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第2课时　基因工程的一系列操作可使生物获得新的遗传特性（一）
知识点一　获取目的基因的方法
1.mRNA上的起始密码子编码甲硫氨酸，与之相对应的DNA片段位于（　　）
A.基因编码区上游的非编码区中
B.基因编码区上游的外显子中
C.基因非编码区的启动子中
D.基因编码区末端的内含子中
2.（2024·嘉兴高二月考）建立基因文库是获取目的基因的方法之一，下列关于基因文库的说法，正确的是（　　）
A.构建基因文库需要将基因导入微生物细胞，形成克隆
B.基因文库的构建不需要限制酶和DNA连接酶
C.基因组文库含有该生物的大部分基因
D.部分基因文库就是cDNA文库
3.（2024·绍兴高二期中）PCR过程的特异性主要取决于（　　）
A.DNA聚合酶的种类
B.反应体系中模板DNA的量
C.引物的碱基序列特异性
D.dNTP的浓度
4.下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是（　　）
A.二者子链的延伸方向相同，均为5'端→3'端
B.二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋
C.体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量
D.二者遵循的碱基互补配对原则相同
5.（2024·绍兴高二期中）利用PCR技术将某DNA分子扩增n代的过程中，下列叙述错误的是（　　）
A.引物越短，PCR扩增的非目标DNA就越多
B.共有（2n－1）对引物参与子代DNA分子的合成
C.引物中G—C含量越高，退火温度越高
D.适温延伸过程中，需要提供ATP
知识点二　PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定
6.（2024·浙江杭州期中）下列有关PCR的叙述，错误的是（　　）
A.退火温度和延伸时间均与引物有关
B.常用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物
C.PCR时需加入DNA聚合酶和解旋酶
D.可用细胞的基因组DNA作为模板
7.（2024·浙江杭州高二期末）下列有关电泳的叙述，不正确的是（　　）
A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B.待测样品中各种分子的形状、大小及带电性质的差异等会影响其在电泳中的迁移速度
C.进行电泳时，带电粒子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D.常用的电泳方法是琼脂糖凝胶电泳
8.在基因工程操作中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶（R1和R2）处理基因载体，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图所示。下列相关叙述不正确的是（　　）
A.该载体最可能为环状DNA分子
B.两种限制酶在载体上各有一个酶切位点
C.限制酶R1与R2的切点最短相距约200 bp
D.限制酶作用于位点会导致氢键和肽键断裂
9.（2024·杭州高二期中）下列关于PCR技术的叙述，正确的是（　　）
A.PCR技术所用的耐高温的Taq DNA聚合酶，其最适温度是95 ℃
B.一个DNA片段经PCR扩增n次后需2n个引物
C.在第2轮循环产物中开始出现目标DNA片段
D.一个DNA片段经PCR扩增n次后含目标DNA片段2n－2n个
　（2024·浙江温州乐清市知临中学月考）阅读下列材料，完成10～11小题。
　　产肠毒素大肠杆菌（ETEC）能引起幼畜发生急性严重腹泻，其直接致病因子为肠毒素，包括热不稳定肠毒素（LT）和热稳定肠毒素（ST）两种。LT由两类功能性亚单位（LTA、LTB）组成，其中LTB具有免疫原性；ST包括ST1、ST2两个亚型，均为小分子多肽，免疫原性弱，构建ST1基因与LTB基因的融合表达质粒，使其表达的ST1具有免疫原性，为研制抗毒素疫苗做好上游工作。
10.从ETEC中扩增得到LTB和ST1两个基因片段，并设计引物：P1、P2为扩增LTB基因序列的引物，P3、P4为扩增ST1基因序列的引物。其中P2、P3中的部分是人工合成能互补的Linker（连接基团）。制备LTB-ST1融合基因的过程如下图所示。
下列叙述错误的是（　　）
A.PCR1和PCR2通常在一个反应体系中同时进行
B.设计引物时，应该将Linker添加在P2、P3的5'端
C.获得①中的两条链至少经过2轮PCR1和PCR2
D.①→②过程利用Linker获得的融合基因不需要DNA连接酶
11.通过融合PCR获得LTB-ST1融合序列，该PCR需分两个阶段进行，过程如图所示。阶段一的PCR产物可通过电泳鉴定，用荧光染料对LTB的PCR产物进行标记后电泳，得到以下结果，除了目标条带外还有许多非特异性扩增条带，原因不可能是（　　）
A.引物长度太短 B.退火温度过高
C.模板被污染 D.循环次数过多
12.1985年，穆里斯等人发明了PCR技术。请回答有关问题：
（1）若要使用PCR扩增目的基因，则需要在反应体系中添加的物质有4种脱氧核苷三磷酸、引物、模板和　　　　　　　　　　　　，其中引物的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
（2）PCR中每次循环的步骤依次是　　　　　　　　　　　　。PCR的产物常用琼脂糖凝胶电泳来鉴定，在凝胶中DNA分子的迁移速率与　　　　　　　　　　　　　　　等因素有关。
（3）利用PCR技术可以从苏云金芽孢杆菌DNA分子中扩增出Bt基因，原因是　　　　　　　　　　　　，至少需要　　　　轮循环才能得到只含有Bt基因的片段，经过5轮复制，需要引物　　　　个，其中只含有Bt基因的片段占总DNA片段的比例为　　　　。
13.如图是利用PCR技术和电泳技术进行的某一次亲子鉴定结果图谱，请根据图谱和所学知识回答下列问题：
（1）PCR技术能把某一DNA分子片段进行扩增。它是利用了DNA的　　　　　　原理，通过控制　　　　来控制DNA双链　　　　与结合。
（2）利用PCR技术扩增DNA的过程中还需要　　　　　　　酶的作用，但它必须在相应的　　　　的作用下才能完成对DNA的复制。假设有一段DNA序列为：
5'—GTTAACCTTAG—3'
3'—CAATTGGAATC—5'
所用引物Ⅰ为5'—GTTA—OH，则引物Ⅱ为　　　　　　　　　　　　。
（3）图①是含有21个氨基酸的多肽水解得到的氨基酸混合物电泳的结果，故可推知该多肽由　　　　种氨基酸构成。
（4）图②为某小孩和其母亲，以及待测定的四位男性的DNA，分别由酶处理后，生成若干DNA片段，并进行扩增，然后进行电泳所得到的一组DNA指纹图谱，请分析F1～F4中，你认为　　　　是该小孩真正生物学意义上的父亲。为什么？　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
第2课时　基因工程的一系列操作可使生物获得新的遗传特性（一）
