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(共34张PPT)
专题八
生物技术与工程
第17讲　细胞工程与胚胎工程
内容索引
核心串讲
名卷优选
体系建构
基础回归
基 础 回 归
1判断下列说法是否正确。
(1) 利用组织培养技术培育脱毒苗，获得具有抗病毒的新品种。____
(2) 培育耐盐植株时，必须在获得试管苗后才可用盐水浇灌进行筛选。______
(3) 植物体细胞杂交过程中，原生质体融合后获得的细胞需要进行筛选。______
(4) 动物细胞培养中，含5% CO2的恒温培养箱用来调控pH和温度。______
(5) 动物细胞培养可用于检测有毒物质，茎尖培养可用于植物脱除病毒。______
×
×
√
√
√
(6) 除温度、pH外，渗透压也是动物细胞培养需要考虑的一个重要环境参数。______
(7) 为了防止细胞培养过程中细菌的污染，可向培养液中加入适量的干扰素。______
(8) 去除植物细胞的细胞壁和将动物组织分散成单个细胞都需要酶处理。______
(9) 直接从活体动物卵巢中吸取采集的卵母细胞，需要经体外人工培养至减数分裂Ⅱ中期。______
(10) 体外受精等技术可培育出与母本遗传性状完全相同的试管牛。______
√
×
√
√
×
(11) 卵裂期胚胎中，细胞数目和有机物总量在不断增加。______
(12) 克隆高产奶牛时，获得的重构胚需要在胚胎移植后用Ca2＋载体等试剂“激活”。______
(13) 当精子入卵后，透明带立即发生生理反应，阻止后来的精子进入。______
(14) 胚胎工程中常以观察到两个极体或雌、雄原核作为受精的标志。______
(15) 超数排卵是指应用外源性激素，诱发卵巢排出比自然情况下更多的成熟卵子。______
(16) 胚胎分割移植时应选取发育良好、形态正常的囊胚或原肠胚。______
×
×
×
√
×
×
2植物组织培养中，若外植体取自一株绿色开花植物，其后代核型会不同，主要原因是_______________________________________________ _______________________________。
3克隆动物的性状与供体不完全相同的原因是____________________ _______________________________________________________________等。
绿色开花植株上同时含有体细胞和生殖细胞，后代既有正常植株，也有单倍体植株
①克隆动物细胞质的遗传物质来自提供卵母细胞的个体；②生物体的性状还受到环境的影响
体 系 建 构
核心考点1　细胞工程
核 心 串 讲
1 比较植物组织培养与动物细胞培养
项目 植物组织培养 动物细胞培养
原理 植物细胞的全能性 细胞的增殖
过程
项目 植物组织培养 动物细胞培养
结果 获得植株个体 细胞群(细胞株或细胞系)
条件 ①无菌 ②营养 ③适宜条件 ①无菌、无毒
②营养(血清等)
③温度、pH和渗透压
④气体环境：O2、CO2
应用 ①植株快速繁殖 ②脱毒植株的培养 ③人工种子 ④生产药物、杀虫剂等 ⑤转基因植物的培育 ①蛋白质生物制品的生产
②皮肤移植材料的培育
③检测有毒物质
④生理、病理、药理学的研究
2 正确认识克隆动物的遗传特性
体细胞核移植技术获得的克隆动物与供核动物性状不完全相同：①克隆动物绝大部分DNA来自供体细胞核，但其核外线粒体中的DNA来自受体卵细胞。②性状是基因与环境共同作用的结果。供核动物生活的环境与克隆动物生活的环境不完全相同，其性状可能和供核动物不完全相同。③在个体发育过程中克隆动物有可能发生基因突变，产生供核动物没有的性状。
3 比较植物体细胞杂交与动物细胞融合
项目 植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理 细胞膜的流动性、细胞的全能性 细胞膜的流动性
过程
项目 植物体细胞杂交 动物细胞融合
相关酶 纤维素酶和果胶酶 胰蛋白酶或胶原蛋白酶
融合方法 物理法、化学法 除物理法和化学法外，还可以用灭活的病毒诱导
结果 杂种植株 杂交细胞
4单克隆抗体的过程和特点
注意：双抗体夹心法定量检测抗原
酶联免疫吸附双抗体夹心法是医学上常用的定量检测抗原的方法，具体原理如图所示：
固相抗体和酶标抗体均能与抗原结合，这是由于不同抗体能与同一抗原表面的不同部位结合。该检测方法中，酶标抗体的作用是抗体与待测抗原结合，酶催化特定底物反应，可通过测定产物量来判断待测抗原量。
名 卷 优 选
