD和ELP50的相应序列，可特异性对pET-SOD-ELP50进行扩增。由于ELP50中含有重复序列，使用S-F和E-R对导入普通质粒和重组质粒的大肠杆菌进行PCR扩增，得到的产物可能无法区分。
（3）RNA聚合酶与启动子结合后，启动转录。由图可知，决定SOD-ELP50融合蛋白的基因长度为462+750=1212bp，编码1212÷3=404个氨基酸，已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，融合蛋白的相对分子质量约为404×0.11kDa=44.44kDa，电泳后应该为条带C。
（4）（ⅰ）由图可知，20℃时，较不加NaCl，加入NaCl后纯化蛋白数量更多。
（ⅱ）100℃时，温度过高，导致蛋白质变性而沉淀。
（ⅲ）20℃，加入NaCl时，较SOD，SOD-ELP50组沉淀中蛋白质相对含量较高，说明低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持。
4．（2023·江苏·高考真题）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：
(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有 ，扩增程序中最主要的不同是 。
(2)有关基因序列如图2，引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用______。

A．ATGGTG------CAACCA
B．TGGTTG------CACCAT
C．GACGAG------CTGCAG
D．CTGCAG------CTCGTC
(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有 。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。
A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落
B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有 。

(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。
【答案】(1)模板（片段F1、片段F2）、引物 退火温度
(2)CD
(3)限制性内切核酸酶（限制酶）和DNA连接酶
(4)ABC
(5)P3、P4
(6)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列
【详解】（1）PCR反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时， 配制的两个反应体系中不同的有模板（片段F1、片段F2）、引物。PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。不同的PCR反应体系中，模板和引物是不同的：扩增 程序中依据不同引物设置不同的退火温度是最重要的环节，恰当地选择退火温度，尽量避免引物与 模板的非特异性结合，以保证目的产物的有效扩增。而对于延伸时间而言，以常用的Taq DNA聚 133 合酶为例，催化DNA延伸的速度为1000~2000 bp/min，通常在实验室中可根据目的片段大小在 30s~2min的时长内大致设置廷伸时间，一般不雪要精确控制。
（2）由图1可知，引物F2-F用于扩增F2片段，引物F1-R用于扩增F1片段，C选项中5'-GACGAG-3'能与AnBI中左侧部分碱基进行碱基互补配对，因此引物F2-F选用C。D选项中5'-CTGCAG-3'能与EGFP中的右侧部分序列进行碱基互补配对，因此引物F1-R选用D。
（3）传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶（限制酶）切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，由于PCR产物片段和线性质粒载体具有同源序列，可通过重组酶形成环化质粒。不需要使用限制性内切核酸酶（限制酶）和DNA连接酶。
（4）A、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，用稀释涂布平板法筛选时，菌落数可能低于30，A错误；
B、培养基冷却后才能接种，抗性平板上未长出菌落，一般不是培养基温度太高所致，B错误；
C、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误；
D、稀释涂布平板和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化，D正确。
故选ABC。
（5）EGFP为720bp，AnBI为390bp，二者的总大小为720bp+390bp=1110bp，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。
（6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。
5．（2022·江苏·高考真题）纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。
(1)纤毛结构如图1所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是 。
(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaC1至2．0mol/L的目的是 。PCR扩增时，需在 催化下，在引物 端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。
(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y-M重组质粒（在EcoRⅤ位点插入片段）。请完成下表。
分步实验目标 简易操作、结果、分析
PCR鉴定正向重组质粒Y-M（图Ⅱ中融合片段M中有白色的箭头，代表方向） ①选择图Ⅱ引物 ； ②PCR目的产物约为 bp。
确保M及连接处序列正确，Y-M的连接处上游含有Hind III+EcoR V的识别序列，下游含有EcoR V+BamH I的识别序列 ③质粒测序，图Ⅲ中正确的是 （选填序列编号）
检测融合蛋白定位 ④对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明 。
(4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经 形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20（Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数）。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的 倍。
【答案】(1)与有丝分裂有关（参与纺锤体的形成，是纺锤体形成中心）
(2)溶解DNA 耐高温DNA聚合酶（Taq酶） 3'
(3) a、b 1100 Q4 X蛋白参与中心体的形成
(4)逆转录 32
【详解】（1）中心体与有丝分裂有关，是纺锤体的组织中心。
（2）从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，DNA在2．0mol/L的NaC1溶液中的浓度最大，高于或低于这一浓度，DNA的溶解度均会下降，因此实验过程中添加NaC1至2．0mol/L的目的是溶解DNA。PCR扩增时，需在耐高温的DNA聚合酶（即Taq聚合酶）的催化下，在引物的3’端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。
（3）PCR扩增目的DNA片段时，在引物的3’端进行DNA链的延伸，据图可知，应选择图II中的引物a和引物b，PCR目的产物约为300+800=1100bp。确保M及连接处序列正确，Y-M的连接处上游含有Hind III+EcoR V的识别序列，下游含有EcoR V+BamH I的识别序列，根据题干信息构建Y-M重组质粒（在EcoRⅤ位点插入片段），Y-M的连接处测序后部分序列应含有EcoR V+BamH I的识别序列，根据EcoR V识别位点，应选择序列Q4。对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明蛋白质X参与中心体的组成。
