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微专题1　发酵工程
一、选择题
1.（2024·江苏南京二模）利用发酵工程生产蓝莓酒需经过“清洗破碎→酶解→过滤→调整成分→接种→主发酵→倒灌过滤→后发酵→消毒→终止”等主要环节。下列叙述正确的是（　　）
A.酶解环节需要添加胰蛋白酶和纤维素酶并控制酶解温度
B.在蓝莓酒发酵旺盛时，醋酸菌能将果汁中的糖发酵为乙酸
C.若发酵装置中初始糖浓度过高，所制得的蓝莓酒酒精浓度反而偏低
D.后发酵时需搅拌处理，以便菌种充分接触营养物质并增加溶解氧的含量
2.泡菜古称葅，是指为利于长时间存放而经发酵的蔬菜。下列关于腌制泡菜的叙述，正确的是（　　）
A.泡菜发酵期间，乳酸积累到质量分数为0.4％～0.8％时，泡菜的口味、品质最佳
B.不同腌制时间，泡菜中亚硝酸盐含量均不相同
C.泡菜发酵过程中表面出现白膜，可能是醋酸菌液面大量发酵引起的
D.膳食中的亚硝酸盐会危害人体健康
3.（2024·山东泰安模拟）在制作发酵食品的学生实践中，控制发酵条件至关重要。下列相关叙述正确的是（　　）
A.泡菜发酵后期，尽管乳酸菌占优势，但仍有产气菌繁殖，需开盖放气
B.葡萄果皮上有酵母菌和醋酸菌，制作好葡萄酒后，可直接通入无菌空气制作葡萄醋
C.制作果酒的葡萄汁不宜超过发酵瓶体积的2/3，制作泡菜的盐水无须淹没全部菜料
D.果酒发酵时温度宜控制在18～30 ℃，果醋发酵时温度宜控制在30～35 ℃
4.（2024·山东菏泽二模）啤酒是以大麦芽为主要原料制成的。下列说法错误的是（　　）
A.酒精的产生积累主要在后发酵阶段完成
B.发酵过程中有机物分解会引起发酵罐温度升高
C.要随时检测发酵液中的微生物数量、产物浓度等，以了解发酵进程
D.用赤霉素处理大麦，可以使大麦种子无须发芽就可以产生α-淀粉酶
5.（2024·福建泉州模拟）同学甲利用含抗生素的滤纸片进行“探究抗生素对细菌的选择作用”实验（实验1），同学乙利用尿素作为氮源进行“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验（实验2）。下列相关叙述正确的是（　　）
A.实验1所用的培养基为选择培养基
B.实验1用接种环将菌液接种到固体培养基表面
C.实验2取土样前要对铁铲和取样纸袋灭菌处理
D.实验2得到的菌落形状、大小和颜色等特征均相同
6.（2024·黑龙江模拟）下列有关微生物的培养或纯化的叙述，正确的是（　　）
A.倒平板时，需完全打开培养皿盖，以防培养基溅到皿盖，造成污染
B.采用稀释涂布平板法接种后，不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单菌落
C.在含有刚果红的培养基上，纤维素分解菌菌落周围会出现抑菌圈
D.用平板划线法分离菌种，划线4个区域，接种环需要灼烧灭菌5次
7.（2024·河南二模）亚硒酸钠对细菌的生长有明显的毒害作用，土壤中的富硒细菌可将其还原为红色单质硒，如图为土壤中富硒细菌的筛选和纯化过程，①～⑤为相应步骤。下列相关叙述错误的是（　　）
A.培养富硒细菌时，培养基应调至酸性并添加维生素
B.步骤②中可将10 mL菌液加入90 mL无菌水中得到稀释10倍的稀释液
C.步骤④中可以根据菌落周围是否出现红色区域对目的菌株进行筛选
D.随机取若干灭菌的空白平板培养一段时间可检测培养基灭菌是否合格
8.（2024·江苏徐州模拟）科研人员利用桤叶唐棣和蓝莓混合制作果醋，其主要流程为：桤叶唐棣、蓝莓→清洗破碎→酶解→过滤→混合→成分调整→灭菌→酒精发酵→酒液→乙酸发酵→过滤→陈酿→澄清→消毒→成品。下图分别表示初始糖度对酒精发酵的影响和醋酸菌接种量对总酸的影响，有关叙述正确的是（　　）
A.酶解过程加入纤维素酶和果胶酶有利于提高出汁率
B.酒精发酵和乙酸发酵过程的温度设置不同，其他发酵条件均相同
C.初始糖度越高，为酵母菌提供的营养越多，越有利于酒精发酵
D.随着醋酸菌接种量的增大，醋酸菌的产酸量增加
9.（2024·江苏南通模拟）下图是科研人员从某药厂污泥中筛选四环素降解菌的主要过程。相关叙述正确的是（　　）
A.选择药厂污泥筛选四环素降解菌，与其含较多四环素有关
B.培养基①、②、③均以四环素为唯一碳源，②中含琼脂
C.培养基③上的每一个菌落均是由一个微生物繁殖形成的细胞群
D.培养基①和培养基③上形成的菌落均为四环素降解菌
二、非选择题
10.（2024·安徽三模）酿酒酵母是酿酒工业发酵最主要的菌种。科研人员对某地酿酒酵母菌种进行了分离筛选，以期排选出酒精耐受性高的菌株，实验步骤如下。
①配制PDA培养基（成分：马铃薯、葡萄糖、氯霉素、X、水、pH 5.6），制作无菌平板；
②利用稀释涂布平板法将果园土壤样品接种到PDA培养基上，筛选出3株具有酿酒酵母典型菌落特征的菌种（记为Y1、Y2、Y3）；
③将3株菌种分别接种于含不同浓度酒精的基础培养基上，记录发酵启动时间和结束时间如表所示（“－”表示没有发酵）。
酒精体积 分数/％ 发酵启动时间/h 发酵结束时间
Y1 Y2 Y3 Y1 Y2 Y3
10 15 10 11 31 28 28
12 27 22 22 44 35 38
14 32 22 26 50 37 45
16 34 25 — 54 43 —
回答下列问题：
（1）PDA培养基中的成分X通常是　　　　，该培养基能抑制细菌生长的原理为　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
（2）如果筛选得到的菌株不是纯培养物，可另采用　　　　　　法进一步分离纯化。通过观察菌落的　　　　　　　　　　（答出两点即可）等特征，可初步判断是否为酿酒酵母菌种。
（3）在酒精耐受性实验中，为保证检测结果的准确性，除控制基础培养基、发酵条件均相同且适宜外，还需控制　　　　　　　　　　　　　　相同，据表分析，酒精耐受性最佳的菌株为　　　　，判断的依据为　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
一、选择题
1.（2024·河北保定二模）酱豆的制作要经过两次发酵。第一阶段以大豆为主要原料，利用毛霉和曲霉等的作用分解大豆蛋白。第二阶段以蔬菜与发酵过的大豆为主，进行乳酸发酵。下列叙述错误的是（　　）
A.毛霉产生的蛋白酶能催化分解大豆蛋白，产生易消化的小分子肽和氨基酸
