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第38讲 微生物的培养技术和应用（知识清单）
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知识主脉络：可视化思维导图，建立知识框架
核心知识库：重难考点总结，梳理必背知识、归纳重点 考点1培养基和无菌技术★★★☆☆ 考点2微生物的纯培养★★★☆☆ 考点3微生物选择培养和计数★★★☆☆ 考点4实验：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数★★★☆☆
陷阱预警台：识别高频错误，提供防错策略（1大陷阱规避）
素养加油站：前沿科研成果或热点问题分析
真题挑战场：感知真题，检验成果，考点追溯
考点1 培养基和无菌技术★★★☆☆
1.培养基
（1）概念：人们按照微生物对 的不同需求，配制出供其生长繁殖的 ，用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
（2）营养成分
①各种培养基一般都含有 和无机盐等营养物质。
营养物质 作用 主要来源
水 良好的溶剂、细胞结构的重要组成成分 培养基、空气、代谢产物
碳源 提供碳元素，有机碳源是异养生物的 物质 葡萄糖、蔗糖、淀粉、纤维素、牛肉膏、蛋白胨等
氮源 提供氮元素，合成 、磷脂以及含氮代谢产物 无机氮源，如铵盐、硝酸盐等；有机氮源，如酵母粉、 、 等
无机盐 组成细胞结构和许多化合物，调节生命活动；某些化能自养菌的能源 如磷酸盐等无机化合物
②培养基的其他条件：满足微生物对pH、特殊营养物质以及O2等的需求。
培养微生物种类 特殊要求
乳酸杆菌 培养基中添加
霉菌 培养基的pH调至
细菌 培养基的pH调至
厌氧微生物 需要提供 的条件
（3）分类
①按物理状态分类
培养基种类 培养基特点 作用
培养基 加凝固剂，如 微生物的分离与鉴定，活菌计数，保藏菌种
半固体培养基 容器放倒不致流出，剧烈震动则破散 观察微生物的运动、分类鉴定
培养基 不加凝固剂 常用于工业生产、微生物的扩大培养
②按化学成分分类
培养基种类 特点 用途
天然培养基 含化学成分不明确的天然物质 工业生产
合成培养基 培养基成分明确（用化学成分已知的化学物质配成） 微生物的分类、鉴定
③按功能分类
种类 制备方法 原理 用途 举例
选择培养基 培养基中加入某些化学物质或缺少某些物质 依据某些微生物对某些物质的特殊需求或抗性而设计 从众多微生物中 所需的微生物 加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌
鉴别培养基 培养基中加入某种指示剂或化学药品 产生特定的颜色或其他变化 鉴别不同种类的微生物 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂鉴定分解尿素的细菌
2.无菌技术
（1）概念：在培养微生物的操作中，所有 的方法。
①目的：获得 的微生物培养物。
②关键：防止 污染。
（2）消毒和灭菌比较
手段 结果 常用方法 应用范围
消毒 较为 的 等方法 杀死物体表面或内部 煮沸消毒法 日常用品
法 牛奶等不耐高温的液体
化学药剂消毒法 用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源
紫外线消毒法 接种室、接种箱或超净工作台
灭菌 的理化方法 杀死物体内外 ，包括 法 接种工具、一些金属用具等
干热灭菌法 玻璃器皿、金属用具等
法（高压蒸汽灭菌法） 培养基及容器等
（3）三种灭菌方法的比较
类型 湿热灭菌 干热灭菌 灼烧灭菌
媒介 沸水、流通蒸汽或高压蒸汽 热空气 火焰的充分燃烧层
方法 高压蒸汽灭菌：100kPa、121℃，维持15～30min 160～170℃、1～2h 直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
对象 等 耐高温的和需要保持干燥的物品，如 、 等 、试管口、瓶口等
原理 高温或高温、高压使蛋白质 ，导致微生物活体以及芽孢和孢子全部死亡
（4）其他操作
①对实验操作的 、操作者的衣着和手进行清洁和 。
②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行 。（但是不耐高温的培养基或成分可采用其他方法除菌，如血清可通过过滤除菌。）
③为了避免周围环境中微生物的污染，实验操作都应在超净工作台并在 附近进行。
④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与 接触。
【教材拾遗】（选择性必修3P10相关信息）生物消毒法是指利用生物或其代谢物除去环境中部分微生物的方法。
考点2 微生物的纯培养★★★☆☆
1．概念
（1）培养物：在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类 称为培养物。
（2）纯培养物：由 繁殖所获得的微生物群体。
（3）纯培养：获得 的过程。
2.步骤：微生物的纯培养包括 、 、 、 和 等步骤。
3.酵母菌的纯培养
（1）原理：微生物群体分散或稀释成单个细胞，单个细胞繁殖成单个菌落。
菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的 ，这就是菌落。
（2）获得单菌落的方法：采用 法和 法将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
（3）步骤
①制备培养基：配制培养基―→灭菌―→ 板。
