资源简介

3. 2 基因工程的
基本操作程序
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗?培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤?
转基因抗虫棉(使棉铃虫死亡，左)与非转基因抗虫棉(右)
第一步：目的基因的筛选与获取
第二步：基因表达载体的构建
第三步：将目的基因导入受体细胞
第四步：目的基因的检测与鉴定
培育转基因抗虫棉主要需要四个步骤：
问题探讨——培育抗虫棉的简要过程 P76
基因工程的基本操作程序
第一步：目的基因的筛选与获取
第二步：基因表达载体的构建
第三步：将目的基因导入受体细胞
第四步：目的基因的检测与鉴定
基因工程的基本操作程序
问题探讨——培育抗虫棉的简要过程 P76
一、第一步：目的基因的筛选与获取 P76
目的基因
①定义
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状的或获得预期表达产物的基因。
目的基因
受体细胞
目的基因主要是指编码蛋白质的基因
抗逆性基因
生产药物基因
毒物降解基因
工业用酶基因
一、第一步：目的基因的筛选与获取 P76
知识回顾
必修二：请从DNA水平上给基因下一个定义，要求既能反映基因与DNA的关系，又能体现基因的作用。
基因通常是有遗传效应的DNA片段
但一段DNA片段不一定是基因
--A TGCATGC ATCGATGCTAGCGATCGC TAAGCAC AG---
--T ACGTACG TAGCTACGATCGCTAGCG ATTCGTG TC---
基因1
基因2
非基因片段
编码区（转录区）
非编码区
非编码区
真核生物基因的结构
启动子
终止子
外显子
内含子
转录后翻译，编码蛋白质的合成
转录后被切除，不翻译
非编码区
编码区
原核生物基因的结构
编码区（转录区）
非编码区
非编码区
启动子
终止子
——编码区是连续的，不含内含子
编码区是间隔的、不连续的
外显子：
内含子：
启动子
终止子
编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？
一、第一步：目的基因的筛选与获取
编码区（转录区）
非编码区
非编码区
启动子
终止子
转录起点
转录终点
转录
前体RNA
mRNA
转录后
加工
翻译
氨基酸序列
非编码序列：不能编码蛋白质的片段，包括 。
编码序列 ：能编码蛋白质的片段，即外显子
外显子
内含子
转录
翻译
基因
蛋白质
mRNA
非编码区和内含子
真核生物基因的表达：
RNA聚合酶
结合部位
一、第一步：目的基因的筛选与获取
基因的结构
非编码区
（不转录）
编码区
（转录）
启动子：在基因的上游
终止子：在基因的下游
调控转录过程
外显子：转录后翻译，编码蛋白质的合成
内含子：转录后被切除，不翻译
原核生物：无内含子，其编码区是连续的
真核生物：有内含子，其编码区是间断的、不连续的。
非编码序列：不能编码蛋白质的片段，包括 非编码区和内含子
编码序列 ：能编码蛋白质的片段，即外显子
①
②
转录起点
转录终点
原核生物
真核生物
编码区（转录区）
非编码区
非编码区
启动子
终止子
外显子
内含子
编码区（转录区）
非编码区
非编码区
启动子
终止子
一、第一步：目的基因的筛选与获取
一、第一步：目的基因的筛选与获取 P76
筛选Bt基因作为转基因抗虫棉的目的基因的原因
苏云金芽孢杆菌
产生
Bt基因
伴胞晶体蛋白
(Bt抗虫蛋白)
表达
破坏鳞翅目昆虫的消化系统
杀死棉铃虫
棉花细胞
导入
培育
②目的基因 —— Bt基因
1.目的基因
一、第一步：目的基因的筛选与获取 P77
2.筛选合适的目的基因
基因海洋
目的基因
如何筛选
相关的已经结构
和功能清晰的基因
筛选
①筛选方法之一
②Bt基因的筛选
苏云金杆菌
制成
杀虫剂
掌握目的基因的功能
掌握目的基因的结构
防治棉花害虫
发现杀虫作用与Bt基因有关
掌握Bt基因的序列
深入了解Bt基因的表达产物(Bt抗虫蛋白)
Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。
一、第一步：目的基因的筛选与获取 P77
2.筛选合适的目的基因
③筛选目的基因的技术手段
测序技术
序列数据库(如GenBank)
序列比对工具(如BLAST)
测定核酸和蛋白质序列
以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库
把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能。
一、第一步：目的基因的筛选与获取 P77
2.筛选合适的目的基因
一、第一步：目的基因的筛选与获取 P77
目的基因获取方法
人工合成目的基因
构建基因文库来获取目的基因
利用PCR获取和扩增目的基因
DNA合成仪
如何获得目的基因？
一、第一步：目的基因的筛选与获取 P77
(1)PCR的概念：PCR是________________的缩写，它是一项根据__________________的原理，在体外提供______________的各种组分与反应条件，对_____________________进行大量复制的技术。
