资源简介 (共85张PPT)基因工程第2讲目 录主题微课(一) 基因工程的操作工具和步骤主题微课(二) PCR技术和基因编辑技术及其应用010201主题微课(一) 基因工程的操作工具和步骤深化点(一) 基因工程的主要操作步骤[例1] (2024·西安模拟)青蒿素是有效的抗疟疾药物,但野生黄花蒿中青蒿素的产量较低。为缓解青蒿素供应不足的状况,科学家将基因tms和tmr导入黄花蒿的愈伤组织,获得了黄花蒿的冠瘿组织,改造过程用到的部分结构如图所示。下列叙述错误的是 ( )A.将目的基因导入黄花蒿愈伤组织细胞常用的方法是农杆菌转化法B.图中P位于基因的上游,作用是RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动转录C.图中缺少标记基因,标记基因的作用是表达出目的基因产物D.欲检测目的基因是否导入冠瘿组织细胞的染色体DNA上可采用PCR技术√[解析] 将目的基因导入黄花蒿愈伤组织细胞常用的方法是农杆菌转化法,A正确;图中P为启动子,位于基因的上游,作用是RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动转录,B正确;图中缺少标记基因,标记基因的作用是便于重组DNA分子的筛选,C错误;要检测目的基因是否导入冠瘿组织细胞的染色体DNA上,可采用PCR技术,D正确。深化点(二) 限制酶的选取与基因表达载体的构建1.限制酶的选择技巧(1)根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶①应选择切点位于目的基因两端的限制酶,不能选择切点位于目的基因内部的限制酶,如图甲不能选择限制酶SmaⅠ。②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点,如图乙)。(2)根据质粒的特点选择限制酶(如图)2.基因表达载体的构建过程(如图)微点拨:利用PCR进行检测,观察能否正常进行扩增,以确定目的基因是正向连接还是反向连接。[例2] (2024·江西高考)γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coli A,构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E.coli B。下列叙述正确的是 ( )A.上图表明,可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadBB.E.coli B发酵生产γ-氨基丁酸时,L-谷氨酸钠的作用是供能C.E.coli A和E.coli B都能高效降解γ-氨基丁酸D.可以用其他酶替代Nco Ⅰ和Kpn Ⅰ构建重组质粒√[解析] 研究人员采用题图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coli A,说明可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB,A正确;由题意分析可知,E.coli B以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸,该过程中L-谷氨酸钠的作用不是供能,B错误;γ-氨基丁酸是E.coli A导入L-谷氨酸脱羧酶基因(gadB)后形成的菌株E.coli B的产物,两者都不能高效降解γ-氨基丁酸,C错误;图中质粒上含有NcoⅠ和KpnⅠ的酶切位点,但不确定是否含其他限制酶的酶切位点,因而不确定是否可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒,D错误。考法(一) 基因工程的基本工具和操作1.(2024·普洱期末)培育转基因生物时,需要在体外对DNA分子进行“切割”“改造”和“拼接”。限制酶是常使用的工具酶之一,下图表示4种限制酶的识别序列及切割位点。下列叙述错误的是( )微 课 测 评 作 业A.4种限制酶都能催化磷酸二酯键断开B.限制酶的识别序列均由6个核苷酸组成C.经EcoRⅠ切割后和经MunⅠ切割后的DNA片段黏性末端可以互补D.限制酶主要来源于原核生物,能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列√解析:限制酶的作用是使特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开,并具有专一性,A正确;大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成,也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成,B错误;经EcoRⅠ切割后和经MunⅠ切割后的DNA片段都有AATT末端,故二者可以互补,C正确;限制酶主要来源于原核生物,能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列,并在特定的部位加以切割,D正确。2.(2023·全国甲卷)接种疫苗是预防传染病的一项重要措施,乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播,降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原(一种病毒蛋白)。回答下列问题。(1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒,原因是_________________________________________________________________________________________________________。 重组乙肝疫苗的主要成分是乙肝病毒表面抗原,由于不含乙肝病毒的遗传物质,接种该疫苗不会在人体中产生乙肝病毒 解析:重组乙肝疫苗的主要成分是乙肝病毒表面抗原,由于不含乙肝病毒的遗传物质,故接种该疫苗不会在人体中产生乙肝病毒。(2)制备重组乙肝疫苗时,需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因(目的基因)导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因,抗生素抗性基因的作用是______________________________________________________________________________________________________。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是_____________。 鉴别受体细胞(酵母菌)中 是否含有目的基因(乙肝病毒表面抗原基因),从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来RNA聚合酶解析:抗生素抗性基因为标记基因,其作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来。启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段,位于基因的上游,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因转录出mRNA,最终获得所需要的蛋白质。(3)目的基因导入酵母细胞后,若要检测目的基因是否插入染色体中,需要从酵母细胞中提取_____________进行DNA分子杂交,DNA分子杂交时应使用的探针是____________________________________________________________。 基因组DNA用放射性同位素等标记的含有乙肝病毒表面抗原基因的DNA片段 解析:目的基因导入酵母细胞后,若要检测目的基因是否插入染色体中,可采用DNA分子杂交技术,即将酵母细胞中的基因组DNA提取出来,在含有乙肝病毒表面抗原基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记,以此作为探针,使探针与基因组DNA杂交,如果显示出杂交带,就表明目的基因已插入染色体DNA中。(4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白,请简要写出实验思路。__________________________________________________________________________________。 解析:若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白,应从转基因酵母菌中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原—抗体杂交,若有杂交带出现,表明目的基因在酵母细胞中表达出目的蛋白。从转基因酵母菌中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原—抗体杂交,观察是否有杂交带出现考法(二) 基因表达载体的构建和检测3.(2024·白银模拟)普通棉花中β-甘露糖苷酶(GhMnaA2)基因表达出的GhMnaA2能催化半纤维素降解,使棉纤维长度变短。为了培育长绒棉,科研人员构建了反义GhMnaA2基因表达载体(将正义GhMnaA2基因与载体反向连接),获得了转基因长绒棉新品种,具体过程如图所示,SmaⅠ、NotⅠ、HindⅢ和BamHⅠ为酶切位点。用SmaⅠ和NotⅠ切割某正义表达载体可获得3 kb、18 kb、28 kb、59 kb 4种长度的DNA片段。下列叙述正确的是( )A.正义GhMnaA2基因的转录方向是B→AB.①过程所得到的表达载体均为反义表达载体C.反义GhMnaA2基因可能通过抑制GhMnaA2基因的翻译来保证棉纤维长度D.用NotⅠ切割反义表达载体获得的DNA片段的长度为21 kb和87 kb√解析:由题图可知,NotⅠ的酶切位点靠近GhMnaA2基因转录的起始端,其转录方向是A→B,A错误;①过程得到的表达载体可能为反义表达载体,也可能为正义表达载体,B错误;反义GhMnaA2基因转录出来的mRNA与正常转录的mRNA互补,从而阻止其与核糖体结合,即反义GhMnaA2基因可能通过抑制GhMnaA2基因的翻译来保证棉纤维长度,C正确;用SmaⅠ和NotⅠ切割正义表达载体可获得3 kb、18 kb、28 kb、59 kb 4种长度的DNA片段,结合题图分析可知,NotⅠ切割反义表达载体获得的DNA片段的长度应分别为18 kb+28 kb=46 kb和3 kb+59 kb=62 kb,D错误。4.(2024·西安模拟)为使玉米获得抗除草剂性状,科研人员进行了相关操作(如图所示)。含有内含子的报告基因不能在原核生物中正确表达,其正确表达产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌,会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。下列叙述错误的是 ( )A.T DNA可将基因G转移并整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上B.利用物质K和氨苄青霉素进行筛选1,可获得农杆菌的蓝色菌落C.利用物质K和除草剂进行筛选2,更易于获得抗除草剂的转基因植株D.提高培养基中细胞分裂素和生长素的比值,有利于诱导生芽解析:农杆菌中的Ti质粒上的T DNA可转移至受体细胞,并且整合到受体细胞染色体的DNA上,根据农杆菌的这一特点,将目的基因(基因G)插入到Ti质粒的T DNA上,通过农杆菌的转化作用,就可以把目的基因(基因G)整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上,A正确;√农杆菌属于原核生物,含有内含子的报告基因不能在原核生物中正确表达,故不会出现农杆菌的蓝色菌落,B错误;根据题意可知,报告基因的产物能催化无色物质K呈现蓝色,而愈伤组织表面残留的农杆菌会导致未转化的愈伤组织能在含除草剂的培养基中生长,因此利用物质K和除草剂进行筛选2,更易于获得抗除草剂的转基因植株,C正确;提高培养基中细胞分裂素和生长素的比值,有利于诱导生芽,D正确。农杆菌属于原核生物,含有内含子的报告基因不能在原核生物中正确表达,故不会出现农杆菌的蓝色菌落,B错误;根据题意可知,报告基因的产物能催化无色物质K呈现蓝色,而愈伤组织表面残留的农杆菌会导致未转化的愈伤组织能在含除草剂的培养基中生长,因此利用物质K和除草剂进行筛选2,更易于获得抗除草剂的转基因植株,C正确;提高培养基中细胞分裂素和生长素的比值,有利于诱导生芽,D错误。5.酵母菌是一种能够引发有机源或者动物源物质发酵的真菌,它有许多分类,其中酿酒酵母是与人类关系较为密切的一种酵母菌。我国是世界上啤酒生产和消费大国,啤酒是以大麦为主要原料经酵母菌发酵制成的。请回答下列问题:(1)为了制备啤酒酵母分离培养基,实验人员将马铃薯去皮切块后高压煮沸,过滤后补加蒸馏水至1 L,加入葡萄糖和琼脂后加热融化。将马铃薯高压煮沸的目的是______,该培养基的碳源主要包括________________,用于装培养基的培养皿一般用__________法进行灭菌处理。 灭菌 淀粉和葡萄糖等 干热灭菌解析:实验人员对马铃薯去皮切块后高压煮沸,主要目的是灭菌(或防止杂菌污染);该培养基的碳源主要包括马铃薯中的淀粉和加入的葡萄糖;用于装培养基的培养皿一般用干热灭菌法进行灭菌处理。(2)啤酒在工业化生产过程中,发酵过程分为 两个阶段。第一阶段结束后,发酵液在____________________________的环境下储存一段时间进行第二阶段,形成澄清、成熟的啤酒。 解析:啤酒在工业化生产过程中,发酵过程分为主发酵和后发酵两个阶段。酵母菌的繁殖、大部分糖的分解和代谢物的生成都在主发酵阶段完成。主发酵结束后,发酵液还不适合饮用,要在低温、密闭的环境下储存一段时间进行后发酵,这样才能形成澄清、成熟的啤酒。主发酵、后发酵 低温、密闭(3)图甲所示为用酿酒酵母生产乙肝疫苗的过程图,回答相关问题:①研究人员拟用PCR扩增目的基因片段,已知目的基因的一条链为5'-ATTCCATATC……CCATGCC-3'。在PCR反应体系中需加入缓冲液、引物、4种脱氧核苷酸、含目的基因的DNA模板以及________________________。设计了一条引物为5'-GGCATG-3',另一条引物为_______________ (写出6个碱基即可)。 ②要形成有效的重组质粒,选择适当的限制酶很重要,根据图乙和图丙可知,选择__________________最佳,原因是________________________________________________________________________________。 耐高温的DNA聚合酶5'-ATTCCA-3' BamHⅠ和EcoRⅠ既防止了质粒和目的基因的自身环化和反向连接,又便于筛选出含有目的基因的受体细胞③在添加卡那霉素和四环素的培养基中有少量菌落,说明了_______________________。 解析:①在PCR反应体系中需加入缓冲液、引物、4种脱氧核苷酸、含目的基因的DNA模板以及耐高温的DNA聚合酶。根据目的基因的一条链可以推出另一条链两端的序列,根据引物的5'端对应模板链的3'端,可推出两条引物的序列分别为5'-GGCATG -3'和5'-ATTCCA-3'。这些菌落不含目的基因②根据图丙可知,EcoRⅤ的限制酶切点在目的基因内部,若用其获取目的基因会破坏目的基因,切割目的基因和质粒的限制酶应该是相同的,以保证有相同的黏性末端,因此选择BamHⅠ和EcoRⅠ最佳。分别使用BamHⅠ和EcoRⅠ限制酶切割,质粒和目的基因两端不会形成相同黏性末端,在连接酶的作用下不会发生自身环化,还可以防止反向连接,最终在连接酶的作用下只会出现目的基因与质粒成功重组和没有进行重组的质粒,此外,还有利于筛选出含有目的基因的受体细胞。③由于构建重组质粒时,BamHⅠ会破坏质粒中的四环素抗性基因,因此若在添加卡那霉素和四环素的培养基中有少量菌落,则说明这些菌落不含目的基因。02主题微课(二) PCR技术和基因编辑技术及其应用深化点(一) PCR技术及其应用(一)PCR引物的特点与设计1.PCR技术引物的作用与具备的特点(1)PCR技术需要引物的原因DNA聚合酶不能单独从头开始合成DNA,只能从一段DNA序列的3'端延伸DNA链,因此,DNA的复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后,DNA聚合酶就能从引物的3'端开始延伸DNA链,因此DNA的合成方向总是从子链的5'端向3'端延伸。(2)PCR中使用的引物应具备的特点①引物能与DNA模板的碱基进行互补配对。②2种引物之间不能有互补的碱基序列,避免引物形成双链,导致扩增失败。③某一引物不能存在局部碱基序列互补配对,避免自身出现折叠配对,无法和模板DNA结合。