（4）研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经逆转录形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20（Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数），说明病人基因Z表达较弱，设健康人Z基因的cDNA数为x，病人Z基因的cDNA数为y，则有x×215=y×220，从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的25=32倍。
6．（2021·江苏·高考真题）某小组为研究真菌基因m的功能，构建了融合表达蛋白M和tag标签的质粒，请结合实验流程回答下列问题：
(1)目的基因的扩增
①提取真菌细胞 ，经逆转录获得cDNA，进一步获得基因m片段。
②为了获得融合tag标签的蛋白M，设计引物P2时，不能包含基因m终止密码子的编码序列，否则将导致 。
③热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是：先将除TaqDNA聚合酶（Taq酶）以外的各成分混合后，加热到80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR扩增，下列叙述正确的有
A．Taq酶最适催化温度范围为50～60℃
B．与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物
C．两条子链的合成一定都是从5′端向3′端延伸
D．PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了Taq酶的特异性
(2)重组质粒的构建
①将Sma I切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进 ，形成A-m结合体。将A-m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及 酶等，完成质粒的环化。
②若正确构建的重组质粒A—m仍能被Sma I切开，则Sma I的酶切位点可能在 。
(3)融合蛋白的表达
①用含有尿嘧啶的培养基培养URA3基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒A-m，然后涂布于无尿嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是 。
②若通过抗原一抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签，说明 ，后续实验可借助tag标签进行蛋白M的分离纯化。
【答案】(1) mRNA 蛋白M上不含tag标签 BC
(2)黏性末端碱基配对 DNA连接 基因m的连接处或基因m的内部
(3) 受体菌在无尿嘧啶的培养基上无法生长，导入重组质粒的受体菌含有URA3基因可以长成菌落 融合基因表达（或融合基因正确解码）
【详解】（1）①以逆转录获得cDNA的方式，要先从真菌细胞中提取基因m转录出来的mRNA。
②从构建好的重组质粒上看，tag序列位于目的基因下游，若m基因的转录产物mRNA上有终止密码子，核糖体移动到终止密码子多肽链就断开，则不会对tag序列的转录产物继续进行翻译，蛋白M上就不含tag标签。
③A、从题干信息可知，“80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR扩增”，故Taq酶最适催化温度范围为94℃左右，A错误；
B、PCR 反应的最初加热过程中，样品温度上升到70℃之前，在较低的温度下引物可能与部分单链模板形成非特异性结合，并在Taq DNA 聚合酶的作用下延伸，结果会导致引物错配形成的产物的扩增，影响反应的特异性；热启动可减少引物错配形成的产物的扩增，提高反应的特异性，B正确；
C、DNA分子复制具有方向性，都是从5′端向3′端延伸，C正确；
D、Taq酶没有特异性，与普通的DNA聚合酶相比，Taq酶更耐高温，D错误。
故选BC。
（2）①从图上看，载体A只有一个Sma I的酶切位点，故被Sma I切开后，载体由环状变为链状DNA，将Sma I切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进载体A与添加同源序列的m的黏性末端碱基互补配对。将A-m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及DNA连接酶等，完成质粒的环化。
②重组质粒中，载体A被Sma I切开的位置已经与基因m相连，原来的酶切位点已不存在，若正确构建的重组质粒A—m仍能被Sma I切开，则Sma I的酶切位点可能在基因m的连接处或基因m内部。
（3）①筛选目的菌株的机理是：导入了质粒A-m的目的菌株由于含有URA3基因，能在无尿嘧啶的培养基上存活，而URA3基因缺失型酵母则不能存活。
②若通过抗原一抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含lag标签，位于lag标签上游的基因m应该正常表达，说明融合基因表达（或融合基因正确解码）。
考点02 基因工程的应用
1．（2021·江苏·高考真题）下图是剔除转基因植物中标记基因的一种策略，下列相关叙述错误的是（ ）
A．分别带有目的基因和标记基因的两个质粒，都带有T-DNA序列
B．该方法建立在高转化频率基础上，标记基因和目的基因须转到不同染色体上
C．若要获得除标记基因的植株，转化植株必须经过有性繁殖阶段遗传重组
D．获得的无筛选标记转基因植株发生了染色体结构变异
【答案】D
【详解】A、农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，故分别带有目的基因和标记基因的两个质粒，都带有T-DNA序列，进而成功整合到受体细胞染色体上，A正确；
B、该方法需要利用农杆菌转化法，在高转化频率的基础上，将目的基因和标记基因整合到染色体上，由图可知，标记基因和目的基因位于细胞中不同的染色体上，B正确；
C、通过杂交分离结果可知，经过有性繁殖阶段遗传重组后获得了三种类型细胞，其中包括只含目的基因的，只含标记基因的和既含目的基因又含标记基因的，C正确；
D、获得的无筛选标记转基因植株发生了基因重组，D错误。
故选D。
一、单选题
1．（2025·江苏淮安·二模）AI 技术通过大数据分析、机器学习、深度学习等方法，为生物医药研究、药物开发、临床诊断和治疗等带来革命性的变化。下列关于 AI 技术在生物医药领域的应用，下列叙述错误的是（　　）
A．AI 技术对大量的蛋白质数据进行分析，能够预测患者体内某些蛋白质的三维结构以便设计新药物，该过程属于蛋白质工程技术
B．AI 技术通过智能穿戴设备和移动应用程序可实时监测患者的生理参数，预测健康风险，并提供相应的诊断和治疗建议
C．AI 技术对大量的基因组数据进行处理和分析，可以识别疾病相关的基因突变，为精准医疗 提供支持
D．AI 技术设计的某种蛋白质的氨基酸序列推导出的对应基因序列不唯一，且基因序列中不包含启动子和终止子
【答案】A
【详解】A、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，利用AI技术设计新药物，没有对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，不属于蛋白质工程技术，A错误；
B、利用AI技术，通过智能穿戴设备和移动应用程序，能够实时监测患者的生理参数，预测健康风险，并提供相应的诊断和治疗建议，AI技术为临床诊断和治疗等方面带来了革命性的变化，B正确；
C、AI技术在基因组数据处理和分析中的应用，通过识别疾病相关的基因突变，为精准医疗的实现提供了强大的技术支持，C正确；
D、密码子具有简并性，故AI技术设计的某种蛋白质的氨基酸序列推导出的对应基因序列不唯一，启动子和终止子为非编码区，由氨基酸序列推理的基因序列中不包含启动子和终止子，D正确。
故选A。
2．（2025·江苏南通·二模）南通某生物兴趣小组的同学用猪肝进行DNA的粗提取与鉴定实验，主要实验流程如下图。相关叙述正确的是（ ）
A．过程①向猪肝组织块中加入研磨液进行充分研磨
B．过程②过滤后弃去滤液，取纱布上的丝状物
C．过程⑤加入酒精后，也可将溶液倒入离心管离心后取上清液
D．过程⑥中A、B试管均会出现蓝色，但B试管中蓝色更深
【答案】A
【详解】A、过程①向猪肝组织块中加入研磨液进行充分研磨，得到含DNA的混合液，A正确；
B、过程②是第一次过滤，应保留滤液，弃去纱布上的物，B错误；
C、DNA不溶于酒精溶液，过程⑤加入酒精后，需要静置析出，如果将溶液倒入离心管离心后应取沉淀，C错误；
D、将DNA丝状物放入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液中，使其溶解，再加入二苯胺试剂，沸水浴加热出现蓝色，过程⑥中B试管均会出现蓝色，A试管为无色的二苯胺溶液，D错误。
故选A。