倒平板注意事项：a.温度：50℃左右；b.操作：在 附近；c.冷凝后平板倒置。
②接种和分离酵母菌
通过接种环在固体培养基表面 的操作，将聚集的菌种逐步 到培养基的表面。经数次划线后培养，可以分离得到单菌落。
③培养酵母菌
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个 的平板倒置，放入28℃左右的恒温培养箱中培养24～48h。
特别提醒
1.平板冷凝后，要将平板倒置的原因是：因为平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，平板倒置后，可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
2.在培养酵母菌时，取一个灭菌后的未接种的平板，同时培养，这样做的目的是检测培养基平板灭菌是否合格。
3.平板划线法
（1）原理：通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。经数次划线后培养，可以分离得到单菌落。
（2）过程
（3）培养：完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将平板 ，放入培养箱中培养。
（4）注意事项
①灼烧接种环的目的
②接种环灼烧后，待其冷却后才能伸入菌液，以免 。
③第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐 ，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
④划线时最后一区不要与 相连。
⑤划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。
考点3 微生物选择培养和计数★★★☆☆
1.微生物的选择培养
（1）选择培养基
①概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时 或 其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
②举例：筛选土壤中分解尿素的细菌的选择培养基是以 为唯一的氮源的；缺乏 的培养基可筛选自生固氮微生物；加入青霉素的培养基可抑制 ，分离出真菌；将培养基放在 环境中培养，可分离出耐高温的微生物。
（2）稀释涂布平板法
①系列稀释操作：该操作常用在将细胞接种到培养基之前，通过液体稀释的方法分散细胞，随着稀释程度的增大，单位体积中的微生物细胞数量 ，细胞得以分散。操作步骤：
②涂布平板操作步骤
序号 名称 图示 操作
1 取菌液 取0.1mL菌液，滴加到
2 涂布器消毒 将涂布器浸在盛有 的烧杯中
3 涂布器灭菌 将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布
4 涂布平板 用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使
（3）培养平板
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板 ，放入恒温培养箱中培养。
（4）两种微生物纯化方法的比较
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
分离结果
关键操作 接种环在固体培养基表面连续划线 ①一系列的梯度稀释 ②涂布平板操作
接种用具 接种环 涂布器
优点 操作相对简单 可以计数
缺点 不能计数 操作较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延
共同点 都要用到固体培养基；都需进行无菌操作；都可在培养基表面形成 ，可用于微生物的分离；都可用于观察
2.微生物的数量测定
方法 间接计数法（ 法、活菌计数法） 直接计数法（显微计数法）
原理 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的 ，就能推测出样品中大约含有多少活菌 利用特定的血细胞计数板（常用于较大的真核细胞，如酵母菌、霉菌孢子等，及某些较大的原核细胞）或 （常用于相对较小的细菌等），在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量
公式 每克样品中的菌体数：C×M÷V C：某一稀释度几次重复培养后的菌落平均数；M：稀释倍数；V：涂布所用的稀释液体积数（mL） 每毫升原液所含细菌数：①每小格平均细菌数×400×10000× ；②5（或4）个中方格的菌体数×5（或4）×10000×稀释倍数
结果 比实际值偏 ，因为 （因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示） 比实际值偏 ，因为此法
注：稀释涂布平板法计数中，为了使结果接近真实值，应设置三个或三个以上的平板（平行重复原则，增强实验的说服力和准确性），计算菌落平均数。另外，为了保证结果的准确，要求选择同一稀释度的平板菌落数在 的平板进行计数。
特别提醒
常见选择培养基举例：
（1）缺少氮源的培养基可以筛选能利用大气中N2的微生物。
（2）含青霉素的培养基可淘汰细菌，筛选出真菌。
（3）无有机碳源的培养基可筛选出自养微生物。
考点4 实验：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数★★★☆☆
1.原理
（1）只有能合成 的微生物才能分解尿素。
（2）利用以 为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