　　　[2025江苏卷·4]图示一种植物组织培养周期，①～③表示相应过程。下列相关叙述错误的是(　　)
A. 过程①发生了细胞的脱分化和有丝分裂
B. 过程②经细胞的再分化形成不同种类的细胞
C. 过程②③所用培养基的成分、浓度相同
D. 培养基中糖类既能作为碳源，又与维持渗透压有关
1
C
【解析】 过程①细胞有丝分裂后脱分化形成愈伤组织，A正确；过程②是愈伤组织经再分化形成胚状体的过程，形成不同种类的细胞，B正确；过程②③培养基的成分、浓度不同，如细胞分裂素和生长素的浓度不同，C错误；植物组织培养的培养基中常加入蔗糖，蔗糖既能作为碳源，又与维持渗透压有关，还能降低被杂菌污染的概率，D正确。
　　　[2024江苏卷·13]图示为植物原生质体制备、分离和检测的流程。下列相关叙述正确的是(　　)
2
A. 步骤①添加盐酸以去除细胞壁
B. 步骤②吸取原生质体放入无菌水中清洗
C. 原生质体密度介于图中甘露醇和蔗糖溶液密度之间
D. 台盼蓝检测后应选择蓝色的原生质体继续培养
C
【解析】 步骤①添加纤维素酶或果胶酶去除细胞壁，其原理是酶的专一性，A错误；步骤②吸取原生质体放入等渗液中清洗，否则会导致原生质体吸水涨破，B错误；结合图示可知，原生质体处于甘露醇和蔗糖溶液之间，因而可推测原生质体的密度介于图中甘露醇和蔗糖溶液密度之间，C正确；台盼蓝检测后应选择无色的原生质体继续培养，染成蓝色的原生质体活性差或死亡，D错误。
　　　[2024江苏卷·11]我国科学家利用人的体细胞制备多能干细胞，再用小分子TH34成功诱导衍生成胰岛B细胞。下列相关叙述错误的是(　　)
A. 基因选择性表达被诱导改变后，可使体细胞去分化成多能干细胞
B. 在小分子TH34诱导下，多能干细胞发生基因突变，获得胰岛素基因
C. 衍生的胰岛B细胞在葡萄糖的诱导下能表达胰岛素，才可用于移植治疗糖尿病
D. 若衍生的胰岛B细胞中凋亡基因能正常表达，细胞会发生程序性死亡
3
B
【解析】 体细胞可以通过特定的因子导入和培养条件，改变基因的调控和表达模式，使得原本专一功能的体细胞去分化成为多能干细胞，A正确；小分子药物通常是通过调节现有的生物通路和基因表达来实现其功能，而胰岛素基因在人体所有细胞中都存在，但只有在胰岛B细胞中才会表达，所以多能干细胞在诱导分化的过程中不会突然发生基因突变获得胰岛素基因，B错误；胰岛B细胞在较高的血糖浓度下分泌胰岛素，降低血糖，所以衍生的胰岛B细胞需在葡萄糖的诱导下能成功表达胰岛素，以确保衍生的胰岛B细胞能够正常发挥功能，才可用于移植治疗糖尿病，C正确；凋亡基因的正常表达会导致衍生的胰岛B细胞发生程序性死亡，D正确。
　　　(多选)[2022江苏卷·19]下图表示利用细胞融合技术进行基因定位的过程，在人—鼠杂种细胞中人的染色体会以随机方式丢失，通过分析基因产物进行基因定位。现检测细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中人的4种酶活性，只有Ⅱ具有芳烃羟化酶活性，只有Ⅲ具有胸苷激酶活性，Ⅰ、Ⅲ都有磷酸甘油酸激酶活性，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ均有乳酸脱氢酶活性。下列相关叙述正确的有(　　　)
4
A. 加入灭活仙台病毒的作用是促进细胞融合
B. 细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别为人—人、人—鼠、鼠—鼠融合细胞
C. 芳烃羟化酶基因位于2号染色体上，乳酸脱氢酶基因位于11号染色体上
D. 胸苷激酶基因位于17号染色体上，磷酸甘油酸激酶基因位于X染色体上
ACD
【解析】 分析题干信息：Ⅰ保留X、11号染色体，Ⅱ保留2、11号染色体，具有芳烃羟化酶活性，Ⅲ保留X、11、17号染色体，具有胸苷激酶活性，Ⅰ、Ⅲ都有磷酸甘油酸激酶活性，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ均有乳酸脱氢酶活性，所以支配芳烃羟化酶合成的基因位于2号染色体上，支配胸苷激酶合成的基因位于17号染色体上，支配磷酸甘油酸激酶合成的基因位于X号染色体上，支配乳酸脱氢酶合成的基因位于11号染色体上。故A、C、D正确。
1 [2025扬州考前模拟]与常规栽培技术相比，利用植物细胞培养进行药用次生代谢产物的生产具有显著的优越性，根据不同的需求可以采用下图所示不同的技术流程。下列相关叙述错误的是(　　)
A. 同一植物的外植体通过不同的培养体系可得到不同的产物
B. 将目标产物合成途径中的关键酶基因导入悬浮细胞，有望提高产量