④多数情况需要在2种引物的5'端添加不同限制酶识别的碱基序列,扩增出的DNA片段可以使用相应限制酶切割后与载体正向连接。⑤引物不能太短,以防扩增出非特异性DNA片段(非目的基因)。2.PCR引物的设计和修饰(1)PCR引物的设计原则①引物长度要适宜,用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。引物过长会导致其延伸温度提高,不适于Taq DNA聚合酶进行反应;引物过短特异性差,可导致引物与模板链随机结合。②引物内部应避免自身互补。引物自身不能有连续4个碱基的互补,以免形成发夹状结构,这种结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。③引物之间应避免互补。引物之间不能有连续4个碱基的互补,尤其应避免3'端的互补重叠,以防形成引物二聚体。(2)引物的特异性和修饰①引物的特异性是指针对目标DNA片段设计出来的引物只能扩增出此目标DNA片段,而不能扩增出其他DNA片段。②引物5'端常见修饰包括:添加酶切位点、引入启动子序列、插入突变序列等。(二)PCR技术的类型及应用1.RT-PCR技术(1)过程:逆转录PCR(RT-PCR)一般分为两步,先以mRNA为模板,在逆转录酶的催化下合成cDNA的第1条链,再以第1条链为模板做常规PCR,从而获得双链cDNA分子。(2)应用:逆转录PCR可从mRNA出发获取目的基因,也可以研究基因的表达情况,实时荧光定量RT-PCR还可用于病毒定量检测。2.重叠延伸PCR技术重叠PCR是采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术,主要应用于基因的定点突变与基因拼接,基本过程如图所示:3.反向PCR技术反向PCR技术是根据DNA片段中间的已知序列设计引物,扩增已知序列两侧的未知序列。扩增思路:先从未知序列的两侧把DNA切成片段,然后通过DNA连接酶将DNA片段环化;再利用已知序列的两端设计引物,只不过引物相对于已知序列是反向配置的,所以子链反向延伸(如图)。PCR反向扩增后,经测序可以确定未知序列,可用于检测目的基因在受体细胞基因组上的插入位点等未知DNA片段。4.巢式PCR技术为减少引物与模板之间的非特异性配对,人们对普通PCR技术进行了改良,发明了巢式PCR技术,其原理是利用两套引物进行两轮PCR扩增。首先利用第一对引物(外引物)对目的基因所在的DNA进行第一轮扩增(经过15~30次循环),第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板,利用第二对引物(内引物或巢式引物)结合在第一轮扩增产物内部,经过15~30次循环,获得第二轮扩增片段(即目的基因),最终第二轮扩增片段短于第一轮,基本过程如图所示:1.(2024·湖南高考,改编)最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中,分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP),子链延伸时,双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则。以加入ddATP的体系为例:若配对的为ddATP,延伸终止;若配对的为原脱氧核苷三磷酸(dATP),继续延伸;PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列,结果如图所示。下列叙述错误的是 ( )微 课 测 评 作 业A.上述PCR反应体系中只加入一种引物B.电泳时产物的片段越小,迁移速率越慢C.5' CTACCCGTGAT 3'为对照个体的一段序列D.患者该段序列中某位点的碱基C突变为T√解析:利用双脱氧测序法时,PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA,故只需加入一种引物,A正确。电泳时,产物的片段越大,迁移速率越慢,B错误。依据题干信息中双脱氧测序法的原理,可以确定每个泳道中条带(DNA片段)的3'终端的碱基,如+ddATP的泳道中出现的条带(DNA片段)的3'终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同,但终止点不同,可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基;图示电泳方向为从上→下,即对应的DNA片段为长→短,则对应的DNA测序结果为3'→5',如对照个体的电泳结果最短的条带为+ddCTP泳道组的条带,则说明该DNA片段5'端第一个碱基为C。因此对照个体的测序结果为5' CTACCCGTGAT 3',患者的测序结果为5' CTACCTGTGAT 3',C正确。对比患者和对照个体的测序结果可知,患者该段序列中某位点的碱基C突变为T,D正确。2.科学家将抗人大肠癌单克隆抗体基因(ND -1)与酵母胞嘧啶脱氨酶基因(CD)融合,在大肠杆菌中成功地表达了单链抗体与酶的融合蛋白,这类蛋白的疗法称为由抗体介导的酶解前药疗法(ADEPT)。ND -1—CD融合基因的构建方法如图所示。下列有关叙述错误的是 ( )A.图中两条杂交链的获得至少需要经过1次扩增循环B.图中杂交链延伸成ND -1—CD融合基因的过程不需要添加引物C.PCR反应体系中须加入耐高温的DNA聚合酶,该酶主要在延伸过程起作用D.该融合蛋白应是利用抗体部分特异性地识别人大肠癌细胞并将酶带到靶部位√解析:经过一次循环得到的杂交链,引物P2端和引物P3端都为相应链的5'端,不可直接延伸子链,为了使杂交链顺利延伸子链,至少需要经过2次循环才能得到如图所示的引物P2端和引物P3端都为相应链的3'端杂交链,A错误;杂交链延伸生成ND -1—CD融合基因的过程中,不需要加入引物,两条母链的起始位置的碱基序列即为引物,可以作为子链合成的引物,为DNA聚合酶提供3'端,B正确;PCR反应体系中须加入耐高温的DNA聚合酶,该酶主要在延伸过程起作用,即催化DNA在高温条件下进行复制,C正确;抗体可以特异性识别抗原成分,故该融合蛋白应是利用抗体部分特异性地识别人大肠癌细胞并将酶带到靶部位,D正确。3.(2024·济宁三模)PCR技术的实用性和极强的生命力使其成为生物科学研究的一种重要方法,极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。下面是两个具体实验中的PCR技术应用,请根据资料回答下列问题:(1)重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板,通过多次PCR扩增,从而获得目的基因的方法。利用该技术可以实现基因的定点诱变。它在需要诱变的位置合成两个带有变异基因碱基的互补引物,然后分别与引物a和引物d做PCR,这样得到的两个PCR引物产物都带有变异基因,并且彼此重叠,再将重叠部位进行重组PCR就能得到诱变PCR产物,如图所示:①PCR扩增DNA的过程中,引物a、b、c、d中,PCR1应选择图1中引物______,大量扩增突变产物AD则应选择引物______。 ②重叠延伸PCR通过___________________________实现定点突变。PCR1和PCR2需要分别进行的原因是__________________________________________。 a和ba和d在引物b和c上引入突变碱基引物b和引物c可以互补配对,导致引物失效 ③若正常基因可被限制酶DpnⅠ识别并切割,特定位点突变后的基因不能被DpnⅠ识别,请设计实验思路鉴定上述过程获得的突变产物AD是否为突变基因: ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。 用限制酶DpnⅠ分别处理正常基因和上述过程获得的突变产物AD,然后进行电泳;若上述过程获得的突变产物AD的电泳条带只有一条且大于正常基因的电泳条带,则为突变基因 解析:①PCR扩增DNA的过程中,新合成的两条单链延伸方向相反,根据图中引物的方向可知,PCR1应选择引物a和b,得到产物AB。PCR2应选择引物c和d,得到产物CD。重叠延伸时,可以分别以AB上链和CD下链为引物进行延伸,所以不需要引物。突变产物AD扩增选择的引物是a和d。②重叠延伸PCR通过在引物b和c上引入突变碱基实现定点突变,引物b和c分别和第一代DNA的两条单链的对应碱基互补,则在同一PCR中引物b和引物c可以互补配对,导致引物失效,所以PCR1和PCR2需要分别进行。③实验设计思路见答案。(2)反向PCR可用于扩增未知序列,其原理如下图所示。下图链状DNA分子内侧是已知序列,外侧为未知序列。①不直接在图2中DNA分子的两端设计引物并进行扩增,原因是_________________________________。 ②图3中环状DNA进行PCR的过程中,沿引物A延伸子链的延伸方向是________ (填“顺时针”或“逆时针”),PCR产物______ (填“含有”或“不含”)EcoRⅠ的酶切位点。 DNA两端序列未知,无法设计引物逆时针含有解析:①利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列作为引物,由于该DNA分子两端的脱氧核苷酸序列未知,故无法设计引物,所以不能直接在图2中DNA分子的两端设计引物并进行扩增。②据图中未知序列的位置可知,图3中环状DNA进行PCR的过程中,沿引物A逆时针延伸子链,沿引物a顺时针延伸子链,才能扩增到未知序列,由于碱基互补配对,环化后的DNA分子含有EcoRⅠ的切割位点,则PCR产物含有EcoR Ⅰ 的酶切位点。深化点(二) CRISPR/Cas9基因编辑技术及其应用CRISPR/Cas9基因编辑技术可进行基因敲除、基因纠正、突变引入等。CRISPR/Cas9系统包含2个组件,一个是Cas蛋白,一个是sgRNA(向导RNA),sgRNA由crRNA和tracrRNA组成;Cas蛋白具有自己特异性识别PAM序列,如Cas9识别的PAM是5'-NGG-3'(N表示任意核苷酸)。编辑过程是sgRNA引导Cas9蛋白找到目标DNA。当sgRNA和目标DNA相匹配时,Cas9蛋白会对DNA进行切割,细胞通过“断裂修复”重新连接时通常会有个别碱基的插入、删除,进而实现基因的敲除、修复或替换。CRISPR/Cas9识别模式示意图:4.(2024·德州二模)CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑,其原理如图1所示。科研人员根据猪的细胞表面抗原基因RAG1的启动子设计了sgRNA1和sgRNA2,并利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了两种基因敲除猪,检测基因敲除猪体内的RAG1表达情况如图2所示。下列说法错误的是 ( )微 课 测 评 作 业A.CRISPR/Cas9识别目标DNA序列主要与sgRNA序列的特异性相关B.基因敲除猪的细胞表面抗原减少,器官移植过程中免疫排斥作用减弱C.两种sgRNA都可引导Cas9在转录水平上减弱RAG1的表达D.据图2可知,用sgRNA2制备的基因敲除猪用于器官移植效果更好解析:CRISPR/Cas9识别目标DNA序列主要与sgRNA编码序列有关,即主要与sgRNA序列的特异性相关,A正确;√猪的细胞表面抗原会导致器官移植时发生免疫排斥,基因敲除猪的细胞表面抗原减少,器官移植过程中免疫排斥作用减弱,提高器官移植的成功率,B正确;启动子是RNA聚合酶识别与结合的位点,用于驱动基因的转录,科研人员根据猪的细胞表面抗原基因RAG1的启动子设计了sgRNA1和sgRNA2,故两种sgRNA都可引导Cas9在转录水平上减弱RAG1的表达,C正确;据图2可知,与对照组相比,用sgRNA1制备的基因敲除猪RAG1表达更低,说明用sgRNA1制备的基因敲除猪用于器官移植效果更好,D错误。5.(2024·山东高考)研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L,可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列,将载体导入大豆细胞后,其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。(1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时,所用的引物越短,引物特异性越_____(填“高”或“低”)。限制酶在切开DNA双链时,形成的单链突出末端为黏性末端,若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA,理论上可产生的黏性末端最多有_____种。载体信息如图甲所示,经BsaⅠ酶切后,载体上保留的黏性末端序列应为5'-________-3'和5'-________-3'。 低44GTTTCAAT解析:引物的长短会影响其在目标DNA序列上的结合能力和特异性。引物过短可能导致非特异性扩增,即引物可能会结合到与目标序列不完全匹配或无关的DNA上,进而导致非特异性产物的形成,影响PCR的特异性和准确性。结合BsaⅠ识别序列可知,BsaⅠ酶切后产生的黏性末端含有4个碱基,故若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA,理论上可产生的黏性末端最多有4×4×4×4=44(种)。根据图甲所示的载体信息,经BsaⅠ酶切后,载体上保留的黏性末端序列应为5'-GTTT-3'和5'-CAAT-3'。(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞,使用抗生素__________筛选到具有该抗生素抗性的植株①~④。为了鉴定基因编辑是否成功,以上述抗性植株的DNA为模板,通过PCR扩增目标基因L,部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示,PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是_______,其中纯合的突变植株是_____ (填序号)。 卡那霉素SacⅠ④解析:根据图甲可知,重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因,因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图乙、丙可知,目标基因L的目标序列跟突变序列之间的差异只有在SacⅠ酶切位点上存在差异,BamHⅠ和EcoRⅠ这两个酶切位点完全相同,结合电泳结果可知,只能选用限制酶SacⅠ酶切PCR产物;限制酶SacⅠ在突变序列存在酶切位点,但是目标序列没有,因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两条,目标序列是一条带,根据图丙的电泳结果可知,只有④为纯和突变的植株。(3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株,该植株具有抗生素抗性,检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代,其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为_____,筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 1/4解析:设基因L突变为基因L',则该株基因L成功突变的纯合植株的基因型为L'L',由题中信息知,一条染色体插入了T-DNA,若其插入了L'所在染色体,其所在染色体记为L'1,则其自交子代的基因型及比例为L'1L'1∶L'1L'∶L'L'=1∶2∶1。若用抗生素筛选这个植株的自交子代,筛选出来的子代中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株(L'L')所占的比例为1/4。若其插入了其他染色体,所得结果相同。主题微课(一) 基因工程的操作工具和步骤深化点(一)基因工程的主要操作步骤 [例1] (2024·西安模拟)青蒿素是有效的抗疟疾药物,但野生黄花蒿中青蒿素的产量较低。为缓解青蒿素供应不足的状况,科学家将基因tms和tmr导入黄花蒿的愈伤组织,获得了黄花蒿的冠瘿组织,改造过程用到的部分结构如图所示。下列叙述错误的是 ( )A.将目的基因导入黄花蒿愈伤组织细胞常用的方法是农杆菌转化法B.图中P位于基因的上游,作用是RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动转录C.图中缺少标记基因,标记基因的作用是表达出目的基因产物D.欲检测目的基因是否导入冠瘿组织细胞的染色体DNA上可采用PCR技术听课记录: 深化点(二) 限制酶的选取与基因表达载体的构建1.限制酶的选择技巧(1)根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶①应选择切点位于目的基因两端的限制酶,不能选择切点位于目的基因内部的限制酶,如图甲不能选择限制酶SmaⅠ。