B.第一阶段在无氧条件下发酵时适度保湿，有利于霉菌的菌丝生长
C.加入一定量的食盐、生姜、蒜瓣和其他香辛料能防腐杀菌、调制风味
D.第二阶段会产生乳酸和亚硝酸盐，乳酸积累会导致发酵体系的pH降低
2.（2024·贵州遵义三模）某企业发酵生产钾细菌菌肥，企业标准规定当发酵液中钾细菌的浓度达到2×108个/mL时，发酵结束，分装入库，经质量抽查合格之后，投放市场。下列叙述正确的是（　　）
A.施用钾细菌菌肥既有利于植株生长，又能改良土壤结构
B.产品达企业标准时，取0.2 mL菌液涂布可选择稀释倍数为105倍
C.施用肥料时，气温不会影响常规化肥和钾细菌菌肥施用的效果
D.发酵中用显微镜直接计数时，测得钾细菌数比实际活菌数偏小
3.（2024·安徽三模）大肠杆菌能在基本培养基上生长，X射线照射后产生的大肠杆菌不能在基本培养基上生长，但可以在完全培养基上生长。夹层培养法多用于营养缺陷型菌株的筛选，其具体操作是：先在培养皿底部倒一薄层已灭菌的基本培养基；待冷凝后，再添加一层内含菌液（经过X射线处理）的基本培养基；冷凝后再加一薄层的基本培养基。培养一段时间后，对首次出现的菌落做好标记；然后再加一层完全培养基，经培养后会长出形态不一的菌落（如图所示）。下列说法错误的是（　　）
A.X射线可能诱发基因突变导致大肠杆菌营养缺陷
B.夹层培养法不适用于对需氧型微生物进行筛选
C.首次出现的菌落做标记时，应在皿盖上做标记
D.最后培养基上形态较小的菌落可能是营养缺陷型菌株
4.（2024·河北石家庄模拟）研究人员采集某富营养化的表层水体，将其梯度稀释后涂布，挑取单一菌落进行划线，最终筛选出对水华鱼腥藻（蓝细菌的一种）具有溶藻作用的溶藻细菌SLW6。细菌的溶藻有直接作用（与藻细胞直接接触）和间接作用（分泌胞外物质溶藻）两种方式，可用叶绿素a的含量来衡量对藻的灭杀效果。为探究SLW6的溶藻方式，研究人员设计相关实验得到如图所示的实验结果，其中用培养基培养的原菌液经离心后获得含胞外分泌物的上清液和菌体沉淀。下列说法正确的是（　　）
A.完成平板划线后应立即将接种后的平板倒置并放入恒温培养箱中培养
B.溶藻菌SLW6可能是通过破坏鱼腥藻的类囊体薄膜来抑制其光合作用
C.空白组应将鱼腥藻与无菌水混合培养，以排除无关变量对实验的影响
D.据图分析，溶藻菌SLW6以直接溶藻为主，间接溶藻为辅
5.（2024·山东青岛三模）利用杨木生产燃料乙醇的基本流程主要包括原料粉碎、提高纤维素浓度的预处理、释放单糖的酶解糖化、产生乙醇的微生物发酵、乙醇脱水的蒸馏工艺等步骤（预处理过程所需的果胶酶常来自黑曲霉等微生物）。下图为发酵阶段菌种接种量对发酵结果的影响。下列说法正确的是（　　）
A.培养黑曲霉时一般需将培养基调至酸性，果胶酶是黑曲霉分泌的一种单细胞蛋白
B.在伊红—亚甲蓝培养基上可筛选出高产纤维素酶的菌株用于酶解糖化过程
C.接种的菌种为酵母菌，当接种量为12％左右时，发酵后的酒精含量与残糖含量相等
D.接种量超过15％时酒精产量反而有所降低的原因可能是菌种生长消耗大量的糖分
6.（2024·河北衡水模拟）在涂布有敏感宿主细菌的固体培养基表面接种噬菌体，一个噬菌体先侵染和裂解一个细菌，然后以此为中心，再侵染和裂解周围大量的细菌，最终在培养基上形成肉眼可见的透明圈，称为噬菌斑，如下图所示。不同种噬菌体形成的噬菌斑形状、大小、边缘和透明度不同。研究者在涂布有敏感宿主细菌的固体培养基上接种0.1 mL相应噬菌体的106倍稀释液进行相关实验。下列叙述错误的是（　　）
A.接种细菌后的平板培养一段时间后变为不透明状态，是由细菌大量繁殖造成的
B.噬菌体样品应有足够的稀释度，以保证初期一个细菌最多被一个噬菌体侵染
C.若平均每个平板的噬菌斑数量为150，则该样品的噬菌体密度为1.5×108个/mL
D.根据噬菌斑的形状、大小等特征可判断是否需要进一步纯化噬菌体
7.（2024·山东济南模拟）研究人员拟从新鲜蚯蚓粪中分离筛选出对番茄枯萎病有良好抑制效果的拮抗细菌。将蚯蚓粪加入无菌水中制成悬浮液，利用甲培养基进行筛选纯化后，将获得的不同菌株分别接种至乙培养基扩大培养，48 h后进行“平板对峙实验”：在丙培养基的空白平板一侧放置一直径为5 mm的番茄枯萎病菌的菌块，在平行另一侧放置相同大小的滤纸片，实验流程如下图。下列说法错误的是（　　）
A.Ⅰ过程使用的接种方法是平板划线法，Ⅰ～Ⅲ过程均需要无菌操作
B.对照组滤纸片用无菌水处理，实验组滤纸片用拮抗菌菌液处理
C.应培养至对照组病菌菌落长满丙培养基时开始测量并计算抑制率
D.选择丙培养基上直径大的病菌菌落对应的拮抗菌作为目的菌
二、非选择题
8.回答有关微生物培养的问题：
（1）厨房中的厨余垃圾多为湿垃圾，湿垃圾处理的有效方法之一是用微生物对其进行降解。如图表示筛选高效降解淀粉菌种的过程。
配制培养基后需进行灭菌处理，常用的灭菌方法是　　　　　　　　　　　。培养基中加入的碳源是　　　　　。据图，菌落①与菌落②周围产生了透明圈，产生透明圈的原因是　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
（2）某公司研发的一种培养大肠杆菌的培养基配方为蛋白胨10克、葡萄糖5克、蔗糖5克、KH2PO4 2克、显色剂（伊红—亚甲蓝）0.2克、琼脂12克，将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL。根据用途划分，该培养基属于　　　培养基，若要分离能分解尿素的细菌，需对培养基作出的两项调整是　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
（3）对同一浓度的脲酶生产菌稀释液，分别用血细胞计数板计数和稀释涂布平板法计数，若不存在实验错误操作，则前者的数量多于后者，其原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
4 / 5专题八　生物技术与工程
微专题1　发酵工程
A级基础强化练
1.C　在果浆中添加果胶酶和纤维素酶可以酶解细胞壁，促进细胞内容物的释放，酶的活性受到温度的影响，所以酶解环节需要控制酶解温度，A错误；在蓝莓酒发酵旺盛时，要接种醋酸菌，同时改变或者满足特定条件，才能将果汁中的糖发酵为乙酸，否则不能出现乙酸，B错误；若发酵装置中初始糖浓度过高，会造成酵母菌失水，活力下降甚至大量死亡，无氧呼吸减弱，所制得的蓝莓酒酒精浓度反而偏低，C正确；酒精发酵是在无氧条件下进行的，不能增加溶解氧的含量，D错误。
