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2026江苏高考生物学的二轮专题
非选择题突破5　基因工程情境
共4题,共49分。除标注外,每空1分。
1.(13分)(2025·苏北四市一模)为了提升猪瘟病毒疫苗的效果,科研人员构建了猪瘟病毒p30蛋白基因(p30)与白喉毒素无毒突变基因(CRM197A)的融合
基因表达质粒,以生产融合蛋白疫苗。图1为质粒构建、疫苗生产以及效果测试示意图,请回答下列问题。
图1
图2
(1)除图1中所示结构外,pET32a质粒上还具有的结构是　　　　　,终止子的功能是　　　　　。
(2)引物F1-F的设计依据是质粒上游同源序列和　　　　　。通过PCR分别扩增p30基因和CRM197A基因时配制的两个反应体系中相同的物质有:缓冲液(含Mg2+)、无菌水、　　　　　　　　　　　等,缓冲液的功能是　　　　　　　　　　。
(3)筛选时科研人员挑选了5个菌落,提取质粒后加入BamHⅠ、HindⅢ酶切、电泳,结果如图2所示。可初步判断　　　　　号菌落含有构建成功的融合基因表达质粒。p30和CRM197A基因　　　　　(填“含”或“不含”)BamHⅠ、HindⅢ酶切位点,理由是　　　　　　　　　　　　　　　　。
(4)为进一步确认质粒构建成功,科研人员检测上述菌落后发现某个菌落中同时含有空载质粒和融合基因表达质粒,可能的原因是 　　　　　　　　　　　　　　　　(2分)。
(5)为验证融合蛋白疫苗的效果,科研人员将p30蛋白、p30-CRM197A融合蛋白分别注射到小鼠体内,检测抗体含量,结果如图3所示。据此可以判定融合蛋白疫苗效果更好,依据有 　　　　　　　　　　　　　　　　(2分)。
深入研究表明某些抗原呈递细胞表面有　　　　,识别、摄取CRM197A的同时也促进了p30的摄取,从而加强了疫苗效果。
图3
2.(12分)(2025·泰州期初质检)水稻基因组中的B基因仅在体细胞和精子中正常表达,在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响,科研人员设计了下图1所示实验。请回答下列问题。
图1
(1)为获取图1中水稻B基因编码蛋白的序列(740 bp),通常采用从　　　　　　　中提取总RNA,经　　　　　　技术从而获得大量的B基因编码序列。
(2)将B基因编码蛋白的序列与荧光素酶Luc基因(460 bp)连接成融合基因,融合基因及重组表达载体构建均采用了无缝克隆的同源重组技术。这一过程与传统重组质粒构建过程相比,无需使用　　　　　。
(3)检测转基因水稻是否含有融合基因,可通过PCR技术对融合基因进行扩增并通过　　　　　　电泳进行鉴定,需注意观察,当　　　　　　接近凝胶边缘时,停止电泳,取出凝胶置于　　　　　观察和照相。对于电泳结果符合预期的基因片段,通常还需进一步通过基因测序确认,原因是　 　　　　　　　　　　　　　　　　(2分)。
(4)检测转基因水稻是否成功表达,可从转基因水稻的　　　中提取蛋白质,并在其中加入　　　,观察是否发出荧光。
(5)已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11 kDa,将融合基因表达的蛋白先进行凝胶电泳,然后用B蛋白抗体进行杂交,显示的条带应是　　　(从图2的“A~D”中选填)。
图2
(6)从转基因植株未成熟种子中分离出胚,观察到细胞内仅含一个染色体组,判定该胚是由未受精的卵细胞发育形成的,而一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育,由此表明　　　　　　　　　　　　　　　　　。
3.(13分)(2025·扬州期末)Ⅰ型遗传性酪氨酸血症(HT1)是一种酪氨酸代谢异常引发肝损伤的疾病。研究人员基于益生大肠杆菌(EcN)设计了一种能高效代谢酪氨酸的肠道工程益生菌(EcN-HT)用于治疗HT1模型小鼠,如图1所示。其中,基因TyrP(编码酪氨酸转运蛋白TyrP)和基因HpaBC(编码酶HpaBC,催化酪氨酸代谢生成无毒物质L-DOPA)均为目的基因。图2表示质粒pUC57的结构示意图,相关限制酶的识别序列和切割位点见表1。请回答下列问题。