②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点,如图乙)。(2)根据质粒的特点选择限制酶(如图)2.基因表达载体的构建过程(如图)微点拨:利用PCR进行检测,观察能否正常进行扩增,以确定目的基因是正向连接还是反向连接。 [例2] (2024·江西高考)γ 氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L 谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L 谷氨酸脱羧是高效生产γ 氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L 谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coli A,构建了以L 谷氨酸钠为底物高效生产γ 氨基丁酸的菌株E.coli B。下列叙述正确的是 ( )A.上图表明,可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadBB.E.coli B发酵生产γ 氨基丁酸时,L 谷氨酸钠的作用是供能C.E.coli A和E.coli B都能高效降解γ 氨基丁酸D.可以用其他酶替代Nco Ⅰ和Kpn Ⅰ构建重组质粒听课记录: [微课测评作业]考法(一) 基因工程的基本工具和操作1.(2024·普洱期末)培育转基因生物时,需要在体外对DNA分子进行“切割”“改造”和“拼接”。限制酶是常使用的工具酶之一,下图表示4种限制酶的识别序列及切割位点。下列叙述错误的是 ( )A.4种限制酶都能催化磷酸二酯键断开B.限制酶的识别序列均由6个核苷酸组成C.经EcoRⅠ切割后和经MunⅠ切割后的DNA片段黏性末端可以互补D.限制酶主要来源于原核生物,能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列2.(2023·全国甲卷)接种疫苗是预防传染病的一项重要措施,乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播,降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原(一种病毒蛋白)。回答下列问题。(1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒,原因是 。 (2)制备重组乙肝疫苗时,需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因(目的基因)导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因,抗生素抗性基因的作用是 。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是 。 (3)目的基因导入酵母细胞后,若要检测目的基因是否插入染色体中,需要从酵母细胞中提取 进行DNA分子杂交,DNA分子杂交时应使用的探针是 。 (4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白,请简要写出实验思路。 。 考法(二) 基因表达载体的构建和检测3.(2024·白银模拟)普通棉花中β 甘露糖苷酶(GhMnaA2)基因表达出的GhMnaA2能催化半纤维素降解,使棉纤维长度变短。为了培育长绒棉,科研人员构建了反义GhMnaA2基因表达载体(将正义GhMnaA2基因与载体反向连接),获得了转基因长绒棉新品种,具体过程如图所示,SmaⅠ、NotⅠ、HindⅢ和BamHⅠ为酶切位点。用SmaⅠ和NotⅠ切割某正义表达载体可获得3 kb、18 kb、28 kb、59 kb 4种长度的DNA片段。下列叙述正确的是 ( )A.正义GhMnaA2基因的转录方向是B→AB.①过程所得到的表达载体均为反义表达载体C.反义GhMnaA2基因可能通过抑制GhMnaA2基因的翻译来保证棉纤维长度D.用NotⅠ切割反义表达载体获得的DNA片段的长度为21 kb和87 kb4.(2024·西安模拟)为使玉米获得抗除草剂性状,科研人员进行了相关操作(如图所示)。含有内含子的报告基因不能在原核生物中正确表达,其正确表达产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌,会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。下列叙述错误的是 ( )A.T DNA可将基因G转移并整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上B.利用物质K和氨苄青霉素进行筛选1,可获得农杆菌的蓝色菌落C.利用物质K和除草剂进行筛选2,更易于获得抗除草剂的转基因植株D.提高培养基中细胞分裂素和生长素的比值,有利于诱导生芽5.酵母菌是一种能够引发有机源或者动物源物质发酵的真菌,它有许多分类,其中酿酒酵母是与人类关系较为密切的一种酵母菌。我国是世界上啤酒生产和消费大国,啤酒是以大麦为主要原料经酵母菌发酵制成的。请回答下列问题:(1)为了制备啤酒酵母分离培养基,实验人员将马铃薯去皮切块后高压煮沸,过滤后补加蒸馏水至1 L,加入葡萄糖和琼脂后加热融化。将马铃薯高压煮沸的目的是 ,该培养基的碳源主要包括 ,用于装培养基的培养皿一般用 法进行灭菌处理。 (2)啤酒在工业化生产过程中,发酵过程分为 两个阶段。第一阶段结束后,发酵液在 的环境下储存一段时间进行第二阶段,形成澄清、成熟的啤酒。 (3)图甲所示为用酿酒酵母生产乙肝疫苗的过程图,回答相关问题:①研究人员拟用PCR扩增目的基因片段,已知目的基因的一条链为5' ATTCCATATC……CCATGCC 3'。在PCR反应体系中需加入缓冲液、引物、4种脱氧核苷酸、含目的基因的DNA模板以及 。设计了一条引物为5' GGCATG 3',另一条引物为 (写出6个碱基即可)。 ②要形成有效的重组质粒,选择适当的限制酶很重要,根据图乙和图丙可知,选择 最佳,原因是 。 ③在添加卡那霉素和四环素的培养基中有少量菌落,说明了 。 主题微课(二) PCR技术和基因编辑技术及其应用深化点(一)PCR技术及其应用(一)PCR引物的特点与设计1.PCR技术引物的作用与具备的特点(1)PCR技术需要引物的原因DNA聚合酶不能单独从头开始合成DNA,只能从一段DNA序列的3'端延伸DNA链,因此,DNA的复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后,DNA聚合酶就能从引物的3'端开始延伸DNA链,因此DNA的合成方向总是从子链的5'端向3'端延伸。(2)PCR中使用的引物应具备的特点①引物能与DNA模板的碱基进行互补配对。②2种引物之间不能有互补的碱基序列,避免引物形成双链,导致扩增失败。③某一引物不能存在局部碱基序列互补配对,避免自身出现折叠配对,无法和模板DNA结合。④多数情况需要在2种引物的5'端添加不同限制酶识别的碱基序列,扩增出的DNA片段可以使用相应限制酶切割后与载体正向连接。⑤引物不能太短,以防扩增出非特异性DNA片段(非目的基因)。2.PCR引物的设计和修饰(1)PCR引物的设计原则①引物长度要适宜,用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。引物过长会导致其延伸温度提高,不适于Taq DNA聚合酶进行反应;引物过短特异性差,可导致引物与模板链随机结合。②引物内部应避免自身互补。引物自身不能有连续4个碱基的互补,以免形成发夹状结构,这种结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。③引物之间应避免互补。引物之间不能有连续4个碱基的互补,尤其应避免3'端的互补重叠,以防形成引物二聚体。(2)引物的特异性和修饰①引物的特异性是指针对目标DNA片段设计出来的引物只能扩增出此目标DNA片段,而不能扩增出其他DNA片段。②引物5'端常见修饰包括:添加酶切位点、引入启动子序列、插入突变序列等。(二)PCR技术的类型及应用1.RT PCR技术(1)过程:逆转录PCR(RT PCR)一般分为两步,先以mRNA为模板,在逆转录酶的催化下合成cDNA的第1条链,再以第1条链为模板做常规PCR,从而获得双链cDNA分子。(2)应用:逆转录PCR可从mRNA出发获取目的基因,也可以研究基因的表达情况,实时荧光定量RT PCR还可用于病毒定量检测。2.重叠延伸PCR技术重叠PCR是采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术,主要应用于基因的定点突变与基因拼接,基本过程如图所示:3.反向PCR技术反向PCR技术是根据DNA片段中间的已知序列设计引物,扩增已知序列两侧的未知序列。扩增思路:先从未知序列的两侧把DNA切成片段,然后通过DNA连接酶将DNA片段环化;再利用已知序列的两端设计引物,只不过引物相对于已知序列是反向配置的,所以子链反向延伸(如图)。PCR反向扩增后,经测序可以确定未知序列,可用于检测目的基因在受体细胞基因组上的插入位点等未知DNA片段。4.巢式PCR技术为减少引物与模板之间的非特异性配对,人们对普通PCR技术进行了改良,发明了巢式PCR技术,其原理是利用两套引物进行两轮PCR扩增。首先利用第一对引物(外引物)对目的基因所在的DNA进行第一轮扩增(经过15~30次循环),第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板,利用第二对引物(内引物或巢式引物)结合在第一轮扩增产物内部,经过15~30次循环,获得第二轮扩增片段(即目的基因),最终第二轮扩增片段短于第一轮,基本过程如图所示:[微课测评作业]1.(2024·湖南高考,改编)最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中,分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP),子链延伸时,双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则。以加入ddATP的体系为例:若配对的为ddATP,延伸终止;若配对的为原脱氧核苷三磷酸(dATP),继续延伸;PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列,结果如图所示。下列叙述错误的是 ( )A.上述PCR反应体系中只加入一种引物B.电泳时产物的片段越小,迁移速率越慢C.5' CTACCCGTGAT 3'为对照个体的一段序列D.患者该段序列中某位点的碱基C突变为T2.科学家将抗人大肠癌单克隆抗体基因(ND 1)与酵母胞嘧啶脱氨酶基因(CD)融合,在大肠杆菌中成功地表达了单链抗体与酶的融合蛋白,这类蛋白的疗法称为由抗体介导的酶解前药疗法(ADEPT)。ND 1—CD融合基因的构建方法如图所示。下列有关叙述错误的是 ( )A.图中两条杂交链的获得至少需要经过1次扩增循环B.图中杂交链延伸成ND 1—CD融合基因的过程不需要添加引物C.PCR反应体系中须加入耐高温的DNA聚合酶,该酶主要在延伸过程起作用D.该融合蛋白应是利用抗体部分特异性地识别人大肠癌细胞并将酶带到靶部位3.(2024·济宁三模)PCR技术的实用性和极强的生命力使其成为生物科学研究的一种重要方法,极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。下面是两个具体实验中的PCR技术应用,请根据资料回答下列问题:(1)重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板,通过多次PCR扩增,从而获得目的基因的方法。利用该技术可以实现基因的定点诱变。它在需要诱变的位置合成两个带有变异基因碱基的互补引物,然后分别与引物a和引物d做PCR,这样得到的两个PCR引物产物都带有变异基因,并且彼此重叠,再将重叠部位进行重组PCR就能得到诱变PCR产物,如图所示:①PCR扩增DNA的过程中,引物a、b、c、d中,PCR1应选择图1中引物 ,大量扩增突变产物AD则应选择引物 。 ②重叠延伸PCR通过 实现定点突变。PCR1和PCR2需要分别进行的原因是 。 ③若正常基因可被限制酶DpnⅠ识别并切割,特定位点突变后的基因不能被DpnⅠ识别,请设计实验思路鉴定上述过程获得的突变产物AD是否为突变基因: 。 (2)反向PCR可用于扩增未知序列,其原理如下图所示。下图链状DNA分子内侧是已知序列,外侧为未知序列。①不直接在图2中DNA分子的两端设计引物并进行扩增,原因是 。 ②图3中环状DNA进行PCR的过程中,沿引物A延伸子链的延伸方向是 (填“顺时针”或“逆时针”),PCR产物 (填“含有”或“不含”)EcoRⅠ的酶切位点。 深化点(二) CRISPR/Cas9基因编辑技术及其应用 CRISPR/Cas9基因编辑技术可进行基因敲除、基因纠正、突变引入等。CRISPR/Cas9系统包含2个组件,一个是Cas蛋白,一个是sgRNA(向导RNA),sgRNA由crRNA和tracrRNA组成;Cas蛋白具有自己特异性识别PAM序列,如Cas9识别的PAM是5' NGG 3'(N表示任意核苷酸)。编辑过程是sgRNA引导Cas9蛋白找到目标DNA。当sgRNA和目标DNA相匹配时,Cas9蛋白会对DNA进行切割,细胞通过“断裂修复”重新连接时通常会有个别碱基的插入、删除,进而实现基因的敲除、修复或替换。CRISPR/Cas9识别模式示意图:[微课测评作业]4.(2024·德州二模)CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑,其原理如图1所示。科研人员根据猪的细胞表面抗原基因RAG1的启动子设计了sgRNA1和sgRNA2,并利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了两种基因敲除猪,检测基因敲除猪体内的RAG1表达情况如图2所示。下列说法错误的是 ( )A.CRISPR/Cas9识别目标DNA序列主要与sgRNA序列的特异性相关B.基因敲除猪的细胞表面抗原减少,器官移植过程中免疫排斥作用减弱C.两种sgRNA都可引导Cas9在转录水平上减弱RAG1的表达D.据图2可知,用sgRNA2制备的基因敲除猪用于器官移植效果更好5.(2024·山东高考)研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L,可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列,将载体导入大豆细胞后,其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。(1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时,所用的引物越短,引物特异性越 (填“高”或“低”)。限制酶在切开DNA双链时,形成的单链突出末端为黏性末端,若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA,理论上可产生的黏性末端最多有 种。载体信息如图甲所示,经BsaⅠ酶切后,载体上保留的黏性末端序列应为5' 3'和5' 3'。 (2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞,使用抗生素 筛选到具有该抗生素抗性的植株①~④。为了鉴定基因编辑是否成功,以上述抗性植株的DNA为模板,通过PCR扩增目标基因L,部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示,PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是 ,其中纯合的突变植株是 (填序号)。 (3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株,该植株具有抗生素抗性,检测发现其体细胞中只有1条染色体有T DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代,其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为 ,筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 第2讲 基因工程课堂抓重难点·讲增分点主题微课(一)[例1] 选C 将目的基因导入黄花蒿愈伤组织细胞常用的方法是农杆菌转化法,A正确;图中P为启动子,位于基因的上游,作用是RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动转录,B正确;图中缺少标记基因,标记基因的作用是便于重组DNA分子的筛选,C错误;要检测目的基因是否导入冠瘿组织细胞的染色体DNA上,可采用PCR技术,D正确。