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(共29张PPT)
人教版（2019）选择性必修三
重组DNA技术的基本工具
第3章 基因工程
基因工程的诞生
1944年艾弗里等人证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移
1950年埃特曼发明了一种测定氨基酸序列的方法
1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型
1958年梅塞尔森和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制
1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子
1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移
基因工程的诞生
1972年，伯格成功构建了第一个体外重组DNA分子
1973年，证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，基因工程正式问世
1977年，桑格等科学家发明了DNA序列分析的方法。此后，DNA合成仪的问世为体外合成DNA提供了方便
1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市
1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶（简称限制酶）
20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现
基因工程的诞生
1983年，科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草
1984年，我国科学家朱作言领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼
1985年，穆里斯等人发明了PCR
1990年，人类基因组计划启动。2003年完成
21世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，加速了人们对基因组序列的了解
2013年，华人科学家张锋及其团队首次报道利用最新的基因组编辑技术编辑了哺乳动物基因组。该技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换
1.理解基因工程的概念
2.运用结构与功能观，说明基因工程的各种工具的作用及特点
3.比较限制酶、DNA连接酶的差异，区分DNA连接酶和DNA聚合酶
4.关注基因工程的社会议题
学习目标
从社会中来
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
DNA 双螺旋的直径只有 2 nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
目录
01
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
02
DNA 连接酶—“分子缝合针”
03
基因进入受体细胞的载体 —“分子运输车”
基因工程概述
按照人们的愿望,进行严格的设计并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作DNA重组技术。
（1）操作对象：基因
（2）操作水平：DNA分子水平
（3）工程实质：基因重组
（4）意义：定向改造生物性状
转基因超级鼠
正常小鼠
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
1.定义
2.来源
3.种类
4.作用特点
（1）能够识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列
（2）使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开
5.作用部位
4~8个核苷酸组成
：切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，又称限制酶
：原核细胞中分离
：数千种
：具有专一性
：特定切点上的磷酸二酯键
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
DNA双螺旋
结构图
限制酶：切断磷酸二酯键
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
限制酶的识别序列
能被限制性内切酶特异性识别的切割部位都具有回文序列：
限制酶所识别序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列。
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
6.切割结果
（1）黏性末端——EcoR I限制酶切割
识别序列：GAATTC
切割位置：G和A之间的磷酸二酯键
黏性末端
EcoR I
（在G与A之间切割）
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
（2）平末端——Sma Ⅰ限制酶切割
识别序列：CCCGGG
切割位置：G和C之间的磷酸二酯键
平末端
Sma Ⅰ
（在G与C之间切割）
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
【思考】
