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第二节　纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得
第1课时　目标微生物的分离和纯化
知识点一　平板划线法和稀释涂布平板法
1.平板划线法接种酵母菌时，下列操作正确的是（　　）
A.每次划线时，接种环都需要蘸取菌液一次
B.划线分离时，需要把接种环深入到培养基中进行接种
C.在超净工作台上接种时要在酒精灯火焰旁进行
D.划线分离后将培养皿正放在恒温培养箱中培养
2.如图表示培养和分离X细菌的部分操作步骤，下列相关叙述正确的是（　　）
A.步骤①倒平板操作时，倒好后应立即将其倒过来放置
B.步骤②将接种环在火焰上灼烧后迅速蘸取菌液后进行平板划线
C.步骤③应多个方向划线，使菌种逐渐分散，培养后出现单菌落
D.步骤④培养箱培养后可用来对X细菌进行计数
3.稀释涂布平板法是分离菌种常用的方法，下列相关叙述不恰当的是（　　）
A.固体培养基灭菌后，应在其未凝固时倒平板
B.倒好的平板需立即使用，以免表面干燥，影响菌种的生长
C.平板涂布分离到的单菌落需进一步划线纯化，以利于菌种保藏
D.稀释涂布平板法可用于微生物的分离
4.若在固体培养基上用稀释涂布平板法培养细菌，看到的结果不可能是（　　）
5.如图所示为实验室使用某种接种方法在培养基上培养某种微生物的结果。下列说法正确的是（　　）
A.该图最可能是用稀释涂布平板法进行接种的
B.在操作时，为防止杂菌污染，需进行严格的消毒和灭菌
C.该种微生物有可能是H5N1病毒
D.该培养基上的菌落分布不均匀，代表纯化失败
6.在接种、培养并分离酵母菌实验中，划线接种（甲）、培养结果（乙）如图所示。下列有关叙述错误的是（　　）
A.接种前应对培养基进行高压蒸汽灭菌
B.连续划线的目的是获得单个细胞形成的菌落
C.接种过程中至少需要对接种环灼烧5次
D.图甲中a区域为划线的起始位置
知识点二　接种、培养并分离酵母菌
7.接种、培养并分离酵母菌最常用的方法是平板划线法或稀释涂布平板法。下列有关这两种方法的叙述，错误的是（　　）
A.均将酵母菌接种在固体培养基的表面
B.获得的每一个菌落均是由一个细菌繁殖而来的子细胞群
C.都应在酒精灯火焰附近操作，以防止杂菌污染
D.稀释分散菌种的原理不同，但均能达到纯化酵母菌的目的
8.下列有关分离酵母菌实验操作的叙述，错误的是（　　）
A.在第二区域内划线时，接种环上的菌种直接来源于菌液
B.第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物
C.每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上一次划线结束后接种环上残留的菌种
D.划线结束后，灼烧接种环能及时杀死接种环上的菌种，避免微生物污染环境和感染操作者
9.微生物的接种方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。下列关于两者区别的说法，正确的是（　　）
类别 平板划线法 稀释涂布平板法
① 需要接种环（灼烧灭菌） 需要涂布器（只需酒精消毒）
② 无需对菌液梯度稀释 对菌液系列梯度稀释
③ 能纯化微生物，不可计数 既能纯化微生物，又能计数
④ 最后的划线区域一定出现单菌落 稀释倍数足够大的菌液，涂布的平板才会出现单菌落
A.②④ B.③④
C.①④ D.②③
10.在培养基配制和微生物接种的过程中，确保无杂菌污染被称为无菌操作。图中符合无菌操作要求的有（　　）
①三角瓶口通过火焰，并在火焰旁将培养基倒入灭菌培养皿　②盛菌种的试管口在火焰上灼烧　③接种前灼烧接种环　④接种前培养皿在火焰上灼烧　⑤靠近火焰接种
A.①②③④ B.①②③⑤
C.①③④⑤ D.②③④⑤
11.鲸死亡后会沉入海底，俗称“鲸落”。“鲸落”后期会形成一个以厌氧菌和硫细菌等为主体的生态系统。厌氧菌以“鲸落”肌肉中的脂肪为食，同时产生硫化氢等一些硫化物。硫细菌将硫化物氧化成硫酸盐，并以该过程中释放的能量合成有机物。请回答相关问题：
（1）培养微生物的培养基中一般都会含有水、无机盐、氮源和碳源，培养“鲸落”群落中厌氧菌的碳源必须是　　　　　　。要培养硫细菌，培养基中的成分需要特殊配制，主要体现在　　　　　　　　　　　，这种培养基可以用来专一性培养硫细菌。
（2）在分离“鲸落”中的微生物时要制备固体培养基，在倒平板操作后，将平板倒置，这样做的目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
（3）若想得到“鲸落”中某目标菌种，可用平板划线法进行纯化。若下图甲是接种培养后的菌落分布图，对应的平板划线操作示意图为　　　　　。图甲中的③更易获得单菌落 ，判断依据是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
12.某研究小组从黄色短杆菌（能合成L-亮氨酸）中筛选L-亮氨酸缺陷型（不能合成L-亮氨酸）突变菌株，实验流程如图所示。回答下列问题：
（1）培养基灭菌常用的方法是　 　　　　　　。
（2）过程①的接种方法是　　　　　　　　　。过程②接种时，先将灭菌后的金丝绒与培养皿A中的菌落接触一次，然后像盖印章一样将菌种连续接种到培养皿B和C的培养基表面，这种接种方法便于将来比较培养皿B、C中菌落的差异，原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