C. 为提高组织培养成功率，外植体的消毒处理时间越长越好
D. 由于不受土壤、气候条件限制，利用该技术有利于缓解资源短缺问题
C
【解析】 为提高组织培养成功率，消毒处理时既要考虑药剂的消毒效果，又要考虑植物的耐受能力，外植体的消毒处理时间并不是越长越好，C错误。
2(多选)[2025南通启东中学模拟]科研人员将诺如病毒(NV)作为抗原注射给小鼠，通过制备NV单克隆抗体1和2，应用于胶体金检测试纸进行抗原鉴定(如图)。检测原理采用双抗体夹心法：将待测样液加到样品孔处，结合垫处含有过量胶体金(可与蛋白质结合，大量聚集时出现肉眼可见的红色)标记的游离金标抗体1，可以结合样液中的抗原，T上固定有抗体2，抗体1和抗体2与NV表面同一抗原的不同部位发生特异性结合而呈红色，多余的抗体1继续向左流，C上固定有抗体1的抗体，二者结合使胶体金大量聚集也呈红色。下列叙述正确的有(　　　)
ABC
A. 将NV作为抗原注射给小鼠，可获得多种产生特定抗体的B淋巴细胞
B. 利用单克隆抗体技术制备的抗体1和抗体2不能直接对患者进行注射治疗
C. 若仅C处呈红色，说明检测结果为阴性，则可初步判断待测液中不含NV
D. 若C、T处均呈红色，说明检测结果为阳性，该过程发生2次特异性结合
【解析】 NV具有多个抗原结合位点，可以诱导机体产生多种特定抗体的B淋巴细胞，A正确；利用单克隆抗体技术制备的抗体1和抗体2是利用小鼠的骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合的杂交瘤细胞分泌产生的，对人来说属于异物，为了降低免疫排斥，需要对单克隆抗体进行改造，除抗原结合区域外，其他部分都替换为人抗体区段，B正确；若待测液中含NV，则检测线和质控线C处均出现红色，而仅C处呈红色，说明检测结果为阴性，则可初步判断待测液中不含NV，C正确；若检测结果为阳性，则该病毒表面的抗原与结合垫处的抗体1结合，随着抗体1移动到T处，同一抗原表面的不同结合位点与抗体2结合呈红色，未与该病毒表面抗原结合的抗体1移动到C处与抗体1的抗体结合，因此该过程共发生3次特异性结合，D错误。
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专题八
生物技术与工程
第17讲　细胞工程与胚胎工程
核心考点2　胚胎工程
内容索引
核心串讲
名卷优选
检测反馈
核 心 串 讲
1 胚胎工程的概念
(1) 理论基础：哺乳动物的受精机制和早期胚胎发育的规律。
(2) 技术手段：体外受精、胚胎移植、胚胎分割、胚胎干细胞培养等。
(3) 操作对象：早期胚胎、配子。
2 体内受精和早期胚胎发育
(1) 精子的发生
①场所：睾丸；②开始时期：初情期。
(2) 卵子的发生
①场所：卵巢；②开始时期：性别分化后。
(3) 受精
①场所：输卵管；
②防止多精入卵的两道屏障：透明带反应和卵细胞膜反应；
③实质：雌、雄原核结合成为受精卵；
④标志：卵细胞膜与透明带的间隙可以观察到两个极体。
(4) 早期胚胎发育
受精卵→卵裂期(有丝分裂)→桑葚胚(桑葚胚及其以前的细胞是全能干细胞)→囊胚期(囊胚腔、内细胞团、滋养层)→原肠胚期(三胚层、原肠腔)
3 体外受精和早期胚胎培养
(1) 体外受精
①卵母细胞的采集方法：超数排卵法和直接采集法。
②精子的采集和获能
a. 采集方法：假阴道法、手握法、电刺激法。
b. 获能方法：培养法和化学诱导法。
③受精：获能的精子和培养成熟的卵子在专用的受精溶液中完成受精作用。
(2) 早期胚胎培养
①培养液成分：与动物细胞培养液成分基本相同，除无机盐、营养成分和调节物质外，还需要血清、抗生素等；
②目的：检查受精状况和受精卵的发育能力；
③胚胎处理：胚胎移植或冷冻保存。
4 胚胎移植的生理学基础
(1) 供、受体生殖器官的生理变化相同。
(2) 早期胚胎与母体无联系。
(3) 受体对外来胚胎无免疫排斥反应。
(4) 供体胚胎的遗传特性在孕育过程中不受任何影响。
5 胚胎工程的操作流程
6 克隆动物、试管动物及转基因动物的比较
项目 克隆动物 试管动物 转基因动物
概念 用核移植的方法获得的动物 用体外受精的方法获得的动物 由被转入了目的基因的受精卵发育成的动物
技术 核移植 体外受精 DNA重组技术
生殖方式 无性生殖 有性生殖 有性生殖或保持原生殖方式
遗传特性 主要与供核个体相同 具备双亲的遗传性状 具备原受精卵及被转入的目的基因两方面的遗传特性
相同点 三者均涉及早期胚胎培养、胚胎移植等技术，且移植所选胚胎一般是桑葚胚或囊胚期的胚胎 名 卷 优 选