2.流程
（1）土壤取样：土壤中的细菌绝大部分分布在距地表 的较潮湿土壤层（酸碱度接近中性）。
（2）样品的稀释：为保证获得菌落数为 的平板进行计数，可将细菌稀释倍数为1×103～1×107的稀释液分别涂布到平板上培养。
（3）微生物的培养与观察：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在 的温度下培养1～2d。在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目，选取 时的记录作为结果。
3.实验结果分析与评价
（1）有无杂菌污染的判断：对照的培养皿中无 生长→未被杂菌污染；对照的培养皿中有 生长→被杂菌污染。
（2）培养基是否具筛选作用：选择培养基上的菌落数目远 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目→选择培养基具筛选作用。
（3）样品稀释评价：得到3个或3个以上菌落数目在 的平板→操作成功。
（4）重复组的结果：比较各重复组，若选取同一种土样，统计结果应接近。
4.注意事项
（1）将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
（2）要按照无菌操作的方法，进行规范操作。取土样时用的铁铲和取样纸袋在使用前都需要 。操作完成后，一定要洗手。
（3）本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前 。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和 等。
（4）本实验耗时较长，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。
特别提醒
显微镜直接计数法本身不能区分细菌的死活，但是通过一定的辅助处理，可以实现活菌计数，如在计数前用台盼蓝染液进行染色，可以通过统计无色细胞的个数来对活菌进行计数。
【教材隐性知识】选择性必修3P19“探究·实践”：本活动初步筛选了能分解尿素的细菌，请进一步借助于生物化学的方法来鉴定所分离的菌种：分解尿素的细菌合成的脲酶可以将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，在培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可确定该细菌能够分解尿素。
陷阱1 微生物的基本培养技术的几点易错点
易错表现 正确理解
认为血细胞计数板既可用于酵母菌的数量测定，也可用于细菌的数量测定 血细胞计数板不适用于微小的细菌计数
认为稀释涂布平板法和平板划线法均能得到单菌落，都可用于细菌计数 平板划线法只能用于细菌分离，不能用于细菌计数
认为利用尿素固体培养基可迅速杀死其他微生物，而保留利用尿素的微生物 尿素固体培养基属于选择培养基，以尿素为唯一氮源，不能利用尿素的微生物因缺乏可利用的氮源而不能在此培养基上生存，故尿素固体培养基的作用并不是迅速杀死其他微生物
细菌的分离与计数
1.样品稀释
(1)取10mL待分离菌液，加入90mL无菌生理盐水或LB液体培养基中，充分混匀，制成10-1稀释液。
(2)从10-1稀释液中取1mL，加入9mL无菌稀释液，制成10-2稀释液，以此类推，制备出10-3、10-4等梯度的稀释液。
(3)选择3个–5个适宜的稀释度（通常是菌落数能落在30–300之间的稀释度，便于计数且结果更准确）。
2.涂布接种
(1)取上述选定稀释度的菌液0.1mL–0.2mL，滴加到已灭菌并冷却至45℃左右的固体培养基平板中央。
(2)用无菌涂布器将菌液均匀涂抹在培养基表面，确保菌液覆盖整个平板，避免局部堆积。
3.培养与观察
(1)将接种好的平板倒置（防止冷凝水滴落污染菌落），放入适宜温度的培养箱中（如大肠杆菌在37℃），培养18h–24h。
(2)培养后观察平板，区分不同形态、颜色、大小的菌落，实现细菌分离；同时统计每个平板上的菌落数。
4.计数计算
(1)选取菌落数在30–300之间的平板进行计数，若同一稀释度有多个平板，取其平均值。
(2)按公式计算原始菌液的活菌数：每毫升菌液活菌数=平板平均菌落数×稀释倍数÷涂布菌液体积（mL）。
考点预测：
1.选择培养基的原理与应用：考查选择培养基的定义，即允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。以及配制选择培养基的依据，如根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的，如培养基中不加入氮元素，可以选择培养能固氮的微生物等。
2.统计菌落数目的方法：稀释涂布平板法的原理、操作步骤及计数计算，如当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个细菌，通过统计平板上的菌落数，结合稀释倍数和涂布菌液体积，推算出原始菌液中活菌的数量，一般选择菌落数在30-300之间的平板进行计数。此外，可能还会考查显微镜直接计数法的特点及与稀释涂布平板法的比较。
3.无菌技术：无菌技术在细菌分离与计数实验中的重要性，包括对实验操作空间、操作者的手和衣着的清洁和消毒，对培养器皿、接种用具和培养基等的灭菌方法，如高压蒸汽灭菌法、干热灭菌法、灼烧灭菌法等，以及实验操作过程中如何避免杂菌污染，如在酒精灯火焰附近进行操作等。