1.B　mRNA是基因编码区转录形成的，真核细胞基因编码区由多个外显子和内含子相隔构成，转录初始形成的RNA需要将内含子转录的部分剪切掉，然后再将外显子转录的部分连接起来形成成熟的mRNA，因此与mRNA上的起始密码子相对应的DNA片段位于基因编码区上游的外显子中，B正确。
2.A　构建基因文库需要限制酶和DNA连接酶，B错误；基因组文库含有该生物的全部基因，C错误；cDNA文库是部分基因文库中的一种，D错误。
3.C　引物决定了PCR过程中复制的特定DNA序列区间，即引物的碱基序列特异性决定了PCR过程的特异性。
4.B　DNA体内复制与利用PCR技术扩增DNA时，子链的延伸方向相同，均为5'端→3'端，A正确；PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，在高温条件下氢键断裂，B错误；DNA体内复制与利用PCR扩增DNA时都需要能量，但两者所需能量来源不同，C正确；DNA体内复制与利用PCR扩增DNA时，遵循的碱基互补配对原则相同，D正确。
5.D　引物越短，其特异性越低，引物与非目标DNA结合的可能性越大，因此PCR扩增的非目标DNA就越多，A正确；PCR技术的原理是DNA复制，根据DNA分子半保留复制的特点可知，共有（2n－1）对引物参与子代DNA分子的合成，B正确；退火表示引物与模板相连，由于G—C之间有三个氢键，A—T之间有两个氢键，所以G—C含量越高的引物，退火温度越高，C正确；适温延伸过程中，由dNTP水解磷酸提供能量，不需要提供ATP，D错误。
6.C　PCR的一次循环包括变性、退火和延伸三个过程，退火温度（使引物结合到互补链DNA上）和延伸时间（从引物3'的合成子链）均与引物有关，A正确；PCR的产物常用琼脂糖凝胶电泳来鉴定，在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象有关，B正确；PCR技术中，DNA解旋是在高温下实现的，不需要加入解旋酶，C错误；PCR是一项体外扩增DNA的技术，可用细胞的基因组DNA作为模板，实现目的基因的快速扩增，D正确。
7.C　进行电泳时，带电粒子会向着与其所带电荷相反的电极移动，C错误。
8.D　由题图可知，当仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一种长度的DNA片段，因此该载体最有可能为环状DNA分子，A正确；当仅用一种限制酶切割载体时，两种限制酶切割产生的DNA片段等长，而两种限制酶同时切割时则产生两种长度的DNA片段，所以两种限制酶在载体上各有一个酶切位点，B正确；两种限制酶同时切割时产生600 bp和200 bp两种长度的DNA片段，所以两种限制酶的酶切位点最短相距200 bp，C正确；限制酶切割DNA分子，破坏的是作用位点上两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键，D错误。
9.D　PCR技术所用的耐高温的Taq DNA聚合酶，其最适温度为72 ℃，A错误；每合成一条子链需要一个引物，PCR扩增n次后有2n＋1条DNA单链，其中有两条是母链，所以经PCR扩增n次后需（2n＋1－2）个引物，B错误；第1轮循环的产物DNA为长—中链，第2轮循环的产物DNA中出现中—短链，第3轮循环的产物中开始出现短—短链（目标DNA片段），C错误；一个DNA片段扩增n次有2个长—中链和（2n－2）个中—短链，一个DNA片段经PCR扩增n次后含目标DNA片段2n－2－（2n－2）＝2n－2n（个），D正确。
10.A　PCR1和PCR2通常在不同的反应体系中同时进行，A错误；设计引物时，应该将Linker添加在P2、P3的5'端，B正确；至少经过2轮PCR1和PCR2，才能得到图中①所示的DNA链，C正确；①→②过程利用Linker通过PCR过程获得的融合基因，不需要DNA连接酶，D正确。
11.B　阶段一的PCR产物可通过电泳鉴定，用荧光染料对LTB的PCR产物进行标记后电泳，除了目标条带外还有许多非特异性扩增条带，可能是引物长度太短、退火温度过低、模板被污染、循环次数过多。
12.（1）（耐高温的）Taq DNA聚合酶　定位DNA合成起始点　（2）变性、退火和延伸　凝胶的浓度、DNA分子的大小、形状、所带电荷　（3）引物是根据Bt基因的一段已知序列设计合成的（或引物能与Bt基因的DNA特异性结合）　3　62　11/16
解析：（3）根据Bt基因的一段已知序列设计合成的引物（或引物能与Bt基因的DNA特异性结合），可利用PCR技术从苏云金芽孢杆菌DNA分子中扩增出Bt基因。至少需要3轮循环才能得到只含有Bt基因的片段，复制次数和目的基因个数的关系式是目的基因的个数＝2n－2n，经过5轮复制，由于有两条模板链，所以需要引物的个数为（2×25－2）＝62（个）引物。经过5轮复制后，目的基因的个数是（25－2×5）＝22（个），DNA分子的总数是25＝32（个），所以其中只含有Bt基因的片段占总DNA片段的比例为11/16。
13.（1）热变性　温度　解旋　（2）Taq DNA聚合　引物　5'—CTAA—OH　（3）6　（4）F2　因为C和F2两者之间的DNA指纹图谱有相同的区段
解析：（1）PCR技术是在体外模拟体内DNA复制过程，利用DNA的热变性原理，用高温替代原有的解旋酶的作用。（2）所用DNA聚合酶为耐高温的Taq DNA聚合酶，但是复制过程要提供现成的引物，引物序列和目的基因两端的碱基互补配对。（3）氨基酸混合物进行电泳时，因为相同的氨基酸相对分子质量和所带电荷数相同，所以在电泳时只出现1个条带，图①所示图谱出现6个条带，所以该多肽由6种氨基酸组成。（4）从遗传角度分析，儿子的核DNA一半来自父方，一半来自母方，仔细观察图②不难发现，F1～F4中F1、F3、F4不可能是孩子的父亲，C和F2两者之间的DNA指纹图谱有相同的区段，所以F2最可能是其生物学意义上的父亲。
4 / 4第2课时　基因工程的一系列操作可使生物获得新的遗传特性（一）
导学 聚焦 1.阐明基因工程基本操作程序中的获取目的基因的方法。 2.阐明PCR的原理、反应所需的条件和反应的过程。 3.尝试PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定
知识点（一）　获取目的基因
1.真核细胞与原核细胞基因的结构
小提醒：真核细胞中外显子和内含子均会被转录成mRNA。在mRNA成熟的过程中，内含子对应部位会被切除。
2.获取目的基因的方法
（1）化学合成
（2）构建基因文库
小提醒：①同一生物的基因组文库中所含的基因往往是相同的；②不同组织细胞的cDNA文库是不同的；③同一组织细胞在不同的发育阶段，cDNA文库也会有差异。
（3）利用PCR技术获取目的基因
3.判断下列相关表述的正误
（1）真核基因外显子会被转录成RNA，而内含子不能被转录。（　　）
（2）PCR扩增DNA片段的起点和终点由2个引物决定。（　　）
（3）PCR除需要耐高温的Taq DNA聚合酶、解旋酶、dNTP和DNA模板之外，还需要引物等基本条件。（　　）
（4）PCR的每一个循环都包括变性→退火→延伸三个步骤，延伸后的产物又可以作为下一个循环的模板。（　　）