3．（2025·江苏苏州·三模）蛋白质表面含有很多极性基团，易溶于苯酚，可采用苯酚/氯仿法分离蛋白质和DNA。图示提取纯化草莓DNA的具体过程。下列相关叙述错误的是（ ）
A．在细胞裂解环节需对样本进行充分研磨以释放更多的DNA
B．转移DNA时需吸取水相溶液，并可重复上一步骤进一步纯化
C．加入预冷的体积分数95%的乙醇后离心，DNA分布于沉淀物中
D．提取出的DNA复溶后加入适量的二苯胺试剂，即可呈现出蓝色
【答案】D
【详解】A、细胞研磨能破坏细胞结构，使 DNA 释放，充分研磨可让更多 DNA 释放，A正确；
B、DNA 溶于水相，转移水相并重复酚、氯仿抽提步骤，可进一步去除杂质纯化 DNA，B正确 ；
C、DNA 不溶于乙醇，95% 冷乙醇能使 DNA 析出，离心后 DNA 在沉淀物，C正确 ；
D、二苯胺检测 DNA 需在沸水浴条件下才会呈现蓝色，仅复溶后加入不处理不会显色，D错误。
故选D。
4．（2025·江苏南京·二模）生物技术与工程学相结合，可研究、设计和加工生产各种生物工程产品。下列叙述错误的是（　　）
A．二倍体植株的花药离体培养得到的单倍体植株可用于基因突变的研究
B．由iPS细胞产生的特定细胞，可以在新药的测试中发挥重要作用
C．将含指示剂的凝胶载样缓冲液与PCR产物混合后滴入加样孔指示电泳进程
D．大量制备一种单克隆抗体时需要用大量的B细胞和骨髓瘤细胞进行融合
【答案】D
【详解】A、二倍体花药离体培养的单倍体植株只有一个染色体组，控制每种性状的基因只有一个，该基因的突变会直接影响生物的性状，因此二倍体植株的花药离体培养得到的单倍体植株可用于基因突变的研究，A正确；
B、iPS细胞为多功能干细胞，能分裂分化产生的特定细胞，可以在新药的测试中发挥重要作用，B正确；
C、电泳指示剂迁移速度较PCR产物快，因此将含指示剂的凝胶载样缓冲液与PCR产物混合后滴入加样孔指示电泳进程，C正确；
D、单克隆抗体是由一个能产生特定抗体的杂交瘤细胞经分裂、分泌而来的，因此大量制备一种单克隆抗体时并不需要用大量的B细胞和骨髓瘤细胞进行融合，D错误。
故选D。
5．（2025·江苏扬州·模拟预测）关于“DNA粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法正确的是（　　）
A．DNA粗提取时加入冷酒精出现白色丝状物后可以用离心法收集
B．PCR缓冲液中需保持较高浓度的Mg2+，以确保DNA聚合酶最佳活性
C．将白色丝状物加入二苯胺试剂，沸水浴待冷却后观察颜色变化
D．DNA电泳指示剂需要加入到稍冷却的琼脂糖溶液中
【答案】A
【详解】A、DNA 不溶于酒精溶液，粗提取时加入冷酒精出现白色丝状物（DNA）后，用离心法可以将 DNA 收集起来，A 正确；
B、PCR 缓冲液中需要保持一定浓度的Mg2+，Mg2+可以激活 DNA 聚合酶，但不是较高浓度，过高浓度可能会对反应产生不利影响，B 错误；
C、将白色丝状物（DNA）溶解在2mol/L的NaCl溶液中，再加入二苯胺试剂，沸水浴待冷却后观察颜色变化，不能直接将白色丝状物加入二苯胺试剂，C 错误；
D、DNA 电泳指示剂是在加样时与 DNA 样品混合加入到凝胶加样孔中的，而不是加入到稍冷却的琼脂糖溶液中，D 错误。
故选A。
6．（2025·江苏·一模）关于"琼脂糖凝胶电泳"实验，下列叙述正确的是（ ）
A．根据待分离DNA片段的大小，需用无菌水配制0.8%～1.2%的琼脂糖溶液
B．向琼脂糖溶液中加入适量的核酸染料后，需在沸水浴内加热至琼脂糖熔化
C．将PCR产物和电泳缓冲液混合后，需用微量移液器将混合液缓慢注入加样孔
D．待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，需及时断电并取出凝胶置于紫外灯下观察
【答案】D
【详解】A、配制琼脂糖溶液时，应该用缓冲液而不是无菌水来配制，这样才能维持合适的离子强度和pH等条件，保证电泳效果，A错误；
B、应该是先将琼脂糖加入缓冲液中，在沸水浴或微波炉中加热至琼脂糖熔化，冷却至50 - 60℃左右时再加入适量的核酸染料，而不是先加染料再加热熔化琼脂糖，B错误；
C、PCR产物和上样缓冲液混合，而不是和电泳缓冲液混合，然后用微量移液器将混合液缓慢注入加样孔，C错误；
D、待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，及时断电并取出凝胶置于紫外灯下观察，这样可以清晰地观察到DNA条带的位置和情况，D正确。
故选D。
7．（2025·江苏盐城·二模）下列有关“DNA的提取与鉴定”“利用PCR扩增DNA片段及电泳鉴定”实验的叙述，错误的是（ ）
A．洋葱切碎加研磨液研磨过滤后，滤液放置4℃冰箱中静置，DNA存在于上清液中
B．将丝状物溶于体积分数95%的酒精，再加入二苯胺试剂在沸水浴中进行DNA鉴定
C．PCR扩增反应体系中dNTP既可以为扩增提供原料，也可以为子链的合成提供能量
D．PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果不止一条条带，可能是引物特异性不强导致
【答案】B
【详解】A、洋葱切碎加研磨液研磨过滤后，滤液放置4 C冰箱中静置，DNA存在于上清液中。因为在该实验中，破碎细胞释放出 DNA 等物质，经过离心或静置分层后DNA会溶解在上清液中，A正确；
B、应该将丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液，再加入二苯胺试剂在沸水浴中进行DNA鉴定，而不是溶于体积分数95%的酒精，B错误；
C、PCR扩增反应体系中dNTP（脱氧核糖核苷三磷酸）既可以为扩增提供原料，在形成磷酸二酯键时，dNTP 脱去两个磷酸基团，释放的能量为子链的合成提供能量，C正确；
D、PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果不止一条条带，可能是引物特异性不强，导致引物与模板结合位点不唯一，扩增出多种不同的DNA片段，从而在电泳结果上出现多条条带，D正确。
故选B。
8．（2025·江苏·三模）琼脂糖凝胶电泳通常用于PCR产物的鉴定，相关叙述正确的是（ ）
A．DNA分子所带电荷越多，在凝胶中的迁移速率越快
B．用微量移液器将PCR产物与核酸染料的混合物缓慢注入凝胶的加样孔内
C．电场强度增大，DNA在凝胶中的迁移速率加快，电泳时的电压一般为1~5V
D．PCR非特异性扩增产物电泳、样品上样量过多电泳均会导致电泳条带模糊
【答案】D
【详解】A、在琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子在凝胶中的迁移速率主要取决于DNA分子的大小，而非所带电荷多少。因为DNA分子本身带有大量负电荷，在电场中都会向正极移动，且在凝胶介质中，分子大小对迁移的阻碍作用更为关键，A正确；
B、用微量移液器将PCR产物缓慢注入凝胶的加样孔内，核酸染料是在制胶时加入到琼脂糖凝胶中，而不是与PCR产物混合后注入加样孔，B错误；
C、电场强度增大，DNA在凝胶中的迁移速率确实会加快，但电泳时的电压一般为5 - 15V，而不是1 - 5V，C错误；
D、CR非特异性扩增产物电泳时，由于存在多种不同的扩增片段，会导致电泳条带混乱模糊；样品上样量过多时，会使条带变宽、分辨率降低，也会导致电泳条带模糊，D正确。
故选D。
9．（2025·江苏南京·二模）关于“DNA粗提取与鉴定”、“琼脂糖凝胶电泳”、“PCR扩增”实验，下列说法正确的是（　　）
A．将洋葱切碎、研磨、过滤，滤液放置4℃冰箱中静置几分钟后，取沉淀物再溶解
B．在DNA鉴定和PCR扩增过程中，DNA双螺旋结构都会改变
C．凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料能与DNA分子结合，便于在紫外灯下观察
D．a个DNA模板分子完成第20轮循环需要a×（220-2）个引物
【答案】B
【详解】A、将洋葱切碎、研磨、过滤，滤液放置4 C冰箱中静置几分钟后，DNA 主要存在于上清液中，应取上清液进行后续操作，而不是沉淀物，A 错误；
B、在 DNA 鉴定实验中，在沸水浴条件下，DNA 与二苯胺反应呈现蓝色，此过程中 DNA 双螺旋结构被破坏；在 PCR 扩增过程中，高温变性使 DNA 双螺旋结构解开，B 正确；
C、核酸染料是在制备凝胶时加入到凝胶中的，而不是在凝胶载样缓冲液中加入，C 错误；
D、PCR技术中，DNA复制遵循半保留复制原则。一个双链DNA分子经过n次循环后得到2 个DNA分子，需要的引物数量为（2 - 2）×a个（因为最初的2个DNA分子各有2条模板链，不需要引物）。n-1次循环共需引物（2 - 2）×a，第n次循环共需引物a2n个，D错误。
故选B。
二、多选题
10．（2025·江苏盐城·模拟预测）单细胞RNA 测序是一种在单细胞水平上利用 RNA 测序对特细胞群体进行基因表达谱定量的高通量实验技术。待测组织经过单细胞分离、裂解、反转录、cDNA扩增、文库构建、测序和计算机分析，便可获得多个细胞的基因表达谱。下列相关叙述正确的有（ ）