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
参与DNA复制
目的基因的核苷酸序列
①全称：
②原理：
③操作环境：
④目的：
⑤优点：
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
体外（PCR扩增仪/PCR仪）
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制
可以在短时间内大量扩增目的基因
聚合酶链式反应（PCR）
一、第一步：目的基因的筛选与获取 P77
DNA复制所需的基本条件
{5940675A-B579-460E-94D1-54222C63F5DA}参与的组分
在DNA复制中的作用
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3‘端开始连接脱氧核苷酸
聚合酶链式反应（PCR）
一、第一步：目的基因的筛选与获取 P77
PCR所需的基本条件
{5940675A-B579-460E-94D1-54222C63F5DA}参与的组分
在DNA复制中的作用
目的基因DNA
4种脱氧核苷酸
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶)
引物
缓冲液
Mg2+
高温
使DNA聚合酶能够从引物的3‘端开始连接脱氧核苷酸
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
催化合成DNA子链
维持反应体系的pH
激活DNA聚合酶的活性
聚合酶链式反应（PCR）
一、第一步：目的基因的筛选与获取 P77
引物
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。在细胞中为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的单链DNA。
引物为DNA聚合酶提供了游离的3‘端，使DNA聚合酶从3‘端延伸子链。(DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能)
a.什么是引物
b.引物的作用
聚合酶链式反应（PCR）
一、第一步：目的基因的筛选与获取 P78-79
引物
引物为DNA聚合酶提供了游离的3‘端，使DNA聚合酶从3‘端延伸子链。(DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能)
b.引物的作用
5‘-
-3‘
5‘-
-3‘
-5‘
3‘-
引物
引物
子链延伸
子链延伸
引物是决定PCR特异性的关键。
3‘-
-5‘
一、第一步：目的基因的筛选与获取 P78-79
95℃
⑤PCR的过程
5‘-
-3‘
3‘-
-5‘
3‘-
-5‘
5‘-
-3‘
第1步：变性
当温度超过90℃时，双链DNA解旋为单链。
DNA模板
4种脱氧核苷酸
引物
耐高温的DNA聚合酶
一、第一步：目的基因的筛选与获取 P78-79
⑤PCR的过程
3‘-
-5‘
5‘-
-3‘
第2步：复性
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
50℃
3‘-
-5‘
5‘-
5‘-
-3‘
-5‘
一、第一步：目的基因的筛选与获取 P78-79
⑤PCR的过程
第3步：延伸
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
72℃
3‘-
-5‘
5‘-
-3‘
5‘-
-3‘
-5‘
3‘-
3‘-
-5‘
5‘-
5‘-
-3‘
-5‘
一、第一步：目的基因的筛选与获取 P78-79
⑤PCR的过程
第一轮循环的产物作为第二轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环产物。
3‘-
-5‘
5‘-
-3‘
5‘-
-3‘
-5‘
3‘-
5‘-
-3‘
-5‘
3‘-
-3‘
-5‘
3‘-
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3‘-
-5‘
5‘-
-3‘
5‘-
-3‘
-5‘
3‘-
一、第一步：目的基因的筛选与获取 P78-79
5‘-
-3‘
-5‘
3‘-
-3‘
-5‘
3‘-
5‘-
-3‘
-5‘
3‘-
5‘-
-3‘
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3‘-
5‘-
3‘-
-5‘
5‘-
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5‘-
-3‘
-5‘
3‘-
5‘-
-3‘
-5‘
3‘-
5‘-
-3‘
-5‘
3‘-
第二轮循环的产物作为第三轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环产物。
5‘-
-3‘
-5‘
3‘-