　　　[2025江苏卷·7]梅花鹿和马鹿杂交后代生命力强、茸质好，但自然杂交很难完成，人工授精能解决此难题。胚胎工程技术的应用，可提高繁殖率，增加鹿场经济效益。下列相关叙述合理的是(　　)
A. 采集的精液无需固定、稀释，即可用血细胞计数板检测精子密度
B. 人工授精时，采集的精液经获能处理后才能输入雌性生殖道
C. 超数排卵处理时，常用含促性腺激素的促排卵剂
D. 母体子宫对胚胎的免疫耐受性低下是胚胎移植的生理学基础
1
C
【解析】 采集的精液需要稀释和固定处理，否则密度过大且活动的精子会影响计数的准确性，A错误；人工授精时，精子在雌性生殖道内自然获能，无需体外获能处理，B错误；超数排卵通过注射促性腺激素促进卵泡发育和排卵，C正确；胚胎移植的生理学基础是母体子宫对胚胎的免疫耐受性高，一般不会发生免疫排斥，而非耐受低下，D错误。
　　　[2022江苏卷·4]下列关于动物细胞工程和胚胎工程的叙述，正确的是(　　)
A. 通常采用培养法或化学诱导法使精子获得能量后进行体外受精
B. 哺乳动物体外受精后的早期胚胎培养不需要额外提供营养物质
C. 克隆牛技术涉及体细胞核移植、动物细胞培养、胚胎移植等过程
D. 将小鼠桑葚胚分割成2等份获得同卵双胎的过程属于有性生殖
2
C
【解析】 精子获能是获得受精的能力，不是获得能量，A错误；哺乳动物体外受精后的早期胚胎培养所需营养物质与体内基本相同，例如需要有糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，还需加入血清、血浆等天然成分，B错误；克隆牛技术涉及体细胞核移植、动物细胞培养、胚胎移植等过程，C正确；胚胎分割可以看作动物无性繁殖或克隆的方法，D错误。
　　　(多选)[2024江苏卷·19]从牛卵巢采集卵母细胞进行体外成熟培养，探究高温对卵母细胞成熟的影响，结果如图所示。下列相关叙述错误的有(　　　)
3
A. 选取发育状态一致的卵母细胞进行培养
B. 体外培养卵母细胞时通常加入湿热灭菌后的血清
C. 对采集的卵母细胞传代培养以产生大量卵细胞
D. 体外培养时高温提高了卵母细胞发育的成熟率
BCD
【解析】 选取发育状态一致的卵母细胞进行培养，这样可以排除其他因素的干扰，保证实验结果是由温度这一变量引起的，A正确；体外培养卵母细胞时通常加入血清，但是动物血清并不能进行湿热灭菌，否则会使其中部分有效成分失活，B错误；未受精的卵母细胞不能进行传代培养，C错误；由图可知，高温降低了卵母细胞发育的成熟率，而不是提高，D错误。
　　　(多选)[2023江苏卷·17]我国科学家利用猴胚胎干细胞首次创造了人工“猴胚胎”，研究流程如图所示。下列相关叙述正确的有(　　)
A. 猴的成纤维细胞和胚胎干细胞功能不同，但具有相同的基因组
B. 囊胚细胞②③都由细胞①分裂分化形成，但表达的基因都不同
C. 移植前，细胞和囊胚的培养都要放在充满CO2的培养箱中进行
D. 移植后，胚胎的发育受母体激素影响，也影响母体激素分泌
4
AD
【解析】 由于猴的成纤维细胞和胚胎干细胞是由猴胚胎干细胞分裂分化而来，虽然功能不同，但基因组相同，A正确；囊胚细胞②③都由细胞①分裂分化形成，但表达的基因有部分不同，有部分基因所有细胞都表达(如呼吸酶基因)，B错误；培养箱中没有CO2，会影响细胞的正常生长，因此移植前细胞和囊胚的培养都要放在含5% CO2的培养箱中进行，C错误；胚胎移植后胚胎的发育受母体激素影响，也影响母体激素分泌，D正确。
1[2025盐城联盟校模拟]我国科学家体外诱导食蟹猴胚胎干细胞，形成了类似囊胚的结构(类囊胚)，为研究灵长类胚胎发育机制提供了实验体系(如图)。相关叙述错误的是(　　)
A. 实验证实食蟹猴胚胎干细胞具有分化潜能
B. 实验过程中使用的培养基含有糖类
C. 类囊胚的获得利用了核移植技术
D. 可借助胚胎移植技术研究类囊胚的后续发育
C
【解析】 体外诱导食蟹猴胚胎干细胞，形成了类似囊胚的结构(类囊胚)，证实了食蟹猴胚胎干细胞具有分化潜能，A正确；实验过程中使用的培养基需含有糖类，糖类可为细胞培养提供能源物质，B正确；类囊胚的获得利用了动物细胞培养技术，并没有进行核移植，C错误；可借助胚胎移植技术将类囊胚移植到相应的雌性受体中继续胚胎发育，从而可以用来研究类囊胚的后续发育，D正确。
2(多选)[2025常州盐城考前指导]近年来亚洲黑熊数量锐减，科学家欲通过现代生物技术促进亚洲黑熊数量增加,其过程如图所示，字母代表不同个体，数字代表不同过程。下列相关叙述错误的有(　　)
A. 获得E后代和F后代都需要黑熊A服用相关激素促进超数排卵
B. 产生F后代和胚胎分割繁殖后代的生殖方式不同
C. 可以使用蛋白酶合成抑制剂法激活重构胚，使重构胚完成细胞分裂和发育