【问题】找到上面两条片段上EcoR Ⅰ的识别序列和切割位点
…TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG…
…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…
5′
3′
5′
3′
…AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGGTATG…
…TCCTAGAATTCTCGGTATGAATTCCATAC…
5′
3′
5′
3′
拓展——限制酶的命名
例如：从大肠杆菌（Escherichia coli）的R型菌株中分离来的EcoR I
EcoR I
属名首字母
种名前两个字母
R型菌株
从中分离的第一个限制酶
DNA连接酶——“分子缝合针”
1.定义
2.作用
DNA连接酶
：将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子所用到的酶
：恢复双链DNA中被限制酶切开的磷酸二酯键
DNA连接酶——“分子缝合针”
切开DNA双链形成的粘性末端
形成磷酸二酯键恢复双链
E.coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端
DNA连接酶——“分子缝合针”
切开DNA双链形成的平末端
T4 DNA连接酶
形成磷酸二酯键恢复双链
T4 DNA连接酶既可以连接黏性末端又可以连接平末端（效率相对较低）
DNA连接酶不具有特异性识别功能
DNA连接酶——“分子缝合针”
A A T T G
C
A
A
T
T
A
A
T
T
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
对比常用的几种酶
名称 作用部位 作用结果
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
DNA(水解)酶
解旋酶
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
碱基对之间的氢键
将DNA切成两个片段
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
将双链DNA分子局部解旋为单链
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1.功能
将目的基因转入受体细胞，在受体细胞内对目的基因进行大量复制
2.种类
质粒
噬菌体
动植物病毒
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
3.载体需要具备的条件
一个至多个限制酶切割位点
能够在受体细胞中复制并表达
具有特殊的标记基因
对受体细胞无害
常用标记基因：四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因
用于筛选重组DNA分子
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
【知识拓展】标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。
导入质粒的受体细胞有抵抗抗生素的能力存活，未导入的受体细胞死亡
到社会中去
随着生物技术的飞速发展，生产和销售“分子工具”的公司大量涌现。感兴趣的话，你可以登录这些公司的网站，查询和了解相关产品的特点、价格和使用说明等。有些这样的公司已成功上市，你还可以通过分析公司的股票价格走势，大致了解公司的经营状况以及投资者目前对该行业的认可程度。
课堂小结
重组DNA技术的基本工具
载体
DNA连接酶
限制酶
种类
作用
来源
来源
切割结果
作用
需要具备的条件
来源
种类
随堂练习
1.基因工程中需要用到多种工具，下列叙述错误的是( )
A.使用不同的限制酶切割DNA分子可以避免质粒和目的基因自身环化
B.DNA连接酶可以恢复被限制酶切开的DNA分子的氢键
C.DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端有黏性末端和平末端等
D.载体除了质粒，还有噬菌体、动植物病毒等
解析：不同限制酶切割可避免质粒和目的基因自身环化，A正确；DNA连接酶恢复磷酸二酯键，不是氢键，B错误；限制酶切割末端有黏性末端和平末端，C正确；载体包括质粒、噬菌体、动植物病毒等，D正确。
B
随堂练习
2.BamH Ⅰ和Bcl Ⅰ是两种限制性内切核酸酶，其识别序列及切割位点如下表所示。下列相关叙述错误的是( )
A.限制性内切核酸酶主要是从
原核生物中分离得到
B.限制性内切核酸酶能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列
C.分别被BamH Ⅰ和Bcl Ⅰ切割后产生的DNA片段能互补配对
D.若某链状DNA分子有两个Bcl Ⅰ识别位点，则被其切割后会产生2个DNA片段
解析：限制性内切核酸酶主要是从原核生物中分离得到，A正确；限制性内切核酸酶能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，B正确；据表分析可知，两种酶切割后产生的黏性末端相同，故分别被BamH Ⅰ和Bcl Ⅰ切割后产生的DNA片段能互补配对，C正确；若某链状DNA分子有两个Bcl Ⅰ识别位点，则被其切割后会产生3个DNA片段，D错误。
D
限制酶 BamH I Bcl I
识别序列及切割位点 —G↓ATCC— —CTAG↑G— —T↓GATCA—
—ACTAG↑T—
随堂练习
3.作为基因工程的运输工具—载体，必须具备的条件及理由对应不正确的是( )