4.实验操作步骤及注意事项：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验的具体操作步骤，如样品稀释的方法、涂布接种的操作要点、培养条件及观察内容等。还可能会考查实验中的注意事项，如稀释时要充分混匀，每一步稀释都要更换无菌吸头；涂布时要将菌液均匀涂抹在培养基表面；培养时要将平板倒置等。
5.对照实验的设置：设置对照的目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。如为了排除培养基是否被杂菌污染，需以培养无杂菌污染的培养基作为空白对照；为了判断选择培养基是否起到了选择作用，可将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，牛肉膏蛋白胨培养基可作为对照。
1．（2025·广西·高考真题）利用微生物分解厨余垃圾可实现资源的再利用。下列说法错误的是（　　）
A．厨余垃圾分解过程产生的热量，会影响分解效率
B．对组成复杂的厨余垃圾再分类，可提高利用效率
C．厨余垃圾中的淀粉，可作为微生物的碳源和氮源
D．含盐量高的厨余垃圾，可选用耐高盐的微生物分解
2．（2025·贵州·高考真题）金龟子绿僵菌（Ma）是一种昆虫病原真菌，可以侵染某些农林害虫。Ma寄生时其孢子（单细胞后代）萌发后侵入昆虫体内大量增殖并产生毒素，导致寄主僵化、死亡。下列叙述错误的是（　　）
A．可利用Ma开发成微生物杀虫剂
B．为分离Ma可从研磨的僵虫组织中取样
C．稀释涂布平板法可用于分离样品中的Ma
D．接种培养Ma时使用的器具需消毒
3．（2025·四川·高考真题）微塑料由塑料废弃物风化形成，难以降解，会危害生态环境和人体健康。有人分离到X和Y两种微塑料降解菌，将总菌量相同的X、Y、X+Y（X:Y=1:1）分别接种于含有等量微塑料的蛋白胨液体培养基中，培养一段时间后测定微塑料的残留率（残留率=剩余量/添加量×100%），结果如下图。下列叙述正确的是（ ）
A．用平板划线法能测定X菌组中的活菌数
B．Y菌组微塑料残留率较高，故菌浓度也高
C．混合菌种对微塑料的降解能力高于单一菌种
D．能在该培养基中生长繁殖的微生物都能降解微塑料
4．（2025·江苏·高考真题）从种植草莓的土壤中分离致病菌，简易流程如下：制备土壤悬液、分离、纯化、鉴定。下列相关叙述正确的是（ ）
A．制备的培养基可用紫外线照射进行灭菌
B．将土样加入无菌水混匀，梯度稀释后取悬液加入平板并涂布
C．连续划线时，接上次划线的起始端开始划线
D．鉴定后的致病菌，可接种在斜面培养基上，并在室温下长期保存
5．（2025·陕晋青宁卷·高考真题）我国是世界上最大的柠檬酸生产国。利用黑曲霉通过深层通气液体发酵技术生产柠檬酸，流程如下图。下列叙述错误的是（ ）
A．淀粉水解糖为发酵提供碳源和能源 B．扩大培养可提供足量的黑曲霉菌种
C．培养基、发酵罐和空气的灭菌方法相同 D．通气、搅拌有利于溶解氧增加和柠檬酸积累
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知识主脉络：可视化思维导图，建立知识框架
核心知识库：重难考点总结，梳理必背知识、归纳重点 考点1培养基和无菌技术★★★☆☆ 考点2微生物的纯培养★★★☆☆ 考点3微生物选择培养和计数★★★☆☆ 考点4实验：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数★★★☆☆
陷阱预警台：识别高频错误，提供防错策略（1大陷阱规避）
素养加油站：前沿科研成果或热点问题分析
真题挑战场：感知真题，检验成果，考点追溯
考点1 培养基和无菌技术★★★☆☆
1.培养基
（1）概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
（2）营养成分
①各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐等营养物质。
营养物质 作用 主要来源
水 良好的溶剂、细胞结构的重要组成成分 培养基、空气、代谢产物
碳源 提供碳元素，有机碳源是异养生物的能源物质 葡萄糖、蔗糖、淀粉、纤维素、牛肉膏、蛋白胨等
氮源 提供氮元素，合成蛋白质、核酸、磷脂以及含氮代谢产物 无机氮源，如铵盐、硝酸盐等；有机氮源，如酵母粉、牛肉膏、蛋白胨等
无机盐 组成细胞结构和许多化合物，调节生命活动；某些化能自养菌的能源 如磷酸盐等无机化合物
②培养基的其他条件：满足微生物对pH、特殊营养物质以及O2等的需求。
培养微生物种类 特殊要求
乳酸杆菌 培养基中添加维生素
霉菌 培养基的pH调至酸性
细菌 培养基的pH调至中性或弱碱性
厌氧微生物 需要提供无氧的条件
（3）分类
①按物理状态分类
培养基种类 培养基特点 作用
固体培养基 加凝固剂，如琼脂 微生物的分离与鉴定，活菌计数，保藏菌种
半固体培养基 容器放倒不致流出，剧烈震动则破散 观察微生物的运动、分类鉴定
液体培养基 不加凝固剂 常用于工业生产、微生物的扩大培养
②按化学成分分类
培养基种类 特点 用途
天然培养基 含化学成分不明确的天然物质 工业生产
合成培养基 培养基成分明确（用化学成分已知的化学物质配成） 微生物的分类、鉴定
③按功能分类
种类 制备方法 原理 用途 举例
选择培养基 培养基中加入某些化学物质或缺少某些物质 依据某些微生物对某些物质的特殊需求或抗性而设计 从众多微生物中分离所需的微生物 加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌
鉴别培养基 培养基中加入某种指示剂或化学药品 产生特定的颜色或其他变化 鉴别不同种类的微生物 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂鉴定分解尿素的细菌
2.无菌技术