D. D受体需选择健康、有正常的繁殖能力的同种生物个体
AB
【解析】 超数排卵需要向雌性个体注射促性腺激素，促性腺激素的本质是蛋白质，不能服用，A错误；F后代是通过体细胞核移植技术繁殖而来，属于无性繁殖，胚胎分割移植也属于无性繁殖，B错误；激活重构胚可使用蛋白酶合成抑制剂等方法，使其完成细胞分裂和发育进程，C正确；D受体的功能是怀孕和分娩，需选择健康、有正常的繁殖能力的同种生物个体，D正确。
检 测 反 馈
2
4
1
3
1[2025南通考前模拟预测]黄酮类化合物是葛根的有效成分。为工厂化生产黄酮，科研人员开展pH对葛根悬浮细胞生长及总黄酮产量的研究，结果如图。下列相关叙述错误的是(　　)
A. 获得悬浮细胞的过程主要有葛根根部灭菌→接种→脱分化→分离细胞
B. 悬浮培养时要将接种好的三角瓶置于摇床培养
C. 悬浮培养的主要原理是细胞的有丝分裂
D. pH为5.3时单细胞黄酮产量比5.8时明显低
A
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4
1
3
【解析】 获得悬浮细胞的过程主要有葛根根部消毒→接种→脱分化→分离细胞，A错误；悬浮培养时为了保证细胞与培养液充分接触并保持悬浮状态，要将接种好的三角瓶置于摇床培养，B正确；细胞悬浮培养的目的是使细胞数目增多，主要原理是细胞的有丝分裂，C正确；由图分析可知，pH为5.3时单细胞黄酮产量比5.8时明显低，D正确。
2
4
1
3
2[2025常州前黄中学阶段考]下列关于试管婴儿技术的叙述，正确的是(　　)
A. 在采集卵母细胞之前，需要给供卵者注射大量的促性腺激素，促进排卵
B. 从卵巢中吸取的卵母细胞，必须经体外培养获能处理后才能用于受精
C. 受精过程中，卵细胞的透明带和卵细胞膜会依次发生生理反应，阻止多精入卵
D. 设计试管婴儿技术，有利于生育健康的下一代，不会造成社会危害
C
2
4
1
3
【解析】 在采集卵母细胞之前，需要给供卵者注射适量的促性腺激素，促进超数排卵，A错误；从卵巢中吸取的卵母细胞，必须经体外培养成熟后才能与获能的精子受精，B错误；受精过程中，卵母细胞会发生透明带反应和卵细胞膜反应，这是防止多精入卵的两道屏障，C正确；以治疗为目的的设计试管婴儿技术，是救治患者最好、最快捷的办法之一，若该项技术用于其他方面，则存在伦理问题，可能会造成社会危害，D错误。
2
4
3
1
3[2025徐州考前打靶卷]乳腺癌、胃癌细胞表面有大量的HER2蛋白，T细胞表面有CD3蛋白和CD28蛋白。研究人员利用上述三种蛋白作为抗原分别制备单克隆抗体，然后将其在体外解偶联后重新偶联制备得到三抗(如图)。相关叙述正确的是(　　)
A. 给小鼠同时注射三种抗原蛋白，可产生能同时分泌三种抗体的浆细胞
B. 三抗能同时与T细胞和肿瘤细胞特异性结合，促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤
C. 三抗的肽链之间通过二硫键相连，空间结构变化不影响其功能
D. 三抗与肿瘤细胞的识别体现了细胞膜进行细胞间信息交流的功能
B
2
4
3
1
【解析】 同时注射3种抗原会刺激B细胞分化形成不同的浆细胞，进而产生三种抗体，但一种浆细胞只能产生一种抗体，A错误；抗原抗体能特异性识别结合，三抗能同时与T细胞和肿瘤细胞特异性结合，促进了T细胞对肿瘤细胞的杀伤，B正确；三抗的肽链之间通过二硫键相连，结构决定其功能，空间结构变化影响其功能，C错误；三抗是物质，不是细胞，它与肿瘤细胞的识别不能体现细胞间的信息交流，D错误。
2
4
3
1
4(多选)[2025泰州中学模拟]为研究治疗性克隆能否用于帕金森病的治疗，科研人员利用“人帕金森病模型鼠”进行了如图所示实验。下列相关说法正确的有(　　)
A. 上述过程体现了动物细胞的全能性
B. 过程③选取的胚胎干细胞具有细胞体积小、细胞核大、核仁明显等特点
C. 鼠皮肤细胞培养与过程②所用的培养液中都需要添加血清等物质
D. 过程⑤需要对受体小鼠注射相应的免疫抑制剂以避免发生免疫排斥反应
BC
2
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3
1
【解析】 治疗性克隆的过程没有体现动物细胞核的全能性，A错误；过程③选取的胚胎干细胞具有细胞体积小、细胞核大、核仁明显等特点，且具有(发育的)全能性，B正确；鼠皮肤细胞培养与过程②所用的培养液中都需要添加血清等物质，以满足动物细胞培养时细胞所需的营养物质，C正确；核移植的受体细胞是鼠细胞，获得的神经元与该小鼠含相同的核基因，几乎不发生免疫排斥，故过程⑤无需注射免疫抑制剂，D错误。