2.A　制作传统泡菜是利用植物体表面天然菌种来进行发酵的，发酵期间，乳酸会不断积累，当它的质量分数为0.4％～0.8％时，泡菜的口味、品质最佳，A正确；泡菜腌制过程中，随着时间增加，亚硝酸盐含量先增加后减少，因此不同腌制时间，泡菜中亚硝酸盐含量可能相同，B错误；在泡菜制作过程中，泡菜发酵液的营养丰富，其表面往往含有适量的氧气，适合酵母菌生长繁殖，成膜酵母生长繁殖，会在泡菜坛液面形成一层白膜，C错误；膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健康，D错误。
3.D　泡菜发酵过程中起作用的微生物是乳酸菌，乳酸菌是厌氧菌，泡菜发酵后期，发酵液中乳酸菌占优势，不需开盖放气，A错误；果酒制作过程中，起作用的是葡萄皮上的酵母菌，酿酒过程是无氧环境。醋酸菌是好氧菌，虽然葡萄果皮上也有醋酸菌，但在酿酒时的无氧环境下醋酸菌已经死亡，且醋酸菌比酵母菌所需的最适生长温度更高。因此，制作好葡萄酒后，除了要通入无菌空气外，还要适当升温，并加入适量醋酸菌，B错误；制作果酒的葡萄汁不宜超过发酵瓶体积的2/3，是为了发酵初期让酵母菌进行有氧呼吸大量繁殖，同时为了防止发酵过程中发酵液溢出。制作泡菜的盐水要淹没全部菜料，以提供无氧环境供乳酸菌进行无氧呼吸，C错误；果酒发酵时温度宜控制在18～30 ℃，果醋发酵时温度宜控制在30～35 ℃，D正确。
4.A　酒精的产生积累主要在前发酵阶段完成，A错误；发酵过程中有机物分解会释放热量使发酵罐温度升高，B正确；发酵过程中要随时检测发酵液中的微生物数量等，以了解发酵进程，C正确；用赤霉素处理大麦，可以使大麦种子无须发芽就可以产生α-淀粉酶，减少操作的过程，D正确。
5.C　实验1所用的培养基为完全培养基，A错误；实验1用涂布器将菌液接种到固体培养基表面，B错误；为了减少杂菌的污染，取土样用的铁铲和取样纸袋在使用前都要灭菌，C正确；土壤中有丰富的微生物，实验2得到的菌落形状、大小和颜色等特征不一定相同，D错误。
6.D　倒平板时不能将灭菌的培养皿盖完全打开，而是将培养皿盖打开一条缝，A错误； 采用稀释涂布平板法接种后，稀释到合适浓度的菌液才可在培养基表面形成单菌落，B错误；刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素分解菌产生的纤维素酶分解后，刚果红-纤维素复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，而不是抑菌圈，C错误； 用平板划线法分离菌种，划线4个区域，每次接种之前需要灼烧接种环灭菌，最后划线完成后也需要灼烧灭菌，共灼烧灭菌5次，D正确。
7.A　培养细菌时，培养基应该调至中性或弱碱性，且培养某些细菌时（如乳酸杆菌）才需要在培养基中添加维生素，A错误；步骤②中可将10 mL菌液加入90 mL无菌水中得到稀释10倍的稀释液，B正确；步骤④中，如果菌落周围出现红色区域，则说明含有富硒细菌，为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围红色区域的大小，从平板中挑取实验效果明显的目的菌株，接种于新的培养基平板，对菌株进行进一步的纯化，C正确；在接种前，为检测培养基平板灭菌是否合格，应该随机取若干灭菌后的空白平板先培养一段时间，观察是否有菌落产生，D正确。
8.A　酶解过程主要加入的是纤维素酶和果胶酶，水解植物细胞细胞壁，有利于细胞膜破裂提高出汁率，A正确。酒精发酵为无氧环境，温度通常为18～30 ℃；而乙酸发酵过程中需要通入氧气，温度控制在30～35 ℃，B错误。结合图示可知，在一定范围内，初始糖度越高，为酵母菌提供的营养越多，越有利于酒精发酵，但高于图中的18％时，酒精度反而有所下降，C错误。结合图示可知，醋酸接种量在12％～15％之间时，随着醋酸菌接种量的增大，醋酸菌的产酸量减少，D错误。
9.A　药厂污泥中含有较多四环素，其中可能具有相对较多的四环素降解菌，A正确；本实验目的为筛选四环素降解菌，因此培养过程中可使用以四环素为唯一碳源的选择培养基，即培养基①②③均以四环素为唯一碳源，培养基①和③要获得单菌落，需要添加琼脂制备固体培养基，培养基②需要进行扩大培养，不需要琼脂，为液体培养基，B错误；根据题图可知，培养基③的接种方法为稀释涂布平板法，当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，C错误；培养基①和培养基③为选择培养基，其上生长的微生物可能含有以四环素降解菌代谢产物为碳源的微生物，D错误。
10.（1）琼脂　氯霉素和酸性条件均能抑制细菌生长　
（2）平板划线　形状、大小、颜色　（3）初始接种的酵母菌数量　Y2　在不同浓度的酒精条件下，Y2均能发酵，且接种Y2的发酵启动时间和结束时间均早于其他菌株
解析：（1）由题干可知，利用稀释涂布平板法将果园土壤样品接种到PDA培养基上，因此PDA培养基是固体培养基，要加入琼脂。氯霉素是一种抗生素，可抑制细菌生长；细菌适于在中性或弱碱性的条件下生长，而PDA培养基呈酸性，也会抑制细菌生长。（2）分离纯化菌株的方法有稀释涂布平板法和平板划线法，题中已用稀释涂布平板法筛选出3株具有酿酒酵母典型菌落特征的菌种（记为Y1、Y2、Y3），因此如果筛选得到的菌株不是纯培养物，可另采用平板划线法进一步分离纯化。通过观察菌落的形状、大小、颜色、隆起程度等特征，可初步判断是否为酿酒酵母菌种。（3）在酒精耐受性实验中，为保证检测结果的准确性，要控制无关变量，除控制基础培养基、发酵条件均相同且适宜外，还需控制初始接种的酵母菌数量相同。据表分析，酒精耐受性最佳的菌株为Y2，因为在不同浓度的酒精条件下，Y2均能发酵，且接种Y2的发酵启动时间和结束时间均早于其他菌株。
B级综合提升练
1.B　毛霉产生的蛋白酶能催化分解大豆蛋白，将蛋白质分解为易消化的小分子肽和氨基酸，A正确；毛霉是一种丝状真菌，新陈代谢类型是异养需氧型，因此第一阶段在有氧条件下发酵，B错误；加入一定量的食盐、生姜、蒜瓣和其他香辛料不仅能防腐杀菌还能调制风味，C正确；第二阶段以蔬菜与发酵过的大豆为主，进行乳酸发酵，产生乳酸和亚硝酸盐，乳酸积累会导致发酵体系的pH降低，D正确。