（3）培养皿A、B、C中的培养基都要使用固体培养基，原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。若培养皿B的培养基中含有L-亮氨酸，培养皿C的培养基中不含L-亮氨酸，培养一段时间后菌落生长情况如图所示，研究人员应该从培养皿　　　（填“B”或“C”）中选取目的菌落。
第二节　纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得
第1课时　目标微生物的分离和纯化
1.C　划线分离时，菌液只蘸取一次，A错误；划线分离时，接种环在培养基表面进行划线操作，B错误；微生物培养的关键是无菌操作，在超净工作台上接种时，需要在酒精灯火焰旁进行，以防止空气中微生物的污染，C正确；划线分离结束后，培养皿应倒置于恒温培养箱中培养，D错误。
2.C　步骤①倒平板操作时，倒好后待平板冷却凝固，然后将其倒过来放置，A错误；步骤②将接种环在火焰上灼烧后冷却至室温再蘸取菌液进行平板划线，B错误；步骤④培养箱培养后可用来对X细菌进行分离纯化，得到单菌落，但不可用来计数，D错误。
3.B　倒好的平板需要冷却后使用，且不宜久存，以免表面干燥，影响接种后微生物的生长，B错误。
4.D　A、B、C选项的固体培养基上所形成的是一个个分布较为均匀的单菌落，是用稀释涂布平板法培养细菌得到的结果，D选项的固体培养基上所形成的菌落分布不均匀，应是用多次连续平行划线法培养细菌得到的结果。
5.B　题图最可能是用平板划线法进行接种的，A错误；病毒不能在培养基上生存繁殖，C错误；平板划线法，随划线次数的增加，菌落密度逐渐减小，因此分布不均匀，D错误。
6.D　菌液经过连续划线，菌液中的菌体越来越少，最后容易形成单菌落，B正确；在每次划线前后都要对接种环进行灭菌，因此按照图中划线顺序（d→c→b→a），整个划线过程中至少需要对接种环灼烧5次，C正确；每次划线的菌种均来自上一区域的末端，因此划线的起始区域菌落多，由图乙可知，图甲中d区域菌落多，为划线的起始位置，D错误。
7.B　用稀释涂布平板法时，如果稀释度不够，获得的单个菌落就可能是由多个酵母菌繁殖形成的，B错误。
8.A　在第二区域内划线时，接种环上的菌种直接来源于第一区域的划线末端，A错误；为避免杂菌的污染，第一步操作前需要灼烧接种环，B正确；每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上一次划线结束后接种环上残留的菌种，C正确；为避免微生物污染环境和感染操作者，划线结束后，灼烧接种环能及时杀死接种环上的菌种，D正确。
9.D　稀释涂布平板法中，用到的涂布器进行酒精浸泡消毒后要在涂布平板前进行灼烧灭菌，①错误；平板划线法不需要对菌液梯度稀释，稀释涂布平板法需要对菌液进行系列梯度稀释，②正确；平板划线法不能计算菌液中的活菌数，稀释涂布平板法可计算菌液中的活菌数，③正确；如果划线操作不规范，平板划线的最后划线区域也不一定出现单菌落，④错误。故选D。
10.B
11.（1）含碳有机物（或脂肪）　碳源必须是含碳无机物（或碳酸盐），同时加入硫化物　（2）防止培养皿皿盖上凝结的水珠落入培养皿造成污染　（3）丙　每次划线的菌种都来自上一次划线的末端，最后一次划线结束时更容易获得单菌落
解析：厌氧菌以“鲸落”肌肉中的脂肪为食，属于异养型微生物，故培养“鲸落”群落中厌氧菌的碳源必须是含碳有机物（或脂肪）。硫细菌将硫化物氧化成硫酸盐，并以该过程中释放的能量合成有机物，即硫细菌为自养型微生物，所以要培养硫细菌，培养基中的成分需要特殊配制，主要体现在碳源必须是含碳无机物（或碳酸盐），同时加入硫化物。
12.（1）高压蒸汽灭菌法　（2）稀释涂布平板法　培养皿B、C中的菌种接种位置相同　（3）便于观察菌落特征和分离目的菌株　B
解析：（2）根据过程①所得培养基中菌落的分布结果可以判断，该过程所采用的接种方法为稀释涂布平板法。先将灭菌后的金丝绒与培养皿A中的菌落接触一次，然后像盖印章一样将菌种连续接种到培养皿B和C的培养基表面，这种接种方法叫影印法，由于其不改变原有菌株在培养基中的位置，因而将来可比较培养皿B、C中菌落的差异。（3）为了便于观察菌落特征和分离目的菌株，培养皿A、B、C中的培养基都要使用固体培养基。在不含L-亮氨酸培养基中，突变菌株不能生长，而在含L-亮氨酸培养基中能够生长，因此培养皿B中的菌落中可挑选出突变菌株。
1 / 3第二节　纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得
第1课时　目标微生物的分离和纯化
导学 聚焦 1.概述分离和纯化微生物的平板划线法和稀释涂布平板法。 2.通过“接种、培养并分离酵母菌”的实验操作，掌握平板划线法和稀释涂布平板法，并能在其他微生物分离培养中进行实践应用
知识点（一）　采用划线或涂布的接种方法能够实现对目标微生物的分离和纯化
1.接种
（1）定义：指　　　　　　　　进入培养基质的过程。
（2）类型：分为自然接种和　　　　　　。
2.单菌落：在　　　　　培养基上采用　　　　　　　　　　　　的方法接种，通过培养获得的由　　　　　　　　分裂形成的、肉眼可见的、有一定形态构造的　　　　　　　　　　。
3.目标微生物分离和纯化的两种方法
4.判断下列相关表述的正误
（1）平板划线的方法有连续平行划线和扇形划线等多种方式。（　　）
（2）多次连续平行划线接种时，将培养皿旋转一定角度后，再次蘸取菌种，并沿上一次划线区域的末端开始划线。（　　）
（3）用稀释涂布平板法接种时，应先在火焰上使涂布器上的酒精燃尽，此时手持涂布器的部位应低于火焰。（　　）
（4）与平板划线法相比，稀释涂布平板法分散细菌得到单菌落的效果更好。（　　）
探讨　分析微生物的分离和纯化的原理