A．将单个细胞从组织中分离出来可以利用有限稀释法或显微操作法
B．实验室裂解细胞后提取的RNA，需要利用特定的技术富集mRNA
C．通过反转录、cDNA扩增以及构建基因组文库等技术可确定单细胞中基因表达情况
D．相比于多细胞混合测序，该技术可以揭示罕见的细胞类型
【答案】ABD
【详解】A、单细胞分离的常用方法包括有限稀释法（通过稀释获得单个细胞）和显微操作法（如显微切割或流式细胞分选），A正确；
B、实验室裂解细胞后提取的RNA数量有限，因此，需要利用特定的技术富集mRNA，B正确；
C、单细胞RNA测序构建的是cDNA文库，通过测序分析基因表达。基因组文库用于研究DNA序列，与基因表达无关，C错误；
D、单细胞分辨率避免了群体测序的平均化效应，能够检测稀有细胞亚群，因而可以揭示罕见的细胞类型，D正确。
故选ABD。
11．（2025·江苏·二模）与DNA相关的实验，下列叙述正确的有（ ）
A．利用DNA在酒精中溶解度较大的特性提取DNA
B．粗提取的DNA中可能含有蛋白质、脂质等杂质
C．用二苯胺试剂鉴定DNA时，沸水浴加热后呈蓝色
D．PCR扩增产物通常利用琼脂糖凝胶电泳技术进行鉴定
【答案】BCD
【详解】A、DNA在酒精（尤其是体积分数为95%的冷酒精）中的溶解度较低，实验中通过加入酒精使DNA析出，而蛋白质等杂质溶解，A错误；
B、粗提取的DNA可能残留细胞破碎后的杂质，如蛋白质（未完全被酶分解或盐析去除）、脂质（细胞膜成分）等，B正确；
C、二苯胺试剂与DNA在沸水浴条件下反应生成蓝色产物，C正确；
D、PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，DNA片段因大小不同呈现不同迁移速率。凝胶经核酸染料染料染色，在紫外灯照射下DNA会发出荧光，据此可判断产物是否存在及分子量大小，D正确。
故选BCD。
12．（2025·江苏南通·模拟预测）下列关于“提取”和“分离”的叙述，正确的是（　　）
A．提取叶绿素可以用无水乙醇、丙酮或无水乙醇与丙酮的混合物
B．提取DNA需同时兼顾DNA的完整性、纯度和含量
C．光合色素用不同的层析液可能会得到不同的色素排列顺序
D．DNA和蛋白质分离常采用琼脂糖凝胶电泳，但用的标准参照物是统一的
【答案】ABC
【详解】A、叶绿素易溶于有机溶剂，几乎不溶于水，根据其性质，可以用无水乙醇、丙酮或无水乙醇与丙酮的混合物等有机溶剂进行提取，A正确；
B、在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，纯度和含量，B正确；
C、不同的色素在不同的层析液中溶解度不同，所以光合色素用不同的层析液可能会得到不同的色素排列顺序，C正确；
D、PCR产物常用琼脂糖凝胶电泳鉴定，依据条带位置、大小等判断产物，利用琼脂糖凝胶电泳技术，将得到的蛋白质进行分离，在电泳过程中，影响蛋白质迁移速度的因素包括蛋白质分子的带电性质差异、形状差异以及本身的大小等，可见两者的标准参照物不统一，D错误。
故选ABC。
13．（2025·江苏·模拟预测）人鼠嵌合抗体是鼠源抗体的可变区（V区）与人源抗体的恒定区（C区）结合而成的抗体。下图1是抗体的示意图（H代表重链，L代表轻链），图2是制备抗肿瘤的人鼠嵌合抗体的部分过程。相关叙述正确的是（　　）
A．过程①从经免疫处理的小鼠脾中获取的B淋巴细胞都能产生特定抗体
B．过程③获得的VL、VH基因碱基序列与B淋巴细胞中的VL、VH基因碱基序列不同
C．过程④构建人鼠重组基因，其表达产物在人体内的免疫原性比鼠源性抗体低
D．过程⑥常采用农杆菌转化法将基因嵌合表达载体转入受体细胞
【答案】BC
【详解】A、过程①从经免疫处理的小鼠脾中获取的B淋巴细胞有很多种，不是都能产生特定抗体，A错误；
B、过程③获得的VL、VH基因碱基序列与B淋巴细胞中的VL、VH基因碱基序列不同，B正确；
C、过程④构建人鼠重组基因，其表达产物在人体内的免疫原性比鼠源性抗体低，C正确；
D、农杆菌转化法是将基因嵌合表达载体转入植物细胞的方法，D错误。
故选BC。
14．（2025·江苏盐城·模拟预测）如图表示花粉管通道法介导植物基因转移。下列说法正确的是（　　）
A．花粉管通道法可适用获得转基因扰虫棉花
B．外源DNA不需要构建基因表达载体，就能借助花粉管通道进入受体细胞并表达
C．必须在雌蕊成熟时才能进行图中所示的处理方法
D．相比于农杆菌转化法，花粉管通道法避免了植物组织培养这一操作
【答案】ACD
【详解】A、花粉管通道法是一种常用的植物基因转移方法，适用于多种植物，包括棉花，A正确；
B、要让目的基因进入受体细胞后能稳定存在并得到复制和表达，不管采用什么导入方法，都需要构建基因表达载体才能实现，外源DNA也需要构建基因表达载体，才能借助花粉管通道进入受体细胞并表达，B错误；
C、授粉过程需要在雌蕊成熟后，因此，花粉管通道法也应该必须在雌蕊成熟时才能进行图中所示的处理方法，C正确；
D、花粉管通道法可以直接实现转基因植物的自然生成，而农杆菌转化法还需要对成功导入目的基因的受体细胞进行植物组织培养获得转基因植物，故花粉管通道法避免了植物组织培养这一操作，D正确。
故选ACD。
15．（2025·江苏淮安·二模）关于“DNA 片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法正确的是（　　）
A．根据 DNA 片段大小配置一定质量分数的琼脂糖溶液以便分离 DNA 分子
B．琼脂糖凝胶电泳中的缓冲液中含指示剂，其可以在紫外灯下被检测出来
C．实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理
D．扩增得到的 PCR 产物与凝胶载样缓冲液混匀后需缓慢注入加样孔以防样品飘散
【答案】ACD
【详解】A、高浓度凝胶孔径小，适合分离小片段；低浓度凝胶孔径大，适合大片段。因此需根根据 DNA 片段大小配置一定质量分数的琼脂糖溶液以便分离 DNA 分子，A正确；
B、琼脂糖凝胶电泳中的缓冲液中不含指示剂，与PCR产物混合的凝胶载样缓冲液中含有指示剂，B错误；
C、PCR实验对污染极为敏感，微量离心管、枪头等需高压灭菌以去除外源DNA或核酸酶。蒸馏水也需灭菌确保无核酸酶污染，C正确；
D、载样缓冲液含甘油或蔗糖以增加样品密度，使其沉入加样孔。操作时应缓慢注入，避免因冲击力导致样品溢出孔外或飘散至周围缓冲液中，D正确。
故选ACD。
16．（2025·江苏常州·三模）如图表示花粉管通道法介导植物基因转移。下列说法正确的是（　　）
A．花粉管通道法可适用获得转基因抗虫棉花
B．相比于农杆菌转化法，花粉管通道法避免了植物组织培养这一操作
C．必须在雌蕊成熟时才能进行图中所示的处理方法
D．外源DNA不需要构建基因表达载体，就能借助花粉管通道进入受体细胞并表达
【答案】ABC
【详解】A、花粉管通道法是一种常用的植物基因转移方法，适用于多种植物，包括棉花，A正确；
B、花粉管通道法可以直接实现转基因植物的自然生成，而农杆菌转化法还需要对成功导入目的基因的受体细胞进行植物组织培养获得转基因植物，故花粉管通道法避免了植物组织培养这一操作，B正确；
C、授粉过程需要在雌蕊成熟后，因此，花粉管通道法也应该必须在雌蕊成熟时才能进行图中所示的处理方法，C正确；
D、要让目的基因进入受体细胞后能稳定存在并得到复制和表达，不管采用什么导入方法，都需要构建重组载体才能实现，外源DNA也需要构建基因表达载体，才能借助花粉管通道进入受体细胞并表达，D错误。
故选ABC。
三、解答题
17．（2025·江苏·三模）病毒诱导的基因沉默技术（VIGS）是利用病毒载体携带目的基因侵染植物细胞，在植物细胞中复制产生dsRNA（双链RNA），激活植物自身的基因沉默机制，降解植物目标mRNA的技术。叶用莴苣生长到一定时期极易抽薹（茎迅速生长），从而导致莴苣减质减产。研究表明LsMET1基因（甲基转移酶1基因）促进叶用莴苣抽薹，研究人员利用VIGS尝试使LsMET1基因沉默来验证该观点，主要操作如图。请回答下列问题。
(1)过程①反应体系中加入的物质除引物、原料、模板外，还有 ，下列四种引物中用于过程①的是 。
A．5'GAATTCATGA………………………3' B．5'CTTAAGTTAC………………………3'
C．5'CTGCAGTAGA………………………3' D．5'GACGTCATCT………………………3'
(2)过程②将环状DNA扩增为线性DNA的目的是 。
(3)在TRV1、TRV2质粒中插入双启动子目的是 。过程④将TRV1质粒和重组质粒导入农杆菌后，在培养基中应加入 进行筛选。
(4)导入植物细胞的CP-LsMET1-RZ基因转录后在 催化下，被剪切为CPRNA、LsMET1 RNA、RZRNA。LsMET1 RNA诱导内源LsMET1基因沉默的机制如图2，AGO1蛋白选择性降解3'端稳定性较低的一条链。据图分析，向农杆菌中导入TRV1质粒的目的是 ，激活的RISC有的能诱导LsMET1 mRNA降解，有的不能诱导LsMET1 mRNA降解，其原因是 。