-3‘
-5‘
3‘-
5‘-
3‘-
-5‘
5‘-
-3‘
5‘-
-3‘
-5‘
3‘-
一、第一步：目的基因的筛选与获取 P78-79
PCR过程(三轮扩增)
Taq聚合酶
引物1
原料
模板DNA
目的基因
3＇
5＇
5＇
3＇
引物2
95
50
72
℃
一、第一步：目的基因的筛选与获取 P78-79
PCR过程(三轮扩增)
95
50
72
℃
3＇
5＇
5＇
3＇
第一轮:高温变性
一、第一步：目的基因的筛选与获取 P78-79
PCR过程(三轮扩增)
3＇
5＇
5＇
3＇
95
50
72
℃
第一轮:低温复性
一、第一步：目的基因的筛选与获取 P78-79
PCR过程(三轮扩增)
3＇
5＇
5＇
3＇
95
50
72
℃
第一轮:中温延伸
一、第一步：目的基因的筛选与获取 P78-79
PCR过程(三轮扩增)
3＇
5＇
5＇
3＇
95
50
72
℃
第二轮:高温变性
一、第一步：目的基因的筛选与获取 P78-79
PCR过程(三轮扩增)
3＇
5＇
5＇
3＇
95
50
72
℃
第二轮:低温复性
一、第一步：目的基因的筛选与获取 P78-79
PCR过程(三轮扩增)
3＇
5＇
5＇
3＇
95
50
72
℃
第二轮:中温延伸
一、第一步：目的基因的筛选与获取 P78-79
PCR过程(三轮扩增)
3＇
5＇
5＇
3＇
95
50
72
℃
第三轮:高温变性
一、第一步：目的基因的筛选与获取 P78-79
PCR过程(三轮扩增)
3＇
5＇
5＇
3＇
95
50
72
℃
第三轮:低温复性
一、第一步：目的基因的筛选与获取 P78-79
PCR过程(三轮扩增)
3＇
5＇
5＇
3＇
95
50
72
℃
第三轮:中温延伸
一、第一步：目的基因的筛选与获取 P78-79
DNA解链为单链
高温(95℃)变性
低温(50℃)复性
中温(72℃)延伸
引物结合到互补DNA链
Taq酶从引物起始进行子链的合成
⑤PCR的过程
PCR过程可以在PCR扩增仪(PCR仪)中自动完成。
一、第一步：目的基因的筛选与获取 P78-79
思考1
复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？
复性时引物与DNA模板的结合是随机的，也存在解开的两条DNA单链的结合，但两条模板链重新结合的概率较低，原因是：①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。②加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之间的碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。
思考2
用PCR可以扩增mRNA吗？
不能！由于RNA不稳定，需要将RNA反转录为cDNA，然后再进行扩增。
单链RNA
逆转录酶
杂交双链
DNA链
RNA链
核酸酶H
单链DNA
DNA聚合酶
双链DNA
PCR扩增
一、第一步：目的基因的筛选与获取 P78-79
思考3
获取目的基因时至少要经过几次循环才能分离出目的基因？
第二轮产物
PCR扩增
三次才能得到目的基因
如何对产物进行检测鉴定？
一、第一步：目的基因的筛选与获取 P78-79
PCR小结
受热变性
引物
耐高温的
DNA聚合酶
(1)过程：
（2）结果：1个模板DNA分子经过n轮PCR，以_____方式扩增，可以扩增出 个DNA片段，共需要引物数量为 个。　　　　
指数
2n
2n＋1－2
一、第一步：目的基因的筛选与获取 P78-79
练一练
判断题
(1)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列( )
(2)PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶( )
(3)PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高。( )
(4)PCR除需要耐高温的DNA聚合酶、解旋酶、4种脱氧核苷酸和DNA模板之外，还需要引物等基本条件。( )
解析：PCR不需要解旋酶的参与。
(5)PCR的每一个循环都包括变性→复性→延伸三个步骤，延伸后的产物又可以作为下一个循环的模板。( )
√
×
√
×
√
练一练
1.下图表示形成cDNA并进行PCR扩增的过程。据图分析，下列叙述正确的是(　　)
D
A.①过程所需的原料是核糖核苷酸
B.②过程所需的酶必须耐高温
C.③过程需要解旋酶破坏氢键
D.④过程的引物对之间不能互补配对
比较项目
PCR
细胞核内DNA复制
场所
细胞外(主要在PCR扩增仪内)
主要在细胞核内
方式
半保留全连续局部区域复制
半保留半不连续全链复制
起始位点
引物3'端
复制起始位点
酶
仅一种DNA聚合酶（Taq酶）
解旋酶、DNA聚合酶等
反应条件
温度变幅大
温和
解旋
DNA在高温下变性解旋
解旋酶解旋
引物
DNA片段，保留在复制的子链中
RNA片段，不保留在复制的子链中
产物
扩增特定的DNA片段或基因
合成整个DNA分子
循环次数
PCR一般要经历30多次循环