　某男性患者，发热伴寒战，入院进行血液、B超及CT检查，疑似肝脓肿。其中细菌性肝脓肿的主要病原菌是：大肠埃希菌、克雷伯菌、链球菌、金黄色葡萄球菌、厌氧菌等。近年来，克雷伯菌感染导致的细菌性肝脓肿患者比例有增高的趋势。为确定致病原因，需要进行细菌的培养及药敏实验检查病原体种类。下图是医院进行的两种不同的微生物纯化操作。请思考并回答以下问题：
（1）图A采用的哪种分离方法，该方法利用的接种工具是什么？
（2）医院采用图A所示方法分离患者体内的细菌时，接种环通过灼烧灭菌，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线。这样做的目的是什么？
（3）图B采用的哪种分离方法，如何获得10倍、100倍、1 000倍稀释液？
（4）如图表示的是某一适当稀释度的固体培养基表面长成的单菌落情况，判断某菌落是克雷伯菌的单菌落依据是什么？
1.多次连续平行划线法分离单菌落的原理
在进行第二次以及其后的划线操作时，要从上一次划线的末端开始划线。每次划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始划线，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的单菌落。
2.多次连续平行划线法中灼烧接种环的目的
1.微生物接种的方法很多，平板划线法是常用的一种。如图是平板划线示意图，划线的顺序为①②③④。下列相关叙述错误的是（　　）
A.划线操作时将蘸有菌液的接种环插入培养基
B.平板划线后培养微生物时要倒置培养
C.不能将第④次的划线与第①次的划线相连
D.在第②～④次划线前都要对接种环进行灭菌
2.图甲所示是稀释涂布平板法中的部分操作，图乙所示是平板划线法的操作结果。下列相关叙述错误的是（　　）
A.图甲中涂布前要将涂布器灼烧，冷却后才能涂布菌液
B.对于浓度较高的菌液，若图甲中的最高稀释倍数仅为102，则所得到的菌落不一定是由单个的细胞繁殖而成的
C.图乙所示培养皿中每个划线区域都可得到符合要求的菌落
D.图乙中连续划线的起点是上一次划线的末端（除第一次划线外）
知识点（二）　活动：接种、培养并分离酵母菌
　
1.目的要求
（1）用　　　　　　法或稀释涂布平板法接种酵母菌。
（2）用　　　　培养基大量扩增酵母菌。
2.方法步骤
（1）制作平板：先在培养皿　　　　做好标记，再向其中倒入未凝固的固体培养基。
（2）接种
①平板划线法：在用接种环蘸取菌液进行接种前，应在酒精灯火焰上从接种环的圆环处依次向上　　　　　　。为避免灭菌后接种环的高温烫死菌种，应在挑取菌种前将接种环贴在　　　　　　　　　上降温。
②稀释涂布平板法
a.在酒精灯旁涂布。
b.用无菌水对酵母菌菌液进行一定浓度的　　　　。
c.取0.1 mL的稀释菌液加入平板　　　　。
d.在使用蘸有酒精的涂布器对平板中的菌液进行涂布时，应先在火焰上使酒精燃烧尽。
③接种到液体培养基：在无菌条件下用接种环将菌液接种到液体培养基中，同时以　　　　　　　　的液体培养基作为对照。
（3）培养：在25 ℃下培养24 h。
（4）结果：获得单菌落后，可挑取菌落，并利用划线法接种至　　　　培养基中。
3.判断下列相关表述的正误
（1）用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上。（　　）
（2）用接种环取出菌种后需马上塞上装菌种试管的棉塞，然后再划线。（　　）
（3）用固体培养基更容易大量扩增酵母菌。（　　）
探讨　酵母菌培养过程的分析
　某生物兴趣小组进行了从中分离、纯化和扩大培养酵母菌的实验，分析回答下列问题：
（1）从土壤悬液中分离纯化酵母菌时，应选用固体培养基还是液体培养基？扩大培养时呢？
（2）如何判断固体培养基是否被杂菌污染？
（3）仅从菌落特征是否能够认定已分离出了酵母菌？怎么进行进一步鉴定？
（4）判断液体培养基中接种酵母菌成功的依据是什么？
1.下列关于接种、培养并分离酵母菌实验的相关叙述，错误的是（　　）
A.利用平板划线法接种酵母菌时，所用的接种环应先灼烧灭菌，待冷却后再进行接种
B.利用稀释涂布平板法接种酵母菌时，涂布器应先用酒精浸泡，灼烧灭菌并冷却后再进行涂布
C.将1 mL菌液加入90 mL无菌水中，可得到100倍稀释液
D.获得单菌落后，可继续挑取菌落利用划线法接种至试管斜面培养基中
2.灭菌和无菌操作是获得微生物纯培养物的基础，在接种、培养、分离酵母菌时，下列操作正确的是（　　）
A.用浸泡在75％酒精中的涂布器直接涂布
B.将接种后的培养皿倒置在恒温培养箱中培养酵母菌
C.为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落
D.倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上
　
　
（1）接种是指　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　，接种的方法有　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
（2）单菌落是在固体培养基上采用划线或稀释涂布的方法接种，通过培养能获得　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　。
（3）灼烧接种环之后要等其冷却后再进行划线的原因是什么？
（4）在进行多次连续平行划线操作时，在做第二次划线以及其后的操作时，总是从上一次划线的末端开始划线的原因是什么？
1.已知酸奶中的有益菌主要是乳酸菌，要进一步分离纯化乳酸菌采用下图所示的划线分离操作最容易得到单菌落的是（　　）
2.（2024·绍兴高二检测）下列有关平板划线法和稀释涂布平板法这两种方法共同点的叙述，正确的是（　　）
A.对接种工具进行灭菌的次数相同