（1）概念：在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。
①目的：获得纯净的微生物培养物。
②关键：防止杂菌污染。
（2）消毒和灭菌比较
手段 结果 常用方法 应用范围
消毒 较为温和的物理、化学或生物等方法 杀死物体表面或内部一部分微生物 煮沸消毒法 日常用品
巴氏消毒法 牛奶等不耐高温的液体
化学药剂消毒法 用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源
紫外线消毒法 接种室、接种箱或超净工作台
灭菌 强烈的理化方法 杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 灼烧灭菌法 接种工具、一些金属用具等
干热灭菌法 玻璃器皿、金属用具等
湿热灭菌 法（高压蒸汽灭菌法） 培养基及容器等
（3）三种灭菌方法的比较
类型 湿热灭菌 干热灭菌 灼烧灭菌
媒介 沸水、流通蒸汽或高压蒸汽 热空气 火焰的充分燃烧层
方法 高压蒸汽灭菌：100kPa、121℃，维持15～30min 160～170℃、1～2h 直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
对象 培养基等 耐高温的和需要保持干燥的物品，如玻璃器皿、金属用具等 接种工具、试管口、瓶口等
原理 高温或高温、高压使蛋白质变性失活，导致微生物活体以及芽孢和孢子全部死亡
（4）其他操作
①对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。
②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。（但是不耐高温的培养基或成分可采用其他方法除菌，如血清可通过过滤除菌。）
③为了避免周围环境中微生物的污染，实验操作都应在超净工作台并在酒精灯火焰附近进行。
④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。
【教材拾遗】（选择性必修3P10相关信息）生物消毒法是指利用生物或其代谢物除去环境中部分微生物的方法。
考点2 微生物的纯培养★★★☆☆
1．概念
（1）培养物：在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。
（2）纯培养物：由单一个体繁殖所获得的微生物群体。
（3）纯培养：获得纯培养物的过程。
2.步骤：微生物的纯培养包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。
3.酵母菌的纯培养
（1）原理：微生物群体分散或稀释成单个细胞，单个细胞繁殖成单个菌落。
菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。
（2）获得单菌落的方法：采用平板划线法和稀释涂布平板法将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
（3）步骤
①制备培养基：配制培养基―→灭菌―→倒平板。
倒平板注意事项：a.温度：50℃左右；b.操作：在酒精灯火焰附近；c.冷凝后平板倒置。
②接种和分离酵母菌
通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。经数次划线后培养，可以分离得到单菌落。
③培养酵母菌
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右的恒温培养箱中培养24～48h。
特别提醒
1.平板冷凝后，要将平板倒置的原因是：因为平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，平板倒置后，可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
2.在培养酵母菌时，取一个灭菌后的未接种的平板，同时培养，这样做的目的是检测培养基平板灭菌是否合格。
3.平板划线法
（1）原理：通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。经数次划线后培养，可以分离得到单菌落。
（2）过程
（3）培养：完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将平板倒置，放入培养箱中培养。
（4）注意事项
①灼烧接种环的目的
②接种环灼烧后，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。
③第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
④划线时最后一区不要与第一区相连。
⑤划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。
考点3 微生物选择培养和计数★★★☆☆
1.微生物的选择培养
（1）选择培养基
①概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
②举例：筛选土壤中分解尿素的细菌的选择培养基是以尿素为唯一的氮源的；缺乏氮源的培养基可筛选自生固氮微生物；加入青霉素的培养基可抑制细菌，分离出真菌；将培养基放在高温环境中培养，可分离出耐高温的微生物。
（2）稀释涂布平板法
①系列稀释操作：该操作常用在将细胞接种到培养基之前，通过液体稀释的方法分散细胞，随着稀释程度的增大，单位体积中的微生物细胞数量减少，细胞得以分散。操作步骤：