[例2] 选A 研究人员采用题图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coli A,说明可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB,A正确;由题意分析可知,E.coli B以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸,该过程中L-谷氨酸钠的作用不是供能,B错误;γ-氨基丁酸是E.coli A导入L-谷氨酸脱羧酶基因(gadB)后形成的菌株E.coli B的产物,两者都不能高效降解γ-氨基丁酸,C错误;图中质粒上含有NcoⅠ和KpnⅠ的酶切位点,但不确定是否含其他限制酶的酶切位点,因而不确定是否可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒,D错误。微课测评作业1.选B 限制酶的作用是使特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开,并具有专一性,A正确;大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成,也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成,B错误;经EcoRⅠ切割后和经MunⅠ切割后的DNA片段都有AATT末端,故二者可以互补,C正确;限制酶主要来源于原核生物,能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列,并在特定的部位加以切割,D正确。2.解析:(1)重组乙肝疫苗的主要成分是乙肝病毒表面抗原,由于不含乙肝病毒的遗传物质,故接种该疫苗不会在人体中产生乙肝病毒。(2)抗生素抗性基因为标记基因,其作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来。启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段,位于基因的上游,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因转录出mRNA,最终获得所需要的蛋白质。(3)目的基因导入酵母细胞后,若要检测目的基因是否插入染色体中,可采用DNA分子杂交技术,即将酵母细胞中的基因组DNA提取出来,在含有乙肝病毒表面抗原基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记,以此作为探针,使探针与基因组DNA杂交,如果显示出杂交带,就表明目的基因已插入染色体DNA中。(4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白,应从转基因酵母菌中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原—抗体杂交,若有杂交带出现,表明目的基因在酵母细胞中表达出目的蛋白。答案:(1)重组乙肝疫苗的主要成分是乙肝病毒表面抗原,由于不含乙肝病毒的遗传物质,接种该疫苗不会在人体中产生乙肝病毒(2)鉴别受体细胞(酵母菌)中是否含有目的基因(乙肝病毒表面抗原基因),从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来 RNA聚合酶(3)基因组DNA 用放射性同位素等标记的含有乙肝病毒表面抗原基因的DNA片段 (4)从转基因酵母菌中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原—抗体杂交,观察是否有杂交带出现3.选C 由题图可知,NotⅠ的酶切位点靠近GhMnaA2基因转录的起始端,其转录方向是A→B,A错误;①过程得到的表达载体可能为反义表达载体,也可能为正义表达载体,B错误;反义GhMnaA2基因转录出来的mRNA与正常转录的mRNA互补,从而阻止其与核糖体结合,即反义GhMnaA2基因可能通过抑制GhMnaA2基因的翻译来保证棉纤维长度,C正确;用SmaⅠ和NotⅠ切割正义表达载体可获得3 kb、18 kb、28 kb、59 kb 4种长度的DNA片段,结合题图分析可知,NotⅠ切割反义表达载体获得的DNA片段的长度应分别为18 kb+28 kb=46 kb和3 kb+59 kb=62 kb,D错误。4.选B 农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞,并且整合到受体细胞染色体的DNA上,根据农杆菌的这一特点,将目的基因(基因G)插入到Ti质粒的T-DNA上,通过农杆菌的转化作用,就可以把目的基因(基因G)整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上,A正确;农杆菌属于原核生物,含有内含子的报告基因不能在原核生物中正确表达,故不会出现农杆菌的蓝色菌落,B错误;根据题意可知,报告基因的产物能催化无色物质K呈现蓝色,而愈伤组织表面残留的农杆菌会导致未转化的愈伤组织能在含除草剂的培养基中生长,因此利用物质K和除草剂进行筛选2,更易于获得抗除草剂的转基因植株,C正确;提高培养基中细胞分裂素和生长素的比值,有利于诱导生芽,D正确。5.解析:(1)实验人员对马铃薯去皮切块后高压煮沸,主要目的是灭菌(或防止杂菌污染);该培养基的碳源主要包括马铃薯中的淀粉和加入的葡萄糖;用于装培养基的培养皿一般用干热灭菌法进行灭菌处理。(2)啤酒在工业化生产过程中,发酵过程分为主发酵和后发酵两个阶段。酵母菌的繁殖、大部分糖的分解和代谢物的生成都在主发酵阶段完成。主发酵结束后,发酵液还不适合饮用,要在低温、密闭的环境下储存一段时间进行后发酵,这样才能形成澄清、成熟的啤酒。(3)①在PCR反应体系中需加入缓冲液、引物、4种脱氧核苷酸、含目的基因的DNA模板以及耐高温的DNA聚合酶。根据目的基因的一条链可以推出另一条链两端的序列,根据引物的5'端对应模板链的3'端,可推出两条引物的序列分别为5'-GGCATG -3'和5'-ATTCCA-3'。②根据图丙可知,EcoRⅤ的限制酶切点在目的基因内部,若用其获取目的基因会破坏目的基因,切割目的基因和质粒的限制酶应该是相同的,以保证有相同的黏性末端,因此选择BamHⅠ和EcoRⅠ最佳。分别使用BamHⅠ和EcoRⅠ限制酶切割,质粒和目的基因两端不会形成相同黏性末端,在连接酶的作用下不会发生自身环化,还可以防止反向连接,最终在连接酶的作用下只会出现目的基因与质粒成功重组和没有进行重组的质粒,此外,还有利于筛选出含有目的基因的受体细胞。③由于构建重组质粒时,BamHⅠ会破坏质粒中的四环素抗性基因,因此若在添加卡那霉素和四环素的培养基中有少量菌落,则说明这些菌落不含目的基因。答案:(1)灭菌 淀粉和葡萄糖等 干热灭菌 (2)主发酵、后发酵 低温、密闭 (3)①耐高温的DNA聚合酶 5'-ATTCCA-3'②BamHⅠ和EcoRⅠ 既防止了质粒和目的基因的自身环化和反向连接,又便于筛选出含有目的基因的受体细胞 ③这些菌落不含目的基因主题微课(二)1.选B 利用双脱氧测序法时,PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA,故只需加入一种引物,A正确。电泳时,产物的片段越大,迁移速率越慢,B错误。依据题干信息中双脱氧测序法的原理,可以确定每个泳道中条带(DNA片段)的3'终端的碱基,如+ddATP的泳道中出现的条带(DNA片段)的3'终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同,但终止点不同,可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基;图示电泳方向为从上→下,即对应的DNA片段为长→短,则对应的DNA测序结果为3'→5',如对照个体的电泳结果最短的条带为+ddCTP泳道组的条带,则说明该DNA片段5'端第一个碱基为C。因此对照个体的测序结果为5'-CTACCCGTGAT-3',患者的测序结果为5'-CTACCTGTGAT-3',C正确。对比患者和对照个体的测序结果可知,患者该段序列中某位点的碱基C突变为T,D正确。2.选A 经过一次循环得到的杂交链,引物P2端和引物P3端都为相应链的5'端,不可直接延伸子链,为了使杂交链顺利延伸子链,至少需要经过2次循环才能得到如图所示的引物P2端和引物P3端都为相应链的3'端杂交链,A错误;杂交链延伸生成ND -1—CD融合基因的过程中,不需要加入引物,两条母链的起始位置的碱基序列即为引物,可以作为子链合成的引物,为DNA聚合酶提供3'端,B正确;PCR反应体系中须加入耐高温的DNA聚合酶,该酶主要在延伸过程起作用,即催化DNA在高温条件下进行复制,C正确;抗体可以特异性识别抗原成分,故该融合蛋白应是利用抗体部分特异性地识别人大肠癌细胞并将酶带到靶部位,D正确。3.解析:(1)①PCR扩增DNA的过程中,新合成的两条单链延伸方向相反,根据图中引物的方向可知,PCR1应选择引物a和b,得到产物AB。PCR2应选择引物c和d,得到产物CD。重叠延伸时,可以分别以AB上链和CD下链为引物进行延伸,所以不需要引物。突变产物AD扩增选择的引物是a和d。②重叠延伸PCR通过在引物b和c上引入突变碱基实现定点突变,引物b和c分别和第一代DNA的两条单链的对应碱基互补,则在同一PCR中引物b和引物c可以互补配对,导致引物失效,所以PCR1和PCR2需要分别进行。③实验设计思路见答案。(2)①利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列作为引物,由于该DNA分子两端的脱氧核苷酸序列未知,故无法设计引物,所以不能直接在图2中DNA分子的两端设计引物并进行扩增。②据图中未知序列的位置可知,图3中环状DNA进行PCR的过程中,沿引物A逆时针延伸子链,沿引物a顺时针延伸子链,才能扩增到未知序列,由于碱基互补配对,环化后的DNA分子含有EcoRⅠ的切割位点,则PCR产物含有EcoR Ⅰ 的酶切位点。答案:(1)①a和b a和d ②在引物b和c上引入突变碱基 引物b和引物c可以互补配对,导致引物失效 ③用限制酶DpnⅠ分别处理正常基因和上述过程获得的突变产物AD,然后进行电泳;若上述过程获得的突变产物AD的电泳条带只有一条且大于正常基因的电泳条带,则为突变基因 (2)①DNA两端序列未知,无法设计引物 ②逆时针 含有4.选D CRISPR/Cas9识别目标DNA序列主要与sgRNA编码序列有关,即主要与sgRNA序列的特异性相关,A正确;猪的细胞表面抗原会导致器官移植时发生免疫排斥,基因敲除猪的细胞表面抗原减少,器官移植过程中免疫排斥作用减弱,提高器官移植的成功率,B正确;启动子是RNA聚合酶识别与结合的位点,用于驱动基因的转录,科研人员根据猪的细胞表面抗原基因RAG1的启动子设计了sgRNA1和sgRNA2,故两种sgRNA都可引导Cas9在转录水平上减弱RAG1的表达,C正确;据图2可知,与对照组相比,用sgRNA1制备的基因敲除猪RAG1表达更低,说明用sgRNA1制备的基因敲除猪用于器官移植效果更好,D错误。5.解析:(1)引物的长短会影响其在目标DNA序列上的结合能力和特异性。引物过短可能导致非特异性扩增,即引物可能会结合到与目标序列不完全匹配或无关的DNA上,进而导致非特异性产物的形成,影响PCR的特异性和准确性。结合BsaⅠ识别序列可知,BsaⅠ酶切后产生的黏性末端含有4个碱基,故若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA,理论上可产生的黏性末端最多有4×4×4×4=44(种)。根据图甲所示的载体信息,经BsaⅠ酶切后,载体上保留的黏性末端序列应为5'-GTTT-3'和5'-CAAT-3'。(2)根据图甲可知,重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因,因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图乙、丙可知,目标基因L的目标序列跟突变序列之间的差异只有在SacⅠ酶切位点上存在差异,BamHⅠ和EcoRⅠ这两个酶切位点完全相同,结合电泳结果可知,只能选用限制酶SacⅠ酶切PCR产物;限制酶SacⅠ在突变序列存在酶切位点,但是目标序列没有,因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两条,目标序列是一条带,根据图丙的电泳结果可知,只有④为纯和突变的植株。(3)设基因L突变为基因L',则该株基因L成功突变的纯合植株的基因型为L'L',由题中信息知,一条染色体插入了T-DNA,若其插入了L'所在染色体,其所在染色体记为L'1,则其自交子代的基因型及比例为L'1L'1∶L'1L'∶L'L'=1∶2∶1。若用抗生素筛选这个植株的自交子代,筛选出来的子代中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株(L'L')所占的比例为1/4。若其插入了其他染色体,所得结果相同。答案:(1)低 44 GTTT CAAT (2)卡那霉素 Sac Ⅰ ④ (3)1/42 / 12(共98张PPT)目 录01习题讲评课Ⅰ 选择小题夯基提速练02习题讲评课Ⅱ 基准考法大题保分练03习题讲评课Ⅲ 创新考法大题增分练1习题讲评课Ⅰ 选择小题夯基提速练1.下列有关基因工程的叙述,错误的是( )A.将目的基因导入植物细胞可利用花粉管通道法B.将某药用蛋白基因导入动物受精卵中可获得乳腺生物反应器C.目的基因扩增完成后的产物常用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定D.可通过RNA分子标记检测目的基因12345678910√12345678910解析:RNA是转录的产物,转录成功并不意味着成功表达,检测目的基因是否成功表达常用抗原—抗体杂交法,D错误。2.W是一种具有特定功能的人体蛋白质。某研究小组拟制备乳腺生物反应器来获得大量W,基本过程如图所示。下列相关叙述错误的是 ( )√12456789103A.①过程构建的表达载体含有组织特异性启动子B.②过程通常在显微镜下进行去核、注入等操作C.该过程培养的山羊所有组织细胞均能分泌WD.该过程利用了转基因、胚胎移植等工程技术12456789103解析:①过程构建的表达载体含有在乳腺中特异表达的基因的启动子,A正确;②为核移植,通常在显微镜下进行去核、注入等操作,B正确;该过程培养的山羊只有乳腺细胞能分泌W,C错误;通过生物工程技术制备山羊乳腺生物反应器过程中应用到了转基因(W基因导入山羊胚胎成纤维细胞)、核移植(胚胎成纤维细胞和卵母细胞形成重构胚)和胚胎移植(重构胚移入山羊体内)等工程技术,D正确。124567891033.科研人员将寒带地区海鱼中的抗冻基因转入千禧果细胞中,成功培育出抗冻千禧果。下图为培育过程中使用的Ti质粒示意图,其中Vir区的基因活化能促进T-DNA的加工和转移,下列叙述正确的是 ( )12456789103A.构建基因表达载体时,最好选择限制酶Ⅱ和Ⅲ来切割质粒B.利用PCR扩增抗冻基因,需提前检测抗冻基因的全部碱基序列C.Vir区的基因活化促进抗冻基因整合到千禧果细胞的染色体DNA上D.利用含卡那霉素的培养基可筛选出成功导入抗冻基因的千禧果细胞√12456789103解析:使用限制酶Ⅱ会破坏Vir区的基因,Vir区的基因活化能促进T-DNA的加工和转移,不能选限制酶Ⅱ切割质粒,A错误;使用PCR技术扩增抗冻基因,只需要知道抗冻基因两端碱基序列设计引物即可,B错误;农杆菌侵染植物细胞后,Ti质粒上的T-DNA能转移到被侵染的细胞并整合到该细胞的染色体DNA上,所以Vir区基因活化可促进抗冻基因整合到千禧果细胞的染色体DNA上,C正确;为筛选成功导入抗冻基因的千禧果细胞,应在培养基中添加四环素,D错误。4.(2024·酒泉三模)实验小组利用PCR技术获得了含有目的基因的DNA片段,并用表中的限制酶对其进行酶切,再用所得DNA片段成功构建了基因表达载体,下列叙述错误的是 ( )1245678910312456789103A.PCR技术中用到的一个引物的前8个碱基序列为5'-TGCGCAGT-3'B.步骤①中用到的限制酶是SpeⅠ和CfoⅠC.用步骤①中的限制酶对质粒进行酶切,可至少获得2个DNA片段D.用步骤①中的限制酶对目的基因和质粒进行酶切,可保证目的基因与质粒正向连接√12456789103解析:由于引物只能引导子链从5'端到3'端合成,根据碱基互补配对原则,其中一个引物序列为5'-TGCGCAGT-3',A正确;根据三种酶的酶切位点,左侧的黏性末端是使用NheⅠ切割形成的,右边的黏性末端是用CfoⅠ切割形成的,B错误;用步骤①的酶对质粒进行酶切,质粒上至少有1个NheⅠ和1个CfoⅠ的酶切位点,质粒为环状DNA,切割之后至少获得了2个片段,C正确;用步骤①中的限制酶对目的基因和质粒进行酶切后,可在目的基因和质粒上分别形成两个不同的黏性末端,可保证目的基因与质粒正向连接,D正确。124567891035.