2.A　微生物肥料利用了微生物在代谢过程中产生的有机酸、生物活性物质等来增进土壤肥力，改良土壤结构，促进植株生长。因此，施用钾细菌菌肥既有利于植株生长，又能改良土壤结构，A正确；当发酵液中钾细菌浓度达到2×108个/mL时，发酵结束，分装入库。产品出库时需采用稀释涂布平板法进行活菌计数，应选择长出30～300个菌落的培养基为宜，0.2 mL发酵液中有2×108个/mL×0.2 mL×10－6＝40个，在30～300个菌落之间，故稀释度应为106倍，B错误；温度会影响微生物菌体的活性，因此，施用肥料时，气温会影响钾细菌菌肥施用的效果，C错误；显微镜直接计数时计算的数据包括了死菌数，因此，发酵中用显微镜直接计数时，测得钾细菌数比实际活菌数偏大，D错误。
3.C　X射线可能诱发基因突变导致大肠杆菌营养缺陷，A正确；夹层培养法菌株生长在两层培养基之间，氧气较少，不适用于对需氧型微生物进行筛选，B正确；首次出现的菌落做标记时应标记在皿底，防止皿盖位置变化或拿错等，C错误；营养缺陷型菌株在基本培养基上不能生长，只有后期加入完全培养基后才能生长，形态较小，D正确。
4.D　完成平板划线后应待菌液吸收后，将接种后的平板放入恒温培养箱中培养，A错误；鱼腥藻是蓝细菌的一种，属于原核生物，没有类囊体薄膜，所以不能通过破坏鱼腥藻的类囊体薄膜来抑制其光合作用，B错误；空白组应用培养基加入无菌水与鱼腥藻混合培养，C错误；沉淀中含有溶藻细菌（直接作用），上清液中含有分泌胞外物质（间接作用），由图可以看出，沉淀组叶绿素含量最低，说明直接溶藻作用最强，D正确。
5.D　单细胞蛋白指微生物菌体，果胶酶不属于单细胞蛋白，A错误；伊红—亚甲蓝培养基是鉴定大肠杆菌的培养基，本实验应该用刚果红培养基筛选高产纤维素酶菌株，B错误；酒精发酵的菌种为酵母菌，当接种量为12％左右时，发酵后的酒精含量与残糖含量曲线有交点，但两者的纵坐标数值及单位均不同，故发酵后二者含量不同，C错误；由图可知，菌种接种量为15％时对应的酒精含量达到最大值，接种量超过15％，菌种数量大，自身的生长会大量消耗反应物，导致酒精产量降低，D正确。
6.C　接种细菌后细菌大量繁殖，造成平板一段时间后变为不透明状态，A正确；一个噬菌体先侵染和裂解一个细菌，然后以此为中心，再侵染和裂解周围大量的细菌，最终在培养基上形成肉眼可见的透明圈，称为噬菌斑，因此噬菌体样品应有足够的稀释度，以保证初期一个细菌最多被一个噬菌体吸附，B正确；若平均每个平板的噬菌斑数量为150，则该样品中噬菌体数量为：150÷0.1×106＝1.5×109个/mL，C错误；不同种噬菌体形成的噬菌斑形状、大小、边缘和透明度不同，因此可根据噬菌斑的形状、大小等特征判断是否需要进一步纯化噬菌体，D正确。
7.D　据图可知，甲培养基中是各种线的分布，故步骤Ⅰ使用的接种方法是平板划线法；微生物分离和培养的关键就是防止杂菌污染，故Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ都需要进行无菌操作，A正确；本实验的目的是探究拮抗细菌是否对番茄枯萎病有良好抑制，故实验组滤纸片用拮抗菌菌液处理，对照组滤纸片用无菌水处理，B正确；由于对照组没有用拮抗菌菌液处理，故培养至对照组枯萎病菌菌落长满时，通过对滴加拮抗菌液处理组进行统计后，开始测量并计算抑制率，C正确；应选择“平板对峙实验”培养后番茄枯萎病菌菌落直径小的细菌，因为番茄枯萎病菌菌落直径越小，说明抑制效果越好，D错误。
C级应用创新练
8.（1）湿热灭菌（或高压蒸汽灭菌法）　淀粉　淀粉遇碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，形成透明圈　
（2）鉴别　将蛋白胨换为尿素，伊红—亚甲蓝换成酚红　（3）前者产脲酶菌是分散的或活菌和死菌一起计数，后者存在两个或多个产脲酶菌形成一个菌落的情况或只计数活菌
解析：（1）培养基灭菌常用湿热灭菌（高压蒸汽灭菌法）。本实验目的是筛选高效降解淀粉的菌种，为了抑制不能分解淀粉的菌种的繁殖，培养基中需加入淀粉作为唯一碳源。淀粉遇碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，因此会形成透明圈，图中菌落①与菌落②周围产生了透明圈，说明菌落①与菌落②能产生淀粉酶。（2）该培养基中含有显色剂（伊红—亚甲蓝），可用于鉴别大肠杆菌，应该属于鉴别培养基。若要分离能分解尿素的细菌，应该以尿素为唯一氮源，因此需要将蛋白胨换成尿素；鉴别分解尿素的细菌，需要使用酚红指示剂，所以应该将伊红—亚甲蓝换成酚红。（3）对同一浓度的脲酶生产菌稀释液，分别用血细胞计数板计数和稀释涂布平板法计数，若不存在实验错误操作，血细胞计数板计数是将产脲酶菌的活菌和死菌一起计数，稀释涂布平板法存在两个或多个产脲酶菌形成的一个菌落只计数一个活菌的情况，因此前者的数量多于后者。
微专题2　细胞工程和基因工程
A级基础强化练
1.B　琼脂是凝固剂，不提供营养，A错误；间歇摆动提高培养液溶氧量，有利于组培苗进行有氧呼吸，有氧呼吸能为组培苗的生长发育提供能量，因此可以提高生长速度，B正确；外植体脱分化可以形成愈伤组织，愈伤组织再分化形成胚状体，C错误；植物组织培养是在无菌条件下进行的，经过间歇浸没培养获得的植株不需要消毒处理，D错误。
2.B　植物体细胞杂交就是将同种或不同种的细胞经过一定的诱导方法诱导融合形成一个细胞，再将细胞培育成植株的过程，A错误；融合后的杂种细胞需要经过植物组织培养过程培育成杂种植株，其中脱分化诱导形成愈伤组织的过程中不需要光照，后期再分化过程中需要光照，B正确；需要在不同的培养基上诱导生芽和生根，C错误；融合形成的杂种植株是异源四倍体，D错误。
3.C　根据题意可知，微囊法能使动物细胞在固定的环境中增殖，因此能保护细胞少受损伤，有利于大规模培养动物细胞，A正确；微囊法培养动物细胞，能将细胞分泌的大分子物质被阻留而积累于囊内，将囊破坏就能获得生物大分子，B正确；微囊悬浮培养能防止培养过程中细胞贴壁生长，但是仍然会出现接触抑制，C错误；动物细胞培养适宜的气体环境为95％的空气和5％的CO2组成的混合气体，D正确。
4.D　反复将HCG注射到小鼠体内，产生的血清中含有多种抗体，不是单克隆抗体，A错误；诱导骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合的方法除灭活病毒外，还有化学方法如PEG等，B错误；用选择培养基筛选出的杂交瘤细胞只是B细胞与杂交瘤细胞的融合细胞，不一定都能产生HCG的抗体，C错误；杂交瘤细胞分泌的抗HCG单克隆抗体能与HCG发生特异性结合，即抗原与抗体发生特异性结合，进而可对早孕做出诊断，D正确。