②涂布平板操作步骤
序号 名称 图示 操作
1 取菌液 取0.1mL菌液，滴加到培养基表面
2 涂布器消毒 将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中
3 涂布器灭菌 将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布
4 涂布平板 用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀
（3）培养平板
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入恒温培养箱中培养。
（4）两种微生物纯化方法的比较
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
分离结果
关键操作 接种环在固体培养基表面连续划线 ①一系列的梯度稀释 ②涂布平板操作
接种用具 接种环 涂布器
优点 操作相对简单 可以计数
缺点 不能计数 操作较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延
共同点 都要用到固体培养基；都需进行无菌操作；都可在培养基表面形成单菌落，可用于微生物的分离；都可用于观察菌落特征
2.微生物的数量测定
方法 间接计数法（稀释涂布平板法、活菌计数法） 直接计数法（显微计数法）
原理 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌 利用特定的血细胞计数板（常用于较大的真核细胞，如酵母菌、霉菌孢子等，及某些较大的原核细胞）或细菌计数板（常用于相对较小的细菌等），在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量
公式 每克样品中的菌体数：C×M÷V C：某一稀释度几次重复培养后的菌落平均数；M：稀释倍数；V：涂布所用的稀释液体积数（mL） 每毫升原液所含细菌数：①每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数；②5（或4）个中方格的菌体数×5（或4）×10000×稀释倍数
结果 比实际值偏小，因为当两个或多个菌体连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落（因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示） 比实际值偏大，因为此法不能区分死细胞和活细胞
注：稀释涂布平板法计数中，为了使结果接近真实值，应设置三个或三个以上的平板（平行重复原则，增强实验的说服力和准确性），计算菌落平均数。另外，为了保证结果的准确，要求选择同一稀释度的平板菌落数在30～300的平板进行计数。
特别提醒
常见选择培养基举例：
（1）缺少氮源的培养基可以筛选能利用大气中N2的微生物。
（2）含青霉素的培养基可淘汰细菌，筛选出真菌。
（3）无有机碳源的培养基可筛选出自养微生物。
考点4 实验：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数★★★☆☆
1.原理
（1）只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。
（2）利用以尿素为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
2.流程
（1）土壤取样：土壤中的细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的较潮湿土壤层（酸碱度接近中性）。
（2）样品的稀释：为保证获得菌落数为30～300的平板进行计数，可将细菌稀释倍数为1×103～1×107的稀释液分别涂布到平板上培养。
（3）微生物的培养与观察：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
3.实验结果分析与评价
（1）有无杂菌污染的判断：对照的培养皿中无菌落生长→未被杂菌污染；对照的培养皿中有菌落生长→被杂菌污染。
（2）培养基是否具筛选作用：选择培养基上的菌落数目远少于牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目→选择培养基具筛选作用。
（3）样品稀释评价：得到3个或3个以上菌落数目在30-300的平板→操作成功。
（4）重复组的结果：比较各重复组，若选取同一种土样，统计结果应接近。
4.注意事项
（1）将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
（2）要按照无菌操作的方法，进行规范操作。取土样时用的铁铲和取样纸袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
（3）本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
（4）本实验耗时较长，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。
特别提醒
显微镜直接计数法本身不能区分细菌的死活，但是通过一定的辅助处理，可以实现活菌计数，如在计数前用台盼蓝染液进行染色，可以通过统计无色细胞的个数来对活菌进行计数。