(5)研究人员测定了LsMET1表达量和抽墓（茎生长）状况，结果如图3。该实验结果与预期是否一致，并说明理由。 。
【答案】(1)逆转录酶、TaqDNA聚合酶（Mg2+缓冲液） A、C
(2)有利于目的基因与载体连接
(3)提高目的基因的表达水平 氨苄青霉素和卡那霉素
(4) CP-LsMET1-RZRNA中的RZRNA片段（自切割核糖核酸酶） 在植物细胞中合成RNA聚合酶，催化合成dsRNA AGO1蛋白水解siRNA的链不同
(5)一致，实验组LsMET1基因表达量明显下降，茎生长受抑制。
【详解】（1）图中过程①是由RNA获得目的基因的过程，该过程首先应经逆转录获得DNA，随后进行PCR扩增，所以反应体系中加入的物质除引物、原料、模板外，还有逆转录酶、TaqDNA聚合酶（Mg2+缓冲液，用于激活TaqDNA聚合酶）。
扩增过程中子链延伸的方向为5'端→3'端，结合图中序列可知，应选择引物A和C进行扩增。
（2）过程②将环状DNA扩增为线性DNA有利于目的基因与载体连接。
（3）启动子的作用是与RNA聚合酶结合，启动转录，在TRV1、TRV2质粒中插入双启动子可有效提高目的基因的转录水平。由于导入的TRV1质粒含有氨苄青霉素抗性基因、重组质粒含有卡那霉素抗性基因，所以在培养基中应加入氨苄青霉素和卡那霉素进行筛选。
（4）由图1注可知，RZ为自切割核糖核酸酶基因，所以导入植物细胞的CP-LsMET1-RZ基因转录后在CP-LsMET1-RZRNA中的RZRNA片段（自切割核糖核酸酶）催化下，被剪切为CPRNA、LsMET1 RNA、RZRNA。由图1可知，RdRp为病毒的RNA聚合酶基因，向农杆菌中导入TRV1质粒的目的是在植物细胞中合成RNA聚合酶，催化合成dsRNA，由于AGO1蛋白选择性降解3'端稳定性较低的一条链，而不同LsMET1链的稳定性，即AGO1蛋白水解siRNA的链不同，所以激活的RISC有的能诱导LsMET1 mRNA降解，有的不能诱导LsMET1 mRNA降解。
（5）由图3可知，实验组较对照组LsMET1基因表达量明显下降，茎生长受抑制，说明实验结果与预期一致。
18．（2025·江苏苏州·三模）我国科学家尝试构建地衣芽孢杆菌基因编辑系统，并通过将外源vgb基因定向插入19T-pflB质粒中对该系统进行初步验证，主要过程如图1。请回答下列问题。
(1)步骤①利用已构建的质粒19T-pflB，通过反向PCR获得左右同源片段，除图中已有的组分外，还应添加缓冲液（Mg2+）和 等。下表为pflB部分基因序列和设计的相关引物，可选用的引物是 （填编号）。根据不同的引物，需要重新设置PCR程序中的 。
DNA序列（虚线处省略了部分核苷酸序列）
pflB基因 5′-TCGCACACCTGACTACAATT……TCGCAATGGCAATCGGCAAACT-3′ 3′-AGCGTGTGGACTGATGTTAA……AGCGTTACCGTTAGCCGTTTGA-5'
PCR引物 ①5'ACGGGATCCTTGTAGTCAGGTGTGCGA3' ②5'ACGGGATCCTTTGCCGATTGCCATTGC3' ③5'AACTGCAGTCGCACACCTGACTACAA3' ④5'AACTGCAGGCAATGGCAATCGGCAAA3'
注：下划线标注的序列为限制酶识别序列。
(2)步骤②双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是 和 ，影响DNA连接酶反应速率的因素有反应体系的温度、pH、酶浓度和 等。
(3)图2是质粒PNZTK-PFTF-vgb转入地衣芽孢杆菌后，将目的基因插入基因组的过程示意图。
将受体菌接种在含四环素和 （含/不含）卡那霉素培养基中培养一段时间后，因没有选择压力，会导致发生双交换的质粒丢失。挑取一定数量的单菌落，接种到含四环素的培养基上，并一一对应接种到含卡那霉素的培养基上，实验结果如图3所示。其中在两种培养基均能生长的菌株是只发生单交换或 的受体菌。
(4)科学家通过分析vgb基因在重组菌株及原始菌株中的表达水平验证该基因编辑系统。分析时需要以rpsE基因（核糖体S5蛋白基因）为参照，该基因表达的特点是 ，可采用 的方法检测基因表达的产物量。
【答案】(1)四种脱氧核苷酸（dNTP）、TagDNA聚合酶 ①④ 退火温度
(2) SmaI XhoI DNA片段浓度（底物浓度）、DNA片段末端类型
(3)不含 未发生交换
(4)在细胞中的表达水平相对恒定 琼脂糖凝胶电泳
【详解】（1）PCR 反应除了图中已有的组分外，还需要添加TagDNA聚合酶（用于催化 DNA 的合成）、四种脱氧核苷酸（dNTP）。PCR 扩增时，引物需要与模板链进行碱基互补配对，且引物的延伸方向是 5' 到 3'。分析 pflB 基因序列和各引物序列，①中 5' 端含有 BamHⅠ 识别序列（GGATCC），且其碱基序列能与 pflB 基因的一条链互补配对；④中 5' 端含有 PstⅠ 识别序列（CTGCAG），且其碱基序列能与 pflB 基因的另一条链互补配对，所以可选用的引物是①④。 不同的引物，其碱基组成和长度可能不同，引物的 Tm 值（解链温度）就不同，所以需要根据不同的引物重新设置 PCR 程序中的退火温度。
（2）观察图可知，要将外源 vgb 基因定向插入 19T pflB 质粒中，构建重组质粒，需要用与切割含目的基因的 DNA 片段相同的限制酶切割质粒。由步骤①可知，pflB片段两端具有SmaI和XhoI的酶切位点，步骤②双酶切时，是要将Kan插入到pflB片段的外侧，需使用的限制酶a和限制酶b分别是SmaI和XhoI。影响 DNA 连接酶反应速率的因素有反应体系的温度、pH、酶浓度和底物浓度，DNA片段末端类型（DNA 片段的浓度，因为 DNA 连接酶催化的是 DNA 片段之间的连接反应，底物浓度会影响反应速率）等。所以②处应填底物浓度，DNA片段末端类型。
（3）因为要让发生双交换的质粒丢失，而双交换后的重组菌含有四环素抗性但不含卡那霉素抗性（发生双交换后卡那霉素抗性基因随质粒丢失），所以受体菌应接种在含四环素和不含卡那霉素培养基中培养。 只发生单交换会使受体菌含有四环素抗性和卡那霉素抗性，另外未发生交换的受体菌本身就对四环素和卡那霉素有抗性（从质粒和原始受体菌的抗性情况分析），所以在两种培养基均能生长的菌株是只发生单交换或未发生交换的受体菌。
（4）psE 基因是核糖体 S5 蛋白基因，核糖体是细胞进行蛋白质合成的场所，在细胞中的表达相对稳定，即该基因表达的特点是在细胞中的表达水平相对恒定。 检测基因表达的产物（蛋白质）量可采用琼脂糖凝胶电泳的方法，琼脂糖凝胶电泳通过分子大小分离和可视化标记，将基因表达产物的量转化为可检测的条带信号，是基因表达分析中简单、直观的方法。
19．（2025·江苏·二模）人类血液中的纤维蛋白原是血液凝固的主要蛋白质成分，由Aα、Bβ和γ三条肽链组成，重组人纤维蛋白原（rFib）的开发有望消除血源性感染的风险。某科研团队欲通过培育转基因蚕并利用蚕茧高效生产人纤维蛋白原，流程如下图。请回答下列问题。

(1)纤维蛋白原的Aα、Bβ和γ链首先在 上合成，然后Aα和γ链在内质网中与Bβ链结合形成的六聚体Aα2Bβ2γ2，最后在 中加工修饰并分泌到细胞外。
(2)选取从人类肝脏的cDNA文库扩增目的基因的原因是 ；步骤①PCR条件如下：94℃，5min→25个循环（变性、退火、延伸）→72℃，7min，其中退火温度设置需参考引物中碱基的 ，延伸阶段使用ExTaqDNA聚合酶，该酶的作用有 和在扩增产物的3'端额外添加上一个碱基“A”。
(3)步骤②中，将Fib-Bβ插入到 （填“3'”或“5'”）端含有碱基T的克隆载体中，将克隆后的Fib-Bβ用 限制酶处理后通过DNA连接酶连接到表达载体上完成载体1的构建。载体2采用类似方法构建。
(4)步骤③分别将载体1和载体2注入胚盘期蚕卵中，在荧光体视显微镜下观察 在眼部的表达，显示阳性表达的即为转基因Bβ-蚕和转基因Aα/γ-蚕。对转基因蚕进行DNA杂交分析表明，Bβ-蚕和Aα/γ-蚕均存在多个转基因品系，这可能与插入的目的基因数量和 有关。
(5)丝胶蛋白启动子将重组纤维蛋白原链的cDNA定向表达在丝腺细胞中，然后依靠吐丝分泌到蚕茧中。科研人员对丝腺细胞中的mRNA进行检测并对蚕茧中的蛋白质进行分析，结果如下表。
组别 mRNA 蛋白质电泳条带
Aα链mRNA Bβ链mRNA γ链mRNA Aα Bβ γ
非转基因蚕（对照组） - - - - - -
转基因Bβ-蚕 - + - - - -
转基因Aα/γ-蚕 + - + + - +
转基因Aα/Bβ/γ-蚕 + + + + + +
注：“+”表示有，“-”表示无
根据实验结果推测， 可能是Bβ链分泌到蚕茧中的必要条件之一。
【答案】(1)（游离的）核糖体 高尔基体
(2)相关基因只在肝细胞中表达 组成和数量 从引物的3'端开始连接脱氧核糖核苷酸
(3) 3' BamH I、xho Ⅰ
(4)红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白 插入位置