(2024·南阳模拟)细菌的水通道蛋白在进化过程中产生了不同的类型。实验小组依据水通道蛋白的部分氨基酸序列设计简并核苷酸引物,通过PCR技术检测某细菌的水通道蛋白,下列说法错误的是 ( )A.应依据水通道蛋白进化过程中易变的氨基酸序列设计引物B.一对简并核苷酸引物可能扩增出多种不同类型的水通道蛋白DNAC.简并核苷酸引物可检测出进化过程中新出现的水通道蛋白D.PCR扩增结果可作为判断该细菌与不同细菌亲缘关系远近的依据√12456789103解析：由于水通道蛋白在进化过程中会产生不同的类型,因此应依据其保守的氨基酸序列设计引物,而不是易变的氨基酸序列,因为易变的氨基酸序列会导致引物无法准确识别和结合PCR模板,从而影响PCR的扩增效果,A错误;简并核苷酸引物可以与多种不同的DNA序列结合,因此可以扩增出多种不同类型的水通道蛋白DNA,B正确;简并核苷酸引物可以与多种变异的DNA序列结合,故它们可以检测出进化过程中新出现的水通道蛋白,C正确;通过比较不同细菌的PCR扩增结果,可以判断它们之间的亲缘关系远近,D正确。124567891036.(2024·自贡模拟)国家生猪种业工程技术研究中心科研团队在转基因猪生物反应器领域取得重要研究进展。在国际上首次利用转基因猪的唾液腺作为生物反应器,高效合成一种对人的神经性疾病具有良好治疗作用的蛋白——人神经生长因子(hNGF)。生产流程如图所示。下列相关说法错误的是 ( )12456789103A.可用人hNGF基因与猪成纤维细胞A中唾液淀粉酶基因的启动子等元件构建表达载体B.重构胚具有发育成个体的潜能,获得后可直接移植到代孕猪C体内进行分裂和发育C.猪卵细胞B需要在体外培养到MⅡ期后通过显微操作去核D.唾液腺生物反应器与乳腺生物反应器相比具有不受性别限制等特点√12456789103解析：用猪成纤维细胞A中唾液淀粉酶基因的启动子与人hNGF基因构建基因表达载体,能使目的基因在唾液腺细胞中表达,A正确;重构胚需要激活培养到一定阶段后才可移植到代孕猪C体内进行分裂和发育,B错误;卵细胞需要培养到MⅡ期去核,C正确;乳腺生物反应器只能是雌性动物,唾液腺生物反应器可以不受性别的限制,D正确。124567891037.(2024·济南期末)研究人员发现高强度光照下,番茄会通过NPQ(一种光保护机制)散失过多热能,避免高强度光照造成损伤。为研究V基因对NPQ的作用机制,科研人员利用病毒诱导基因沉默技术(VIGS技术)特异性地使V基因沉默,发现高强度光照下番茄叶片的损伤明显增强。技术原理如图所示。下列叙述正确的是 ( )12456789103A.本实验中的目的基因应选用V基因,该基因可通过PCR技术获得B.该过程中目的基因整合到特殊农杆菌的T DNA上C.该过程中VIGS技术通过降解V基因的mRNA进而抑制V基因的转录D.V基因的表达可能促进了NPQ机制的活化√12456789103解析：分析题意可知,本实验目的是研究V基因在高光条件下对NPQ机制的作用,且需要令V基因沉默,故本实验中目的基因应选用基因V的反义基因,A错误;目的基因与烟草病毒载体形成重组病毒载体,该目的基因没有整合到特殊农杆菌的T DNA上,B错误;VIGS技术是将反义V基因转录的RNA切割形成小分子RNA,小分子RNA与V基因的mRNA结合,抑制了V基因的翻译的过程,C错误;V基因沉默,发现高强度光照下番茄叶片的损伤明显增强,推测V基因的表达可能促进了NPQ机制的活化,D正确。8.(2024·辽阳模拟)黄酒是中国最古老的酒种,享有“酒中之祖”“酒中之王”的美誉,深得大众喜爱。但研究发现黄酒中的潜在致癌物质——氨基甲酸乙酯(EC)的含量远高于其他酒。已知酒液中的EC主要由尿素和乙醇反应生成,而尿素主要由酵母菌代谢产生。下列叙述错误的是 ( )1245678910312456789103A.在黄酒工艺流程中加入酸性脲基酰胺酶可起到降低EC含量的作用B.降低黄酒中EC含量可以通过抑制CAR1基因的表达来实现C.酒精浓度升高导致酵母菌活性下降会使发酵过程中酒精度数无法提高D.可用二苯胺鉴定经PCR扩增后的目的基因DUR1,2的特定核苷酸序列√12456789103解析：由题意可知,EC主要由尿素和乙醇反应形成,脲基酰胺酶可以将尿素分解成氨,减少尿素的含量,所以适量加入脲基酰胺酶,可以减少黄酒中EC的含量,A正确;为了降低黄酒中EC含量,可减少黄酒中尿素的含量,由题图可知,可以抑制CAR1基因的表达或增强DUR1,2基因的表达,B正确;在黄酒发酵过程中出现酒精度数无法提高,原因可能是酒精浓度升高导致酵母菌活性下降,C正确;在沸水浴的条件下,DNA遇二苯胺会被染成蓝色,故可用二苯胺试剂鉴定DNA,但不能鉴定特定核苷酸序列,D错误。9.研究人员将目的基因插入质粒,构建重组质粒的过程如图所示,再将该重组质粒导入大肠杆菌中。由β 半乳糖苷酶基因编码产生的β 半乳糖苷酶可分解X gal产生蓝色物质,使菌落呈蓝色,否则菌落为白色。下列叙述错误的是 ( )1245678910312456789103A.将目的基因插入质粒中时,需要用到的酶有XhoⅠ、NheⅠ和DNA连接酶B.需要用Ca2+处理大肠杆菌,使其处于易于吸收周围环境中DNA分子的状态C.按图示构建的重组质粒导入大肠杆菌后,大肠杆菌可正常表达该目的基因D.在含X gal的培养基上培养导入了重组质粒的大肠杆菌,可出现蓝色菌落√12456789103解析：目的基因两侧含有限制酶XhoⅠ、NheⅠ的识别序列,将目的基因插入质粒中时,需要用到的限制酶XhoⅠ、NheⅠ切割目的基因和质粒,再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接在一起,A正确;将目的基因导入受体细胞(大肠杆菌)时,需要用Ca2+处理大肠杆菌,使其处于易于吸收周围环境中DNA分子的状态,B正确;按图示构建的重组质粒导入大肠杆菌后,由于目的基因的转录方向和启动子的方向相反,大肠杆菌不能正常表达该目的基因,C错误;在含X gal的培养基上培养导入了重组质粒的大肠杆菌,β 半乳糖苷酶基因编码产生的β-半乳糖苷酶可分解X gal产生蓝色物质,使菌落呈蓝色,D正确。1245678910310.科学家将某病毒抗原蛋白的部分编码序列(RBD)拼接成融合基因2RBD和3RBD,探究RBD的二聚体蛋白和三聚体蛋白能否模拟RBD的天然构象并获得高效免疫原性。为鉴定重组质粒是否构建成功,将重组质粒用Nco Ⅰ和Sac Ⅰ双酶切处理后电泳,结果如图,其中泳道1为双酶切pNZ8149 2RBD,两个条带大小分别为2 507 bp和2 020 bp。将构建好的重组质粒分别导入工程菌中进行表达产物的检测。下列说法错误的是 ( )1245678910312456789103A.PCR扩增融合基因时,在引物的3'端添加相应限制酶的识别序列B.据图可知,融合基因3RBD的长度为2 686 bpC.泳道2呈现一个条带的原因是酶切pNZ8149 3RBD后产生的两个片段大小相近D.从工程菌细胞提取蛋白质进行检测,从而进一步比较两者的免疫原性√12456789103解析：引物使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸,PCR扩增融合基因时,在引物的5'端添加相应限制酶的识别序列,A错误;由题图可知pNZ8149 2RBD和pNZ8149 3RBD的长度分别为4 527 bp和5 193 bp,所以RBD长度为5 193-4 527=666 bp,泳道1为双酶切Pnz8149 2RBD,两个条带大小分别为2 507 bp和2 020 bp,泳道2呈现一个条带,其原因是双酶切pNZ8149 3RBD后产生的两个片段大小相近,说明融合基因2RBD的长度为2 020 bp,所以融合基因3RBD的长度为666+2 020=2 686 bp,B、C正确;12456789103该实验的目的是“探究RBD的二聚体蛋白和三聚体蛋白能否模拟RBD的天然构象并获得高效免疫原性”,可以从工程菌细胞提取蛋白质进行检测,从而进一步比较两者的免疫原性,D正确。2习题讲评课Ⅱ 基准考法大题保分练1.(13分)(2024·成都期末)枯草芽孢杆菌可分泌降解纤维素的酶,这种酶由W基因编码,其相关信息如图甲所示,利用重组DNA技术使W基因在乳酸杆菌中表达,需使用图乙的质粒为载体,图中标注限制酶的部位是其酶切位点。回答下列问题:(1)基因表达载体中的启动子是______________识别和结合的部位,可驱动基因转录。为确保质粒进入受体细胞后能进行自我复制,质粒还应该存在的结构是_________。 解析:基因表达载体中的启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,可驱动基因转录。为确保质粒进入受体细胞后能进行自我复制,质粒还应该存在的结构是复制原点。RNA聚合酶复制原点(2)限制酶Hind Ⅲ能特异性识别W基因的下游端和质粒的特定核苷酸序列,并使特定部位的___________键断开,产生的互补黏性末端可使用___________酶进行连接。 解析:限制酶Hind Ⅲ能特异性识别W基因的下游端和质粒的特定核苷酸序列,并使特定部位的磷酸二酯键断开,产生的互补黏性末端可使用DNA连接酶进行连接。磷酸二酯DNA连接(3)切割W基因上游端的限制酶不能选择MfeⅠ,原因是________________________。若选择KpnⅠ和HindⅢ分别切割W基因的上游和下游,再用这两种酶去切割质粒,得到的W基因和切割后的质粒______ (填“能”或“不能”)形成正确表达W基因的载体,原因是______________________________________。 会破坏W基因不能方向与启动子的方向相反W基因转录的MfeⅠ解析:切割W基因上游端的限制酶不能选择MfeⅠ,原因是MfeⅠ会破坏W基因。若选择KpnⅠ和HindⅢ分别切割W基因的上游和下游,再用这两种酶去切割质粒,得到的W基因和切割后的质粒不能形成正确表达W基因的载体,原因是W基因转录的方向与启动子的方向相反。(4)构建的基因表达载体导入乳酸杆菌后,可接种到含___________的培养基上筛选导入成功的目的菌。若要判定W基因在工程菌中是否表达,可以进行分子水平的检测,包括___________________________________________________________________________(答出两点)。 氨苄青霉素 检测W基因是否转录出了mRNA,检测乳酸杆菌中是否产生了降解纤维素的酶解析:质粒上存在氨苄青霉素抗性基因,故在构建的基因表达载体导入乳酸杆菌后,可接种到含氨苄青霉素的培养基上筛选导入成功的目的菌。若要判定W基因在工程菌中是否表达,可以进行分子水平的检测,包括检测W基因是否转录出了mRNA,检测乳酸杆菌中是否产生了降解纤维素的酶。2.(14分)(2024·漳州模拟)pET-22b质粒是基因工程中广为使用的一种载体。如图为pET-22b质粒,其中AmpR为氨苄青霉素抗性基因;pelB信号肽序列指导合成的信号肽能使翻译产物分泌至细胞外。(1)图中DNA单链______(填“是”或“不是”)转录的模板链,启动子的作用是___________________________________________。 解析:转录形成mRNA序列的方向为5'端→3'端,其模板链的方向应为3'端→5'端,图中DNA单链方向为5'端→3'端,因此图中DNA单链不是转录的模板链。启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录。不是RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录 (2)某研究团队利用PCR技术扩增吡哆醛激酶(PLK)基因,其中一条链两端的序列如下:5'GGCCATATGTCTCA……ACCTCGAGAGAC3'则PCR扩增PLK基因应选引物______ (填选项)。 A.5'GGCCATATGT…3'B.5'CCGGTATACA…3'C.5'CTCGAGAGAC…3'D.5'GTCTCTCGAG…3'AD为了将PLK基因插入pET-22b质粒序列,研究人员选用NdeⅠ和XhoⅠ对质粒和PLK基因进行切割,然后加入__________酶构建重组质粒。受体菌应选用_________ (填“不具有”或“具有”)氨苄青霉素抗性的大肠杆菌。检测结果发现大肠杆菌无法将PLK分泌到胞外,结合题干信息分析,原因是____________________________________________________________。 DNA连接不具有pelB信号肽序列被切除,无法表达出信号肽引导PLK分泌至胞外解析:引物的设计依据是目的基因两端的脱氧核苷酸序列,引物结合在模板链的3'端,因此PCR扩增PLK基因应选引物A、D。研究人员选用NdeⅠ和XhoⅠ对质粒和PLK基因进行切割,然后加入DNA连接酶将目的基因与pET-22b质粒连接起来构建重组质粒。由于重组质粒上含有氨苄青霉素抗性基因,因此需要将重组质粒导入到不具有氨苄青霉素抗性的大肠杆菌中。结合题干信息分析,选用NdeⅠ和XhoⅠ切割质粒导致pelB信号肽序列被切除,无法表达出信号肽引导PLK分泌至胞外。(3)为解决以上问题,可在题(2)引物_____ (填选项)的5'端添加限制酶________________的识别序列,再选相应的限制酶重复上述实验。 解析:为解决以上问题,可在题(2)引物A的5'端添加限制酶HindⅢ或EagⅠ的识别序列,再选相应的限制酶重复上述实验。A HindⅢ或EagⅠ(4)若以上述工艺流程大规模生产PLK,涉及的现代生物工程有___________________。 解析:以题述工艺流程大规模生产吡哆醛激酶,涉及生物工程的领域有基因工程、发酵工程。发酵工程、基因工程3.(14分)(2024·汕头二模)由P基因编码的P蛋白是一种水通道蛋白,该蛋白在植物调节水分吸收方面发挥着重要作用。科研人员成功培育出超量表达P蛋白的转基因玉米。培育过程中所用DNA片段和Ti质粒的酶切位点如图1所示。(1)构建基因表达载体时,切割Ti质粒应选用________________酶。从切割DNA片段和Ti质粒到构建基因表达载体完成共需____种酶。 解析:构建基因表达载体时,切割目的基因需要用到的限制酶为MunⅠ和XbaⅠ,结合各种限制酶的识别序列可知,EcoRⅠ和SpeⅠ分别与MunⅠ和XbaⅠ为同尾酶,因此,切割Ti质粒应选用EcoRⅠ和SpeⅠ酶。从切割DNA片段和Ti质粒到构建基因表达载体完成共需四种限制酶和一种DNA连接酶,共需要5种酶。EcoRⅠ和SpeⅠ5(2)将农杆菌浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养,培养基中需加入_________ (填“潮霉素”“卡那霉素”或“潮霉素或卡那霉素”)进行筛选,理由是_________________________________________________________________________________。筛选出的愈伤组织最终培养成转基因玉米。 潮霉素潮霉素抗性基因位于T-DNA中,会与目的基因一同转移到玉米愈伤组织细胞的染色体上解析:将农杆菌浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养,培养基中需加入潮霉素进行筛选,因为潮霉素抗性基因位于T-DNA中,会与目的基因一同转移到玉米愈伤组织细胞的染色体上,因此凡是成功导入目的基因的愈伤组织细胞应该具有对潮霉素的抗性。进而用筛选出的愈伤组织最终培养成转基因玉米。(3)农杆菌转化法除了用于获取转基因植物外,还可以通过T-DNA插入基因内部使基因沉默,获得突变体。为了获得mm突变体,某科研小组利用野生型MM,通过农杆菌转化法使基因M沉默。由于T-DNA插入的位置是随机的,为确定T-DNA是否插入M基因中,该小组采用“三引物法”进行PCR扩增,即采用三种引物(LP、RP、BP),LP、RP为与目的基因片段互补的,BP为插入T-DNA的特异引物,如图2所示。(说明:T-DNA插入基因后,会阻止被插入基因两端引物的扩增产物的形成)根据下表中三种样品的电泳结果判断样品___是纯合突变体,理由是_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________。 3样品1只能扩增出大片段,其基因型为MM;样品2能扩增出大片段和小片段,基因型为Mm;样品3中插入了T-DNA片段,表现为无扩增大片段出现,其基因型可表示为mm引物种类样品序号 LP+RP BP+RP样品1 有大片段 无样品2 有大片段 有小片段样品3 无 有小片段解析:根据题表中三种样品的电泳结果可判断样品3是纯合突变体,理由见答案。4.(14分)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术,原理如图1所示:由一条单链向导SgRNA引导Cas9蛋白识别并切割目标DNA双链的特定序列,以敲除目标基因或插入新的基因。我国科学家领衔的团队利用CRISPR/Cas9等技术,将人的突变亨廷顿舞蹈病致病基因(HTT基因)部分片段,插入猪基因组内,获得了人—猪“镶嵌”HTT基因,利用胚胎工程技术成功地构建了亨廷顿舞蹈病的动物模型。