5.D　在该过程中需要采集卵母细胞并在体外培养到MⅡ期，A错误；在细胞核移植过程中需要用物理或化学方法激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育进程，B错误；通过电融合法使两细胞融合，供体细胞与去核的卵母细胞融合，形成重构细胞，涉及动物细胞融合，C错误；在细胞核移植技术中没有涉及体外受精，D正确。
6.B　获取郊狼供体细胞的过程需用到动物细胞培养，而动物细胞培养需要无菌、无毒环境，A错误；由郊狼甲克隆出郊狼乙，可得出郊狼体细胞的细胞核具有全能性，郊狼乙是由重组细胞发育而来，可得出重组细胞也具有全能性，B正确；将胚胎植入代孕家犬前，需进行同期发情处理，进行同期发情处理主要使用的是孕激素和前列腺素，不同动物的处理方法不同，但不是通过注射性激素进行同期发情处理，C错误；郊狼乙的遗传物质来自家犬和郊狼甲，D错误。
7.A　T4溶菌酶是具有催化作用的蛋白质，由题意“二硫键”可推知：T4溶菌酶的组成元素除了C、H、O、N外，还含有S，A错误；T4溶菌酶在高温下失去活性后，其结构中还存在肽键，仍然能够与双缩脲试剂发生颜色反应，B正确；科学家将T4溶菌酶肽链中第3位的异亮氨酸变为半胱氨酸，该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成了一个二硫键，使酶的耐热性得到了提高，说明T4溶菌酶中氨基酸种类的变化造成其空间结构发生了改变，C正确；由题意可知：科学家借助蛋白质工程提高了T4溶菌酶的耐热性，蛋白质工程是通过改造或合成基因来完成的，因此T4溶菌酶耐热性提高的根本原因是编码该酶的基因碱基序列发生了变化，D正确。
8.C　为了说明诱导多能干细胞（iPSc）移植给急性心肌梗死小鼠的影响，该实验需正常小鼠作为对照组，也需要急性心肌梗死小鼠为对照，①错误；诱导多能干细胞可分化形成多种组织细胞，与成体干细胞相比，iPSc的分化潜能可能更强，②正确；诱导多能干细胞（iPSc）来源于病鼠自身的体细胞的诱导，再移植回病鼠体内可避免免疫排斥，且诱导过程无需破坏胚胎，所以应用前景优于胚胎干细胞，③正确；培养iPSc的培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素、微量元素和动物血清等，④错误。
9.B　农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，根据农杆菌的这一特点，将目的基因（基因G）插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因（基因G）整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上，A正确；农杆菌属于原核生物，含有内含子的报告基因不能在原核生物中正确表达，故不会出现农杆菌的蓝色菌落，B错误；根据题意可知，报告基因的产物能催化无色物质K呈现蓝色，而愈伤组织表面残留的农杆菌会导致未转化的愈伤组织能在含除草剂的培养基中生长，因此利用物质K和除草剂进行筛选2，更易于获得抗除草剂的转基因植株，C正确；提高培养基中细胞分裂素和生长素的比值，有利于诱导生芽，D正确。
10.（1）一种抗原中包含多种抗原决定簇　（2）既能大量增殖，又能产生足够数量的特定抗体　PEG（或聚乙二醇）　相同　特定的选择培养基　克隆化培养　能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备　（3）选用腺瘤细胞、鳞状细胞瘤细胞、（骨髓瘤细胞）分别与B淋巴细胞融合后选择能产生单一抗体的杂交瘤细胞，取等量的杂交瘤细胞在体外培养相同的时间，检测抗体的数量
解析：（1）一种抗原中包含多种抗原决定簇，因此一种抗原刺激小鼠能使小鼠产生多种B淋巴细胞。（2）在单克隆抗体的制备过程中，利用了杂交瘤细胞既能大量增殖，又能产生足够数量的特定抗体的特点。B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合时，常采用的方法为灭活病毒诱导法、电融合法和PEG融合法，动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理相同。由融合细胞到单克隆抗体需要多次筛选，第一次筛选通常采用特定的选择培养基筛选出杂交瘤细胞，对上述过程得到的杂交瘤细胞要进行克隆化培养和抗体检测，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。与多克隆抗体相比，单克隆抗体的优势为能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备。（3）实验目的是探究选用不同种的瘤细胞与B淋巴细胞杂交对单克隆抗体数量的影响，自变量是不同种的瘤细胞，因变量是对单克隆抗体数量的影响，因此实验可以设计为选用腺瘤细胞、鳞状细胞瘤细胞、（骨髓瘤细胞）分别与B淋巴细胞融合后选择能产生单一抗体的杂交瘤细胞，取等量的杂交瘤细胞在体外培养相同的时间，检测抗体的数量。
B级综合提升练
1.D　紫杉醇是红豆杉属植物体内的一种次生代谢物，所以为培育产紫杉醇的柴胡，需要用紫外线照射红豆杉细胞，使其染色体片段化，A错误；诱导植物细胞融合，应先用酶解法去除细胞壁，获取原生质体，然后加入聚乙二醇诱导，B错误；得到产紫杉醇的柴胡的杂种细胞的染色体数目应介于12（柴胡的染色体数目）和36（两种生物染色体数目之和）之间，C错误；杂种细胞中两种植物细胞的染色体间排斥较为明显，所以对称性细胞杂交技术中不同物种间基因表达的干扰程度高于非对称性细胞杂交技术，D正确。
2.C　制备CD38单克隆抗体常用的技术有动物细胞培养和动物细胞融合，其中动物细胞培养是动物细胞工程的基本技术，A正确；若利用小鼠来制备CD38单克隆抗体，则需要给小鼠注射CD38，B正确；FTL004与原CD38单克隆抗体相比特异性更强，因为题中显示，该单克隆抗体不与红细胞结合，C错误；FTL004与原CD38单克隆抗体相比疗效更显著，因为该抗体避免了由原来的单抗所引起的红细胞破裂，D正确。