探讨一　分析cDNA文库的特点
1.基因文库的建立和使用是70年代早期重组DNA技术的一个发展。人们为了分离基因，特别是分离真核生物的基因，从1974年起相继建立了大肠杆菌、酵母菌、果蝇、鸡、兔、小鼠、人、大豆等生物的基因文库。
（1）利用成熟的mRNA构建的cDNA文库中，基因是否含有启动子、终止子和内含子？
（2）不同组织细胞和同一组织细胞在不同的发育阶段，cDNA文库是否会有差异？为什么？
探讨二　分析PCR技术的原理和过程
2.聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，下图为PCR扩增中第一轮的变化，结合所学知识回答下列问题：
（1）结合下图分析PCR过程中为什么需要引物？DNA链复制的方向是怎样的？
（2）PCR扩增目的基因时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏引物与模板的碱基配对，退火温度过低又会造成引物不能与DNA模板链的特定部位结合。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，假设引物的长度相同，在G—C含量高时，对退火温度的设定有什么要求？说明理由。
（3）如果循环n次，则共消耗多少对引物？
（4）下图是某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理，请分别说明理由。
1.cDNA文库和基因组文库的主要区别
文库类型 cDNA文库 基因组文库
文库大小 小 大
基因中启动 子和终止子 无 有
基因中内含子 无 有
基因多少 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因
2.生物体内DNA复制与PCR反应的比较
3.PCR中的数量关系
复制次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物的 DNA分子数 2 4 8 2n
含其中一种引物的DNA分子数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1
同时含两种引物的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2
共消耗引物的对数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1
含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6 2n－2n
　　
1.如图表示基因工程中目的基因的获取示意图。下列相关叙述不正确的是（　　）
A.①过程的完成需要逆转录酶
B.②过程需用限制性内切核酸酶
C.目前获取目的基因的方法只有上图所示的两种
D.cDNA的构建需要提前了解目的基因的有关信息
2.下图表示形成cDNA 并进行PCR扩增的过程。据图分析，下列叙述正确的是（　　）
A.①过程所需的原料是核糖核苷酸
B.②过程所需的酶必须耐高温
C.③过程需要解旋酶破坏氢键
D.④过程的引物之间不能互补配对
3.（2024·宁波高二检测）PCR引物的3'端为结合模板DNA的关键碱基，5'端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列。下列叙述正确的是（　　）
A.该图表示PCR循环中的变性环节
B.PCR第四次循环要消耗8对引物
C.Taq DNA聚合酶催化相邻的两个游离dNTP之间形成磷酸二酯键
D.用图中引物扩增两个循环后即可获得两端添加限制酶切点的脱氧核苷酸链等长的产物
知识点（二）　活动：PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定
　
1.实验原理
2.方法步骤
（1）PCR扩增
（2）琼脂糖凝胶电泳
3.判断下列相关表述的正误
（1）PCR使用的微量离心管使用前必须进行灭菌处理。（　　）
（2）使用微量移液器时，必须先装好相应的已灭菌的一次性吸液枪头，避免液体进入微量移液器内部，且枪头在每吸取一种溶液后更换一次。（　　）
（3）DNA Marker是一种已知长度和含量的标准DNA片段，在电泳中能作为参照物；不同的DNA Marker所含DNA片段长度相同但含量不同。（　　）
探讨　分析PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定的实验结果
某生物兴趣小组进行PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定实验后，提出了以下几个问题，请分析回答：
（1）判断是否成功扩增出DNA片段的依据是什么？
（2）如果扩增条带不止一条，可能的原因有哪些？
（3）PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定实验活动的对照组应该如何设计？
1.PCR的阳性对照和阴性对照
（1）阳性对照：即Marker，推测PCR产物长度，判断PCR产物是否是目的片段。
（2）阴性对照：PCR的空白管，除了不加模板外，其成分与其他管一样，证明没有其他模板污染。
2.PCR中的误差分析
1.（2024·舟山高二期中）聚合酶链式反应（PCR）技术是一种体外迅速扩增目的基因的技术。某研究小组计划通过PCR扩增目的基因，下列有关叙述正确的是（　　）
A.必须不断向反应体系中加入模板DNA
B.必须不断向反应体系中加入耐高温的Taq DNA聚合酶
C.必须不断向反应体系中加入DNA连接酶
D.必须不断改变反应体系中温度
2.为优化目的基因（700 bp）的PCR条件，研究者设计不同的退火温度进行实验，产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图。据图分析，下列表述错误的是（　　）
A.对照组可用无菌蒸馏水代替模板，其他成分相同
B.电泳条带的宽度、亮度与扩增产物大小呈正相关
C.退火温度的高低会影响PCR扩增产物的纯度
D.58 ℃是本实验中扩增该基因的最佳退火温度
　
（1）真核细胞的基因与原核细胞的基因的不同点是　　　　　　　　　　　　　　　，由内含子和外显子构成。
（2）cDNA文库是利用　　　　　　　　　　在逆转录酶的作用下合成互补DNA（即cDNA），借助载体构建的。
（3）PCR每一次循环一般可以分为　　　　　　　　三步。
1.如图为一个真核基因的结构示意图，下列对基因特点的叙述，正确的是（　　）
A.非编码区是外显子，编码区是内含子
B.非编码区中含有翻译过程中的起始密码子和终止密码子的对应碱基序列
C.不管是原核基因还是真核基因，能编码蛋白质的序列都位于编码区
D.非编码区对该基因转录不发挥作用
2.PCR仪实质上是一台自动调控温度的仪器，下列关于它调控不同温度的目的的叙述，错误的是（　　）
A.94 ℃，使DNA分子变性，解开螺旋
B.55 ℃，引物与作为模板的单链DNA特定部位相互配对、结合
C.72 ℃，使DNA分子开始复制、延伸
D.72 ℃，使DNA分子恢复双螺旋结构，恢复活性