回答下列问题:(1)PCR技术是获得HTT基因常用的方法,制备PCR反应体系时,向缓冲液中分别加入HTT基因模板、4种脱氧核糖核苷酸、______、_____________________等进行扩增。 (2)SgRNA可识别并特异性结合目标DNA序列,二者结合所遵循的原则是__________________。Cas9蛋白相当于______酶,可催化__________键断裂,可在受体细胞中特定的基因位点进行切割,改变基因结构。 引物耐高温的DNA聚合酶碱基互补配对原则限制 磷酸二酯 (3)CRISPR/Cas9基因编辑技术可通过改变__________________ 的碱基序列,从而任意编辑基因组上的各种靶序列。若要将目标基因从目标DNA上切除下来,一般需要设计___种不同的SgRNA。 SgRNA的引导序列2 (4)含有插入序列的猪胚胎成纤维细胞在体外培养时通过细胞分裂,数量不断增加,当细胞贴壁生长到表面相互接触时,细胞停止分裂增殖,这种现象称为__________。将含有插入序列的猪胚胎成纤维细胞的细胞核导入去核的卵母细胞的过程,称为___________________。此后进行体外胚胎培养并移植到代孕母猪体内,最终获得亨廷顿舞蹈病动物模型。 接触抑制 动物体细胞核移植(5)CRISPR/Cas9基因编辑技术存在一定的脱靶效应:正常情况下,SgRNA通过20个核苷酸长度的引导序列与目标DNA序列发生碱基互补配对,准确识别需要编辑的位点,然而有时会发生第18~20个碱基不匹配的情况,此时,Cas9可通过一个手指状的结构紧紧抓住错配区稳定住RNA-DNA双链,从而为Cas9切割DNA铺平道路,但这可能会导致Cas9在错误的基因位点切割双链DNA,从而引发潜在风险。请就如何降低脱靶效应,提出可能的思路: _________________________________________________________________________________________。 设计SgRNA引导序列的长度为17个核苷酸长度,避免第18~20个碱基不匹配时,导致错误位点的切割3习题讲评课Ⅲ 创新考法大题增分练1.(12分)科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测,该质粒的部分结构如图甲所示,其中V5编码序列表达标签短肽V5。(1)与图甲中启动子结合的酶是_____________。除图甲中标出的结构外,作为载体,质粒还需具备的结构有_____________________________________(答出2个结构即可)。 解析:与启动子结合的酶是RNA聚合酶,图中甲有启动子和终止子等,质粒还需具备的结构有限制酶切割位点、标记基因、复制原点等。RNA聚合酶限制酶切割位点、标记基因、复制原点等(2)构建重组质粒后,为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物__________________。已知J基因转录的模板链位于b链,由此可知引物F1与图甲中J基因的______ (填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。 F1和R2(或F2和R1)a链解析:为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物F1和R2或F2和R1。b是模板链,而根据图甲中启动子和终止子的位置可知转录方向是从左向右,对应的模板链方向应是3'→5',非模板链(a链)是5'→3'。由于DNA复制的方向是子链的5'→3',所以引物的延伸方向为5'→3',引物结合的单链其方向是3'→5',故与引物F1配对的单链是b链,与引物F1相应的部分序列相同的是a链。(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平,结果如图乙所示。其中,出现条带1证明细胞内表达了________________,条带2所检出的蛋白_______ (填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。 J-V5融合蛋白不是解析:据图乙可知,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测,均出现条带1,说明条带1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2,抗V5抗体检测不出现条带2,说明条带2所检测出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。2.(16分)(2024·长沙模拟)酵母细胞基因转录需要转录因子,转录因子包括DNA结合结构域(DNA-BD)和转录激活结构域(DNA-AD),两结构域分开时不能激活转录。如果将待测蛋白质X与DNA-BD融合,蛋白质Y与DNA-AD融合,蛋白质X和Y有相互作用时,两结构域能重新呈现完整转录因子活性,并可激活报告基因的转录,过程如图1所示。已知报告基因LacZ表达的酶可以将无色化合物X-gal水解成蓝色产物。科研人员为了验证蛋白质X和Y是否具有相互作用,分别构建不同的酵母表达载体(如图2和图3所示),其中AmpR为氨苄青霉素抗性基因,HIS 3和TRPⅠ分别为控制组氨酸和色氨酸合成的基因。分析回答下列有关问题:(1)获得BD-X蛋白和AD-Y蛋白的关键是将相应基因序列连接形成__________。X与Y的结合能使转录因子的BD和AD同时结合到报告基因的上游,进而招募______________催化LacZ基因的转录。 解析:获得BD-X蛋白和AD-Y蛋白的关键是将相应基因序列连接形成融合基因,催化基因转录的应为RNA聚合酶。融合基因 RNA聚合酶(2)为将目的基因定向插入相应位点,扩增蛋白质X编码区序列时需在两个引物的5'端分别添加序列____________________;为验证目的基因在PCR扩增时是否发生了基因突变,可对PCR产物进行______ (填“电泳”“测序”或“电泳或测序”)。 GAATTC和GGATCC测序解析:据图2可知,pLexA-JL中蛋白质X编码区序列插入位置的两端是限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列,故扩增蛋白质X编码区序列时需在两个引物的5'端分别添加序列GAATTC和GGATCC;电泳只能反应DNA分子的大小和构象,并不能显示目的基因中碱基的排列顺序,因此为验证目的基因在PCR扩增时是否发生了基因突变,可对PCR产物进行测序。(3)pLexA-JL和pB42AD载体的构建时用特定限制酶切割目的基因和载体并连接,连接产物导入大肠杆菌后扩增;为确定质粒构建是否成功,需要抽提两种质粒进行酶切,并_______________________________________。 电泳后观察是否出现预期大小的目标条带解析:构建好基因表达载体后,可以抽提两种质粒并酶切,使用DNA电泳,观察电泳结果是否出现预期大小的目标条带,来确定表达载体构建是否成功。(4)将成功构建的pLexA-JL和pB42AD载体导入________ (填“同一个”或“不同的”)营养缺陷型的酵母菌中,与普通酵母菌相比,该营养缺陷型的酵母菌的特点是______________________________。 同一个自身不能合成组氨酸和色氨酸解析:根据酵母双杂交的机制,应将成功构建的pLexA-JL和pB42AD载体导入同一个酵母菌中,在一个细胞中同时表达BD-X蛋白和AD-Y蛋白,观察是否发生互作。pLexA-JL和pB42AD载体中的标记基因HIS3和TRPⅠ分别为控制组氨酸和色氨酸合成的基因,因此培养基中不能添加组氨酸和色氨酸,所用营养缺陷型的酵母菌为组氨酸和色氨酸合成缺陷型酵母菌。只有同时导入了pLexA-JL和pB42AD载体的酵母菌才能合成组氨酸和色氨酸,从而在培养基上存活,起到筛选作用。(5)请预测实验结果并写出相应的实验结论: ___________________________________________________________________________________________________________________________。 解析:由于只有当蛋白质X和蛋白质Y相互作用时,转录因子的DNA结合功能域(DNA-BD)和转录激活结构域(DNA-AD)才能发挥作用,激活报告基因的启动子,驱动对报告其因(LacZ基因)的转录,进而得以表达,报告基因LacZ表达的酶可以将无色化合物X-gal水解成蓝色产物。因此,可以通过检测菌落的颜色(菌落是否呈现蓝色)来确定蛋白质X和Y是否具有相互作用。若实验结果中菌落出现蓝色,则说明蛋白质X和Y具有相互作用;若实验结果菌落全部为白色(不出现蓝色),则说明蛋白质X和Y无相互作用3.(15分)(2024·沧州三模)人体内的t-PA蛋白能高效降解血栓,是心梗和脑血栓的急救药。然而,为心梗患者注射大剂量的基因工程t-PA会诱发颅内出血。研究证实,将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸,能显著降低出血副作用。据此,先对天然的t-PA基因进行序列改造,然后再采取传统的基因工程方法表达该突变基因,可制造出性能优异的t-PA突变蛋白。下图是通过重叠延伸PCR技术获取t-PA改良基因和利用质粒pCLY11构建含t-PA改良基因的重组质粒示意图(图中重叠延伸PCR过程中引物a、b用来扩增突变位点的上游DNA序列,引物c、d用来扩增突变位点的下游DNA序列)。请回答下列问题。(1)科学家将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸,生产出性能优良的t-PA突变蛋白的生物技术手段属于_____________范畴。该工程的基础是___________。 解析:题干所述生产改良t-PA蛋白的技术是先对天然的t-PA基因进行序列改造,然后再采取传统的基因工程方法表达该突变基因,可得到性能优异的改良t-PA蛋白,因此属于蛋白质工程。该工程的基础是基因工程。蛋白质工程基因工程(2)获得性能优良的t-PA突变蛋白的正确顺序是_____________ (选择正确编号并排序)。 ①t-PA蛋白功能分析和结构设计 ②借助定点突变改造t-PA基因序列 ③检验t-PA蛋白的结构和功能 ④设计t-PA蛋白氨基酸序列和基因序列 ⑤利用工程菌发酵合成t-PA蛋白①④②⑤③解析:据蛋白质工程的一般过程可知,获得性能优良的t-PA突变蛋白的正确顺序是①t-PA蛋白功能分析和结构设计→④设计t-PA蛋白氨基酸序列和基因序列→②借助定点突变改造t-PA基因序列→⑤利用工程菌发酵合成t-PA蛋白→③检验t-PA蛋白的结构和功能。(3)已知t-PA蛋白第84位是半胱氨酸,相应的基因模板链(图中t-PA基因的上链)上的碱基序列是ACA,丝氨酸的密码子是UCU。重叠延伸PCR示意图中的黑点便是突变部位的碱基,引物b中该突变位点的碱基是__________,引物c中该突变位点的碱基是___________。 G(鸟嘌呤)C(胞嘧啶)解析:已知t-PA蛋白第84位是半胱氨酸,相应的基因模板链(图中t-PA基因的上链)上的碱基序列是ACA,则半胱氨酸的密码子为UGU,而丝氨酸的密码子是UCU,由此可知,若要将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸,则t-PA基因上链第84位发生碱基C替换为碱基G,图中显示引物b与t-PA基因的下链互补,故其中相应部位的碱基与上链相同,即该部位的碱基是G,引物c与t-PA基因的上链互补,故其中相应部位的碱基与下链相同,即该部位的碱基是C。(4)若扩增图中序列时引物选择正确,PCR操作过程没有问题,但对产物进行电泳时,发现除了目标序列外还有很多非特异性条带,请分析出现此情况的原因: ________________________________。 解析:出现非目的序列产物的原因有引物设计太短(或引物特异性不强,即与非目的序列有同源性)、两引物之间碱基互补配对(形成引物二聚体)、复性温度过低、Mg2+浓度过高、DNA模板出现污染等。复性温度过低、引物特异性不高(5)若获得的t-PA改良基因如图所示,那么质粒pCLY11需用限制酶_______________切开,才能与t-PA改良基因高效连接。 解析:根据图中目的基因(t-PA改良基因)两端的黏性末端以及各种限制酶的切割位点可知,在构建重组质粒时,选用限制酶XmaⅠ和BglⅡ切割质粒,才能与目的基因t-PA改良基因高效连接。XmaⅠ、BglⅡ4.(17分)(2024·江苏高考)为了高效纯化超氧化物歧化酶(SOD),科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50,以融合表达SOD-ELP50蛋白,过程如图1。其中,ELP50是由人工合成的DNA片段,序列为:限制酶a识别序列—(GTTCCTGGTGTTGGC)50—限制酶b识别序列,50为重复次数。请回答下列问题:(1)步骤①双酶切时,需使用的限制酶a和限制酶b分别是__________________。 解析:目的基因应插入启动子和终止子之间,结合题意可知,ELP50应插入SOD之后,由题图可知,限制酶a和限制酶b分别是EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ。EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ(2)步骤②转化时,科研人员常用_______________处理大肠杆菌,使细胞处于感受态;转化后的大肠杆菌采用含有___________的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌,应选用的一对引物是_____________。 CaCl2(或Ca2+)卡那霉素S-F和E-R解析:将目的基因导入细菌时常用CaCl2(或Ca2+)处理大肠杆菌,使其处于感受态。重组DNA含有标记基因卡那霉素抗性基因,所以转化后的大肠杆菌采用含有卡那霉素的培养基进行筛选。成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌同时含有SOD和ELP50,结合图示可知,选引物S-F和E-R可特异性对SOD-ELP50进行扩增。(3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与________结合,驱动转录,翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11 kDa,将表达的蛋白先进行凝胶电泳,然后用SOD抗体进行杂交,显示的条带应是____ (从图2的“A~D”中选填)。 启动子C解析:RNA聚合酶与启动子结合后,启动转录。由题图可知,ELP50内含750碱基对,转录后再经翻译可形成约250个氨基酸;SOD内含462个碱基对,转录后再经翻译可形成约154个氨基酸,则SOD-ELP50蛋白共约含404个氨基酸残基,其相对分子质量约为404×0.11=44.44 KDa,电泳后应该为条带C。(4)步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法,科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响,部分结果如图3。(ⅰ)20 ℃时,加入NaCl后实验结果是___________________________________________。 (ⅱ)100 ℃时,导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是______________。 (ⅲ)据图分析,融合表达SOD-ELP50蛋白的优点有__________________________________________________________________。 SOD-ELP50组纯化SOD-ELP50蛋白数量更多高温使蛋白变性 低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化,杂蛋白较少,有利于酶活性的保持解析: (ⅰ)由题图可知,20 ℃时,较不加NaCl,加入NaCl后SOD-ELP50组纯化SOD-ELP50蛋白数量更多。(ⅱ)100 ℃时,温度过高,导致蛋白质变性而沉淀。(ⅲ)20 ℃,加入NaCl时,较SOD组,SOD-ELP50组沉淀中SOD-ELP50蛋白质相对含量较高,说明低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化,杂蛋白较少,有利于酶活性的保持。习题讲评课Ⅰ 选择小题夯基提速练(本卷每小题4分,满分40分) 1.下列有关基因工程的叙述,错误的是 ( )A.将目的基因导入植物细胞可利用花粉管通道法B.将某药用蛋白基因导入动物受精卵中可获得乳腺生物反应器C.目的基因扩增完成后的产物常用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定D.