A.对宿主细胞无伤害，不影响宿主细胞的正常生命活动
B.具有多个限制酶切割位点，以便于目的基因的插入
C.具有某些标记基因，以便目的基因能够准确定位与其结合
D.能够在宿主细胞中稳定保存并大量复制，以便提供大量的目的基因
解析：A、携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，停留在细胞中进行自我复制，或整合到染色体DNA上，随着染色体DNA进行同步复制，同时运载体对宿主细胞无伤害，以使目的基因在宿主细胞中复制并稳定保存，A正确；B、作为运载体必须具备的条件之一是具有多个限制酶切点，以便于目的基因的插入，B正确；C、作为运载体必须具备的条件之一是具有某些标记基因，以便于重组后进行重组DNA分子的筛选，C错误；D、作为运载体必须具备的条件之一是能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因，D正确。
C
感谢各位的聆听
人教版（2019）选择性必修三(共27张PPT)
人教版（2019）选择性必修三
DNA的粗提取与鉴定
第3章 基因工程
1.了解 DNA 的物理和化学性质，理解DNA 粗提取和鉴定的原理
2.学会 DNA 粗提取的方法以及用二苯胺试剂对DNA 进行鉴定
学习目标
知识回顾
1.DNA分子存在于细胞中的哪些结构呢？
（1）真核细胞：细胞核（染色体）、线粒体、叶绿体
（2）原核细胞：拟核、质粒
2.细胞中除了DNA，还有哪些生物大分子？
RNA、蛋白质、脂质、糖类等
【思考】如何去除其他成分，提取DNA？
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质上的差异，提取DNA，去除其他成分
知识回顾
细胞中DNA的分布
真核细胞（洋葱）中DNA主要分布在细胞核和线粒体中（被甲基绿染为绿色）
原核细胞无细胞核
DNA集中区被称为拟核
拟核：DNA存在区域
目录
01
实验原理
02
材料用具
03
实验步骤
04
实验结果
实验原理
1.提取原理
利用DNA、RNA、蛋白质和脂质在物理和化学性质方面的差异用适当的物理或化学方法进行提取
（1）DNA不溶于酒精（但某些蛋白质溶于酒精）
（2）DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同（能溶于2mol/L NaCl溶液）
2.检验原理
一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色
材料用具
1.取材原则
原则上含有DNA的生物材料都可以采用，但是优先考虑以下几个方面
（1）材料是否容易获取
（2）DNA含量的多少（真核生物比原核生物细胞内DNA含量高、生殖细胞内DNA含量低）
（3）是否容易提取（植物细胞有细胞壁不易破碎）
材料用具
【思考】下列哪些材料不能用来进行DNA的粗提取与鉴定 为什么
①猪血 ②猪肝 ③鸡血 ④洋葱 ⑤大肠杆菌
猪血不可以，因为猪是哺乳动物，哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核、细胞器如线粒体等，因此DNA含量很低不适合用来提取DNA。
【注意】
（1）要选用新鲜的、DNA含量较高的材料
（2）不能选用哺乳动物的血作为材料
材料用具
2.试剂
研磨液——溶解并提取DNA分子
体积分数为95%的酒精——析出DNA
2mol/L的NaCl溶液——溶解DNA
二苯胺试剂——检验DNA，注意现配现用
蒸馏水
水浴加热
材料用具
1.
实验步骤
1.取材、研磨
称取30g洋葱放入研钵中，加入10ml研磨液，充分研磨
研磨的目的：破碎细胞，使DNA分子充分溶解到研磨液中
研钵
研钵
实验步骤
2.过滤（离心）
过滤（纱布）得研磨液后，在4℃冰箱中放置几分钟取上清液（或1500r/min离心5min）
（1）低温：抑制DNA分子运动，使DNA分子易析出
（2）纱布：不可用滤纸代替，DNA会被滤纸吸附，降低DNA含量
离心机
实验步骤
3.冷却析出DNA
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置23 min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA
酒精溶液（体积分数为95%）：蛋白质溶于酒精，DNA不溶于酒精析出
实验步骤
3.冷却析出DNA
用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分【或者将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干】
搅拌：缓慢搅拌，不能用力过猛，防止DNA分子断裂
实验步骤
【注意】
（1）搅拌时应轻缓、并沿一个方向
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子
（2）酒精预冷的作用
低温可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解
低温抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出
低温有利于增加DNA的柔韧性，减少断裂
实验步骤
4.DNA鉴定
取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化
实验结果
对照组颜色无变化
（不加入丝状物）
实验组颜色变蓝
（加入丝状物）
结果分析与评价
1.本实验中有三次过滤
（1）第一次过滤获得DNA的滤液
（2）第二次过获得DNA粘稠物
（3）第三次过滤获得DNA的滤液
2.本实验两次析出DNA