3.在核酸分子杂交技术中，常常使用已知序列的单链核酸片段作为探针（探针是指以放射性同位素、生物素或荧光染料等进行标记的已知核苷酸序列的核酸片段）。为了获得B链作探针，可应用PCR技术进行扩增，应选择的引物种类是（　　）
A.引物1与引物2
B.引物3与引物4
C.引物2与引物3
D.引物1与引物4
4.下列关于“PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定”的叙述，错误的是（　　）
A.PCR引物要根据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设计
B.制备的凝胶放入电泳槽内时，要将加样孔一端朝向正极
C.染色后要用75％酒精和冷的蒸馏水进行脱色
D.可根据已知DNA Marker每一条带的位置和长度推测PCR产物长度
第2课时　基因工程的一系列操作可使生物获得新的遗传特性（一）
【核心要点·巧突破】
知识点（一）
自主学习
1. RNA聚合酶　 转录　 转录　 不连续的　 内含子　 连续的
2.（1）全部　高　短　（2）mRNA　逆转录酶　（3） 脱氧核苷三磷酸　 耐高温的Taq DNA聚合酶　 人工合成　 单链DNA　 变性　 氢键　 退火　 各自互补的DNA单链　 延伸　⑩两条DNA单链　 4种dNTP　 耐高温的Taq DNA　 2个引物　 电泳
3.（1）×　提示：真核基因外显子和内含子都会被转录成RNA。
（2）√
（3）×　提示：PCR不需要解旋酶的参与。
（4）√
互动探究
1.（1）提示：由mRNA逆转录合成的cDNA不含有基因的调控序列启动子和终止子，也不含有内含子。
（2）提示：是；基因的选择性表达。
2.（1）提示：DNA聚合酶不能从头合成子链，只能把游离的脱氧核苷酸连接到已经存在的片段上。加入引物，能够使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。DNA链复制的方向总是从子链的5'端向3'端延伸。
（2）提示：在引物的G—C含量高时，设定的退火温度要高一些。因为DNA分子中G—C之间有三个氢键，A—T之间有两个氢键。
（3）提示：共消耗2n－1对引物。
（4）提示：第1组：引物 Ⅰ和引物 Ⅱ会因局部发生碱基互补配对而失效。第2组：引物 Ⅰ'自身折叠后会因出现局部碱基互补配对而失效。
学以致用
1.C　①为逆转录过程，完成该过程需要逆转录酶，A正确；②表示将DNA分子切割，因此需用限制性内切核酸酶，B正确；目前获取目的基因的方法除了从基因文库中获取外，还可利用PCR技术扩增和人工化学合成，C错误；cDNA的构建需要提前了解目的基因的有关信息，D正确。
2.D　①过程为逆转录，所需的原料是脱氧核糖核苷酸，A错误；②过程由DNA单链合成DNA双链过程所需要的DNA聚合酶不需要耐高温，B错误；③过程为变性，温度上升到90 ℃至95 ℃时，双链DNA解旋为单链，不需要解旋酶破坏氢键，C错误；④过程为退火，温度降到50～60 ℃时，两种引物通过碱基互补配对与两条DNA单链结合，但引物之间不能互补配对，D正确。
3.B　图中引物与模板链碱基互补配对，表示PCR循环中的退火环节，A错误；PCR三次循环共消耗23－1＝7（对）引物，PCR四次循环共消耗24－1＝15（对）引物，第四次循环要消耗8对引物，B正确；Taq DNA聚合酶将核苷酸不断地连接到两个引物的3'端，C错误；通过绘图可推知，第三轮循环产物中开始出现含限制酶切点的脱氧核苷酸链等长的DNA片段，D错误。
知识点（二）
自主学习
1. 变性　 退火　 延伸　 琼脂糖凝胶电泳　 亚甲基蓝　 75％酒精　 蒸馏水
2.（1）微量移液器　微量离心管　PCR仪　（2） 胶盒　 加样孔　 亚甲基蓝　 蓝色　 Marker
3.（1）√
（2）√
（3）×　提示：DNA Marker是一组已知长度和含量的标准DNA片段混合物，在电泳中能作为参照物；不同的DNA Marker所含DNA片段长度和含量是不同的。
互动探究
（1）提示：观察蓝色条带的数目和位置，通过和Marker对比来判断扩增的结果。
（2）提示：模板被污染、引物设计不合理、退火温度过低、DNA聚合酶质量不好等。
（3）提示：除了不加酵母细胞悬液外，其成分和其他微量离心管一样。
学以致用
1.D　该反应体系中需要加入待扩增的DNA作为模板，合成后的DNA分子可做模板，不需要向反应体系中重复加入模板DNA，A错误；反应体系中加入的耐高温的Taq DNA聚合酶可以重复使用，不需要重复加入，B错误；PCR技术扩增需要的条件是目的基因、引物、dNTP、耐高温的Taq DNA聚合酶，但不需要DNA连接酶，C错误；在扩增目的基因的过程中，需要高温变性、低温退火和中温延伸，因此反应体系中温度会不断改变，D正确。
2.B　实验设计应遵循对照原则与单一变量原则，故对照组可用无菌蒸馏水代替模板，其他成分相同，A正确；PCR技术中，反应最终的电泳条带的宽度、亮度与PCR起始状态的模板DNA（或者模板）含量呈正相关，B错误；PCR扩增时，退火温度会影响PCR扩增产物的纯度，故退火温度的设定是成败的关键，退火温度过高会破坏引物与模板的碱基配对，进而影响PCR扩增产物的纯度，C正确；据图可知，58 ℃条件下条带宽度最大，故该温度是本实验中扩增该基因的最佳退火温度，D正确。
【过程评价·勤检测】
网络构建
（1）编码蛋白质的核苷酸序列是不连续的
（2）成熟的mRNA
（3）变性、退火和延伸
课堂演练
1.C　外显子和内含子都位于编码区，A错误；密码子对应的碱基序列位于编码区，B错误；非编码区含有启动子、终止子等结构，对转录有调控作用，D错误。
2.D　90～95 ℃，使DNA分子变性，解开螺旋，A正确；50～60 ℃，引物与作为模板的单链DNA特定部位相互配对、结合，B正确；72 ℃左右，使DNA分子开始复制、延伸，C正确，D错误。
3.C　要获得B链，根据PCR中子链延伸方向为5'端到3'端，则需选择引物2与引物3进行扩增，故选C。
4.B　制备的凝胶放入电泳槽内时，要将加样孔一端朝向负极，B错误。
7 / 8(共79张PPT)
第2课时　基因工程的一系列操作可使生物获得新的遗传特性（一）
导
学 聚
焦 1.阐明基因工程基本操作程序中的获取目的基因的方法。
2.阐明PCR的原理、反应所需的条件和反应的过程。
3.尝试PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定
核心要点·巧突破
01
过程评价·勤检测
02
课时训练·提素能
03
目录
CONTENTS
核心要点·巧突破
01
精准出击 高效学习
知识点（一）　获取目的基因
1. 真核细胞与原核细胞基因的结构
小提醒：真核细胞中外显子和内含子均会被转录成mRNA。在
mRNA成熟的过程中，内含子对应部位会被切除。
2. 获取目的基因的方法
（1）化学合成
（2）构建基因文库
小提醒：①同一生物的基因组文库中所含的基因往往是相同
的；②不同组织细胞的cDNA文库是不同的；③同一组织细
胞在不同的发育阶段，cDNA文库也会有差异。
（3）利用PCR技术获取目的基因
3. 判断下列相关表述的正误
（1）真核基因外显子会被转录成RNA，而内含子不能被转录。
（　×　）
提示：真核基因外显子和内含子都会被转录成RNA。