B.接种工具都要先蘸上酒精再放在酒精灯火焰上灼烧灭菌
C.都可以用来计数微生物的数量
D.可以用相同成分的培养基
3.（2023·浙江1月选考19题）某同学想从泡菜汁中筛选耐高盐乳酸菌，进行了如下实验：取泡菜汁样品，划线接种于一定NaCl浓度梯度的培养基，经培养得到了单菌落。下列叙述正确的是（　　）
A.培养基pH需偏碱性
B.泡菜汁需多次稀释后才能划线接种
C.需在无氧条件下培养
D.分离得到的微生物均为乳酸菌
第二节　纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得
第1课时　目标微生物的分离和纯化
【核心要点·巧突破】
知识点（一）
自主学习
1.（1）微生物　（2）人工接种
2.固体　划线或稀释涂布　一个细胞　子细胞集团
3. 微生物　 连续平行　 扇形　 梯度稀释　 固体　 涂布器　 划线的尾部　 稀释度适当　 多次连续平行
4.（1）√
（2）×　提示：多次连续平行划线接种时，将培养皿旋转一定角度后，不需再次蘸取菌种，只需在上一次划线区域的末端直接开始划线即可。
（3）×　提示：手持涂布器的部位应高于火焰，以免酒精沿器具流下，烧伤手指。
（4）√
互动探究
　（1）提示：平板划线法，接种工具为接种环。
（2）提示：将聚集的菌体逐步稀释以便获得单菌落。
（3）提示：稀释涂布平板法。向1 mL菌液中加入9 mL无菌水，获得10倍稀释液；再取1 mL 10倍稀释液，加入9 mL无菌水，获得100倍稀释液；取1 mL的100倍稀释液加入9 mL无菌水获得1 000倍稀释液。
（4）提示：根据克雷伯菌菌落特有的形状、大小、颜色、边缘、表面光滑与否等特征进行确定。
学以致用
1.A　划线时不能将接种环插入培养基，而是在培养基表面划线，A错误；用平板培养基培养微生物时，为防止水蒸汽凝集滴入培养基造成干扰或污染，应将平板倒置培养，B正确；划线时要避免最后一次的划线与第一次的划线相连，否则有可能影响单个菌落的分离效果，C正确；在第②～④次划线前都要对接种环进行灼烧灭菌，保证每次划线的菌种都来自上一次划线的末端，D正确。
2.C　平板划线法中多次划线的目的是减少菌种数目，经过连续划线才有可能得到由单个细胞繁殖而成的单菌落，这种菌落才符合要求，C错误。
知识点（二）
自主学习
1.（1）平板划线　（2）液体
2.（1）底部　（2）①灼烧灭菌　培养容器内壁　②b.稀释　c.中央　③不接种菌液　（4）斜面
3.（1）√
（2）×　提示：用接种环取出菌种后需要灼烧瓶口后再塞上装菌种试管的棉塞。
（3）×　提示：用液体培养基更容易大量扩增酵母菌。
互动探究
　（1）提示：固体培养基。液体培养基。
（2）提示：培养未接种的培养基，观察是否有菌落生长；如果有，说明培养基被杂菌污染。
（3）提示：不能。可以利用生化实验和染色及显微镜观察来进一步鉴定。
（4）提示：和对照组相比，培养基变浑浊。
学以致用
1.C　得到100倍稀释液的方法为：将1 mL菌液加入9 mL无菌水中得到10倍稀释液，再取1 mL 10倍稀释液加入9 mL无菌水中，可得到100倍稀释液或将1 mL菌液加入99 mL无菌水中，可得到100倍稀释液，C错误。
2.B　将浸泡在75％酒精中的涂布器拿出后还需要经过灼烧灭菌及冷却才能涂布，A错误；将接种后的培养皿倒置在恒温培养箱中培养酵母菌，B正确；接种环经火焰灭菌之后还需要冷却才能挑取菌落，C错误；倒平板时，用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约10～20 mL）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖，D错误。
【过程评价·勤检测】
网络构建
　（1）微生物进入培养基质的过程　平板划线法和稀释涂布平板法
（2）由一个细胞分裂形成的、肉眼可见的、有一定形态构造的子细胞集团
（3）提示：避免接种环温度太高，杀死菌种。
（4）提示：划线末端含有的细菌数目较少，每次从上一次划线的末端开始划线能够使细菌的数目随划线次数的增加而逐渐减少，最终分散成单个菌落。
课堂演练
1.B　A图连续平行划线不容易得到单菌落；B图下一次划线从上一次划线末端开始，可以使菌种稀释分散，容易得到单菌落；C图划线没有从上次划线的末端开始，不能得到单菌落；D图划线不都是从上次划线末端开始，一般不能得到单菌落。
2.D　接种环需要多次划线，每次划线开始和结尾均需要灭菌，涂布器只需开始和结尾灭菌即可，A错误；涂布器需要先进行酒精浸泡再放在酒精灯火焰上进行灼烧灭菌，接种环不需要蘸上酒精，B错误；平板划线法不能用于计数，C错误。
3.C　因为乳酸菌经过厌氧呼吸产生乳酸，故其生活的环境是酸性，培养基pH需偏酸性，A错误；平板划线接种时不需要稀释，B错误；乳酸菌是厌氧型微生物，所以需在无氧条件下培养，C正确；参与泡菜发酵的微生物有植物乳杆菌、短乳杆菌和明串珠菌等，所以分离得到的微生物除了乳酸菌，还会有其他耐高盐的微生物，D错误。
2 / 2(共66张PPT)
第1课时
目标微生物的分离和纯化
导
学 聚
焦 1.概述分离和纯化微生物的平板划线法和稀释涂布平板法。
2.通过“接种、培养并分离酵母菌”的实验操作，掌握平板划
线法和稀释涂布平板法，并能在其他微生物分离培养中进行实
践应用
核心要点·巧突破
01
过程评价·勤检测
02
课时训练·提素能
03
目录
CONTENTS
核心要点·巧突破
01
精准出击 高效学习
知识点（一）　采用划线或涂布的接种方法能够实现对目标微生物的
分离和纯化
1. 接种
（1）定义：指 进入培养基质的过程。
（2）类型：分为自然接种和 。
微生物　
人工接种　
2. 单菌落：在 培养基上采用 的方法接
种，通过培养获得的由 分裂形成的、肉眼可见的、有