【教材隐性知识】选择性必修3P19“探究·实践”：本活动初步筛选了能分解尿素的细菌，请进一步借助于生物化学的方法来鉴定所分离的菌种：分解尿素的细菌合成的脲酶可以将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，在培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可确定该细菌能够分解尿素。
陷阱1 微生物的基本培养技术的几点易错点
易错表现 正确理解
认为血细胞计数板既可用于酵母菌的数量测定，也可用于细菌的数量测定 血细胞计数板不适用于微小的细菌计数
认为稀释涂布平板法和平板划线法均能得到单菌落，都可用于细菌计数 平板划线法只能用于细菌分离，不能用于细菌计数
认为利用尿素固体培养基可迅速杀死其他微生物，而保留利用尿素的微生物 尿素固体培养基属于选择培养基，以尿素为唯一氮源，不能利用尿素的微生物因缺乏可利用的氮源而不能在此培养基上生存，故尿素固体培养基的作用并不是迅速杀死其他微生物
细菌的分离与计数
1.样品稀释
(1)取10mL待分离菌液，加入90mL无菌生理盐水或LB液体培养基中，充分混匀，制成10-1稀释液。
(2)从10-1稀释液中取1mL，加入9mL无菌稀释液，制成10-2稀释液，以此类推，制备出10-3、10-4等梯度的稀释液。
(3)选择3个–5个适宜的稀释度（通常是菌落数能落在30–300之间的稀释度，便于计数且结果更准确）。
2.涂布接种
(1)取上述选定稀释度的菌液0.1mL–0.2mL，滴加到已灭菌并冷却至45℃左右的固体培养基平板中央。
(2)用无菌涂布器将菌液均匀涂抹在培养基表面，确保菌液覆盖整个平板，避免局部堆积。
3.培养与观察
(1)将接种好的平板倒置（防止冷凝水滴落污染菌落），放入适宜温度的培养箱中（如大肠杆菌在37℃），培养18h–24h。
(2)培养后观察平板，区分不同形态、颜色、大小的菌落，实现细菌分离；同时统计每个平板上的菌落数。
4.计数计算
(1)选取菌落数在30–300之间的平板进行计数，若同一稀释度有多个平板，取其平均值。
(2)按公式计算原始菌液的活菌数：每毫升菌液活菌数=平板平均菌落数×稀释倍数÷涂布菌液体积（mL）。
考点预测：
1.选择培养基的原理与应用：考查选择培养基的定义，即允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。以及配制选择培养基的依据，如根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的，如培养基中不加入氮元素，可以选择培养能固氮的微生物等。
2.统计菌落数目的方法：稀释涂布平板法的原理、操作步骤及计数计算，如当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个细菌，通过统计平板上的菌落数，结合稀释倍数和涂布菌液体积，推算出原始菌液中活菌的数量，一般选择菌落数在30-300之间的平板进行计数。此外，可能还会考查显微镜直接计数法的特点及与稀释涂布平板法的比较。
3.无菌技术：无菌技术在细菌分离与计数实验中的重要性，包括对实验操作空间、操作者的手和衣着的清洁和消毒，对培养器皿、接种用具和培养基等的灭菌方法，如高压蒸汽灭菌法、干热灭菌法、灼烧灭菌法等，以及实验操作过程中如何避免杂菌污染，如在酒精灯火焰附近进行操作等。
4.实验操作步骤及注意事项：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验的具体操作步骤，如样品稀释的方法、涂布接种的操作要点、培养条件及观察内容等。还可能会考查实验中的注意事项，如稀释时要充分混匀，每一步稀释都要更换无菌吸头；涂布时要将菌液均匀涂抹在培养基表面；培养时要将平板倒置等。
5.对照实验的设置：设置对照的目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。如为了排除培养基是否被杂菌污染，需以培养无杂菌污染的培养基作为空白对照；为了判断选择培养基是否起到了选择作用，可将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，牛肉膏蛋白胨培养基可作为对照。
1．（2025·广西·高考真题）利用微生物分解厨余垃圾可实现资源的再利用。下列说法错误的是（　　）
A．厨余垃圾分解过程产生的热量，会影响分解效率
B．对组成复杂的厨余垃圾再分类，可提高利用效率
C．厨余垃圾中的淀粉，可作为微生物的碳源和氮源
D．含盐量高的厨余垃圾，可选用耐高盐的微生物分解
【答案】C
【详解】A、微生物分解有机物时通过呼吸作用释放热量，若温度过高可能导致酶活性下降，从而影响分解效率，A正确；
B、厨余垃圾成分复杂，分类后可根据不同成分选择适宜微生物或处理条件，提高分解效率，B正确；
C、淀粉由C、H、O组成，仅含碳元素，可为微生物提供碳源，但无法提供氮源（氮源需含N元素），C错误；
D、高盐环境会抑制普通微生物生长，但耐高盐微生物（如嗜盐菌）可适应此环境并分解有机物，D正确。
故选C。
2．（2025·贵州·高考真题）金龟子绿僵菌（Ma）是一种昆虫病原真菌，可以侵染某些农林害虫。Ma寄生时其孢子（单细胞后代）萌发后侵入昆虫体内大量增殖并产生毒素，导致寄主僵化、死亡。下列叙述错误的是（　　）
A．可利用Ma开发成微生物杀虫剂
B．为分离Ma可从研磨的僵虫组织中取样
C．稀释涂布平板法可用于分离样品中的Ma
D．接种培养Ma时使用的器具需消毒
【答案】D
【详解】A、金龟子绿僵菌（Ma）作为昆虫病原真菌，可通过寄生导致害虫死亡，符合微生物杀虫剂的特点，可用于生物防治，A正确；
B、僵化死亡的昆虫体内含有大量Ma菌体，因此从研磨的僵虫组织取样是分离Ma的合理方法，B正确；
C、稀释涂布平板法可通过梯度稀释和菌落形成来分离纯化微生物，适用于分离样品中的Ma，C正确；