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生物技术与工程
第16讲　微生物培养技术与发酵工程
核心考点2　微生物的培养技术及应用
内容索引
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核 心 串 讲
1 培养基的分类和制备
(1) 培养基的种类和用途
划分标准 培养基的种类 特点 应用
物理性质 液体培养基 不加凝固剂 工业生产
半固体培养基 加凝固剂，如琼脂 观察微生物的运动、鉴定
固体培养基 对微生物分离、鉴定、计数等
化学成分 天然培养基 含化学成分不明确的天然物质 工业生产
合成培养基 培养基成分明确(用化学成分已知的化学物质配制) 分类、鉴定
半合成培养基 培养基成分有已明确的，也有天然成分 /
划分标准 培养基的种类 特点 应用
用途 基础培养基 含有野生型微生物所需的所有营养物质 用于野生型微生物的培养
选择培养基 培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长 培养、分离出特定微生物(如以尿素为唯一氮源的培养基筛选出能分解尿素的微生物)
鉴别培养基 根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品 鉴别不同种类的微生物，如分解尿素的细菌可使添加酚红指示剂的培养基变红，纤维素分解菌可在含有刚果红的培养基上长出周围存在透明圈的菌落
(2) 选择培养基四种常见的制备方法
①加入某些特定的物质(前提是培养基具备全部营养成分)
②改变培养基的营养成分
③利用培养基“特定化学成分”分离
④通过某些“特殊环境”分离
(3) 鉴别培养基的常见制备方法
加入某种特殊的化学物质，这种物质会与某种微生物的代谢物发生反应，产生明显的特征性变化，根据这种特征性变化，就可将该种微生物与其他微生物区分开来。实例如下：
名称 主要用途 主要化学物质 特征性变化
伊红—亚甲蓝琼脂培养基 鉴别大肠杆菌 伊红、亚甲蓝 出现带金属光泽的深紫色菌落
刚果红培养基 鉴别纤维素分解菌 刚果红、纤维素 纤维素被分解后出现透明圈
名称 主要用途 主要化学物质 特征性变化
脂肪培养基 鉴别产脂肪酶菌株 食用油、中性红指示剂 由淡红色变成深红色
淀粉培养基 鉴别产淀粉酶菌株 可溶性淀粉 淀粉水解程度不同，滴加碘液出现不同颜色变化
2 微生物培养中的无菌操作技术
(1) 3种常用消毒方法——煮沸消毒法、巴氏消毒法及化学药剂消毒法。
(2) 3种常用灭菌方法
①灼烧灭菌——微生物的接种工具，如接种环、接种针等金属器具。
②干热灭菌——耐高温的和需要保持干燥的物品，如玻璃器皿等。
③高压蒸汽灭菌——主要针对培养基等。
3 培养基制备与微生物纯化技术
【注意】为了确定培养基的灭菌是否合格，微生物实验一般会设置空白对照：随机取若干个灭菌后的空白平板培养基在适宜条件下培养一段时间，观察培养基上是否有菌落生成。
名 卷 优 选
　　　[2025江苏卷·11]从种植草莓的土壤中分离致病菌，简易流程如下：制备土壤悬液、分离、纯化、鉴定。下列相关叙述正确的是(　　)
A. 制备的培养基可用紫外线照射进行灭菌
B. 将土样加入无菌水混匀，梯度稀释后取悬液加入平板并涂布
C. 连续划线时，接上次划线的起始端开始划线
D. 鉴定后的致病菌，可接种在斜面培养基上，并在室温下长期保存
1
B
【解析】 培养基需用高压蒸汽灭菌法灭菌，紫外线仅用于表面或空气消毒，无法用于培养基灭菌，A错误；将土样加入无菌水制成悬液，经梯度稀释后，取各稀释度菌液涂布于培养基表面，分离并计数，B正确；连续划线时，每次应从上次划线的末端开始，以逐步稀释菌体，若从起始端开始无法有效分离单菌落，C错误；斜面培养基保存菌种可置于4 ℃短期保存，或甘油管藏法(－20 ℃)长期保存，室温下无法长期保存，D错误。
　　　[2023江苏卷·7]下列关于细菌和酵母菌实验的叙述，正确的是(　　)
A. 通常酵母菌培养基比细菌培养基有更高的碳氮比
B. 通常细菌的生长速度比酵母菌快，菌落比酵母菌落大
C. 通常细菌培养基用高压蒸汽灭菌法灭菌，酵母菌培养基用过滤除菌法除菌
D. 血细胞计数板既可用于酵母菌的数量测定，也可用于细菌的数量测定
2
A
【解析】 常用的酵母菌培养基是用马铃薯和葡萄糖配制而成的，一般不添加专门的氮源，而细菌常用的培养基是牛肉膏蛋白胨培养基，故通常酵母菌培养基比细菌培养基有更高的碳氮比，A正确；通常细菌的生长速度比酵母菌快，但形成的菌落不一定大于酵母菌的，与细菌的种类有关，部分细菌的菌落小于酵母菌的，B错误；通常细菌和酵母菌的培养基都可以用高压蒸汽灭菌法灭菌，C错误；血细胞计数板适用于真菌的计数，细菌计数板用于细菌的数量测定等，D错误。