一定形态构造的 。
固体　
划线或稀释涂布　
一个细胞　
子细胞集团　
3. 目标微生物分离和纯化的两种方法
4. 判断下列相关表述的正误
（1）平板划线的方法有连续平行划线和扇形划线等多种方式。
（　√　）
（2）多次连续平行划线接种时，将培养皿旋转一定角度后，再次
蘸取菌种，并沿上一次划线区域的末端开始划线。
（　×　）
提示：多次连续平行划线接种时，将培养皿旋转一定角度
后，不需再次蘸取菌种，只需在上一次划线区域的末端直接
开始划线即可。
√
×
（3）用稀释涂布平板法接种时，应先在火焰上使涂布器上的酒精
燃尽，此时手持涂布器的部位应低于火焰。 （　×　）
提示：手持涂布器的部位应高于火焰，以免酒精沿器具流
下，烧伤手指。
（4）与平板划线法相比，稀释涂布平板法分散细菌得到单菌落的
效果更好。 （　√　）
×
√
探讨　分析微生物的分离和纯化的原理
　某男性患者，发热伴寒战，入院进行血液、B超及CT检查，疑似肝
脓肿。其中细菌性肝脓肿的主要病原菌是：大肠埃希菌、克雷伯菌、
链球菌、金黄色葡萄球菌、厌氧菌等。近年来，克雷伯菌感染导致的
细菌性肝脓肿患者比例有增高的趋势。为确定致病原因，需要进行细
菌的培养及药敏实验检查病原体种类。下图是医院进行的两种不同的
微生物纯化操作。请思考并回答以下问题：
（1）图A采用的哪种分离方法，该方法利用的接种工具是什么？
提示：平板划线法，接种工具为接种环。
（2）医院采用图A所示方法分离患者体内的细菌时，接种环通过灼烧
灭菌，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划
线。这样做的目的是什么？
提示：将聚集的菌体逐步稀释以便获得单菌落。
（3）图B采用的哪种分离方法，如何获得10倍、100倍、1 000倍
稀释液？
提示：稀释涂布平板法。向1 mL菌液中加入9 mL无菌水，获得
10倍稀释液；再取1 mL 10倍稀释液，加入9 mL无菌水，获得
100倍稀释液；取1 mL的100倍稀释液加入9 mL无菌水获得1 000
倍稀释液。
（4）如图表示的是某一适当稀释度的固体培养基表面长成的单菌落
情况，判断某菌落是克雷伯菌的单菌落依据是什么？
提示：根据克雷伯菌菌落特有的形状、大小、颜色、边缘、表
面光滑与否等特征进行确定。
1. 多次连续平行划线法分离单菌落的原理
在进行第二次以及其后的划线操作时，要从上一次划线的末端开始
划线。每次划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次
从上一次划线的末端开始划线，能使细菌的数目随着划线次数的增
加而逐渐减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的单菌落。
2. 多次连续平行划线法中灼烧接种环的目的
1. 微生物接种的方法很多，平板划线法是常用的一种。如图是平板划
线示意图，划线的顺序为①②③④。下列相关叙述错误的是（　）
A. 划线操作时将蘸有菌液的接种环插入培养基
B. 平板划线后培养微生物时要倒置培养
C. 不能将第④次的划线与第①次的划线相连
D. 在第②～④次划线前都要对接种环进行灭菌
解析：　划线时不能将接种环插入培养基，而是在培养基表面划
线，A错误；用平板培养基培养微生物时，为防止水蒸汽凝集滴入
培养基造成干扰或污染，应将平板倒置培养，B正确；划线时要避
免最后一次的划线与第一次的划线相连，否则有可能影响单个菌落
的分离效果，C正确；在第②～④次划线前都要对接种环进行灼烧
灭菌，保证每次划线的菌种都来自上一次划线的末端，D正确。
2. 图甲所示是稀释涂布平板法中的部分操作，图乙所示是平板划线法的操作结果。下列相关叙述错误的是（　）
A. 图甲中涂布前要将涂布器灼烧，冷却后才能涂布菌液
B. 对于浓度较高的菌液，若图甲中的最高稀释倍数仅为102，则所得
到的菌落不一定是由单个的细胞繁殖而成的
C. 图乙所示培养皿中每个划线区域都可得到符合要求的菌落
D. 图乙中连续划线的起点是上一次划线的末端（除第一次划线外）
解析：　平板划线法中多次划线的目的是减少菌种数目，经过连
续划线才有可能得到由单个细胞繁殖而成的单菌落，这种菌落才符
合要求，C错误。
知识点（二）　活动：接种、培养并分离酵母菌
1. 目的要求
（1）用 法或稀释涂布平板法接种酵母菌。
（2）用 培养基大量扩增酵母菌。
2. 方法步骤
（1）制作平板：先在培养皿 做好标记，再向其中倒入未
凝固的固体培养基。
平板划线　
液体　
底部　
①平板划线法：在用接种环蘸取菌液进行接种前，应在酒精
灯火焰上从接种环的圆环处依次向上 。为避免
灭菌后接种环的高温烫死菌种，应在挑取菌种前将接种环贴
在 上降温。
灼烧灭菌　
培养容器内壁　
（2）接种
a.在酒精灯旁涂布。
b.用无菌水对酵母菌菌液进行一定浓度的 。
c.取0.1 mL的稀释菌液加入平板 。
d.在使用蘸有酒精的涂布器对平板中的菌液进行涂布时，应
先在火焰上使酒精燃烧尽。
③接种到液体培养基：在无菌条件下用接种环将菌液接种
到液体培养基中，同时以 的液体培养基作
为对照。
稀释　
中央　
不接种菌液　
②稀释涂布平板法
（3）培养：在25 ℃下培养24 h。
（4）结果：获得单菌落后，可挑取菌落，并利用划线法接种
至 培养基中。
斜面　
3. 判断下列相关表述的正误
（1）用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上。
（　√　）
（2）用接种环取出菌种后需马上塞上装菌种试管的棉塞，然后再
划线。 （　×　）
提示：用接种环取出菌种后需要灼烧瓶口后再塞上装菌种试
管的棉塞。
（3）用固体培养基更容易大量扩增酵母菌。 （　×　）