与细胞分裂同步
联系
①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板
②原料:均为四种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）
③酶:均需DNA聚合酶
④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成
PCR技术与细胞内DNA复制的比较
一、第一步：目的基因的筛选与获取 P78-79
思考4
如何对产物进行检测鉴定？
琼脂糖凝胶电泳
不同大小的DNA片段混合物
电源
加样孔
mark
凝胶
小分子或带更多负电荷的分子比大分子或带更少电荷的分子移动得更远。
凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300纳米的紫外灯下被检测出来。
DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。
二、第二步：基因表达载体的构建 P80
思考5
获得目的基因之后直接转入受体吗？
不是
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因。
解决办法？
思考6
目的基因
质粒
细菌染色体
植物染色体
细胞核
表达载体
二、第二步：基因表达载体的构建 P80
① ;
② 。
使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代
使目的基因能够表达和发挥作用
2.基因表达载体的组成
当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。
（1）启动子：
一段有特殊序列结构的____片段。
DNA
①本质：
②位置：
位于基因的____，紧挨______________。
上游
转录的起始位点
③功能：
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
诱导型启动子：
（启动子≠起始密码）
启动子
终止子
标记基因
复制原点
限制酶切割位点
1.构建原因
二、第二步：基因表达载体的构建 P80
（2）终止子：
①本质：
一段有特殊序列结构的____片段。
DNA
②位置：
位于基因的_____。
下游
③功能：
使转录在所需要的地方停下来。
（3）标记基因：
①作用：
便于重组DNA分子的筛选。
（4）目的基因：
②常见类型：
抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。
如Bt基因,能控制表达所需要的特殊性状。
（5）复制原点：
DNA复制的起始位点。
注意：目的基因必须插入到 与 之间。
启动子 终止子
（终止子≠终止密码）
{5C22544A-7EE6-4342-B048-85BDC9FD1C3A}
化学本质
作用
启动子、终止子
起始密码子、终止密码子
启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子
①启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端。
它是RNA聚合酶识别、结合的部位，驱动转录。
②终止子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。
作用是使转录过程停止。
③起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。
DNA片段
起始、终止转录
mRNA上的三个碱基
起始、终止翻译
掌握：启动子、终止子 vs 起始密码子、终止密码子
二、第二步：基因表达载体的构建 P80
二、第二步：基因表达载体的构建 P80
基因表达载体构建模式图
载体
（质粒）
DNA分子
（含目的基因）
限制酶处理
带有黏性末端或平末端的切口
带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段
DNA连接酶
重组DNA分子
（重组质粒）
同一种
练一练
2.如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列说法错误的是(　　)
B
A.卡那霉素抗性基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
B.表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠ
C.图示过程是基因工程的核心步骤
D.除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构
三、第三步：将目的基因导入受体细胞 P80-81
1.转化
指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。
2.转化的受体细胞
将目的基因导入植物细胞；
将目的基因导入动物细胞；
将目的基因导入微生物细胞。
1.花粉管通道法
我国科学家独创