（1）第一次：用0.14 mol/L的NaCI溶液析出DNA
除去溶液中的杂质
（2）第二次：用冷却的95％的酒精
获得含杂质较少的DNA丝状物
获得含DNA的滤液
获取DNA粘稠物
得到含DNA的滤液
结果分析与评价
1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？
可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质
结果分析与评价
3.本实验的检测结果蓝色较浅的原因可能是什么？
（1）材料中的核物质没有充分释放出来，如研磨不充分
（2）加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏
（3）二苯胺最好现用现配，二苯胺易被空气氧化，影响鉴定效果
4.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。
本实验可以采取分组的方式进行。可以选取不同的实验材料；也可以查阅资料了解其他提取DNA的方法，对同种材料采用不同的方法。最后从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺试剂显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。
进一步探究
进一步纯化DNA
方法一：
含DNA的滤液→60~75℃恒温保温10~15分钟→过滤获得DNA滤液
（1）原理：DNA和蛋白质对高温的耐受程度不同
（2）蛋白质：在60℃以上开始变性形成沉淀
（3）DNA：80~100℃ DNA双螺旋结构开始解体，双链打开，即DNA的变性
进一步探究
进一步纯化DNA
方法二：
含DNA的滤液 + 嫩肉粉（木瓜蛋白酶）→静置10~15分钟→DNA滤液
原理：利用蛋白酶分解滤液中的杂质蛋白质，使提取出来的DNA和蛋白质分离
蛋白质具有专一性，利用蛋白酶分解滤液中的杂质蛋白
课堂小结
DNA的粗提取与鉴定
实验原理
实验步骤
实验结果
DNA鉴定
DNA析出
去除杂质，粗提取DNA
含有DNA的试管溶液变蓝
取材（新鲜洋葱）、研磨
DNA、蛋白质等在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同
随堂练习
1.下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是( )
A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低
B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA
C.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物
D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质
解析：A、研磨液有利于DNA的溶解，换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低，A正确；B、DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可分离DNA，B正确；C、DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变，因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取，C正确；D、在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA，D错误。
D
随堂练习
2.以洋葱为材料进行DNA的粗提取与鉴定实验，相关叙述错误的是( )
A.可将洋葱换成哺乳动物的红细胞进行该实验
B.向含DNA的滤液中加入2mol/L的NaCl溶液，有利于去除杂质
C.向含DNA的滤液中加入预冷的体积分数为95%的酒精溶液，有利于获得较纯净的DNA
D.用二苯胺试剂鉴定DNA时进行沸水浴，有利于显色反应的发生
解析：哺乳动物的成熟红细胞中没有细胞核和线粒体等，不宜作为DNA的粗提取与鉴定实验的材料，A错误；在2mol/L的NaCl溶液中，DNA的溶解度较大，进而可去除部分不溶或难溶杂质，B正确；DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，向含DNA的滤液中加入预冷的体积分数为95%的酒精溶液，有利于获得较纯净的DNA，C正确；DNA与二苯胺试剂在沸水浴条件下反应呈蓝色，D正确。
A
随堂练习
3.如图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图，下列相关叙述不正确的是( )
A.图1中的溶液a和图2中的溶液b的成分不同，
溶液b是2 mol·L-1的NaCl溶液
B.图1所示操作的原理是DNA能溶于酒精，而蛋白质等杂质不溶于酒精
C.图2所示实验的结果是试管1不变蓝，试管2变蓝色
D.图2所示实验中设置试管1的目的是作为对照实验
解析：图1中的溶液a和图2中的溶液b的成分不同，溶液b是2 mol·L-1的NaCl溶液，A正确；图1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精，而某些蛋白质等杂质能溶于酒精，B错误；图2所示实验的结果是试管1不变蓝、试管2变蓝，C正确；图2所示实验中设置试管1的目的是作为对照实验，D正确。
B
感谢各位的聆听
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