3.D　在进行核移植时，可以通过显微操作技术去核，也可采用梯度离心、紫外线照射和化学物质处理等方法去核，A错误；若从野生动物体内采集到的体细胞数目较少，可先用添加动物血清的液体培养基进行培养，以增加体细胞的数目，B错误；种间体细胞核移植（iSCNT）技术的原理是动物细胞核具有全能性，操作过程中可用Ca2＋载体激活重构胚，C错误； 在种间体细胞核移植（iSCNT）过程中，去核的卵母细胞来自不同种、科、目或纲的家畜（驯养动物），获得的重构胚的细胞质遗传物质可能不同，因此同一野生动物经iSCNT技术获得的多个重构胚中，遗传物质可能不完全相同，D正确。
4.A　依据图示，极体1是由卵原细胞经过减数分裂Ⅰ产生的，因此是第一极体；由于供卵卵母细胞不具备纺锤体，不能进行分裂，故极体2是第一极体经过减数分裂Ⅱ产生，因此为第二极体，A正确；图中“？”处指受精作用，精子需进行获能处理，这里的“获能”是指具备受精的能力，而并不直接为受精作用提供能量，B错误；据图，该过程中是利用极体作为核供体，因为极体中的线粒体数量少，适合进行线粒体置换，若直接使用患者的体细胞作为核供体可能会引入有问题的线粒体，C错误；极体是由卵原细胞经过减数分裂产生的，其遗传物质主要来自卵原细胞，由于供卵卵母细胞不具备纺锤体，不能进行分裂，故图中极体2的遗传物质来自患者卵母细胞，D错误。
5.D　构建重组DNA分子用到的工具酶有限制酶和DNA连接酶，质粒为载体，A错误；由于四环素和氨苄青霉素在高温下不稳定易失效，因此应在灭菌后再加入抗生素，B错误；图2中利用绒布接种的方法为影印法，不改变菌落的位置，C错误；原板上的甲、乙菌落中，甲菌落在含四环素的培养基上能生存，在含氨苄青霉素的培养基上不能生存，说明甲菌落中质粒的氨苄青霉素抗性基因被破坏，说明甲菌落是成功导入重组质粒的受体菌，D正确。
6.C　原生质体是植物细胞去除细胞壁后的结构，为避免原生质体吸水涨破，酶解法制备原生质体时，应在等渗或稍微高渗溶液中进行，A正确。根据题干信息，“拟矮牵牛的原生质体在X培养基上只能形成小细胞团，不能形成植株，在X培养基中加入放线菌素-D后不影响上述过程；矮牵牛的原生质体在X培养基上能分化成植株，但在含放线菌素-D的X培养基上不能生长”，杂种细胞兼有两者的特点，能在B上形成植株，B正确。物种的判断标准是指在自然状态下能相互交配并产生可育后代，上述过程是植物体细胞杂交技术，是人为状态下实现的，故杂种矮牵牛可育，不能说明拟矮牵牛和矮牵牛属于同一物种，C错误。植物体细胞杂交首先要使原生质体融合形成杂种细胞，其次要把杂种细胞经过植物组织培养技术培育成杂种植株。细胞融合的原理是细胞膜具有一定的流动性，植物组织培养的原理是植物细胞的全能性，D正确。
7.C　若①是利用PCR扩增出含有限制酶切割位点的sGFP，则5轮后消耗引物数为25×2－2＝62个，A正确；需要利用上述两种限制酶对sGFP片段和质粒进行剪切，根据图中sGFP在重组质粒中的位置可知，sGFP一端a链的黏性末端碱基序列为BamHⅠ切割后的序列，从5'→3'阅读为GATC，B正确；重组质粒中启动子、终止子不只含有一个，复制原点含有一个，C错误；③过程用含潮霉素的培养基筛选农杆菌，得到的某些菌落的质粒DNA中可能不含sGFP，因为导入原始质粒也可以具有抗性，D正确。
C级应用创新练
8.（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精　使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸　镁离子　（2）引物1、引物3　（3）能吸收周围环境中DNA分子　潮霉素　转化　（4）导入的融合基因不一定能够成功表达
解析：（1）从细菌中提取DNA的过程中，使用预冷酒精（体积分数为95％）初步分离DNA与蛋白质，原理是DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精。PCR技术的原理是DNA复制，而DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3'端延伸DNA链，因此，引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始复制，连接脱氧核苷酸；Mg2＋是DNA聚合酶的必需激活剂，因此DNA聚合酶需要Mg2＋激活。（2）检测所获融合基因中是否含有正确插入的XplA和XplB基因，应该是扩增包括XplA和XplB基因和两侧部分DNA序列片段。若使用引物1＋引物4，引物1可以扩增出XplB基因加部分左侧DNA片段，引物4可以扩增出XplA基因加部分右侧DNA片段，但是无法确定XplA和XplB基因插入位置是否正确；若使用引物2＋引物3，可以扩增出XplA、XplB基因，证明两者同时存在，无法确定其是否插入到DNA上；若使用引物2＋引物4，引物2可以扩增出XplB基因加部分XplA基因片段，引物4可以扩增出XplA基因加部分右侧DNA基因片段，但是无法确定XplA和XplB的正确插入顺序；若使用引物1＋引物3，引物1以XplB的模板链为模板可以扩增出XplB基因加部分左侧DNA片段，引物3可以扩增出XplA基因和XplB基因片段，从而可以正确判断XplA和XplB基因插入顺序。综上，使用引物1＋引物3进行扩增。（3）表达载体导入农杆菌时，首先用Ca2＋处理细胞，使细胞成为能吸收周围环境中DNA分子的状态，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。若农杆菌得到含目的基因的表达载体，则也同时含有潮霉素抗性基因，因此可以用加有潮霉素的选择培养基把它筛选出来。通过农杆菌的转化作用，就可以使融合基因进入植物细胞。（4）农杆菌侵染植物之后，需要T-DNA携带融合基因整合到植物细胞的染色体上，在整合过程中，不一定正确整合，导致导入的融合基因不一定能够成功表达，因此成功导入融合基因的植株不一定能降解RDX物质。
大题突破（五）　生物工程类
1.（1）根部细胞　逆转录　琼脂糖凝胶电泳　（2）5'　目的基因自身环化；质粒的自身环化；目的基因的反向连接　启动子与终止子　（3）使细胞易于吸收外源DNA　抗原—抗体杂交法　（4）b区有些菌落明显大于a区的菌落