（2）PCR扩增DNA片段的起点和终点由2个引物决定。
（　√　）
（3）PCR除需要耐高温的Taq DNA聚合酶、解旋酶、dNTP和DNA
模板之外，还需要引物等基本条件。 （　×　）
提示：PCR不需要解旋酶的参与。
（4）PCR的每一个循环都包括变性→退火→延伸三个步骤，延伸
后的产物又可以作为下一个循环的模板。 （　√　）
×
√
×
√
探讨一　分析cDNA文库的特点
1. 基因文库的建立和使用是70年代早期重组DNA技术的一个发展。
人们为了分离基因，特别是分离真核生物的基因，从1974年起相继
建立了大肠杆菌、酵母菌、果蝇、鸡、兔、小鼠、人、大豆等生物
的基因文库。
（1）利用成熟的mRNA构建的cDNA文库中，基因是否含有启动
子、终止子和内含子？
提示：由mRNA逆转录合成的cDNA不含有基因的调控序列启
动子和终止子，也不含有内含子。
（2）不同组织细胞和同一组织细胞在不同的发育阶段，cDNA文
库是否会有差异？为什么？
提示：是；基因的选择性表达。
探讨二　分析PCR技术的原理和过程
2. 聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物
学技术，下图为PCR扩增中第一轮的变化，结合所学知识回答下列
问题：
（1）结合下图分析PCR过程中为什么需要引物？DNA链复制的方
向是怎样的？
提示：DNA聚合酶不能从头合成子链，只能把游离的脱氧核
苷酸连接到已经存在的片段上。加入引物，能够使DNA聚合
酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。DNA链复制的方向总
是从子链的5'端向3'端延伸。
（2）PCR扩增目的基因时，退火温度的设定是成败的关键。退火
温度过高会破坏引物与模板的碱基配对，退火温度过低又会
造成引物不能与DNA模板链的特定部位结合。退火温度的设
定与引物长度、碱基组成有关，假设引物的长度相同，在
G—C含量高时，对退火温度的设定有什么要求？说明理由。
提示：在引物的G—C含量高时，设定的退火温度要高一
些。因为DNA分子中G—C之间有三个氢键，A—T之间有
两个氢键。
（3）如果循环n次，则共消耗多少对引物？
提示：共消耗2n－1对引物。
（4）下图是某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都
不合理，请分别说明理由。
提示：第1组：引物 Ⅰ和引物 Ⅱ会因局部发生碱基互补配对而
失效。第2组：引物 Ⅰ'自身折叠后会因出现局部碱基互补配对
而失效。
1. cDNA文库和基因组文库的主要区别
文库类型 cDNA文库 基因组文库
文库大小 小 大
基因中启动子和终止子 无 有
基因中内含子 无 有
基因多少 某种生物的部
分基因 某种生物的全部基因
2. 生物体内DNA复制与
PCR反应的比较
3. PCR中的数量关系
复制次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物的DNA分子
数 2 4 8 2n
含其中一种引物的
DNA分子数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1
同时含两种引物的
DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2
共消耗引物的对数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1
含脱氧核苷酸链等
长的DNA分子数 0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6 2n－2n
1. 如图表示基因工程中目的基因的获取示意图。下列相关叙述不正确
的是（　　）
A. ①过程的完成需要逆转录酶
B. ②过程需用限制性内切核酸酶
C. 目前获取目的基因的方法只有上图所示的两种
D. cDNA的构建需要提前了解目的基因的有关信息
解析：　①为逆转录过程，完成该过程需要逆转录酶，A正确；
②表示将DNA分子切割，因此需用限制性内切核酸酶，B正确；目
前获取目的基因的方法除了从基因文库中获取外，还可利用PCR技
术扩增和人工化学合成，C错误；cDNA的构建需要提前了解目的
基因的有关信息，D正确。
2. 下图表示形成cDNA 并进行PCR扩增的过程。据图分析，下列叙述
正确的是（　　）
A. ①过程所需的原料是核糖核苷酸
B. ②过程所需的酶必须耐高温
C. ③过程需要解旋酶破坏氢键
D. ④过程的引物之间不能互补配对
解析：　①过程为逆转录，所需的原料是脱氧核糖核苷酸，A错
误；②过程由DNA单链合成DNA双链过程所需要的DNA聚合酶不
需要耐高温，B错误；③过程为变性，温度上升到90 ℃至95 ℃
时，双链DNA解旋为单链，不需要解旋酶破坏氢键，C错误；④过
程为退火，温度降到50～60 ℃时，两种引物通过碱基互补配对与
两条DNA单链结合，但引物之间不能互补配对，D正确。
3. （2024·宁波高二检测）PCR引物的3'端为结合模板DNA的关键碱
基，5'端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列。下列叙述正
确的是（　　）
A. 该图表示PCR循环中的变性环节
B. PCR第四次循环要消耗8对引物
C. Taq DNA聚合酶催化相邻的两个游离dNTP之间形成磷酸二酯键
D. 用图中引物扩增两个循环后即可获得两端添加限制酶切点的脱氧
核苷酸链等长的产物
解析：　图中引物与模板链碱基互补配对，表示PCR循环中的退
火环节，A错误；PCR三次循环共消耗23－1＝7（对）引物，PCR
四次循环共消耗24－1＝15（对）引物，第四次循环要消耗8对引
物，B正确；Taq DNA聚合酶将核苷酸不断地连接到两个引物的3'
端，C错误；通过绘图可推知，第三轮循环产物中开始出现含限制
酶切点的脱氧核苷酸链等长的DNA片段，D错误。
知识点（二）　活动：PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定
1. 实验原理
2. 方法步骤
（1）PCR扩增
（2）琼脂糖凝胶电泳
3. 判断下列相关表述的正误
（1）PCR使用的微量离心管使用前必须进行灭菌处理。
（　√　）
（2）使用微量移液器时，必须先装好相应的已灭菌的一次性吸液
枪头，避免液体进入微量移液器内部，且枪头在每吸取一种
溶液后更换一次。 （　√　）
√
√
（3）DNA Marker是一种已知长度和含量的标准DNA片段，在电泳
中能作为参照物；不同的DNA Marker所含DNA片段长度相同
但含量不同。 （　×　）
提示：DNA Marker是一组已知长度和含量的标准DNA片段混
合物，在电泳中能作为参照物；不同的DNA Marker所含DNA
片段长度和含量是不同的。
×
探讨　分析PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定的实验结果
某生物兴趣小组进行PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定实验后，提出