图1
图2
限制酶 BamHⅠ HindⅢ BglⅡ
识别序列及 切割位点
限制酶 EcoRⅠ MboⅠ SmaⅠ
识别序列及 切割位点
(1)肠道微生物与人体健康密不可分。EcN的鞭毛通过单个菌之间的相互作用在肠道上皮形成紧密的防护网,可抑制病原菌的侵袭,这种防御属于机体的　　　　　　免疫。图1中,TyrP需要表达在EcN-HT的细胞膜上,以促进对酪氨酸的吸收。则EcN-HT中参与TyrP的合成与定位的结构有　　　　　(填序号)。
①内质网　②核糖体　③细胞膜　④高尔基体
(2)图2中pfnr的基本组成单位是　　　　　。在　　　条件下,一些特定的信号分子会与pfnr结合,进而改变其构象或活性,使其能与RNA聚合酶更有效地结合,启动下游基因表达。
(3)为实现高效构建重组质粒并筛选获得EcN-HT工程菌,研究人员开展以下实验。
Ⅰ.获得含基因TyrP的菌株EcN-T。
①获取基因TyrP;
②选用限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ,分别切割 　　　　　　　　　　　　　　　　,
构建重组质粒pUC57-T;
③将pUC57-T导入EcN,并将其接种在含有X-gal、卡那霉素的固体培养基甲上,培养一段时间后,菌落呈　　　色的为目的菌株EcN-T。
Ⅱ.获得含基因TyrP和HpaBC的EcN-HT工程菌。
④获取基因HpaBC;
⑤选用限制酶　　　　　　　　,构建重组质粒pUC57-H;
⑥将pUC57-H导入EcN-T,并将其接种在培养基乙上,以筛选出含双质粒的菌株EcN-HT。相比培养基甲,培养基乙特有的成分是　　　。
(4)图3显示目的基因TyrP两端的部分碱基序列,为获得能与质粒pUC57相连接的目的基因,PCR时设计的引物应选用　　　　　。
图3
A.5'-AAGGCACCCGGG-3'和5'-TGTTACGAATTC-3'
B.5'-AAGGCACCCGGG-3'和5'-CATTGTGAATTC-3'
C.5'-GAATTCAAGGCA-3'和5'-CCCGGGCATTGT-3'
D.5'-GAATTCTGTTAC-3'和5'-CCCGGGAAGGCA-3'
(5)本实验将TyrP基因和HpaBC基因分别构建两种重组质粒导入受体细胞,与装载在同一个质粒的方法相比,优点有　　　　　(2分)。
A.提高导入受体细胞的效率
B.降低基因逃逸的可能性,不存在生物安全风险
C.增强基因表达的灵活性
D.提高基因的稳定性,增强治疗的效果
(6)进一步研究表明,EcN-HT可以有效缓解HT1模型小鼠肝脏损伤等病症,其作用机理是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(2分)。
4.(11分)将野生型谷氨酸棒状杆菌利用同源重组(将外源目的基因与受体的同源序列交换)的方法敲除葡萄糖转运系统关键酶基因ptsG,可以实现葡萄糖转运阻断,为分子水平研究葡萄糖转运提供参考。ptsG基因敲除质粒构建过程如图1所示,其中KanR是卡那霉素抗性基因,SacB是将蔗糖转变为果聚糖的基因,果聚糖积累对细菌有毒害,XhoⅠ、EcoRⅠ的识别序列和切割位点分别是5'-C↓TCGAG-3'、5'-G↓AATTC-3'。据此回答下列问题。
图1
图2
(1)图1中利用PCR获得上同源臂区段至少需要扩增　　　　轮。从引物角度分析,扩增得到上、下同源臂能拼接到一起的关键是　 　　　　　　　　　　　　　　　　。
ptsG基因敲除质粒构建过程中,选用XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切的优点是 　　　　　　(2分)。XhoⅠ酶切割形成的黏性末端为　　　　　　　,其突出的末端是游离的　　　　基团。
(2)为扩增敲除ptsG基因的质粒,先将其导入工程菌中,此步骤需先用一定浓度的CaCl2溶液处理工程菌使其处于感受态,感受态是一种　　　　　　　　　　　　　　　　　　　的生理状态。在工程菌筛选时,可分别接种到含卡那霉素培养基、含10%蔗糖培养基,　　　　　　　　(填“仅能在含卡那霉素”“仅能在含10%蔗糖”或“两种”)培养基上生长的为目的菌。