解析：（1）锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞膜，所以以该植物的根为材料提取并纯化mRNA，逆转录合成cDNA。PCR完成以后产物通常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。（2）PCR过程中，由于DNA子链是从引物的3'端延伸，因此在设计引物时，只能在两条引物的5'端加上限制酶酶切位点。两种引物含不同的限制酶识别序列，主要目的是为了防止构建基因表达载体时出现目的基因自身环化、质粒的自身环化或目的基因的反向连接。要将锌转运蛋白基因插入到质粒的启动子和终止子之间，才能保证锌转运蛋白基因的表达。（3）转化前一般用醋酸锂处理酵母菌细胞，使细胞处于感受态，目的是改变细胞膜的通透性，使细胞易于吸收外源DNA。可采用抗原—抗体杂交法检测目的基因在受体细胞中的表达。（4）配制含适量Zn2＋的（酵母菌）固体培养基、灭菌，分成a、b两半区域，a区接种涂布少量的缺陷型酵母，b区接种涂布少量的转化酵母，由于锌吸收缺陷型酵母增殖较慢，转化成功的酵母赋予了锌吸收特性后增殖较快，在适宜的条件下培养一段时间后，b区有些菌落明显大于a区的菌落。
2.（1）母猴的卵母细胞　MⅡ（减数分裂Ⅱ中）　（2）动物胚胎细胞比体细胞的分化程度低，表达全能性相对容易　接触抑制　传代　（3）Kdm4d可以表达组蛋白去甲基化酶，降低H3组蛋白的甲基化水平　组蛋白脱乙酰酶　提高
解析：（1）图1中的细胞a是母猴的卵母细胞，从卵巢中采集的细胞a需在体外培养至MⅡ（减数分裂Ⅱ中）期才能用于体细胞核移植等。（2）体细胞分化的程度高，恢复其全能性较难，因此动物体细胞核移植技术难度明显高于胚胎细胞核移植，所以取胎猴期而非成年期的体细胞。当贴壁细胞在体外培养过程中发生接触抑制现象时，需要对细胞分瓶进行传代培养。（3）Kdm4d是组蛋白去甲基化酶，则Kdm4d可以表达组蛋白去甲基化酶，降低H3组蛋白的甲基化水平，进而促进基因A的表达。TSA是组蛋白脱乙酰酶抑制剂，可以抑制组蛋白脱乙酰酶的作用，提高组蛋白的乙酰化水平最终调节相关基因的表达。
3.（1）能产生抗RANKL抗体的B淋巴细胞　（2）PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法　未融合的亲本细胞和融合有同种细胞的　克隆化培养和抗体检测　（3）纯度高、灵敏度高和可以大量制备　（4）大于　在癌症患者体内RANKL高表达的情况下，联合用药效果最好
解析：（1）步骤①中，用RANKL多次免疫小鼠，其目的是获得能产生抗RANKL抗体的B淋巴细胞。（2）步骤②为诱导动物细胞融合的过程，常用的诱导动物细胞融合的方法有PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法，经过步骤②后获得的细胞需要在选择培养基上方可筛选出杂交瘤细胞，因为该培养基上未融合的亲本细胞和融合有同种细胞的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长，然后对获得的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量分泌抗RANKL单克隆抗体的细胞。（3）单克隆抗体的优点有能准确地识别抗原，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备，即表现为纯度高、灵敏度高和可以大量制备的优势。（4）由图可知，使用地舒单抗后能使RANKL高表达骨肿瘤肺转移患者PFS时间大于RANKL低表达患者。题意显示，RANKL是一种跨膜蛋白，RANKL过量表达会激活破骨细胞，导致实体瘤骨转移的发生。地舒单抗是一种可与人细胞中RANKL结合的IgG2单克隆抗体，能够靶向作用于过度表达RANKL的细胞，阻断肿瘤的生长，而患者4表现为效果最佳，且用药方式为联合用药，且癌症患者表现为RANKL高表达，因此对于癌症患者来讲，在癌症患者体内RANKL高表达的情况下，联合用药效果最好。
4.（1）两种引物的碱基序列互补配对　加热使 DNA变性后解旋为单链；冷却复性使引物结合到模板DNA 链上；再加热促进热稳定DNA聚合酶发挥作用，开始子链的延伸　（2）AluⅠ切割会破坏抗盐碱基因　防止目的基因和质粒反向连接　防止目的基因、质粒自身环化　（3）将目的基因导入农杆菌细胞　3　在培养农杆菌的培养基内添加氨苄青霉素　农杆菌中 Ti质粒上的T-DNA 能转移并整合至植物细胞染色体DNA上
解析：（1）DNA分子是由两条反向平行的链构成，且都作模板，其上碱基序列互补，因此要避免两种引物的碱基序列互补配对；扩增时，需先加热至90 ℃以上，再冷却至50 ℃左右，再加热至72 ℃左右，进行系列温度调整的目的分别是：加热使 DNA变性后解旋为单链；冷却复性使引物结合到模板DNA 链上；再加热促进热稳定DNA聚合酶发挥作用，开始子链的延伸。（2）据图可知，抗盐碱基因中包含了AluⅠ限制酶识别序列，若用限制酶AluⅠ切割则会破坏抗盐碱基因；选择SmaⅠ和PstⅠ两种限制酶分别切割抗盐碱基因和质粒，抗盐碱基因与质粒各自能形成不能互补配对的两个黏性末端，同时抗盐碱基因与质粒之间的黏性末端又能互补配对，相比只选择PstⅠ一种酶进行切割的优点是可防止目的基因、质粒反向连接，防止目的基因和质粒自身环化。（3）图中②表示将目的基因导入农杆菌细胞；据图分析，3号培养基可诱导组织细胞脱分化形成愈伤组织；质粒中含有氨苄青霉素抗性基因，故含重组质粒的农杆菌具有抗氨苄青霉素的特性，所以为了筛检成功导入重组质粒的农杆菌，1号培养基需要加入氨苄青霉素；Ti质粒上的T-DNA具有可转移的特性，当农杆菌侵染大豆愈伤组织细胞时，农杆菌中Ti质粒上的T-DNA包括插入其中的目的基因，可转移并整合至受体细胞染色体DNA上。
5.（1）EcoRⅠ和SpeⅠ　5　（2）潮霉素　潮霉素基因位于T-DNA中，会与目的基因一同转移到玉米愈伤组织细胞的染色体上　（3）3　样品1表现为能合成大片段，其基因型为MM，样品3中插入了T-DNA片段，表现为无扩增大片段出现，其基因型可表示为mm