2.农杆菌转化法-双子叶和裸子植物
①用___________将___________________直接注入____中；
微量注射器
含目的基因的DNA溶液
子房
②在植物受粉后的一定时间内，剪去____，将________滴加在________上，使目的基因借助___________进入_____；
柱头
DNA溶液
花柱切面
花粉管通道
胚囊
受体细胞：
受精卵
子房
花粉
柱头
花粉管
精子
卵细胞
胚囊
三、第三步：将目的基因导入受体细胞 P80-81
——植物细胞
1.花粉管通道法
③花粉管通道法的过程：
——植物细胞
三、第三步：将目的基因导入受体细胞 P80-81
2.农杆菌转化法-双子叶和裸子植物
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程
①转化：
②农杆菌特点：
a.能在自然条件下侵染___________和_________，而对大多数___________没有侵染能力；
双子叶植物
裸子植物
单子叶植物
b.农杆菌细胞内含有______，当它侵染植物细胞后，能将______上的______（___________）转移到被侵染的细胞，并且将其_________________________；
Ti质粒
Ti质粒
T-DNA
可转移的DNA
整合到该细胞的染色体DNA上
将目的基因插入_____________中，通过农杆菌的_____作用，就可以使目的基因_____________。
③利用农杆菌进行转化的思路：
Ti质粒的T-DNA
转化
进入植物细胞
——植物细胞
三、第三步：将目的基因导入受体细胞 P80-81
④农杆菌转化法的过程：
2.农杆菌转化法-双子叶和裸子植物
构建表 达载体
含目的基因的重组Ti质粒
表现出新性状的植株
导入植物
细胞
植物细胞
将目的基因插入染色体DNA中
目的基因
Ti质粒
T-DNA
含重组Ti质粒的农杆菌
转入农杆菌
农杆菌转化法示意图
Ti质粒
目的基因
构建
基因表达载体
转入
农杆菌
导入
植物细胞
T-DNA携带目的基因插入植物细胞染色体DNA中
表达
新性状
——植物细胞
三、第三步：将目的基因导入受体细胞 P80-81
⑤转化的具体方法：
a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片_______________，然后_____________，并__________；
受体细胞为_______
与农杆菌共培养
筛选转化细胞
再生成植株
体细胞
b.可以将____直接浸没在________________中一段时间，然后培养植株并获得____，再进行_____、_____等；
受体细胞为_______
花序
含有农杆菌的溶液
种子
筛选
鉴定
受精卵
2.农杆菌转化法-双子叶和裸子植物
——植物细胞
三、第三步：将目的基因导入受体细胞 P80-81
——动物细胞
显微注射法
1.受体细胞：
受精卵。
(因为受精卵容易表现出全能性)
2.过程：
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
三、第三步：将目的基因导入受体细胞 P82
——微生物细胞
Ca2+处理法
1.受体细胞：
微生物（常用大肠杆菌）
微生物作为受体细胞的优点：
繁殖快，单细胞，遗传物质相对较少，易于培养操作
2.使用Ca2+处理：
可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
过程
Ca2+处理细胞
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA分子
大肠杆菌细胞
三、第三步：将目的基因导入受体细胞 P82
实例：利用转基因大肠杆菌生产药物
原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。
——微生物细胞
三、第三步：将目的基因导入受体细胞 P82
细胞种类
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常用方法
农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法
显微注射法
Ca2+处理法（感受态细胞法）
受体细胞
体细胞
受精卵
原核细胞
转化过程
以农杆菌转化法为例：将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA上→表达
将含有目的基因的表达载体提纯→取受精卵→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
三、第三步：将目的基因导入受体细胞 P80-81
练一练
3.判断题
(1)花粉管通道法是我国科学家独创的一种方法，主要适用于双子叶植物和裸子植物。( )
解析：农杆菌转化法主要适用于双子叶植物和裸子植物。
(2)农杆菌侵入植物细胞后，其Ti质粒上的T－DNA能转移到被侵染的细胞，并且整合到该细胞的染色体DNA上。( )
(3)培育转基因动物时，常选择受精卵作为受体细胞，利用显微注射法将目的基因直接注入受精卵中。( )