(5)Aα链、γ链和Bβ链共表达
【详解】（1）由题意知，三种肽链构成的纤维蛋白原上血液中的成分，即需要分泌到细胞外。根据人教版必修一内容，分泌蛋白首先在游离核糖体上合成，然后游离的核糖体附着在内质网继续合成，在内质网中对蛋白质初步加工，在高尔基体进一步加工。
（2）细胞分化的实质是基因的选择性表达。血浆蛋白由肝脏合成，肝脏细胞中有血浆蛋白基因表达，因此肝脏细胞含有目的基因的mRNA。退火温度与两条链之间的氢键数目有关。引物的CG含量、碱基数量都会影响氢键数。DNA聚合酶的作用是从引物的3'端连接脱氧核苷酸。
（3）因为扩增产物的3'端有一个游离碱基A，形成黏性末端，根据碱基互补配对原则，将扩增产物插入载体需要载体3'端加一个碱基T，两种黏性末端互补配对。从图中可看出，载体1Fib-Bβ的上下游分别有限制酶XhoI和BamHI的识别序列。
（4）载体1、2都含有眼部特异性启动子3xP3，载体1中该启动子启动红色荧光蛋白基因的转录，载体2中该启动子启动绿色荧光蛋白基因的转录，因此通过观察在眼部是否有相应的荧光蛋白产生，即可判断载体是否导入。目的基因插入的数量和位置影响基因表达产物的量。
（5）从表中看出，使Bβ能够分泌到蚕茧中的只有第4组，即只有Aα、Bβ、γ同时导入并表达时，Bβ能够分泌到蚕茧中。
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21世纪教育网(www.21cnjy.com)专题11 基因工程
考点 五年考情（2021-2025） 命题趋势
考点1 基因工程的基本操作程序 （5年6考） 2021江苏卷、2022江苏卷、2023江苏卷、2024江苏卷、2025江苏卷：基因工程的综合应用 1、基因工程的基本操作程序是考察中的 重点内容，主要考察基因工程的基本操作程序包括目的基因的筛选和获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定，要对这部分内容进行分析和理解，结合情境进行分析判断，主要以非选择题形式考察。 2、基因工程的应用部分主要考察基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用、基因诊断和基因治疗、基因芯片相关内容，主要考察对基因工程的理解以及在生活中的应用。
考点2 基因工程的应用 （5年1考） 2021江苏卷：基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用
考点01 基因工程的基本操作程序
1．（2025·江苏·高考真题）（多选）图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为，下列相关叙述正确的有（ ）
A．基因A突变为a是一种碱基增添的突变
B．用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末端类型不同
C．用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小一致
D．产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定
2．（2025·江苏·高考真题）川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，为了更好地保护这一物种，研究者开展了以下研究。请回答下列问题：
(1)川金丝猴警戒行为具有监测捕食者和同种个体的功能，这说明生物之间的关系有 。川金丝猴的警戒行为依赖于环境中获取的信息，信息类型有 。川金丝猴根据这些信息及时作出反应，一方面可以降低被捕食风险，另一方面为争夺 获得更多机会。
(2)川金丝猴以植食为主，消化道中部分微生物直接参与高纤维食物的消化，这些微生物与川金丝猴构成 关系。
(3)研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA提取、扩增，部分实验过程如下。请完成下表：
实验目的 简要操作步骤
释放DNA 在去杂后的样本中加入裂解液
析出DNA 离心后取① ，加入乙醇
② 在沉淀物中加入纯水
扩增DNA 将③ 、引物、样本DNA、含有Mg 缓冲 液、超纯水等加入PCR管中，进行PCR
(4)为分析川金丝猴摄食的植物种类，研究者设计一对引物F和R，能同时扩增出不同种植物叶绿体中的rbeL基因片段，是因为引物F和R的碱基能与rbcL基因的保守序列的碱基 。用引物F和R对4种植物样本甲~丁的叶绿体基因组DNA进行扩增测序，结果如图所示。若对4个样本的扩增产物进行DNA电泳条带分析，能检出的样本是 。研究者用引物F和R对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序，得到的序列有图中的3种序列，据此可确定川金丝猴摄食的植物有 。若要更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物，参照叶绿体基因库，还需选用 的保守序列设计引物，对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析。
注：“·”表示与植物甲对应位置上相同的碱基：“……”表示省略200个碱基
(5)依据上述研究，保护川金丝猴可采取的措施有 （填字母）。
a．建立川金丝猴生态廊道，促进种群间基因交流
b．保护川金丝猴栖息地的植被和它喜食的植物
c．需用标记重捕法定期重捕，以精确监测种群数量
d．主要依赖迁地保护，扩大川金丝猴种群数量
3．（2024·江苏·高考真题）为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达SOD-ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列-（GTTCCTGGTGTTGGC）50-限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题：

(1)步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是 。
(2)步骤②转化时，科研人员常用 处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有 的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是 。
(3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与 结合，驱动转录，翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是 （从图2的“A~D”中选填）。

(4)步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。

（ⅰ）20℃时，加入NaCl后实验结果是 。
（ⅱ）100℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是 。
（ⅲ）据图分析，融合表达SOD-ELP50蛋白的优点有 。
4．（2023·江苏·高考真题）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：
(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有 ，扩增程序中最主要的不同是 。
(2)有关基因序列如图2，引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用______。

A．ATGGTG------CAACCA
B．TGGTTG------CACCAT
C．GACGAG------CTGCAG
D．CTGCAG------CTCGTC
(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有 。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。
A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落
B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有 。

(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。
5．（2022·江苏·高考真题）纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。
(1)纤毛结构如图1所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是 。