可通过RNA分子标记检测目的基因是否成功表达2.W是一种具有特定功能的人体蛋白质。某研究小组拟制备乳腺生物反应器来获得大量W,基本过程如图所示。下列相关叙述错误的是 ( )A.①过程构建的表达载体含有组织特异性启动子B.②过程通常在显微镜下进行去核、注入等操作C.该过程培养的山羊所有组织细胞均能分泌WD.该过程利用了转基因、胚胎移植等工程技术3.科研人员将寒带地区海鱼中的抗冻基因转入千禧果细胞中,成功培育出抗冻千禧果。下图为培育过程中使用的Ti质粒示意图,其中Vir区的基因活化能促进T DNA的加工和转移,下列叙述正确的是 ( )A.构建基因表达载体时,最好选择限制酶Ⅱ和Ⅲ来切割质粒B.利用PCR扩增抗冻基因,需提前检测抗冻基因的全部碱基序列C.Vir区的基因活化促进抗冻基因整合到千禧果细胞的染色体DNA上D.利用含卡那霉素的培养基可筛选出成功导入抗冻基因的千禧果细胞4.(2024·酒泉三模)实验小组利用PCR技术获得了含有目的基因的DNA片段,并用表中的限制酶对其进行酶切,再用所得DNA片段成功构建了基因表达载体,下列叙述错误的是 ( )A.PCR技术中用到的一个引物的前8个碱基序列为5' TGCGCAGT 3'B.步骤①中用到的限制酶是SpeⅠ和CfoⅠC.用步骤①中的限制酶对质粒进行酶切,可至少获得2个DNA片段D.用步骤①中的限制酶对目的基因和质粒进行酶切,可保证目的基因与质粒正向连接5.(2024·南阳模拟)细菌的水通道蛋白在进化过程中产生了不同的类型。实验小组依据水通道蛋白的部分氨基酸序列设计简并核苷酸引物,通过PCR技术检测某细菌的水通道蛋白,下列说法错误的是 ( )A.应依据水通道蛋白进化过程中易变的氨基酸序列设计引物B.一对简并核苷酸引物可能扩增出多种不同类型的水通道蛋白DNAC.简并核苷酸引物可检测出进化过程中新出现的水通道蛋白D.PCR扩增结果可作为判断该细菌与不同细菌亲缘关系远近的依据6.(2024·自贡模拟)国家生猪种业工程技术研究中心科研团队在转基因猪生物反应器领域取得重要研究进展。在国际上首次利用转基因猪的唾液腺作为生物反应器,高效合成一种对人的神经性疾病具有良好治疗作用的蛋白——人神经生长因子(hNGF)。生产流程如图所示。下列相关说法错误的是 ( )A.可用人hNGF基因与猪成纤维细胞A中唾液淀粉酶基因的启动子等元件构建表达载体B.重构胚具有发育成个体的潜能,获得后可直接移植到代孕猪C体内进行分裂和发育C.猪卵细胞B需要在体外培养到MⅡ期后通过显微操作去核D.唾液腺生物反应器与乳腺生物反应器相比具有不受性别限制等特点7.(2024·济南期末)研究人员发现高强度光照下,番茄会通过NPQ(一种光保护机制)散失过多热能,避免高强度光照造成损伤。为研究V基因对NPQ的作用机制,科研人员利用病毒诱导基因沉默技术(VIGS技术)特异性地使V基因沉默,发现高强度光照下番茄叶片的损伤明显增强。技术原理如图所示。下列叙述正确的是 ( )A.本实验中的目的基因应选用V基因,该基因可通过PCR技术获得B.该过程中目的基因整合到特殊农杆菌的T DNA上C.该过程中VIGS技术通过降解V基因的mRNA进而抑制V基因的转录D.V基因的表达可能促进了NPQ机制的活化8.(2024·辽阳模拟)黄酒是中国最古老的酒种,享有“酒中之祖”“酒中之王”的美誉,深得大众喜爱。但研究发现黄酒中的潜在致癌物质——氨基甲酸乙酯(EC)的含量远高于其他酒。已知酒液中的EC主要由尿素和乙醇反应生成,而尿素主要由酵母菌代谢产生。下列叙述错误的是 ( )A.在黄酒工艺流程中加入酸性脲基酰胺酶可起到降低EC含量的作用B.降低黄酒中EC含量可以通过抑制CAR1基因的表达来实现C.酒精浓度升高导致酵母菌活性下降会使发酵过程中酒精度数无法提高D.可用二苯胺鉴定经PCR扩增后的目的基因DUR1,2的特定核苷酸序列9.研究人员将目的基因插入质粒,构建重组质粒的过程如图所示,再将该重组质粒导入大肠杆菌中。由β 半乳糖苷酶基因编码产生的β 半乳糖苷酶可分解X gal产生蓝色物质,使菌落呈蓝色,否则菌落为白色。下列叙述错误的是 ( )A.将目的基因插入质粒中时,需要用到的酶有XhoⅠ、NheⅠ和DNA连接酶B.需要用Ca2+处理大肠杆菌,使其处于易于吸收周围环境中DNA分子的状态C.按图示构建的重组质粒导入大肠杆菌后,大肠杆菌可正常表达该目的基因D.在含X gal的培养基上培养导入了重组质粒的大肠杆菌,可出现蓝色菌落10.科学家将某病毒抗原蛋白的部分编码序列(RBD)拼接成融合基因2RBD和3RBD,探究RBD的二聚体蛋白和三聚体蛋白能否模拟RBD的天然构象并获得高效免疫原性。为鉴定重组质粒是否构建成功,将重组质粒用Nco Ⅰ和Sac Ⅰ双酶切处理后电泳,结果如图,其中泳道1为双酶切pNZ8149 2RBD,两个条带大小分别为2 507 bp和2 020 bp。将构建好的重组质粒分别导入工程菌中进行表达产物的检测。下列说法错误的是 ( )A.PCR扩增融合基因时,在引物的3'端添加相应限制酶的识别序列B.据图可知,融合基因3RBD的长度为2 686 bpC.泳道2呈现一个条带的原因是酶切pNZ8149 3RBD后产生的两个片段大小相近D.从工程菌细胞提取蛋白质进行检测,从而进一步比较两者的免疫原性习题讲评课Ⅰ1.选D RNA是转录的产物,转录成功并不意味着成功表达,检测目的基因是否成功表达常用抗原—抗体杂交法,D错误。2.选C ①过程构建的表达载体含有在乳腺中特异表达的基因的启动子,A正确;②为核移植,通常在显微镜下进行去核、注入等操作,B正确;该过程培养的山羊只有乳腺细胞能分泌W,C错误;通过生物工程技术制备山羊乳腺生物反应器过程中应用到了转基因(W基因导入山羊胚胎成纤维细胞)、核移植(胚胎成纤维细胞和卵母细胞形成重构胚)和胚胎移植(重构胚移入山羊体内)等工程技术,D正确。3.选C 使用限制酶Ⅱ会破坏Vir区的基因,Vir区的基因活化能促进T-DNA的加工和转移,不能选限制酶Ⅱ切割质粒,A错误;使用PCR技术扩增抗冻基因,只需要知道抗冻基因两端碱基序列设计引物即可,B错误;农杆菌侵染植物细胞后,Ti质粒上的T-DNA能转移到被侵染的细胞并整合到该细胞的染色体DNA上,所以Vir区基因活化可促进抗冻基因整合到千禧果细胞的染色体DNA上,C正确;为筛选成功导入抗冻基因的千禧果细胞,应在培养基中添加四环素,D错误。4.选B 由于引物只能引导子链从5'端到3'端合成,根据碱基互补配对原则,其中一个引物序列为5'-TGCGCAGT-3',A正确;根据三种酶的酶切位点,左侧的黏性末端是使用NheⅠ切割形成的,右边的黏性末端是用CfoⅠ切割形成的,B错误;用步骤①的酶对质粒进行酶切,质粒上至少有1个NheⅠ和1个CfoⅠ的酶切位点,质粒为环状DNA,切割之后至少获得了2个片段,C正确;用步骤①中的限制酶对目的基因和质粒进行酶切后,可在目的基因和质粒上分别形成两个不同的黏性末端,可保证目的基因与质粒正向连接,D正确。5.选A 由于水通道蛋白在进化过程中会产生不同的类型,因此应依据其保守的氨基酸序列设计引物,而不是易变的氨基酸序列,因为易变的氨基酸序列会导致引物无法准确识别和结合PCR模板,从而影响PCR的扩增效果,A错误;简并核苷酸引物可以与多种不同的DNA序列结合,因此可以扩增出多种不同类型的水通道蛋白DNA,B正确;简并核苷酸引物可以与多种变异的DNA序列结合,故它们可以检测出进化过程中新出现的水通道蛋白,C正确;通过比较不同细菌的PCR扩增结果,可以判断它们之间的亲缘关系远近,D正确。6.选B 用猪成纤维细胞A中唾液淀粉酶基因的启动子与人hNGF基因构建基因表达载体,能使目的基因在唾液腺细胞中表达,A正确;重构胚需要激活培养到一定阶段后才可移植到代孕猪C体内进行分裂和发育,B错误;卵细胞需要培养到MⅡ期去核,C正确;乳腺生物反应器只能是雌性动物,唾液腺生物反应器可以不受性别的限制,D正确。7.选D 分析题意可知,本实验目的是研究V基因在高光条件下对NPQ机制的作用,且需要令V基因沉默,故本实验中目的基因应选用基因V的反义基因,A错误;目的基因与烟草病毒载体形成重组病毒载体,该目的基因没有整合到特殊农杆菌的T-DNA上,B错误;VIGS技术是将反义V基因转录的RNA切割形成小分子RNA,小分子RNA与V基因的mRNA结合,抑制了V基因的翻译的过程,C错误;V基因沉默,发现高强度光照下番茄叶片的损伤明显增强,推测V基因的表达可能促进了NPQ机制的活化,D正确。8.选D 由题意可知,EC主要由尿素和乙醇反应形成,脲基酰胺酶可以将尿素分解成氨,减少尿素的含量,所以适量加入脲基酰胺酶,可以减少黄酒中EC的含量,A正确;为了降低黄酒中EC含量,可减少黄酒中尿素的含量,由题图可知,可以抑制CAR1基因的表达或增强DUR1,2基因的表达,B正确;在黄酒发酵过程中出现酒精度数无法提高,原因可能是酒精浓度升高导致酵母菌活性下降,C正确;在沸水浴的条件下,DNA遇二苯胺会被染成蓝色,故可用二苯胺试剂鉴定DNA,但不能鉴定特定核苷酸序列,D错误。9.选C 目的基因两侧含有限制酶XhoⅠ、NheⅠ的识别序列,将目的基因插入质粒中时,需要用到的限制酶XhoⅠ、NheⅠ切割目的基因和质粒,再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接在一起,A正确;将目的基因导入受体细胞(大肠杆菌)时,需要用Ca2+处理大肠杆菌,使其处于易于吸收周围环境中DNA分子的状态,B正确;按图示构建的重组质粒导入大肠杆菌后,由于目的基因的转录方向和启动子的方向相反,大肠杆菌不能正常表达该目的基因,C错误;在含X-gal的培养基上培养导入了重组质粒的大肠杆菌,β-半乳糖苷酶基因编码产生的β-半乳糖苷酶可分解X-gal产生蓝色物质,使菌落呈蓝色,D正确。10.选A 引物使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸,PCR扩增融合基因时,在引物的5'端添加相应限制酶的识别序列,A错误;由题图可知pNZ8149-2RBD和pNZ8149-3RBD的长度分别为4 527 bp和5 193 bp,所以RBD长度为5 193-4 527=666 bp,泳道1为双酶切pNZ8149-2RBD,两个条带大小分别为2 507 bp和2 020 bp,泳道2呈现一个条带,其原因是双酶切pNZ8149-3RBD后产生的两个片段大小相近,说明融合基因2RBD的长度为2 020 bp,所以融合基因3RBD的长度为666+2 020=2 686 bp,B、C正确;该实验的目的是“探究RBD的二聚体蛋白和三聚体蛋白能否模拟RBD的天然构象并获得高效免疫原性”,可以从工程菌细胞提取蛋白质进行检测,从而进一步比较两者的免疫原性,D正确。4 / 4习题讲评课Ⅱ 基准考法大题保分练(本卷共4题,满分60分) 1.(13分)(2024·成都期末)枯草芽孢杆菌可分泌降解纤维素的酶,这种酶由W基因编码,其相关信息如图甲所示,利用重组DNA技术使W基因在乳酸杆菌中表达,需使用图乙的质粒为载体,图中标注限制酶的部位是其酶切位点。回答下列问题:(1)基因表达载体中的启动子是 识别和结合的部位,可驱动基因转录。为确保质粒进入受体细胞后能进行自我复制,质粒还应该存在的结构是 。 (2)限制酶Hind Ⅲ能特异性识别W基因的下游端和质粒的特定核苷酸序列,并使特定部位的 键断开,产生的互补黏性末端可使用 酶进行连接。 (3)切割W基因上游端的限制酶不能选择MfeⅠ,原因是 。若选择KpnⅠ和HindⅢ分别切割W基因的上游和下游,再用这两种酶去切割质粒,得到的W基因和切割后的质粒 (填“能”或“不能”)形成正确表达W基因的载体,原因是 。 (4)构建的基因表达载体导入乳酸杆菌后,可接种到含 的培养基上筛选导入成功的目的菌。若要判定W基因在工程菌中是否表达,可以进行分子水平的检测,包括 (答出两点)。 2.(14分)(2024·漳州模拟)pET 22b质粒是基因工程中广为使用的一种载体。如图为pET 22b质粒,其中AmpR为氨苄青霉素抗性基因;pelB信号肽序列指导合成的信号肽能使翻译产物分泌至细胞外。(1)图中DNA单链 (填“是”或“不是”)转录的模板链,启动子的作用是 。 (2)某研究团队利用PCR技术扩增吡哆醛激酶(PLK)基因,其中一条链两端的序列如下:5'GGCCATATGTCTCA……ACCTCGAGAGAC3'则PCR扩增PLK基因应选引物 (填选项)。 A.5'GGCCATATGT…3'B.5'CCGGTATACA…3'C.5'CTCGAGAGAC…3'D.5'GTCTCTCGAG…3'为了将PLK基因插入pET 22b质粒序列,研究人员选用NdeⅠ和XhoⅠ对质粒和PLK基因进行切割,然后加入 酶构建重组质粒。受体菌应选用 (填“不具有”或“具有”)氨苄青霉素抗性的大肠杆菌。检测结果发现大肠杆菌无法将PLK分泌到胞外,结合题干信息分析,原因是 。 (3)为解决以上问题,可在题(2)引物 (填选项)的5'端添加限制酶 的识别序列,再选相应的限制酶重复上述实验。 (4)若以上述工艺流程大规模生产PLK,涉及的现代生物工程有 。 3.(14分)(2024·汕头二模)由P基因编码的P蛋白是一种水通道蛋白,该蛋白在植物调节水分吸收方面发挥着重要作用。科研人员成功培育出超量表达P蛋白的转基因玉米。培育过程中所用DNA片段和Ti质粒的酶切位点如图1所示。(1)构建基因表达载体时,切割Ti质粒应选用 酶。从切割DNA片段和Ti质粒到构建基因表达载体完成共需 种酶。 (2)将农杆菌浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养,培养基中需加入 (填“潮霉素”“卡那霉素”或“潮霉素或卡那霉素”)进行筛选,理由是 。筛选出的愈伤组织最终培养成转基因玉米。 (3)农杆菌转化法除了用于获取转基因植物外,还可以通过T DNA插入基因内部使基因沉默,获得突变体。为了获得mm突变体,某科研小组利用野生型MM,通过农杆菌转化法使基因M沉默。由于T DNA插入的位置是随机的,为确定T DNA是否插入M基因中,该小组采用“三引物法”进行PCR扩增,即采用三种引物(LP、RP、BP),LP、RP为与目的基因片段互补的,BP为插入T DNA的特异引物,如图2所示。(说明:T DNA插入基因后,会阻止被插入基因两端引物的扩增产物的形成)根据下表中三种样品的电泳结果判断样品 是纯合突变体,理由是 。 引物种类样品序号 LP+RP BP+RP样品1 有大片段 无样品2 有大片段 有小片段样品3 无 有小片段4.(19分)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术,原理如图1所示:由一条单链向导SgRNA引导Cas9蛋白识别并切割目标DNA双链的特定序列,以敲除目标基因或插入新的基因。我国科学家领衔的团队利用CRISPR/Cas9等技术,将人的突变亨廷顿舞蹈病致病基因(HTT基因)部分片段,插入猪基因组内,获得了人—猪“镶嵌”HTT基因,利用胚胎工程技术成功地构建了亨廷顿舞蹈病的动物模型。回答下列问题:(1)PCR技术是获得HTT基因常用的方法,制备PCR反应体系时,向缓冲液中分别加入HTT基因模板、4种脱氧核糖核苷酸、 、 等进行扩增。 (2)SgRNA可识别并特异性结合目标DNA序列,二者结合所遵循的原则是 。Cas9蛋白相当于 酶,可催化 键断裂,可在受体细胞中特定的基因位点进行切割,改变基因结构。 (3)CRISPR/Cas9基因编辑技术可通过改变 的碱基序列,从而任意编辑基因组上的各种靶序列。若要将目标基因从目标DNA上切除下来,一般需要设计 种不同的SgRNA。 (4)含有插入序列的猪胚胎成纤维细胞在体外培养时通过细胞分裂,数量不断增加,当细胞贴壁生长到表面相互接触时,细胞停止分裂增殖,这种现象称为 。将含有插入序列的猪胚胎成纤维细胞的细胞核导入去核的卵母细胞的过程,称为 。此后进行体外胚胎培养并移植到代孕母猪体内,最终获得亨廷顿舞蹈病动物模型。 (5)CRISPR/Cas9基因编辑技术存在一定的脱靶效应:正常情况下,SgRNA通过20个核苷酸长度的引导序列与目标DNA序列发生碱基互补配对,准确识别需要编辑的位点,然而有时会发生第18~20个碱基不匹配的情况,此时,Cas9可通过一个手指状的结构紧紧抓住错配区稳定住RNA DNA双链,从而为Cas9切割DNA铺平道路,但这可能会导致Cas9在错误的基因位点切割双链DNA,从而引发潜在风险。请就如何降低脱靶效应,提出可能的思路: 。 习题讲评课Ⅱ1.解析:(1)基因表达载体中的启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,可驱动基因转录。为确保质粒进入受体细胞后能进行自我复制,质粒还应该存在的结构是复制原点。(2)限制酶Hind Ⅲ能特异性识别W基因的下游端和质粒的特定核苷酸序列,并使特定部位的磷酸二酯键断开,产生的互补黏性末端可使用DNA连接酶进行连接。(3)切割W基因上游端的限制酶不能选择MfeⅠ,原因是MfeⅠ会破坏W基因。若选择KpnⅠ和HindⅢ分别切割W基因的上游和下游,再用这两种酶去切割质粒,得到的W基因和切割后的质粒不能形成正确表达W基因的载体,原因是W基因转录的方向与启动子的方向相反。(4)质粒上存在氨苄青霉素抗性基因,故在构建的基因表达载体导入乳酸杆菌后,可接种到含氨苄青霉素的培养基上筛选导入成功的目的菌。