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第1章 发酵工程
第2节 微生物的培养技术及应用
——微生物的选择培养和计数
发酵工程
目录 /CONTENTS
01
02
03
选择培养基
微生物的选择培养
微生物的数量测定
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。
稀释涂布平板法
呈现的杂菌群
从社会中来
从社会中来
从社会中来科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶美国黄石公园筛选原因：因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，而水生栖热菌能在70-800C高温条件下生存。1966年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的水生栖热菌，并分离到耐高温的DNA聚合酶。耐高温的酶耐高温生物体高温环境（热泉、火山口）寻找寻找PCR是一种在体外DNA复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。启示：根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。耐寒微生物耐热微生物石油分解菌同理：人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和PH）等，同时抑制或阻止其他微生物生长。选择培养基适用实验室微生物的筛选。01选择培养基1.概念:2.类型:在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。类型条件分离得到的菌种改变培养条件70～80℃的高温添加某种化学物质加入青霉素高浓度食盐特殊碳、氮源石油是唯一碳源营养缺陷不加碳源不加氮源水生栖热菌酵母菌、霉菌等真菌金黄色葡萄球菌能消除石油污染的微生物自养型微生物固氮菌
+氨苄青霉素
具有抗氨苄青霉素能力的菌落
没有氨苄青霉素抗性的细菌
选择培养基
培养基+氨苄青霉素
培养基
没有抗氨苄青霉素能力的菌落被淘汰
怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌
01选择培养基尿素的立体结构【思考·讨论】尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶。脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以为细菌生长的氮源。CO(NH2)2脲酶+ H2O+ CO22NH301选择培养基2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？【思考·讨论】除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同。问在选择培养基中，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的细菌才能生长发育繁殖。1.将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？问牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 定容到1000ml
培养基一
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4 ·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
培养基二
1.从物理性质来讲，两者属于_____培养基，判断依据是_______________；该类培养基的主要用途为_______________。
2.从用途上来讲， 属于选择培养基，目的是为了获得 。
3.两种培养基共有的培养基成分有：
。
培养基一的主要碳源为 ，
主要氮源为 ；
培养基二的碳源为 ，氮源为 。
固体
添加了凝固剂琼脂
分离、鉴定、计数、保存
培养基二
能分解尿素的微生物
碳源、氮源、无机盐、水
牛肉膏
蛋白胨
葡萄糖
尿素
021g土壤中有多少能分解尿素的细菌？分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物计数：测定分解尿素的细菌的数量概念：将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养。主要过程:A、梯度稀释菌液B、涂布平板稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。微生物的选择培养稀释涂布平板法02微生物的选择培养1×101 mL1 mL1 mL1 mL1 mL1 mL1×1021×1031×1041×1051×1061×1079 mL无菌水90mL无菌水10g微量移液器①铲取土样，将样品装入纸袋中注意：取土样用的小铁铲和盛土样的的纸袋在使用前都要灭菌。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。（1）梯度稀释稀释涂布平板法02微生物的选择培养③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。注意：多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。（2）涂布平板稀释涂布平板法02微生物的选择培养恒温培养箱稀释103倍稀释104倍稀释105倍空白对照待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的恒温培养箱中，培养1-2d。（3）菌落培养稀释涂布平板法主要方法 稀释涂布平板法 平板划线法
主要步骤 系列梯度稀释操作和涂布平板操作 接种环在固体培养基表面连续划线
接种工具 涂布器 接种环
菌体获取 从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体 在具有显著的菌落特征的区域挑取菌体
能否用于计数 可以计数，但是操作复杂，需涂布多个平板 不能计数
共同点 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可以观察菌落特征。 知识归纳
比较稀释涂布平板法和平板划线法
03微生物的数量测定当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。1.稀释涂布平板法1.稀释涂布平板法2.显微镜直接计数法——间接计数法——直接计数法计数原则:为了保证结果准确，选择30-300个菌落的平板进行计数；每个稀释度至少取3个平板取其平均值；分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。统计的菌落往往比活菌的实际数目低；统计的结果一般用菌落数而不是活菌数来表示；恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。结果分析:当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。03微生物的数量测定1.稀释涂布平板法03微生物的数量测定计算公式:每g样品中的菌落数＝(C÷V)×MM代表稀释倍数C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)例：某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( )A. 2.34×108B. 2.34×109C. 234 D. 23.4（234÷0.1）×106=2.34×109答B例：甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？（80+90+100）/30.1× 105=9 ×107个1.稀释涂布平板法032.显微镜直接计数法血细胞计数板：细菌计数板：常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。对细菌等较小的细胞进行观察和计数。缺点：①不能区分死菌和活菌→偏大②不适于对运动细菌的计数。③个体小的细菌在显微镜下难以观察。优点：快速、直观微生物的数量测定1.提出问题