(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaC1至2．0mol/L的目的是 。PCR扩增时，需在 催化下，在引物 端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。
(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y-M重组质粒（在EcoRⅤ位点插入片段）。请完成下表。
分步实验目标 简易操作、结果、分析
PCR鉴定正向重组质粒Y-M（图Ⅱ中融合片段M中有白色的箭头，代表方向） ①选择图Ⅱ引物 ； ②PCR目的产物约为 bp。
确保M及连接处序列正确，Y-M的连接处上游含有Hind III+EcoR V的识别序列，下游含有EcoR V+BamH I的识别序列 ③质粒测序，图Ⅲ中正确的是 （选填序列编号）
检测融合蛋白定位 ④对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明 。
(4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经 形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20（Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数）。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的 倍。
6．（2021·江苏·高考真题）某小组为研究真菌基因m的功能，构建了融合表达蛋白M和tag标签的质粒，请结合实验流程回答下列问题：
(1)目的基因的扩增
①提取真菌细胞 ，经逆转录获得cDNA，进一步获得基因m片段。
②为了获得融合tag标签的蛋白M，设计引物P2时，不能包含基因m终止密码子的编码序列，否则将导致 。
③热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是：先将除TaqDNA聚合酶（Taq酶）以外的各成分混合后，加热到80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR扩增，下列叙述正确的有
A．Taq酶最适催化温度范围为50～60℃
B．与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物
C．两条子链的合成一定都是从5′端向3′端延伸
D．PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了Taq酶的特异性
(2)重组质粒的构建
①将Sma I切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进 ，形成A-m结合体。将A-m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及 酶等，完成质粒的环化。
②若正确构建的重组质粒A—m仍能被Sma I切开，则Sma I的酶切位点可能在 。
(3)融合蛋白的表达
①用含有尿嘧啶的培养基培养URA3基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒A-m，然后涂布于无尿嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是 。
②若通过抗原一抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签，说明 ，后续实验可借助tag标签进行蛋白M的分离纯化。
考点02 基因工程的应用
1．（2021·江苏·高考真题）下图是剔除转基因植物中标记基因的一种策略，下列相关叙述错误的是（ ）
A．分别带有目的基因和标记基因的两个质粒，都带有T-DNA序列
B．该方法建立在高转化频率基础上，标记基因和目的基因须转到不同染色体上
C．若要获得除标记基因的植株，转化植株必须经过有性繁殖阶段遗传重组
D．获得的无筛选标记转基因植株发生了染色体结构变异
一、单选题
1．（2025·江苏淮安·二模）AI 技术通过大数据分析、机器学习、深度学习等方法，为生物医药研究、药物开发、临床诊断和治疗等带来革命性的变化。下列关于 AI 技术在生物医药领域的应用，下列叙述错误的是（　　）
A．AI 技术对大量的蛋白质数据进行分析，能够预测患者体内某些蛋白质的三维结构以便设计新药物，该过程属于蛋白质工程技术
B．AI 技术通过智能穿戴设备和移动应用程序可实时监测患者的生理参数，预测健康风险，并提供相应的诊断和治疗建议
C．AI 技术对大量的基因组数据进行处理和分析，可以识别疾病相关的基因突变，为精准医疗 提供支持
D．AI 技术设计的某种蛋白质的氨基酸序列推导出的对应基因序列不唯一，且基因序列中不包含启动子和终止子
2．（2025·江苏南通·二模）南通某生物兴趣小组的同学用猪肝进行DNA的粗提取与鉴定实验，主要实验流程如下图。相关叙述正确的是（ ）
A．过程①向猪肝组织块中加入研磨液进行充分研磨
B．过程②过滤后弃去滤液，取纱布上的丝状物
C．过程⑤加入酒精后，也可将溶液倒入离心管离心后取上清液
D．过程⑥中A、B试管均会出现蓝色，但B试管中蓝色更深
3．（2025·江苏苏州·三模）蛋白质表面含有很多极性基团，易溶于苯酚，可采用苯酚/氯仿法分离蛋白质和DNA。图示提取纯化草莓DNA的具体过程。下列相关叙述错误的是（ ）
A．在细胞裂解环节需对样本进行充分研磨以释放更多的DNA
B．转移DNA时需吸取水相溶液，并可重复上一步骤进一步纯化
C．加入预冷的体积分数95%的乙醇后离心，DNA分布于沉淀物中
D．提取出的DNA复溶后加入适量的二苯胺试剂，即可呈现出蓝色
4．（2025·江苏南京·二模）生物技术与工程学相结合，可研究、设计和加工生产各种生物工程产品。下列叙述错误的是（　　）
A．二倍体植株的花药离体培养得到的单倍体植株可用于基因突变的研究
B．由iPS细胞产生的特定细胞，可以在新药的测试中发挥重要作用
C．将含指示剂的凝胶载样缓冲液与PCR产物混合后滴入加样孔指示电泳进程
D．大量制备一种单克隆抗体时需要用大量的B细胞和骨髓瘤细胞进行融合
5．（2025·江苏扬州·模拟预测）关于“DNA粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法正确的是（　　）
A．DNA粗提取时加入冷酒精出现白色丝状物后可以用离心法收集
B．PCR缓冲液中需保持较高浓度的Mg2+，以确保DNA聚合酶最佳活性
C．将白色丝状物加入二苯胺试剂，沸水浴待冷却后观察颜色变化
D．DNA电泳指示剂需要加入到稍冷却的琼脂糖溶液中
6．（2025·江苏·一模）关于"琼脂糖凝胶电泳"实验，下列叙述正确的是（ ）
A．根据待分离DNA片段的大小，需用无菌水配制0.8%～1.2%的琼脂糖溶液
B．向琼脂糖溶液中加入适量的核酸染料后，需在沸水浴内加热至琼脂糖熔化
C．将PCR产物和电泳缓冲液混合后，需用微量移液器将混合液缓慢注入加样孔
D．待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，需及时断电并取出凝胶置于紫外灯下观察
7．（2025·江苏盐城·二模）下列有关“DNA的提取与鉴定”“利用PCR扩增DNA片段及电泳鉴定”实验的叙述，错误的是（ ）
A．洋葱切碎加研磨液研磨过滤后，滤液放置4℃冰箱中静置，DNA存在于上清液中
B．将丝状物溶于体积分数95%的酒精，再加入二苯胺试剂在沸水浴中进行DNA鉴定
C．PCR扩增反应体系中dNTP既可以为扩增提供原料，也可以为子链的合成提供能量
D．PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果不止一条条带，可能是引物特异性不强导致
8．（2025·江苏·三模）琼脂糖凝胶电泳通常用于PCR产物的鉴定，相关叙述正确的是（ ）
A．DNA分子所带电荷越多，在凝胶中的迁移速率越快
B．用微量移液器将PCR产物与核酸染料的混合物缓慢注入凝胶的加样孔内
C．电场强度增大，DNA在凝胶中的迁移速率加快，电泳时的电压一般为1~5V
D．PCR非特异性扩增产物电泳、样品上样量过多电泳均会导致电泳条带模糊
9．（2025·江苏南京·二模）关于“DNA粗提取与鉴定”、“琼脂糖凝胶电泳”、“PCR扩增”实验，下列说法正确的是（　　）
A．将洋葱切碎、研磨、过滤，滤液放置4℃冰箱中静置几分钟后，取沉淀物再溶解
B．在DNA鉴定和PCR扩增过程中，DNA双螺旋结构都会改变
C．凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料能与DNA分子结合，便于在紫外灯下观察
D．a个DNA模板分子完成第20轮循环需要a×（220-2）个引物
二、多选题