提示：用液体培养基更容易大量扩增酵母菌。
√
×
×
探讨　酵母菌培养过程的分析
　某生物兴趣小组进行了从中分离、纯化和扩大培养酵母菌的实验，
分析回答下列问题：
（1）从土壤悬液中分离纯化酵母菌时，应选用固体培养基还是液体
培养基？扩大培养时呢？
提示：固体培养基。液体培养基。
（2）如何判断固体培养基是否被杂菌污染？
提示：培养未接种的培养基，观察是否有菌落生长；如果有，
说明培养基被杂菌污染。
（3）仅从菌落特征是否能够认定已分离出了酵母菌？怎么进行进一
步鉴定？
提示：不能。可以利用生化实验和染色及显微镜观察来进一步
鉴定。
（4）判断液体培养基中接种酵母菌成功的依据是什么？
提示：和对照组相比，培养基变浑浊。
1. 下列关于接种、培养并分离酵母菌实验的相关叙述，错误的是（　）
A. 利用平板划线法接种酵母菌时，所用的接种环应先灼烧灭菌，待
冷却后再进行接种
B. 利用稀释涂布平板法接种酵母菌时，涂布器应先用酒精浸泡，灼
烧灭菌并冷却后再进行涂布
C. 将1 mL菌液加入90 mL无菌水中，可得到100倍稀释液
D. 获得单菌落后，可继续挑取菌落利用划线法接种至试管斜面培养
基中
解析：　得到100倍稀释液的方法为：将1 mL菌液加入9 mL无菌
水中得到10倍稀释液，再取1 mL 10倍稀释液加入9 mL无菌水中，
可得到100倍稀释液或将1 mL菌液加入99 mL无菌水中，可得到100
倍稀释液，C错误。
2. 灭菌和无菌操作是获得微生物纯培养物的基础，在接种、培养、分
离酵母菌时，下列操作正确的是（　　）
A. 用浸泡在75％酒精中的涂布器直接涂布
B. 将接种后的培养皿倒置在恒温培养箱中培养酵母菌
C. 为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落
D. 倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上
解析：　将浸泡在75％酒精中的涂布器拿出后还需要经过灼烧灭
菌及冷却才能涂布，A错误；将接种后的培养皿倒置在恒温培养箱
中培养酵母菌，B正确；接种环经火焰灭菌之后还需要冷却才能挑
取菌落，C错误；倒平板时，用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口
的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约10～20 mL）倒入培养皿，
左手立即盖上培养皿的皿盖，D错误。
过程评价·勤检测
02
反馈效果 筑牢基础
（1）接种是指 ，接种的方法有
。
（2）单菌落是在固体培养基上采用划线或稀释涂布的方法接种，通
过培养能获得
。
（3）灼烧接种环之后要等其冷却后再进行划线的原因是什么？
提示：避免接种环温度太高，杀死菌种。
微生物进入培养基质的过程　
平
板划线法和稀释涂布平板法　
由一个细胞分裂形成的、肉眼可见的、有一定
形态构造的子细胞集团　
（4）在进行多次连续平行划线操作时，在做第二次划线以及其后的
操作时，总是从上一次划线的末端开始划线的原因是什么？
提示：划线末端含有的细菌数目较少，每次从上一次划线的末
端开始划线能够使细菌的数目随划线次数的增加而逐渐减少，
最终分散成单个菌落。
1. 已知酸奶中的有益菌主要是乳酸菌，要进一步分离纯化乳酸菌采用
下图所示的划线分离操作最容易得到单菌落的是（　　）
解析：　A图连续平行划线不容易得到单菌落；B图下一次划线
从上一次划线末端开始，可以使菌种稀释分散，容易得到单菌落；
C图划线没有从上次划线的末端开始，不能得到单菌落；D图划线
不都是从上次划线末端开始，一般不能得到单菌落。
2. （2024·绍兴高二检测）下列有关平板划线法和稀释涂布平板法这
两种方法共同点的叙述，正确的是（　　）
A. 对接种工具进行灭菌的次数相同
B. 接种工具都要先蘸上酒精再放在酒精灯火焰上灼烧灭菌
C. 都可以用来计数微生物的数量
D. 可以用相同成分的培养基
解析：　接种环需要多次划线，每次划线开始和结尾均需要灭
菌，涂布器只需开始和结尾灭菌即可，A错误；涂布器需要先进行
酒精浸泡再放在酒精灯火焰上进行灼烧灭菌，接种环不需要蘸上酒
精，B错误；平板划线法不能用于计数，C错误。
3. （2023·浙江1月选考19题）某同学想从泡菜汁中筛选耐高盐乳酸
菌，进行了如下实验：取泡菜汁样品，划线接种于一定NaCl浓度
梯度的培养基，经培养得到了单菌落。下列叙述正确的是（　　）
A. 培养基pH需偏碱性
B. 泡菜汁需多次稀释后才能划线接种
C. 需在无氧条件下培养
D. 分离得到的微生物均为乳酸菌
解析：　因为乳酸菌经过厌氧呼吸产生乳酸，故其生活的环境是
酸性，培养基pH需偏酸性，A错误；平板划线接种时不需要稀释，
B错误；乳酸菌是厌氧型微生物，所以需在无氧条件下培养，C正
确；参与泡菜发酵的微生物有植物乳杆菌、短乳杆菌和明串珠菌
等，所以分离得到的微生物除了乳酸菌，还会有其他耐高盐的微生
物，D错误。
课时训练·提素能
03
分级练习 巩固提升
知识点一　平板划线法和稀释涂布平板法
1. 平板划线法接种酵母菌时，下列操作正确的是（　　）
A. 每次划线时，接种环都需要蘸取菌液一次
B. 划线分离时，需要把接种环深入到培养基中进行接种
C. 在超净工作台上接种时要在酒精灯火焰旁进行
D. 划线分离后将培养皿正放在恒温培养箱中培养
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解析：　划线分离时，菌液只蘸取一次，A错误；划线分离时，
接种环在培养基表面进行划线操作，B错误；微生物培养的关键是
无菌操作，在超净工作台上接种时，需要在酒精灯火焰旁进行，以