了以下几个问题，请分析回答：
（1）判断是否成功扩增出DNA片段的依据是什么？
提示：观察蓝色条带的数目和位置，通过和Marker对比来判断
扩增的结果。
（2）如果扩增条带不止一条，可能的原因有哪些？
提示：模板被污染、引物设计不合理、退火温度过低、DNA聚
合酶质量不好等。
（3）PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定实验活动的对照组应该如何
设计？
提示：除了不加酵母细胞悬液外，其成分和其他微量离心管
一样。
1. PCR的阳性对照和阴性对照
（1）阳性对照：即Marker，推测PCR产物长度，判断PCR产物是
否是目的片段。
（2）阴性对照：PCR的空白管，除了不加模板外，其成分与其他
管一样，证明没有其他模板污染。
2. PCR中的误差分析
1. （2024·舟山高二期中）聚合酶链式反应（PCR）技术是一种体外
迅速扩增目的基因的技术。某研究小组计划通过PCR扩增目的基
因，下列有关叙述正确的是（　　）
A. 必须不断向反应体系中加入模板DNA
B. 必须不断向反应体系中加入耐高温的Taq DNA聚合酶
C. 必须不断向反应体系中加入DNA连接酶
D. 必须不断改变反应体系中温度
解析：　该反应体系中需要加入待扩增的DNA作为模板，合成后
的DNA分子可做模板，不需要向反应体系中重复加入模板DNA，A
错误；反应体系中加入的耐高温的Taq DNA聚合酶可以重复使用，
不需要重复加入，B错误；PCR技术扩增需要的条件是目的基因、
引物、dNTP、耐高温的Taq DNA聚合酶，但不需要DNA连接酶，
C错误；在扩增目的基因的过程中，需要高温变性、低温退火和中
温延伸，因此反应体系中温度会不断改变，D正确。
2. 为优化目的基因（700 bp）的PCR条件，研究者设计不同的退火温度进行实验，产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图。据图分析，下列表述错误的是（　　）
A. 对照组可用无菌蒸馏水代替模板，其他成分相同
B. 电泳条带的宽度、亮度与扩增产物大小呈正相关
C. 退火温度的高低会影响PCR扩增产物的纯度
D. 58 ℃是本实验中扩增该基因的最佳退火温度
解析：　实验设计应遵循对照原则与单一变量原则，故对照组可
用无菌蒸馏水代替模板，其他成分相同，A正确；PCR技术中，反
应最终的电泳条带的宽度、亮度与PCR起始状态的模板DNA（或
者模板）含量呈正相关，B错误；PCR扩增时，退火温度会影响
PCR扩增产物的纯度，故退火温度的设定是成败的关键，退火温度
过高会破坏引物与模板的碱基配对，进而影响PCR扩增产物的纯
度，C正确；据图可知，58 ℃条件下条带宽度最大，故该温度是本
实验中扩增该基因的最佳退火温度，D正确。
过程评价·勤检测
02
反馈效果 筑牢基础
（1）真核细胞的基因与原核细胞的基因的不同点是
，由内含子和外显子构成。
（2）cDNA文库是利用 在逆转录酶的作用下合成互
补DNA（即cDNA），借助载体构建的。
（3）PCR每一次循环一般可以分为 三步。
编码蛋白质的
核苷酸序列是不连续的　
成熟的mRNA　
变性、退火和延伸　
1. 如图为一个真核基因的结构示意图，下列对基因特点的叙述，正确
的是（　　）
A. 非编码区是外显子，编码区是内含子
B. 非编码区中含有翻译过程中的起始密码子和终止密码子的对应碱
基序列
C. 不管是原核基因还是真核基因，能编码蛋白质的序列都位于编码区
D. 非编码区对该基因转录不发挥作用
解析：　外显子和内含子都位于编码区，A错误；密码子对应的碱基序列位于编码区，B错误；非编码区含有启动子、终止子等结
构，对转录有调控作用，D错误。
2. PCR仪实质上是一台自动调控温度的仪器，下列关于它调控不同温
度的目的的叙述，错误的是（　　）
A. 94 ℃，使DNA分子变性，解开螺旋
B. 55 ℃，引物与作为模板的单链DNA特定部位相互配对、结合
C. 72 ℃，使DNA分子开始复制、延伸
D. 72 ℃，使DNA分子恢复双螺旋结构，恢复活性
解析：　90～95 ℃，使DNA分子变性，解开螺旋，A正确；50～
60 ℃，引物与作为模板的单链DNA特定部位相互配对、结合，B
正确；72 ℃左右，使DNA分子开始复制、延伸，C正确，D错误。
3. 在核酸分子杂交技术中，常常使用已知序列的单链核酸片段作为探
针（探针是指以放射性同位素、生物素或荧光染料等进行标记的已
知核苷酸序列的核酸片段）。为了获得B链作探针，可应用PCR技
术进行扩增，应选择的引物种类是（　　）
A. 引物1与引物2
B. 引物3与引物4
C. 引物2与引物3
D. 引物1与引物4
解析：　要获得B链，根据PCR中子链延伸方向为5'端到3'端，则
需选择引物2与引物3进行扩增，故选C。
4. 下列关于“PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定”的叙述，错误的
是（　　）
A. PCR引物要根据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设计
B. 制备的凝胶放入电泳槽内时，要将加样孔一端朝向正极
C. 染色后要用75％酒精和冷的蒸馏水进行脱色
D. 可根据已知DNA Marker每一条带的位置和长度推测PCR产物长度
解析：　制备的凝胶放入电泳槽内时，要将加样孔一端朝向负
极，B错误。
课时训练·提素能
03
分级练习 巩固提升
知识点一　获取目的基因的方法
1. mRNA上的起始密码子编码甲硫氨酸，与之相对应的DNA片段位
于（　　）
A. 基因编码区上游的非编码区中
B. 基因编码区上游的外显子中
C. 基因非编码区的启动子中
D. 基因编码区末端的内含子中
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解析：　mRNA是基因编码区转录形成的，真核细胞基因编码区
由多个外显子和内含子相隔构成，转录初始形成的RNA需要将内
含子转录的部分剪切掉，然后再将外显子转录的部分连接起来形成
成熟的mRNA，因此与mRNA上的起始密码子相对应的DNA片段位
于基因编码区上游的外显子中，B正确。
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2. （2024·嘉兴高二月考）建立基因文库是获取目的基因的方法之
一，下列关于基因文库的说法，正确的是（　　）
A. 构建基因文库需要将基因导入微生物细胞，形成克隆
B. 基因文库的构建不需要限制酶和DNA连接酶
C. 基因组文库含有该生物的大部分基因
D. 部分基因文库就是cDNA文库
解析：　构建基因文库需要限制酶和DNA连接酶，B错误；基因
组文库含有该生物的全部基因，C错误；cDNA文库是部分基因文
库中的一种，D错误。
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3. （2024·绍兴高二期中）PCR过程的特异性主要取决于（　　）
A. DNA聚合酶的种类
B. 反应体系中模板DNA的量
C. 引物的碱基序列特异性
D. dNTP的浓度