　　　[2022江苏卷·3]下列关于某同学分离高产脲酶菌的实验设计，不合理的是(　　)
A. 选择农田或公园土壤作为样品分离目的菌株
B. 在选择培养基中需添加尿素作为唯一氮源
C. 适当稀释样品是为了在平板上形成单菌落
D. 可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌
3
D
【解析】 农田或公园土壤中含有较多的含脲酶的微生物，A正确；为了筛选可分解尿素的细菌，配置的培养基应选择尿素作为唯一氮源，含脲酶的微生物在该培养基上能生长，B正确；当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，C正确；在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红，因此在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，能对分离的菌种做进一步鉴定，D错误。
1[2025泰州中学期末]某同学进行了下面的实验：将5个手指尖在贴有“洗手前”标签的培养基上轻按一下，用肥皂洗手后再在贴有“洗手后”的培养基上进行相同操作，将这两个培养基置于恒温箱中培养24 h，结果贴有“洗手后”标签的培养基菌落较少。下列相关叙述正确的是(　　)
A. “指尖在培养基上轻按”和“肥皂洗手”分别相当于微生物培养中的接种和灭菌过程
B. 两个培养基均可在表面形成单个的菌落，且具有相同的形状、颜色和隆起程度
C. 恒温箱设置为37 ℃较为适宜，且需同时放入未接种的空白培养基同时进行培养
D. 该实验结果说明，养成良好的洗手习惯和正确佩戴口罩有利于传染病的防控
C
【解析】 “肥皂洗手”相当于消毒而不是灭菌，A错误；由于洗手前后手上的细菌已存在差异，故两个培养基表面形成的菌落状况不同，B错误；人体的体温约37℃，故本实验中培养细菌以37℃较为适宜，为确定培养基是否被污染，需同时放入未接种的空白培养基同时进行培养，C正确；本实验与是否正确佩戴口罩无关，D错误。
2 (多选)[2025宿迁模拟]为筛选出可高效抑制番茄枯萎病菌(一类真菌)的土壤芽孢杆菌菌株，科研人员从土壤中采集、分离、筛选芽孢杆菌菌株作为待测菌株，并采用平板对峙培养法观察各待测菌株的抑菌能力。如图为研究过程示意图，下列叙述正确的有(　　)
A. 过程①常利用涂布器蘸取0.1 mL菌液涂布平板
B. 过程②可根据芽孢杆菌菌落的形态、颜色进行挑选
C. 若甲、乙、丙三个平板的平均菌落数为12个，则10 g土样中芽孢杆菌约有1.2×109个
D. 实验筛选出的菌株仍需进行大田种植试验以检测防治效果
BD
【解析】 过程①常利用移液器移取0.1 mL菌液涂布平板，A错误；每种细菌都有特定的菌落的形态、大小和颜色，所以过程②可根据芽孢杆菌菌落的形态、颜色进行挑选，B正确；若甲、乙、丙三个平板的平均菌落数为12个，平均菌落数是12个不符合30～300的菌落计数要求，C错误；进一步确定菌株的抑菌能力，需要进行大田种植试验，检测防治效果，D正确。
检 测 反 馈
2
4
1
3
1 [2025常州中学期中]在《诗经·邶风·谷风》中有“我有旨蓄，亦以御冬”的记载，“旨蓄”就是储藏的美味食品，包括腌制的酸菜、泡菜。下列叙述正确的是(　　)
A. 制作泡菜时，腌制时间过长会引起细菌大量繁殖
B. 条件适宜时，蔬菜中的糖转化成醋酸，降低溶液pH
C. 发酵坛表面可能出现一层由乳酸菌繁殖形成的白膜
D. 通过向泡菜坛沿边水槽注水可保持发酵所需的环境
D
2
4
1
3
【解析】 温度过高、食盐用量过低、腌制时间过短，容易造成细菌大量繁殖，亚硝酸盐含量增加，A错误；条件适宜时，乳酸菌可将蔬菜汁中的糖分解成乳酸，B错误；乳酸菌是厌氧型生物，发酵坛表面含有氧气，乳酸菌不能繁殖，出现的白膜一般是酵母菌繁殖所致，C错误；乳酸菌需要在无氧环境下将葡萄糖分解为乳酸，故腌制泡菜时可通过向泡菜坛沿边水槽注水保持发酵所需环境，D正确。
2
4
1
3
2 [2025扬州模拟]科研人员利用桤叶唐棣和蓝莓混合制作果醋，其主要流程为桤叶唐棣、蓝莓→清洗破碎→酶解→过滤→混合→成分调整→灭菌→酒精发酵→酒液→醋酸发酵→过滤→陈酿→澄清→消毒→成品。下图分别表示初始糖度对酒精发酵的影响和醋酸菌接种量对总酸的影响，下列有关叙述正确的是(　　)
A. 酶解过程加入纤维素酶和果胶酶有利于提高出汁率