防止空气中微生物的污染，C正确；划线分离结束后，培养皿应倒
置于恒温培养箱中培养，D错误。
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2. 如图表示培养和分离X细菌的部分操作步骤，下列相关叙述正确的
是（　　）
A. 步骤①倒平板操作时，倒好后应立即将其倒过来放置
B. 步骤②将接种环在火焰上灼烧后迅速蘸取菌液后进行平板划线
C. 步骤③应多个方向划线，使菌种逐渐分散，培养后出现单菌落
D. 步骤④培养箱培养后可用来对X细菌进行计数
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解析：　步骤①倒平板操作时，倒好后待平板冷却凝固，然后将
其倒过来放置，A错误；步骤②将接种环在火焰上灼烧后冷却至室
温再蘸取菌液进行平板划线，B错误；步骤④培养箱培养后可用来
对X细菌进行分离纯化，得到单菌落，但不可用来计数，D错误。
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3. 稀释涂布平板法是分离菌种常用的方法，下列相关叙述不恰当的是
（　　）
A. 固体培养基灭菌后，应在其未凝固时倒平板
B. 倒好的平板需立即使用，以免表面干燥，影响菌种的生长
C. 平板涂布分离到的单菌落需进一步划线纯化，以利于菌种保藏
D. 稀释涂布平板法可用于微生物的分离
解析：　倒好的平板需要冷却后使用，且不宜久存，以免表面干
燥，影响接种后微生物的生长，B错误。
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4. 若在固体培养基上用稀释涂布平板法培养细菌，看到的结果不可能
是（　　）
解析：　A、B、C选项的固体培养基上所形成的是一个个分布较
为均匀的单菌落，是用稀释涂布平板法培养细菌得到的结果，D选
项的固体培养基上所形成的菌落分布不均匀，应是用多次连续平行
划线法培养细菌得到的结果。
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5. 如图所示为实验室使用某种接种方法在培养基上培养某种微生物的
结果。下列说法正确的是（　　）
A. 该图最可能是用稀释涂布平板法进行接种的
B. 在操作时，为防止杂菌污染，需进行严格的消毒和灭菌
C. 该种微生物有可能是H5N1病毒
D. 该培养基上的菌落分布不均匀，代表纯化失败
解析：　题图最可能是用平板划线法进行接种的，A错误；病毒
不能在培养基上生存繁殖，C错误；平板划线法，随划线次数的增
加，菌落密度逐渐减小，因此分布不均匀，D错误。
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6. 在接种、培养并分离酵母菌实验中，划线接种（甲）、培养结果
（乙）如图所示。下列有关叙述错误的是（　　）
A. 接种前应对培养基进行高压蒸汽灭菌
B. 连续划线的目的是获得单个细胞形成的菌落
C. 接种过程中至少需要对接种环灼烧5次
D. 图甲中a区域为划线的起始位置
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解析：　菌液经过连续划线，菌液中的菌体越来越少，最后容易
形成单菌落，B正确；在每次划线前后都要对接种环进行灭菌，因
此按照图中划线顺序（d→c→b→a），整个划线过程中至少需要对
接种环灼烧5次，C正确；每次划线的菌种均来自上一区域的末
端，因此划线的起始区域菌落多，由图乙可知，图甲中d区域菌落
多，为划线的起始位置，D错误。
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知识点二　接种、培养并分离酵母菌
7. 接种、培养并分离酵母菌最常用的方法是平板划线法或稀释涂布平
板法。下列有关这两种方法的叙述，错误的是（　　）
A. 均将酵母菌接种在固体培养基的表面
B. 获得的每一个菌落均是由一个细菌繁殖而来的子细胞群
C. 都应在酒精灯火焰附近操作，以防止杂菌污染
D. 稀释分散菌种的原理不同，但均能达到纯化酵母菌的目的
解析：　用稀释涂布平板法时，如果稀释度不够，获得的单个菌
落就可能是由多个酵母菌繁殖形成的，B错误。
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8. 下列有关分离酵母菌实验操作的叙述，错误的是（　　）
A. 在第二区域内划线时，接种环上的菌种直接来源于菌液
B. 第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培
养物
C. 每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上一次划线结束后接种环上
残留的菌种
D. 划线结束后，灼烧接种环能及时杀死接种环上的菌种，避免微生
物污染环境和感染操作者
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解析：　在第二区域内划线时，接种环上的菌种直接来源于第一
区域的划线末端，A错误；为避免杂菌的污染，第一步操作前需要
灼烧接种环，B正确；每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上一次
划线结束后接种环上残留的菌种，C正确；为避免微生物污染环境
和感染操作者，划线结束后，灼烧接种环能及时杀死接种环上的菌
种，D正确。
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9. 微生物的接种方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。下列