10．（2025·江苏盐城·模拟预测）单细胞RNA 测序是一种在单细胞水平上利用 RNA 测序对特细胞群体进行基因表达谱定量的高通量实验技术。待测组织经过单细胞分离、裂解、反转录、cDNA扩增、文库构建、测序和计算机分析，便可获得多个细胞的基因表达谱。下列相关叙述正确的有（ ）
A．将单个细胞从组织中分离出来可以利用有限稀释法或显微操作法
B．实验室裂解细胞后提取的RNA，需要利用特定的技术富集mRNA
C．通过反转录、cDNA扩增以及构建基因组文库等技术可确定单细胞中基因表达情况
D．相比于多细胞混合测序，该技术可以揭示罕见的细胞类型
11．（2025·江苏·二模）与DNA相关的实验，下列叙述正确的有（ ）
A．利用DNA在酒精中溶解度较大的特性提取DNA
B．粗提取的DNA中可能含有蛋白质、脂质等杂质
C．用二苯胺试剂鉴定DNA时，沸水浴加热后呈蓝色
D．PCR扩增产物通常利用琼脂糖凝胶电泳技术进行鉴定
12．（2025·江苏南通·模拟预测）下列关于“提取”和“分离”的叙述，正确的是（　　）
A．提取叶绿素可以用无水乙醇、丙酮或无水乙醇与丙酮的混合物
B．提取DNA需同时兼顾DNA的完整性、纯度和含量
C．光合色素用不同的层析液可能会得到不同的色素排列顺序
D．DNA和蛋白质分离常采用琼脂糖凝胶电泳，但用的标准参照物是统一的
13．（2025·江苏·模拟预测）人鼠嵌合抗体是鼠源抗体的可变区（V区）与人源抗体的恒定区（C区）结合而成的抗体。下图1是抗体的示意图（H代表重链，L代表轻链），图2是制备抗肿瘤的人鼠嵌合抗体的部分过程。相关叙述正确的是（　　）
A．过程①从经免疫处理的小鼠脾中获取的B淋巴细胞都能产生特定抗体
B．过程③获得的VL、VH基因碱基序列与B淋巴细胞中的VL、VH基因碱基序列不同
C．过程④构建人鼠重组基因，其表达产物在人体内的免疫原性比鼠源性抗体低
D．过程⑥常采用农杆菌转化法将基因嵌合表达载体转入受体细胞
14．（2025·江苏盐城·模拟预测）如图表示花粉管通道法介导植物基因转移。下列说法正确的是（　　）
A．花粉管通道法可适用获得转基因扰虫棉花
B．外源DNA不需要构建基因表达载体，就能借助花粉管通道进入受体细胞并表达
C．必须在雌蕊成熟时才能进行图中所示的处理方法
D．相比于农杆菌转化法，花粉管通道法避免了植物组织培养这一操作
15．（2025·江苏淮安·二模）关于“DNA 片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法正确的是（　　）
A．根据 DNA 片段大小配置一定质量分数的琼脂糖溶液以便分离 DNA 分子
B．琼脂糖凝胶电泳中的缓冲液中含指示剂，其可以在紫外灯下被检测出来
C．实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理
D．扩增得到的 PCR 产物与凝胶载样缓冲液混匀后需缓慢注入加样孔以防样品飘散
16．（2025·江苏常州·三模）如图表示花粉管通道法介导植物基因转移。下列说法正确的是（　　）
A．花粉管通道法可适用获得转基因抗虫棉花
B．相比于农杆菌转化法，花粉管通道法避免了植物组织培养这一操作
C．必须在雌蕊成熟时才能进行图中所示的处理方法
D．外源DNA不需要构建基因表达载体，就能借助花粉管通道进入受体细胞并表达
三、解答题
17．（2025·江苏·三模）病毒诱导的基因沉默技术（VIGS）是利用病毒载体携带目的基因侵染植物细胞，在植物细胞中复制产生dsRNA（双链RNA），激活植物自身的基因沉默机制，降解植物目标mRNA的技术。叶用莴苣生长到一定时期极易抽薹（茎迅速生长），从而导致莴苣减质减产。研究表明LsMET1基因（甲基转移酶1基因）促进叶用莴苣抽薹，研究人员利用VIGS尝试使LsMET1基因沉默来验证该观点，主要操作如图。请回答下列问题。
(1)过程①反应体系中加入的物质除引物、原料、模板外，还有 ，下列四种引物中用于过程①的是 。
A．5'GAATTCATGA………………………3' B．5'CTTAAGTTAC………………………3'
C．5'CTGCAGTAGA………………………3' D．5'GACGTCATCT………………………3'
(2)过程②将环状DNA扩增为线性DNA的目的是 。
(3)在TRV1、TRV2质粒中插入双启动子目的是 。过程④将TRV1质粒和重组质粒导入农杆菌后，在培养基中应加入 进行筛选。
(4)导入植物细胞的CP-LsMET1-RZ基因转录后在 催化下，被剪切为CPRNA、LsMET1 RNA、RZRNA。LsMET1 RNA诱导内源LsMET1基因沉默的机制如图2，AGO1蛋白选择性降解3'端稳定性较低的一条链。据图分析，向农杆菌中导入TRV1质粒的目的是 ，激活的RISC有的能诱导LsMET1 mRNA降解，有的不能诱导LsMET1 mRNA降解，其原因是 。
(5)研究人员测定了LsMET1表达量和抽墓（茎生长）状况，结果如图3。该实验结果与预期是否一致，并说明理由。 。
18．（2025·江苏苏州·三模）我国科学家尝试构建地衣芽孢杆菌基因编辑系统，并通过将外源vgb基因定向插入19T-pflB质粒中对该系统进行初步验证，主要过程如图1。请回答下列问题。
(1)步骤①利用已构建的质粒19T-pflB，通过反向PCR获得左右同源片段，除图中已有的组分外，还应添加缓冲液（Mg2+）和 等。下表为pflB部分基因序列和设计的相关引物，可选用的引物是 （填编号）。根据不同的引物，需要重新设置PCR程序中的 。
DNA序列（虚线处省略了部分核苷酸序列）
pflB基因 5′-TCGCACACCTGACTACAATT……TCGCAATGGCAATCGGCAAACT-3′ 3′-AGCGTGTGGACTGATGTTAA……AGCGTTACCGTTAGCCGTTTGA-5'
PCR引物 ①5'ACGGGATCCTTGTAGTCAGGTGTGCGA3' ②5'ACGGGATCCTTTGCCGATTGCCATTGC3' ③5'AACTGCAGTCGCACACCTGACTACAA3' ④5'AACTGCAGGCAATGGCAATCGGCAAA3'
注：下划线标注的序列为限制酶识别序列。
(2)步骤②双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是 和 ，影响DNA连接酶反应速率的因素有反应体系的温度、pH、酶浓度和 等。
(3)图2是质粒PNZTK-PFTF-vgb转入地衣芽孢杆菌后，将目的基因插入基因组的过程示意图。
将受体菌接种在含四环素和 （含/不含）卡那霉素培养基中培养一段时间后，因没有选择压力，会导致发生双交换的质粒丢失。挑取一定数量的单菌落，接种到含四环素的培养基上，并一一对应接种到含卡那霉素的培养基上，实验结果如图3所示。其中在两种培养基均能生长的菌株是只发生单交换或 的受体菌。
(4)科学家通过分析vgb基因在重组菌株及原始菌株中的表达水平验证该基因编辑系统。分析时需要以rpsE基因（核糖体S5蛋白基因）为参照，该基因表达的特点是 ，可采用 的方法检测基因表达的产物量。
19．（2025·江苏·二模）人类血液中的纤维蛋白原是血液凝固的主要蛋白质成分，由Aα、Bβ和γ三条肽链组成，重组人纤维蛋白原（rFib）的开发有望消除血源性感染的风险。某科研团队欲通过培育转基因蚕并利用蚕茧高效生产人纤维蛋白原，流程如下图。请回答下列问题。

(1)纤维蛋白原的Aα、Bβ和γ链首先在 上合成，然后Aα和γ链在内质网中与Bβ链结合形成的六聚体Aα2Bβ2γ2，最后在 中加工修饰并分泌到细胞外。
(2)选取从人类肝脏的cDNA文库扩增目的基因的原因是 ；步骤①PCR条件如下：94℃，5min→25个循环（变性、退火、延伸）→72℃，7min，其中退火温度设置需参考引物中碱基的 ，延伸阶段使用ExTaqDNA聚合酶，该酶的作用有 和在扩增产物的3'端额外添加上一个碱基“A”。
(3)步骤②中，将Fib-Bβ插入到 （填“3'”或“5'”）端含有碱基T的克隆载体中，将克隆后的Fib-Bβ用 限制酶处理后通过DNA连接酶连接到表达载体上完成载体1的构建。载体2采用类似方法构建。
(4)步骤③分别将载体1和载体2注入胚盘期蚕卵中，在荧光体视显微镜下观察 在眼部的表达，显示阳性表达的即为转基因Bβ-蚕和转基因Aα/γ-蚕。对转基因蚕进行DNA杂交分析表明，Bβ-蚕和Aα/γ-蚕均存在多个转基因品系，这可能与插入的目的基因数量和 有关。
(5)丝胶蛋白启动子将重组纤维蛋白原链的cDNA定向表达在丝腺细胞中，然后依靠吐丝分泌到蚕茧中。科研人员对丝腺细胞中的mRNA进行检测并对蚕茧中的蛋白质进行分析，结果如下表。
组别 mRNA 蛋白质电泳条带
Aα链mRNA Bβ链mRNA γ链mRNA Aα Bβ γ
非转基因蚕（对照组） - - - - - -
转基因Bβ-蚕 - + - - - -
转基因Aα/γ-蚕 + - + + - +
转基因Aα/Bβ/γ-蚕 + + + + + +
注：“+”表示有，“-”表示无
根据实验结果推测， 可能是Bβ链分泌到蚕茧中的必要条件之一。
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