若要判定W基因在工程菌中是否表达,可以进行分子水平的检测,包括检测W基因是否转录出了mRNA,检测乳酸杆菌中是否产生了降解纤维素的酶。答案:(1)RNA聚合酶 复制原点 (2)磷酸二酯 DNA连接(3)MfeⅠ会破坏W基因 不能 W基因转录的方向与启动子的方向相反 (4)氨苄青霉素 检测W基因是否转录出了mRNA,检测乳酸杆菌中是否产生了降解纤维素的酶2.解析:(1)转录形成mRNA序列的方向为5'端→3'端,其模板链的方向应为3'端→5'端,图中DNA单链方向为5'端→3'端,因此图中DNA单链不是转录的模板链。启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录。(2)引物的设计依据是目的基因两端的脱氧核苷酸序列,引物结合在模板链的3'端,因此PCR扩增PLK基因应选引物A、D。研究人员选用NdeⅠ和XhoⅠ对质粒和PLK基因进行切割,然后加入DNA连接酶将目的基因与pET-22b质粒连接起来构建重组质粒。由于重组质粒上含有氨苄青霉素抗性基因,因此需要将重组质粒导入到不具有氨苄青霉素抗性的大肠杆菌中。结合题干信息分析,选用NdeⅠ和XhoⅠ切割质粒导致pelB信号肽序列被切除,无法表达出信号肽引导PLK分泌至胞外。(3)为解决以上问题,可在题(2)引物A的5'端添加限制酶HindⅢ或EagⅠ的识别序列,再选相应的限制酶重复上述实验。(4)以题述工艺流程大规模生产吡哆醛激酶,涉及生物工程的领域有基因工程、发酵工程。答案:(1)不是 RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录 (2)AD DNA连接 不具有 pelB信号肽序列被切除,无法表达出信号肽引导PLK分泌至胞外 (3)A HindⅢ或EagⅠ (4)发酵工程、基因工程3.解析:(1)构建基因表达载体时,切割目的基因需要用到的限制酶为MunⅠ和XbaⅠ,结合各种限制酶的识别序列可知,EcoRⅠ和SpeⅠ分别与MunⅠ和XbaⅠ为同尾酶,因此,切割Ti质粒应选用EcoRⅠ和SpeⅠ酶。从切割DNA片段和Ti质粒到构建基因表达载体完成共需四种限制酶和一种DNA连接酶,共需要5种酶。(2)将农杆菌浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养,培养基中需加入潮霉素进行筛选,因为潮霉素抗性基因位于T-DNA中,会与目的基因一同转移到玉米愈伤组织细胞的染色体上,因此凡是成功导入目的基因的愈伤组织细胞应该具有对潮霉素的抗性。进而用筛选出的愈伤组织最终培养成转基因玉米。(3)根据题表中三种样品的电泳结果可判断样品3是纯合突变体,理由见答案。答案:(1)EcoRⅠ和SpeⅠ 5 (2)潮霉素 潮霉素抗性基因位于T-DNA中,会与目的基因一同转移到玉米愈伤组织细胞的染色体上 (3)3 样品1只能扩增出大片段,其基因型为MM;样品2能扩增出大片段和小片段,基因型为Mm;样品3中插入了T-DNA片段,表现为无扩增大片段出现,其基因型可表示为mm4.(1)引物 耐高温的DNA聚合酶 (2)碱基互补配对原则 限制 磷酸二酯 (3)SgRNA的引导序列 2 (4)接触抑制 动物体细胞核移植 (5)设计SgRNA引导序列的长度为17个核苷酸长度,避免第18~20个碱基不匹配时,导致错误位点的切割2 / 4习题讲评课Ⅲ 创新考法大题增分练(本卷共4题,满分60分)1.(12分)科研人员构建了可表达J V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测,该质粒的部分结构如图甲所示,其中V5编码序列表达标签短肽V5。(1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外,作为载体,质粒还需具备的结构有 (答出2个结构即可)。 (2)构建重组质粒后,为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链,由此可知引物F1与图甲中J基因的 (填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平,结果如图乙所示。其中,出现条带1证明细胞内表达了 ,条带2所检出的蛋白 (填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。 2.(16分)(2024·长沙模拟)酵母细胞基因转录需要转录因子,转录因子包括DNA结合结构域(DNA BD)和转录激活结构域(DNA AD),两结构域分开时不能激活转录。如果将待测蛋白质X与DNA BD融合,蛋白质Y与DNA AD融合,蛋白质X和Y有相互作用时,两结构域能重新呈现完整转录因子活性,并可激活报告基因的转录,过程如图1所示。已知报告基因LacZ表达的酶可以将无色化合物X gal水解成蓝色产物。科研人员为了验证蛋白质X和Y是否具有相互作用,分别构建不同的酵母表达载体(如图2和图3所示),其中AmpR为氨苄青霉素抗性基因,HIS 3和TRPⅠ分别为控制组氨酸和色氨酸合成的基因。分析回答下列有关问题:(1)获得BD X蛋白和AD Y蛋白的关键是将相应基因序列连接形成 。X与Y的结合能使转录因子的BD和AD同时结合到报告基因的上游,进而招募 催化LacZ基因的转录。 (2)为将目的基因定向插入相应位点,扩增蛋白质X编码区序列时需在两个引物的5'端分别添加序列 ;为验证目的基因在PCR扩增时是否发生了基因突变,可对PCR产物进行 (填“电泳”“测序”或“电泳或测序”)。 (3)pLexA JL和pB42AD载体的构建时用特定限制酶切割目的基因和载体并连接,连接产物导入大肠杆菌后扩增;为确定质粒构建是否成功,需要抽提两种质粒进行酶切,并 。 (4)将成功构建的pLexA JL和pB42AD载体导入 (填“同一个”或“不同的”)营养缺陷型的酵母菌中,与普通酵母菌相比,该营养缺陷型的酵母菌的特点是 。 (5)请预测实验结果并写出相应的实验结论: 。 3.(15分)(2024·沧州三模)人体内的t PA蛋白能高效降解血栓,是心梗和脑血栓的急救药。然而,为心梗患者注射大剂量的基因工程t PA会诱发颅内出血。研究证实,将t PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸,能显著降低出血副作用。据此,先对天然的t PA基因进行序列改造,然后再采取传统的基因工程方法表达该突变基因,可制造出性能优异的t PA突变蛋白。下图是通过重叠延伸PCR技术获取t PA改良基因和利用质粒pCLY11构建含t PA改良基因的重组质粒示意图(图中重叠延伸PCR过程中引物a、b用来扩增突变位点的上游DNA序列,引物c、d用来扩增突变位点的下游DNA序列)。请回答下列问题。(1)科学家将t PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸,生产出性能优良的t PA突变蛋白的生物技术手段属于 范畴。该工程的基础是 。 (2)获得性能优良的t PA突变蛋白的正确顺序是 (选择正确编号并排序)。 ①t PA蛋白功能分析和结构设计 ②借助定点突变改造t PA基因序列 ③检验t PA蛋白的结构和功能 ④设计t PA蛋白氨基酸序列和基因序列 ⑤利用工程菌发酵合成t PA蛋白(3)已知t PA蛋白第84位是半胱氨酸,相应的基因模板链(图中t PA基因的上链)上的碱基序列是ACA,丝氨酸的密码子是UCU。重叠延伸PCR示意图中的黑点便是突变部位的碱基,引物b中该突变位点的碱基是 ,引物c中该突变位点的碱基是 。 (4)若扩增图中序列时引物选择正确,PCR操作过程没有问题,但对产物进行电泳时,发现除了目标序列外还有很多非特异性条带,请分析出现此情况的原因: 。 (5)若获得的t PA改良基因如图所示,那么质粒pCLY11需用限制酶 切开,才能与t PA改良基因高效连接。 4.(17分)(2024·江苏高考)为了高效纯化超氧化物歧化酶(SOD),科研人员将ELP50片段插入pET SOD构建重组质粒pET SOD ELP50,以融合表达SOD ELP50蛋白,过程如图1。其中,ELP50是由人工合成的DNA片段,序列为:限制酶a识别序列—(GTTCCTGGTGTTGGC)50—限制酶b识别序列,50为重复次数。请回答下列问题:(1)步骤①双酶切时,需使用的限制酶a和限制酶b分别是 。 (2)步骤②转化时,科研人员常用 处理大肠杆菌,使细胞处于感受态;转化后的大肠杆菌采用含有 的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET SOD ELP50的大肠杆菌,应选用的一对引物是 。 (3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与 结合,驱动转录,翻译SOD ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11 kDa,将表达的蛋白先进行凝胶电泳,然后用SOD抗体进行杂交,显示的条带应是 (从图2的“A~D”中选填)。 (4)步骤④为探寻高效纯化SOD ELP50蛋白的方法,科研人员研究了温度、NaCl对SOD ELP50蛋白纯化效果的影响,部分结果如图3。(ⅰ)20 ℃时,加入NaCl后实验结果是 。 (ⅱ)100 ℃时,导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是 。 (ⅲ)据图分析,融合表达SOD ELP50蛋白的优点有 。 习题讲评课Ⅲ1.解析:(1)与启动子结合的酶是RNA聚合酶,图中甲有启动子和终止子等,质粒还需具备的结构有限制酶切割位点、标记基因、复制原点等。(2)为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物F1和R2或F2和R1。b是模板链,而根据图甲中启动子和终止子的位置可知转录方向是从左向右,对应的模板链方向应是3'→5',非模板链(a链)是5'→3'。由于DNA复制的方向是子链的5'→3',所以引物的延伸方向为5'→3',引物结合的单链其方向是3'→5',故与引物F1配对的单链是b链,与引物F1相应的部分序列相同的是a链。(3)据图乙可知,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测,均出现条带1,说明条带1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2,抗V5抗体检测不出现条带2,说明条带2所检测出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。答案:(1)RNA聚合酶 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等 (2)F1和R2(或F2和R1) a链 (3)J-V5融合蛋白 不是2.解析:(1)获得BD-X蛋白和AD-Y蛋白的关键是将相应基因序列连接形成融合基因,催化基因转录的应为RNA聚合酶。(2)据图2可知,pLexA-JL中蛋白质X编码区序列插入位置的两端是限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列,故扩增蛋白质X编码区序列时需在两个引物的5'端分别添加序列GAATTC和GGATCC;电泳只能反应DNA分子的大小和构象,并不能显示目的基因中碱基的排列顺序,因此为验证目的基因在PCR扩增时是否发生了基因突变,可对PCR产物进行测序。(3)构建好基因表达载体后,可以抽提两种质粒并酶切,使用DNA电泳,观察电泳结果是否出现预期大小的目标条带,来确定表达载体构建是否成功。(4)根据酵母双杂交的机制,应将成功构建的pLexA-JL和pB42AD载体导入同一个酵母菌中,在一个细胞中同时表达BD-X蛋白和AD-Y蛋白,观察是否发生互作。pLexA-JL和pB42AD载体中的标记基因HIS3和TRPⅠ分别为控制组氨酸和色氨酸合成的基因,因此培养基中不能添加组氨酸和色氨酸,所用营养缺陷型的酵母菌为组氨酸和色氨酸合成缺陷型酵母菌。只有同时导入了pLexA-JL和pB42AD载体的酵母菌才能合成组氨酸和色氨酸,从而在培养基上存活,起到筛选作用。(5)由于只有当蛋白质X和蛋白质Y相互作用时,转录因子的DNA结合功能域(DNA-BD)和转录激活结构域(DNA-AD)才能发挥作用,激活报告基因的启动子,驱动对报告其因(LacZ基因)的转录,进而得以表达,报告基因LacZ表达的酶可以将无色化合物X-gal水解成蓝色产物。因此,可以通过检测菌落的颜色(菌落是否呈现蓝色)来确定蛋白质X和Y是否具有相互作用。答案:(1)融合基因 RNA聚合酶 (2)GAATTC和GGATCC测序 (3)电泳后观察是否出现预期大小的目标条带 (4)同一个 自身不能合成组氨酸和色氨酸 (5)若实验结果中菌落出现蓝色,则说明蛋白质X和Y具有相互作用;若实验结果菌落全部为白色(不出现蓝色),则说明蛋白质X和Y无相互作用3.解析:(1)题干所述生产改良t-PA蛋白的技术是先对天然的t-PA基因进行序列改造,然后再采取传统的基因工程方法表达该突变基因,可得到性能优异的改良t-PA蛋白,因此属于蛋白质工程。该工程的基础是基因工程。(2)据蛋白质工程的一般过程可知,获得性能优良的t-PA突变蛋白的正确顺序是①t-PA蛋白功能分析和结构设计→④设计t-PA蛋白氨基酸序列和基因序列→②借助定点突变改造t-PA基因序列→⑤利用工程菌发酵合成t-PA蛋白→③检验t-PA蛋白的结构和功能。(3)已知t-PA蛋白第84位是半胱氨酸,相应的基因模板链(图中t-PA基因的上链)上的碱基序列是ACA,则半胱氨酸的密码子为UGU,而丝氨酸的密码子是UCU,由此可知,若要将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸,则t-PA基因上链第84位发生碱基C替换为碱基G,图中显示引物b与t-PA基因的下链互补,故其中相应部位的碱基与上链相同,即该部位的碱基是G,引物c与t-PA基因的上链互补,故其中相应部位的碱基与下链相同,即该部位的碱基是C。(4)出现非目的序列产物的原因有引物设计太短(或引物特异性不强,即与非目的序列有同源性)、两引物之间碱基互补配对(形成引物二聚体)、复性温度过低、Mg2+浓度过高、DNA模板出现污染等。(5)根据图中目的基因(t-PA改良基因)两端的黏性末端以及各种限制酶的切割位点可知,在构建重组质粒时,选用限制酶XmaⅠ和BglⅡ切割质粒,才能与目的基因t-PA改良基因高效连接。答案:(1)蛋白质工程 基因工程 (2)①④②⑤③ (3)G(鸟嘌呤)C(胞嘧啶) (4)复性温度过低、引物特异性不高 (5)XmaⅠ、BglⅡ4.解析:(1)目的基因应插入启动子和终止子之间,结合题意可知,ELP50应插入SOD之后,由题图可知,限制酶a和限制酶b分别是EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ。(2)将目的基因导入细菌时常用CaCl2(或Ca2+)处理大肠杆菌,使其处于感受态。重组DNA含有标记基因卡那霉素抗性基因,所以转化后的大肠杆菌采用含有卡那霉素的培养基进行筛选。成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌同时含有SOD和ELP50,结合图示可知,选引物S-F和E-R可特异性对SOD-ELP50进行扩增。(3)RNA聚合酶与启动子结合后,启动转录。由题图可知,ELP50内含750碱基对,转录后再经翻译可形成约250个氨基酸;SOD内含462个碱基对,转录后再经翻译可形成约154个氨基酸,则SOD-ELP50蛋白共约含404个氨基酸残基,其相对分子质量约为404×0.11=44.44 KDa,电泳后应该为条带C。(4)(ⅰ)由题图可知,20 ℃时,较不加NaCl,加入NaCl后SOD-ELP50组纯化SOD-ELP50蛋白数量更多。(ⅱ)100 ℃时,温度过高,导致蛋白质变性而沉淀。(ⅲ)20 ℃,加入NaCl时,较SOD组,SOD-ELP50组沉淀中SOD-ELP50蛋白质相对含量较高,说明低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化,杂蛋白较少,有利于酶活性的保持。答案:(1)EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ (2)CaCl2(或Ca2+) 卡那霉素 S-F和E-R (3)启动子 C (4)(ⅰ)SOD-ELP50组纯化SOD-ELP50蛋白数量更多 (ⅱ)高温使蛋白变性 (ⅲ)低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化,杂蛋白较少,有利于酶活性的保持4 / 4 展开更多...... 收起↑ 资源列表 习题讲评课Ⅰ 选择小题夯基提速练.docx 习题讲评课Ⅱ 基准考法大题保分练.docx 习题讲评课Ⅲ 创新考法大题增分练.docx 课下 专题检测·习题讲评.pptx 课堂 抓重难点·讲增分点.pptx 课堂：抓重难点?讲增分点.docx
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