(3)将筛选得到的敲除ptsG基因质粒导入野生型谷氨酸棒状杆菌,通过两次同源重组可敲除ptsG基因(如图2)。①验证同源重组是否成功,可以设计特定的引物进行PCR,通常将扩增产物利用　　　　　　　　　方法鉴定。②若从细胞水平上证明谷氨酸棒状杆菌的ptsG基因敲除成功,还需要将该菌和野生型谷氨酸棒状杆菌分别培养在以葡萄糖为唯一碳源的　　　　　培养基(按功能分)上,该菌对葡萄糖的利用率明显比野生型菌　　　　　。
参考答案
1.答案 (1)复制原点　终止转录
(2)p30(上游)末端序列　耐高温的DNA聚合酶、dNTP　维持适宜的pH(或为酶提供适宜的反应条件)
(3)2和4　不含　2和4中只有两个条带(或若含有酶切位点,2和4中条带数应多于两条)
(4)涂布平板时含有不同质粒的细菌未分开,形成一个菌落(或一个细菌同时吸收了空载质粒和融合表达质粒)
(5)(诱发机体)短时间内产生更多抗体(或作用效果快),长时间维持较高水平抗体(或持续时间长)　CRM197A受体(或特异性受体)
解析 (1)质粒需要具有启动子、终止子、标记基因、复制原点和目的基因,图中所示结构还需具有复制原点,终止子的功能是终止转录。
(2)由图可知,引物F1-F的设计依据是质粒上游同源序列和p30上游同源序列,PCR中共有的物质有含Mg2+的缓冲液、无菌水、耐高温的DNA聚合酶(以催化DNA的子链的延伸)、dNTP(原料)等,缓冲液的功能是维持适宜的pH,其中的Mg2+具有激活DNA聚合酶的作用。
(3)由图1可知,构建成功的融合基因表达质粒经BamHⅠ、HindⅢ酶切后含600+500+25=1 125个碱基对,结合图2可知,2、4号菌落含有构建成功的融合基因表达质粒。由于2和4中只有两个条带,所以p30和CRM197A基因不含BamHⅠ、HindⅢ酶切位点,若含有酶切位点,2和4中条带数应多于两条。
(4)由图1可知,上述菌落是经稀释涂布平板法获得的,可能在涂布平板时含有不同质粒的细菌未分开,形成一个菌落,导致某个菌落中同时含有空载质粒和融合基因表达质粒。
(5)由图3可知,将p30-CRM197A融合蛋白注入小鼠体内后,产生抗体快,维持高抗体量时间长,说明其作为疫苗效果较p30蛋白更好。抗原呈递细胞能识别、摄取CRM197A,说明抗原呈递细胞上具有CRM197A受体。
2.答案 (1)体细胞或精子　RT-PCR
(2)限制酶
(3)琼脂糖凝胶　指示剂前沿　紫外灯下　琼脂糖凝胶电泳仅能检测DNA分子的相对大小,无法测定其碱基序列
(4)卵细胞　荧光素
(5)C
(6)B基因表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚
3.答案 (1)非特异性　②③
(2)脱氧核苷酸　厌氧(低氧/缺氧)
(3)含基因TyrP的DNA片段和质粒pUC57　白　BglⅡ、EcoRⅠ　氯霉素
(4)C
(5)ACD
(6)EcN-HT可以吸收酪氨酸,使其转变成无毒物质(减少小鼠体内酪氨酸及毒性中间代谢产物的蓄积)
解析 (1)EcN的鞭毛通过单个菌之间的相互作用在肠道上皮形成紧密的防护网,属于免疫的第一道防线,为非特异性免疫。EcN-HT为原核生物,无内质网和高尔基体,参与TyrP的合成与定位的结构有②核糖体和③细胞膜。
(2)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出mRNA。图2中pfnr为厌氧启动子,基本组成单位是脱氧核苷酸。在厌氧条件下,pfnr可与RNA聚合酶结合,启动基因表达。