解析：（1）构建基因表达载体时，切割目的基因需要用到的限制酶为MunⅠ和XbaⅠ，结合各种限制酶的识别序列可知，EcoRⅠ和SpeⅠ分别和MunⅠ和XbaⅠ为同尾酶，因此，切割Ti质粒应选用EcoRⅠ和SpeⅠ酶。从切割DNA片段和Ti质粒到构建基因表达载体完成共需四种限制酶和一种DNA连接酶，即需要5种酶。（2）将农杆菌浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养，培养基中需加入潮霉素进行筛选，因为潮霉素基因位于T-DNA中，会与目的基因一同转移到玉米愈伤组织细胞的染色体上，因此凡是成功导入目的基因的愈伤组织细胞应该都具有对潮霉素的抗性。进而用筛选出的愈伤组织最终培养成转基因玉米。（3）农杆菌转化法除了用于获取转基因植物外，还可以通过T-DNA插入基因内部使基因沉默，获得突变体。为了获得mm突变体，某科研小组利用野生型MM，通过农杆菌转化法使基因M沉默。由于T-DNA插入的位置是随机的，为确定T-DNA是否插入M基因中，该小组采用“三引物法”进行PCR扩增，即采用三种引物（LP、RP、BP），LP、RP为与目的基因片段互补的特异引物，BP为插入T-DNA的特异引物，如图所示。结合题图以及题目信息可知，样品1没有插入相应的T-DNA片段，其基因型为MM，样品3中插入了T-DNA片段，表现为无扩增大片段出现，其基因型可表示为mm，而样品2的基因型可表示为Mm。即根据表中三种样品的电泳结果可判断样品3是纯合突变体。
6.（1）变性、复性　模板DNA和两种引物　2n－2n　（2）RNA聚合酶结合位点，驱动基因转录出mRNA　（3）将目的基因转移到受体细胞，并将其整合到受体细胞的染色体DNA上　新霉素　（4）生长素和细胞分裂素　诱导叶绿素的形成、满足叶绿体利用光能制造有机物的需要　（5）将此转基因水稻和普通水稻分别种在高盐稻田中，观察和对比这两种水稻的长势
解析：（1）PCR（聚合酶链式反应）是利用DNA在体外95 ℃高温时变性会变成单链，低温（经常是50 ℃左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72 ℃左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5'→3'）的方向合成互补链。图1中步骤1和步骤2分别是PCR循环程序中的变性、复性，这两个步骤的温度都相对较高，可能与模板DNA和两种引物中碱基C和G的含量较高有关，因为碱基C和G之间可以形成三个氢键。观察图中信息可知，三次循环可以得到目的基因，因此循环n次能获得等长目的基因2n－2n个。（2）根据题干信息“所有转入该重组DNA分子的植物细胞都会表达GsERF6基因，且表达量较高”，可知该35s为启动子，能驱动基因高效表达，且在所有植物细胞中均能驱动基因表达，故35s的作用是RNA聚合酶结合位点，驱动基因转录出mRNA。（3）T-DNA又叫可转移的DNA，因此T-DNA的作用是将目的基因转移到受体细胞，并将其整合到受体细胞的染色体DNA上；T-DNA可以将目的基因转移到受体细胞，并将其整合到受体细胞的染色体DNA上，NeoR为新霉素抗性基因，因此将重组GsERF6基因超表达载体导入农杆菌，①过程利用含新霉素的培养基筛选出重组的农杆菌。（4）愈伤组织到幼苗的过程需要加入的激素有生长素和细胞分裂素，另外该过程还需要光照，光照的作用是诱导叶绿素的形成、满足叶绿体利用光能制造有机物的需要。（5）个体水平上的鉴定包括抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等，因此检验此转基因水稻新品种是否培育成功可以将此转基因水稻和普通水稻分别种在高盐稻田中，观察和对比这两种水稻的长势。
7.（1）限制酶PstⅠ和BamHⅠ所识别的双链DNA分子的核苷酸序列不同，切割位点不同，产生的黏性末端也不同　（2）4种脱氧核苷酸　2n　（3）①稀释涂布平板法　pBR322（空载质粒）和含外源DNA的重组质粒上均含有AmpR，导入了pBR322（空载质粒）或含外源DNA的重组质粒的大肠杆菌对Amp均有抗性　②Amp　限制酶BamHⅠ破坏了质粒上的TetR（四环素抗性基因），因此含外源DNA的重组质粒不能在添加了四环素的培养基中生长
解析：（1）由于限制酶PstⅠ和BamHⅠ所识别的双链DNA分子的核苷酸序列不同，切割位点不同，所以产生的黏性末端也不同，故限制酶PstⅠ和BamHⅠ切割DNA分子产生的末端不能互补。（2）利用RT-PCR技术获取外源DNA的过程中用到的原料是4种脱氧核苷酸。DNA复制过程中每一个子链的合成都需要引物，第n次扩增外源DNA时即DNA分子数由2n－1变为2n，增加的DNA分子数为2n－2n－1＝2n－1，需要消耗的引物数量是2（n－1）×2＝2n个。（3）①图示中培养基上菌落分布均匀，因此将大肠杆菌接种到固体培养基上的方法是稀释涂布平板法。由于pBR322（空载质粒）和含外源DNA的重组质粒上均含有AmpR，导入了pBR322（空载质粒）或含外源DNA的重组质粒的大肠杆菌对Amp均有抗性，因此在该培养基中生长的大肠杆菌并不是一定导入了含外源DNA的重组质粒。②由于限制酶BamHⅠ破坏了质粒上的TetR（四环素抗性基因），因此含外源DNA的重组质粒不能在添加了四环素的培养基中生长，所以导入了成功构建的重组质粒的大肠杆菌菌落应该从含Amp的培养基上获取。
8.（1）一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸　PCR技术中的DNA聚合酶耐高温，而人体细胞中的DNA聚合酶不耐高温　（2）目的基因或线性化质粒自身环化　目的基因反向连接　噬菌体、动植物病毒　（3）使细胞处于一种能够吸收周围环境中DNA分子的生理状态　用含有氨苄青霉素的培养基培养大肠杆菌，然后分别用显微镜计数法和稀释涂布平板法进行计数，若计数结果是A和B，则致死率＝（A－B）/A×100％
解析：（1）引物指的是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。由于PCR技术中需要较高的温度条件，所以使用的DNA聚合酶必须耐高温，而人体细胞中的DNA聚合酶不耐高温。（2）图中的同源序列1、2中的碱基序列不同，可以防止目的基因或线性化质粒自身环化，还可以防止目的基因反向连接。目的基因的运载体除了质粒外，噬菌体和动植物病毒也可以作为目的基因的运载体。（3）将目的基因导入微生物细胞（如大肠杆菌）时，需要用Ca2＋处理微生物细胞，使之处于一种能够吸收周围环境中DNA分子的生理状态。如果目的基因转化效果好，则在含有氨苄青霉素的培养基中培养的大肠杆菌的致死率会较低。细菌计数法有显微镜计数法和稀释涂布平板法，显微镜计数法计数的大肠杆菌包括活菌和死亡的细菌，而稀释涂布平板法计数的都是活菌，因此大肠杆菌的致死率＝（A－B）/A×100％。
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