解析：　引物决定了PCR过程中复制的特定DNA序列区间，即引
物的碱基序列特异性决定了PCR过程的特异性。
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4. 下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是（　　）
A. 二者子链的延伸方向相同，均为5'端→3'端
B. 二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋
C. 体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量
D. 二者遵循的碱基互补配对原则相同
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解析：　DNA体内复制与利用PCR技术扩增DNA时，子链的延伸
方向相同，均为5'端→3'端，A正确；PCR扩增中双链DNA解开不
需要解旋酶，在高温条件下氢键断裂，B错误；DNA体内复制与利
用PCR扩增DNA时都需要能量，但两者所需能量来源不同，C正
确；DNA体内复制与利用PCR扩增DNA时，遵循的碱基互补配对
原则相同，D正确。
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5. （2024·绍兴高二期中）利用PCR技术将某DNA分子扩增n代的过
程中，下列叙述错误的是（　　）
A. 引物越短，PCR扩增的非目标DNA就越多
B. 共有（2n－1）对引物参与子代DNA分子的合成
C. 引物中G—C含量越高，退火温度越高
D. 适温延伸过程中，需要提供ATP
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解析：　引物越短，其特异性越低，引物与非目标DNA结合的可
能性越大，因此PCR扩增的非目标DNA就越多，A正确；PCR技术
的原理是DNA复制，根据DNA分子半保留复制的特点可知，共有
（2n－1）对引物参与子代DNA分子的合成，B正确；退火表示引
物与模板相连，由于G—C之间有三个氢键，A—T之间有两个氢
键，所以G—C含量越高的引物，退火温度越高，C正确；适温延
伸过程中，由dNTP水解磷酸提供能量，不需要提供ATP，D错误。
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知识点二　PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定
6. （2024·浙江杭州期中）下列有关PCR的叙述，错误的是（　　）
A. 退火温度和延伸时间均与引物有关
B. 常用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物
C. PCR时需加入DNA聚合酶和解旋酶
D. 可用细胞的基因组DNA作为模板
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解析：　PCR的一次循环包括变性、退火和延伸三个过程，退火
温度（使引物结合到互补链DNA上）和延伸时间（从引物3'的合成
子链）均与引物有关，A正确；PCR的产物常用琼脂糖凝胶电泳来
鉴定，在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的
大小和构象有关，B正确；PCR技术中，DNA解旋是在高温下实现
的，不需要加入解旋酶，C错误；PCR是一项体外扩增DNA的技
术，可用细胞的基因组DNA作为模板，实现目的基因的快速扩
增，D正确。
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7. （2024·浙江杭州高二期末）下列有关电泳的叙述，不正确的是
（　　）
A. 电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B. 待测样品中各种分子的形状、大小及带电性质的差异等会影响其
在电泳中的迁移速度
C. 进行电泳时，带电粒子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D. 常用的电泳方法是琼脂糖凝胶电泳
解析：　进行电泳时，带电粒子会向着与其所带电荷相反的电极
移动，C错误。
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8. 在基因工程操作中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶（R1
和R2）处理基因载体，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图所示。
下列相关叙述不正确的是（　　）
A. 该载体最可能为环状DNA分子
B. 两种限制酶在载体上各有一个酶切位点
C. 限制酶R1与R2的切点最短相距约200 bp
D. 限制酶作用于位点会导致氢键和肽键断裂
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解析：　由题图可知，当仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一
种长度的DNA片段，因此该载体最有可能为环状DNA分子，A正
确；当仅用一种限制酶切割载体时，两种限制酶切割产生的DNA
片段等长，而两种限制酶同时切割时则产生两种长度的DNA片
段，所以两种限制酶在载体上各有一个酶切位点，B正确；两种限
制酶同时切割时产生600 bp和200 bp两种长度的DNA片段，所以两
种限制酶的酶切位点最短相距200 bp，C正确；限制酶切割DNA分
子，破坏的是作用位点上两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键，
D错误。
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9. （2024·杭州高二期中）下列关于PCR技术的叙述，正确的是（　）
A. PCR技术所用的耐高温的Taq DNA聚合酶，其最适温度是95 ℃
B. 一个DNA片段经PCR扩增n次后需2n个引物
C. 在第2轮循环产物中开始出现目标DNA片段
D. 一个DNA片段经PCR扩增n次后含目标DNA片段2n－2n个
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解析：　PCR技术所用的耐高温的Taq DNA聚合酶，其最适温度
为72 ℃，A错误；每合成一条子链需要一个引物，PCR扩增n次后
有2n＋1条DNA单链，其中有两条是母链，所以经PCR扩增n次后需
（2n＋1－2）个引物，B错误；第1轮循环的产物DNA为长—中链，
第2轮循环的产物DNA中出现中—短链，第3轮循环的产物中开始
出现短—短链（目标DNA片段），C错误；一个DNA片段扩增n次
有2个长—中链和（2n－2）个中—短链，一个DNA片段经PCR扩