(3)构建重组质粒pUC57-T时,目的基因为基因TyrP、载体是质粒pUC57,因此,用限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ应分别切割含基因TyrP的DNA片段和质粒pUC57。基因lacZr表达的酶蛋白可将无色的X-gal水解成蓝色产物。由图2可知:基因lacZr在限制酶EcoRⅠ的识别序列和切割位点内。构建重组质粒pUC57-T时,用限制酶EcoRⅠ切割质粒pUC57,基因lacZr的结构被破坏,不能表达相应的酶蛋白,所以将pUC57-T导入EcN,并将其接种在含有X-gal、卡那霉素的固体培养基甲上。培养一段时间后,成功导入pUC57-T的菌落呈白色,此白色菌落即为目的菌株EcN-T。目的基因应该插入启动子和终止子之间,可选的限制酶只有BglⅡ、EcoRⅠ、MboⅠ、SmaⅠ,由于BglⅡ的识别序列中含有MboⅠ识别序列,如果使用MboⅠ,BglⅡ的识别序列也会被切割,且由于重组质粒pUC57-T破坏了标记基因Cmr(氯霉素抗性基因),为了区分两者的不同,那么构建的重组质粒pUC57-H不能破坏该标记基因,因此构建重组质粒pUC57-H需选用限制酶BglⅡ、EcoRⅠ。筛选含双质粒的菌株EcN-HT时,固体培养基乙应加入卡那霉素、氯霉素、X-gal。相比培养基甲,培养基乙特有的成分是氯霉素。
(4)由于构建重组质粒pUC57-T时,选用限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ分别切割含基因TyrP的DNA片段和质粒pUC57,根据该基因的转录方向和质粒中启动子和终止子的位置,该基因的左端应该加上EcoRⅠ识别序列,右端应该加上SmaⅠ识别序列,由于DNA聚合酶只能从引物的3'端延伸子链,左端的引物应该是5'-GAATTCAAGGCA-3',同理,右端的引物是5'-CCCGGGCATTGT-3',C项符合题意。
(5)与装载在同一个质粒的方法相比,将TyrP基因和HpaBC基因分别构建两种重组质粒,这两种重组质粒均较小,可提高导入受体细胞的效率,A项正确;将外源基因导入受体细胞,构成的工程菌也可能存在生物安全风险,B项错误;与装载在同一个质粒的方法相比,将TyrP基因和HpaBC基因分别构建两种重组质粒,两种基因的表达无相关性,增强了基因表达的灵活性,同时也使基因的稳定性得以提高,进而增强治疗的效果,C、D两项正确。
(6)在肠道工程益生菌体内,基因TyrP编码的酪氨酸转运蛋白TyrP有助于细胞吸收酪氨酸,基因HpaBC编码的酶HpaBC能催化酪氨酸代谢生成无毒物质L-DOPA,可有效缓解HT1模型小鼠肝损伤等病症。
4.答案 (1)2　引物2和引物3的5'端具有配对序列　避免质粒或目的基因的自我拼接、避免目的基因倒接　TCGA-　磷酸
(2)能吸收周围环境中DNA分子　仅能在含卡那霉素
(3)琼脂糖凝胶电泳　选择　低
解析 (1)第一轮扩增出来的DNA双链不等长,再经第二轮的扩增才能得到上同源臂或下同源臂区段,所以至少需要扩增2轮;从引物角度分析,扩增得到上、下同源臂拼接到一起的关键是引物2和引物3的5'端有配对序列,这样热变性后再复性时上同源区段和下同源区段的互补序列可通过氢键连接,从而拼接到一起;ptsG基因敲除质粒构建过程中,选用XhoⅠ和EcoRⅠ进行双酶切的优点是由于两种酶切后的黏性末端不同,从而可以避免目的基因的自身环化以及质粒和目的基因反向连接。XhoⅠ的识别序列和切割位点分别是5'-C↓TCGAG-3',则XhoⅠ酶切割形成的黏性末端为TCGA-,其突出的末端是游离的磷酸基团。
(2)感受态是一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。敲除ptsG基因的质粒导入工程菌时,由于质粒上带有卡那霉素抗性基因KanR,可在含卡那霉素培养基上生长,具有SacB基因能将蔗糖转变为果聚糖,果聚糖积累对细菌有毒害,所以不能在含有蔗糖的培养基上生长,仅能在含卡那霉素培养基上生长的为目的菌。
(3)①敲除pstG基因后的同源重组片段与原基因片段的碱基数量不同,可通过琼脂糖凝胶电泳加以区分。
②将该菌和野生型谷氨酸棒状杆菌分别培养在以葡萄糖为唯一碳源的选择培养基上,从而起到筛选作用;ptsG基因为葡萄糖转运系统关键酶基因,敲除后该菌对葡萄糖的利用率明显比野生型菌低。
21世纪教育网 www.21cnjy.com 精品试卷·第 2 页 （共 2 页）
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