(4)将目的基因导入原核细胞时，通常用大肠杆菌作为受体细胞，并需要用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态。( )
×
√
√
√
四、第四步：目的基因的检测与鉴定 P82
在棉花细胞中，重组表达载体是否导入成功？是否可以稳定维持并表达出Bt蛋白？表达出的Bt蛋白是否具有杀虫的功效？
1.分子检测
2.个体水平鉴定
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
②检测目的基因是否转录出了mRNA
①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因
分子水平
观察是否出现杂交带
检测目的基因
DNA分子杂交
检测mRNA
检测表达的蛋白质
分子杂交
抗原—抗体杂交
四、第四步：目的基因的检测与鉴定 P82
个体水平
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等个体水平鉴定
{5940675A-B579-460E-94D1-54222C63F5DA}转基因生物
鉴定方法
成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）接种实验
未染病
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
四、第四步：目的基因的检测与鉴定 P82
四、第四步：目的基因的检测与鉴定 P82
练一练
4.判断题
(1)常使用PCR等技术，从分子水平上检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或Bt基因是否转录出mRNA。( )
(2)从分子水平上检测目的基因是否翻译出相关蛋白质的方法之一是利用抗原—抗体杂交技术。( )
(3)可以通过盐碱地栽培试验从细胞水平上检测转基因抗盐碱作物是否具有抗盐碱的特性以及抗盐碱的程度。( )
解析：作物抗盐碱栽培试验属于个体生物学水平。
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课堂小结
获取质粒、噬菌体等载体
筛选和获取目的基因
用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA连接酶连接，构建基因表达载体
将含有目的基因的表达载体导入受体细胞
检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性
探究实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 P84-85
一、实验原理
1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理
①PCR利用了DNA的______原理，通过_________来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够_____________的仪器，一次PCR一般要经历___次循环；
热变性
调节温度
自动调控温度
30
②PCR扩增DNA片段还利用了______________的原理；
DNA半保留复制
2.DNA片段电泳鉴定的原理
①DNA分子具有_____________，在一定的___下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在_____的作用下，这些________会向着________________的电极移动，这个过程就是_____；
可解离的基团
pH
电场
带电分子
电泳
与它所带电荷相反
②PCR的产物一般通过_______________来鉴定；
③在凝胶中DNA分子的迁移速率与___________、______________和_____等有关
④凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为______的______下被检测出来。
琼脂糖凝胶电泳
凝胶的浓度
染色
300nm
紫外灯
DNA分子的大小
构象
探究实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 P84-85
三、方法步骤
(一）DNA片段的扩增：
移液
反应
离心
（二）DNA片段的电泳鉴定：
配制琼脂糖溶液
制备凝胶
加样
电泳
观察记录
四、注意
探究实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 P84-85
探究实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 P84-85
探究实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 P84-85

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