增n次后含目标DNA片段2n－2－（2n－2）＝2n－2n（个），D
正确。
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　（2024·浙江温州乐清市知临中学月考）阅读下列材料，完成10～
11小题。
　　产肠毒素大肠杆菌（ETEC）能引起幼畜发生急性严重腹泻，其
直接致病因子为肠毒素，包括热不稳定肠毒素（LT）和热稳定肠毒素
（ST）两种。LT由两类功能性亚单位（LTA、LTB）组成，其中LTB
具有免疫原性；ST包括ST1、ST2两个亚型，均为小分子多肽，免疫
原性弱，构建ST1基因与LTB基因的融合表达质粒，使其表达的ST1具
有免疫原性，为研制抗毒素疫苗做好上游工作。
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10. 从ETEC中扩增得到LTB和ST1两个基因片段，并设计引物：P1、
P2为扩增LTB基因序列的引物，P3、P4为扩增ST1基因序列的引
物。其中P2、P3中的部分是人工合成能互补的Linker（连接基
团）。制备LTB-ST1融合基因的过程如下图所示。
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下列叙述错误的是（　　）
A. PCR1和PCR2通常在一个反应体系中同时进行
B. 设计引物时，应该将Linker添加在P2、P3的5'端
C. 获得①中的两条链至少经过2轮PCR1和PCR2
D. ①→②过程利用Linker获得的融合基因不需要DNA连接酶
解析：　PCR1和PCR2通常在不同的反应体系中同时进行，A错
误；设计引物时，应该将Linker添加在P2、P3的5'端，B正确；至
少经过2轮PCR1和PCR2，才能得到图中①所示的DNA链，C正
确；①→②过程利用Linker通过PCR过程获得的融合基因，不需
要DNA连接酶，D正确。
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11. 通过融合PCR获得LTB-ST1融合序列，该PCR需分两个阶段进
行，过程如图所示。阶段一的PCR产物可通过电泳鉴定，用荧光
染料对LTB的PCR产物进行标记后电泳，得到以下结果，除了目
标条带外还有许多非特异性扩增条带，原因不可能是（　　）
A. 引物长度太短 B. 退火温度过高
C. 模板被污染 D. 循环次数过多
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解析：　阶段一的PCR产物可通过电泳鉴定，用荧光染料对LTB
的PCR产物进行标记后电泳，除了目标条带外还有许多非特异性
扩增条带，可能是引物长度太短、退火温度过低、模板被污染、
循环次数过多。
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12. 1985年，穆里斯等人发明了PCR技术。请回答有关问题：
（1）若要使用PCR扩增目的基因，则需要在反应体系中添加的物
质有4种脱氧核苷三磷酸、引物、模板和
，其中引物的作用是 。
（2）PCR中每次循环的步骤依次是 。PCR的
产物常用琼脂糖凝胶电泳来鉴定，在凝胶中DNA分子的迁
移速率与
等因素有关。
（耐高温的）Taq
DNA聚合酶　
定位DNA合成起始点　
变性、退火和延伸　
凝胶的浓度、DNA分子的大小、形状、所带电荷　
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（3）利用PCR技术可以从苏云金芽孢杆菌DNA分子中扩增出Bt
基因，原因是
，至少需要
轮循环才能得到只含有Bt基因的片段，经过5轮复制，需要
引物 个，其中只含有Bt基因的片段占总DNA片段的比例
为 。
引物是根据Bt基因的一段已知序列设计合成
的（或引物能与Bt基因的DNA特异性结合）　
3　
62　
11/16　
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解析：根据Bt基因的一段已知序列设计合成的引物（或引物能与Bt基因的DNA特异性结合），可利用PCR技术从苏云金芽孢杆菌DNA分子中扩增出Bt基因。至少需要3轮循环才能得到只含有Bt基因的片段，复制次数和目的基因个数的关系式是目的基因的个数＝2n－2n，经过5轮复制，由于有两条模板链，所以需要引物的个数为（2×25－2）＝62（个）引物。经过5轮复制后，目的基因的个数是（25－2×5）＝22（个），DNA分子的总数是25＝32（个），所以其中只含有Bt基因的片段占总DNA片段的比例为11/16。
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13. 如图是利用PCR技术和电泳技术进行的某一次亲子鉴定结果图
谱，请根据图谱和所学知识回答下列问题：
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（1）PCR技术能把某一DNA分子片段进行扩增。它是利用了
DNA的 原理，通过控制 来控制DNA双链
与结合。
解析：PCR技术是在体外模拟体内DNA复制过程，利用DNA的热变性原理，用高温替代原有的解旋酶的作用。
热变性　
温度　
解
旋　
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（2）利用PCR技术扩增DNA的过程中还需要 酶的
作用，但它必须在相应的 的作用下才能完成对DNA的
复制。假设有一段DNA序列为：
5'—GTTAACCTTAG—3'
3'—CAATTGGAATC—5'
所用引物Ⅰ为5'—GTTA—OH，则引物Ⅱ为 。
Taq DNA聚合　
引物　
5'—CTAA—OH　
解析：所用DNA聚合酶为耐高温的Taq DNA聚合酶，但是复制过程要提供现成的引物，引物序列和目的基因两端的碱基互补配对。
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（3）图①是含有21个氨基酸的多肽水解得到的氨基酸混合物电泳
的结果，故可推知该多肽由 种氨基酸构成。
解析：氨基酸混合物进行电泳时，因为相同的氨基酸相对分子质量和所带电荷数相同，所以在电泳时只出现1个条带，图①所示图谱出现6个条带，所以该多肽由6种氨基酸组成。
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（4）图②为某小孩和其母亲，以及待测定的四位男性的DNA，
分别由酶处理后，生成若干DNA片段，并进行扩增，然后
进行电泳所得到的一组DNA指纹图谱，请分析F1～F4中，你
认为 是该小孩真正生物学意义上的父亲。为什么？
。
解析：从遗传角度分析，儿子的核DNA一半来自父方，一半来自母方，仔细观察图②不难发现，F1～F4中F1、F3、F4不可能是孩子的父亲，C和F2两者之间的DNA指纹图谱有相同的区段，所以F2最可能是其生物学意义上的父亲。
F2　
因为
C和F2两者之间的DNA指纹图谱有相同的区段　
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