关于两者区别的说法，正确的是（　　）
类别 平板划线法 稀释涂布平板法
① 需要接种环（灼烧灭菌） 需要涂布器（只需酒精消毒）
② 无需对菌液梯度稀释 对菌液系列梯度稀释
③ 能纯化微生物，不可计数 既能纯化微生物，又能计数
④ 最后的划线区域一定出现单菌落 稀释倍数足够大的菌液，涂布的平
板才会出现单菌落
A. ②④ B. ③④
C. ①④ D. ②③
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解析：　稀释涂布平板法中，用到的涂布器进行酒精浸泡消毒后
要在涂布平板前进行灼烧灭菌，①错误；平板划线法不需要对菌液
梯度稀释，稀释涂布平板法需要对菌液进行系列梯度稀释，②正
确；平板划线法不能计算菌液中的活菌数，稀释涂布平板法可计算
菌液中的活菌数，③正确；如果划线操作不规范，平板划线的最后
划线区域也不一定出现单菌落，④错误。故选D。
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10. 在培养基配制和微生物接种的过程中，确保无杂菌污染被称为无
菌操作。图中符合无菌操作要求的有（　　）
①三角瓶口通过火焰，并在火焰旁将培养基倒入灭菌培养皿　②
盛菌种的试管口在火焰上灼烧　③接种前灼烧接种环　④接种前
培养皿在火焰上灼烧　⑤靠近火焰接种
A. ①②③④ B. ①②③⑤
C. ①③④⑤ D. ②③④⑤
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11. 鲸死亡后会沉入海底，俗称“鲸落”。“鲸落”后期会形成一个
以厌氧菌和硫细菌等为主体的生态系统。厌氧菌以“鲸落”肌肉
中的脂肪为食，同时产生硫化氢等一些硫化物。硫细菌将硫化物
氧化成硫酸盐，并以该过程中释放的能量合成有机物。请回答相
关问题：
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（1）培养微生物的培养基中一般都会含有水、无机盐、氮源和碳
源，培养“鲸落”群落中厌氧菌的碳源必须是
。要培养硫细菌，培养基中的成分需要特殊配
制，主要体现在
，这种培养基可以用来专一性培养硫细菌。
（2）在分离“鲸落”中的微生物时要制备固体培养基，在倒平板
操作后，将平板倒置，这样做的目的是
。
含碳有机物
（或脂肪）　
碳源必须是含碳无机物（或碳酸盐），同
时加入硫化物　
防止培养皿皿盖上
凝结的水珠落入培养皿造成污染　
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（3）若想得到“鲸落”中某目标菌种，可用平板划线法进行纯
化。若下图甲是接种培养后的菌落分布图，对应的平板划线
操作示意图为 。图甲中的③更易获得单菌落 ，判断依据
是
。
丙　
每次划线的菌种都来自上一次划线的末端，最后一次划
线结束时更容易获得单菌落　
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解析：厌氧菌以“鲸落”肌肉中的脂肪为食，属于异养型微
生物，故培养“鲸落”群落中厌氧菌的碳源必须是含碳有机
物（或脂肪）。硫细菌将硫化物氧化成硫酸盐，并以该过程
中释放的能量合成有机物，即硫细菌为自养型微生物，所以
要培养硫细菌，培养基中的成分需要特殊配制，主要体现在
碳源必须是含碳无机物（或碳酸盐），同时加入硫化物。
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12. 某研究小组从黄色短杆菌（能合成L-亮氨酸）中筛选L-亮氨酸缺
陷型（不能合成L-亮氨酸）突变菌株，实验流程如图所示。回答
下列问题：
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（2）过程①的接种方法是 。过程②接种时，先
将灭菌后的金丝绒与培养皿A中的菌落接触一次，然后像盖
印章一样将菌种连续接种到培养皿B和C的培养基表面，这
种接种方法便于将来比较培养皿B、C中菌落的差异，原因
是 。
（1）培养基灭菌常用的方法是 。
高压蒸汽灭菌法　
稀释涂布平板法　
培养皿B、C中的菌种接种位置相同　
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解析：根据过程①所得培养基中菌落的分布结果可以判断，该过程所采用的接种方法为稀释涂布平板法。先将灭菌后的金丝绒与培养皿A中的菌落接触一次，然后像盖印章一样将菌种连续接种到培养皿B和C的培养基表面，这种接种方法叫影印法，由于其不改变原有菌株在培养基中的位置，因而将来可比较培养皿B、C中菌落的差异。
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（3）培养皿A、B、C中的培养基都要使用固体培养基，原因
是 。若培养皿B的培养
基中含有L-亮氨酸，培养皿C的培养基中不含L-亮氨酸，培
养一段时间后菌落生长情况如图所示，研究人员应该从培养
皿 （填“B”或“C”）中选取目的菌落。
便于观察菌落特征和分离目的菌株　
B　
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解析：为了便于观察菌落特征和分离目的菌株，培养皿A、B、C中的培养基都要使用固体培养基。在不含L-亮氨酸培养基中，突变菌株不能生长，而在含L-亮氨酸培养基中能够生长，因此培养皿B中的菌落中可挑选出突变菌株。
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