土壤中含有能分解尿素的细菌，我们如何分离它们？
每克土壤样品究竟含有多少这样的细菌？
利用以“尿素作为唯一氮源”的选择培养基，可以分离。
2.做出假设
3.实验设计
实验步骤
土壤
取样
制备
培养基
样品稀释
与取样涂布
微生物的
培养与观察
探究·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
实验原理
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
CO(NH2)2+H2O
脲酶
2NH3+CO2
①培养基的制备
制备选择培养基（尿素为唯一氮源）
制备牛肉膏蛋白胨培养基
对照作用
思考1.为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？
探究·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
4.进行实验
②土壤取样
A 取样地：酸碱度接近中性的潮湿土壤中。
B 取样：铲去表层土（一般3cm左右）。
细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。
探究·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
4.进行实验
③样品的稀释与涂布平板
不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300、适于计数的平板。
选用稀释范围更大的稀释液进行平板培养
思考2.测定土壤中细菌总量和能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？
探究·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
4.进行实验
③样品的稀释与涂布平板
1）每个浓度设置了 个平板，1、2、3平板是选择培养基（ 实验），
4为 培养基（用以判断选择培养基是否具有选择作用）；
2）另外，整个实验还要设置 个空白对照平板：未接种的 。
培养基，以验证培养基中是否含有杂菌。
4
重复
牛肉膏蛋白胨
2
选择培养基和牛肉膏蛋白胨
探究·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
4.进行实验
④微生物的培养与观察
培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。
观察：每隔 统计一次菌落数目，选取 时的记录作为结果。防止 。
结果：一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。
因培养时间不足而导致菌落数目遗漏
24h
菌落数目稳定
③注意事项：
本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等；
本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌, 对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。你可以查阅相关资料,进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种。
5.进一步探究
探究·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
方法：在培养基中加入酚红指示剂
——鉴别培养基
CO(NH2)2+H2O
脲酶
2NH3+CO2
呈碱性，遇酚红指示剂呈 红 色。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
课堂小结
Brief summary
微生物的数量测定
选择培养基的作用
微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法
微
生
物
的
选
择
培
养
和
计
数
选择培养基
微生物的选择培养
科学实例
筛选原则
选择培养基的概念及举例
稀释涂布平板法的操作过程
间接计数法 — 稀释涂布平板法
直接计数 —计数板计数法
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
培养基的制备
实验设计
（1）土壤取样
（2）样品的稀释
（3）稀释涂布平板法接种
（4）微生物的培养与观察
实验设计
习题巩固
Exercises to consolidate
1. 研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。
（1）这种培养基是一种选择培养基。（ ）
（2）利用这种石油降解菌可以降解石油。修复土壤。
（ ）
（3）相对于未被污染的土壤,从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（ ）
√
√
√
习题巩固
Exercises to consolidate
2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计
平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数,原因是（ ）
A. 菌落中的细菌数目是固定的
B. 平板上的一个菌落就是一个细菌
C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
D
习题巩固
Exercises to consolidate
1.反刍（chú）动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。
反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基，还应该参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。
习题巩固
Exercises to consolidate
2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，
其中 40% ~ 60% 能被土壤中某些微生物分解
利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸秆等生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素
形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解
后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌
为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。
习题巩固
Exercises to consolidate
（1）现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出详细
的实验方案。
用“纤维素为唯一碳源”的选择培养基进行培养，并在培养基加入刚果红进行鉴别。
（2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？
纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。
习题巩固
Exercises to consolidate
（3）有同学说,可以把滤纸埋在土壤中,经过一段时间后,再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。
这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。

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