D、微生物培养中，接种环等直接接触菌种的器具需严格灭菌（如灼烧灭菌），而非仅消毒，消毒无法彻底杀灭微生物的芽孢或孢子，D错误。
故选D。
【考点追溯】
消毒是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。灭菌是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物,包括芽孢和孢子。(P10)
3．（2025·四川·高考真题）微塑料由塑料废弃物风化形成，难以降解，会危害生态环境和人体健康。有人分离到X和Y两种微塑料降解菌，将总菌量相同的X、Y、X+Y（X:Y=1:1）分别接种于含有等量微塑料的蛋白胨液体培养基中，培养一段时间后测定微塑料的残留率（残留率=剩余量/添加量×100%），结果如下图。下列叙述正确的是（ ）
A．用平板划线法能测定X菌组中的活菌数
B．Y菌组微塑料残留率较高，故菌浓度也高
C．混合菌种对微塑料的降解能力高于单一菌种
D．能在该培养基中生长繁殖的微生物都能降解微塑料
【答案】C
【分析】接种最常用的方法：
（1）平板划线分离法：由接种环以菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。
（2）稀释平板法：首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个细胞），再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。
【详解】A、平板划线法主要用于微生物的分离和纯化，不能用于测定活菌数，测定活菌数常用稀释涂布平板法，A错误；
B、Y菌组微塑料残留率较高，说明Y菌对微塑料的降解能力相对较弱，而不是菌浓度高，微塑料残留率与菌对微塑料的降解能力有关，而非直接与菌浓度相关，B错误；
C、由图可知，X+Y混合菌种组的微塑料残留率低于X菌组和Y菌组，说明混合菌种对微塑料的降解能力高于单一菌种，C正确；
D、该培养基中含有蛋白胨，能在该培养基中生长繁殖的微生物可能利用蛋白胨作为碳源和氮源等，但不一定都能降解微塑料，D错误。
故选C。
【考点追溯】
分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体,这就是菌落。采用平板划线法和稀释涂布平板法能将单个微生物分散在固体培养基上,之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。(P12)
4．（2025·江苏·高考真题）从种植草莓的土壤中分离致病菌，简易流程如下：制备土壤悬液、分离、纯化、鉴定。下列相关叙述正确的是（ ）
A．制备的培养基可用紫外线照射进行灭菌
B．将土样加入无菌水混匀，梯度稀释后取悬液加入平板并涂布
C．连续划线时，接上次划线的起始端开始划线
D．鉴定后的致病菌，可接种在斜面培养基上，并在室温下长期保存
【答案】B
【分析】微生物常见的接种方法：（1）平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在划线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。（2）稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
【详解】A、制备的培养基需用高压蒸汽灭菌法灭菌，紫外线仅用于表面或空气消毒，无法灭菌，A错误；
B、将土样加入无菌水制成悬液，经梯度稀释后，取各稀释度菌液涂布于培养基表面，分离并计数，B正确；
C、连续划线时，每次应从上次划线的末端开始，以逐步稀释菌体，若从起始端开始无法有效分离单菌落，C错误；
D、斜面培养基保存菌种需置于4℃短期保存，长期保存应使用甘油管藏法（-20℃），室温下无法长期保存，D错误。
故选B。
【考点追溯】
灭菌
（1）灭菌是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
（2）灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、湿热灭菌。
5．（2025·陕晋青宁卷·高考真题）我国是世界上最大的柠檬酸生产国。利用黑曲霉通过深层通气液体发酵技术生产柠檬酸，流程如下图。下列叙述错误的是（ ）
A．淀粉水解糖为发酵提供碳源和能源 B．扩大培养可提供足量的黑曲霉菌种
C．培养基、发酵罐和空气的灭菌方法相同 D．通气、搅拌有利于溶解氧增加和柠檬酸积累
【答案】C
【分析】黑曲霉发酵时需通入空气，为异养需氧型。
【详解】A、淀粉水解形成的糖类可以作为黑曲霉生存所需的碳源，氧化分解可以为黑曲霉提供能源，A正确；
B、通过液体培养基的扩大培养，可以为后续的发酵罐内发酵提供足量的黑曲霉菌种，B正确；
C、空气一般用过滤除菌的方式，培养基一般用高压蒸汽灭菌的方式，发酵罐可以用高温灭菌的方式等，因此它们的灭菌方法不相同，C错误；
D、已知利用黑曲霉通过深层通气液体发酵技术生产柠檬酸，说明通气、搅拌有利于溶解氧增加，有利于发酵产物柠檬酸的积累，D正确。
故选C。
【考点追溯】
分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体,这就是菌落。采用平板划线法和稀释涂布平板法能将单个微生物分散在固体培养基上,之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。(P12)
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