B. 酒精发酵和醋酸发酵过程的温度设置不同，其他发酵条件均相同
C. 初始糖度越高，为酵母菌提供的营养越多，越有利于酒精发酵
D. 随着醋酸菌接种量的增大，醋酸菌的产酸量增加
A
2
4
1
3
【解析】 酶解过程主要加入的是纤维素酶和果胶酶，水解植物细胞的细胞壁，有利于细胞膜破裂提高出汁率，A正确；酒精发酵为无氧环境，温度通常为18～30℃，而醋酸发酵过程中需要通入氧气，温度控制为30～35℃，B错误；结合图示可知，在一定范围内，初始糖度越高，为酵母菌提供的营养越多，越有利于酒精发酵，但高于图中的18%，则酒精度反而有所下降，C错误；结合图示可知，在醋酸接种量在12%～15%之间时，随着醋酸菌接种量的增大，醋酸菌的产酸量减少，D错误。
2
4
3
1
3(多选)[2025徐州期末]某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病，其筛选流程及抗性检测如图。下列操作正确的有(　　)
A. 在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内，从感病植株上采集样品
B. 将采集的样品充分消毒后，用蒸馏水冲洗，收集冲洗液进行无菌检测
C. 将无菌检测合格的样品研磨，经稀释涂布平板法分离得到内生菌的单菌落
D. 判断内生菌的抗性效果需比较有无接种内生菌的平板上的病原菌菌斑大小
CD
2
4
3
1
【解析】 由题干信息“某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病”可知，在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内，从未感病植株上采集样品，A错误；获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染，将采集的样品充分消毒后，用无菌水冲洗，收集冲洗液进行无菌检测，B错误；由题图可知，样品研磨后进行了稀释涂布，可见将无菌检测合格的样品研磨，经稀释涂布平板法分离得到内生菌的单菌落，C正确；由题图抗性检测可知，判断内生菌的抗性效果需设置对照组和实验组，对照组不接种内生菌得到病原菌菌斑，实验组接种内生菌得到病原菌菌斑，然后比较对照组和实验组的菌斑大小，实验组病原菌菌斑越小表明内生菌抗性效果越好，D正确。
2
4
3
1
4[2025泰州期末]杨梅具有很高的营养价值，其鲜果也是酿酒的良好材料。发酵型果酒品质取决于所选择的酵母性能。科研人员为挖掘某杨梅主产区的酵母资源，筛选出酒精转化率高、酒精耐受性强的优质杨梅酿酒酵母，进行的研究如图所示。请回答下列问题。
2
4
3
1
(1) 图中过程②③④⑤所用培养基为适于酵母菌生长的YPD培养基，其成分包括1%酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖等，其中能提供的氮源的有__________________，与过程②所用培养基相比，过程③所用培养基中还添加了________(填成分)。
酵母膏和蛋白胨
琼脂
2
4
3
1
(2) 过程③梯度稀释时，先分别向A、B、C三支试管中加入________ _______，再依次加入酵母菌培养液的上清液或稀释液1 mL，摇匀，进行10倍的梯度稀释。取多种稀释倍数的酵母菌培养液0.1 mL分别接种到多个平板上，这样做的目的有_____________________________________ ________________________；甲、乙研究员在105稀释倍数下操作和得到的结果为：甲涂布4个平板，统计的菌落数分别是150、178、259、310；乙涂布4个平板，统计的菌落数分别是152、161、179、188，则1 mL培养液中含有的酵母菌数量可能为____________。
(3) 过程④中接种环灼烧灭菌的次数为______，划线后将培养皿________，放入恒温培养箱中培养。
9 mL无
菌水
为了获得菌落数量合适的平板，并且排除偶然因素造成的误差
1.7×108
6
倒置
2
4
3
1
(4) 分离获得的酵母菌还需经过多级筛选才能获取到理想菌株。科研人员利用DY5、RY5、JW14三种菌株，发酵制作杨梅酒，并进行酒精耐受性检测，结果如下表、图所示，三种菌株中，最适于杨梅果酒发酵的是_______，理由有______________________________。
菌株 名称 酒精度/% 总糖/(g·L－1) 总酸/(g·L－1)
DY5 7.0 34.23 12.045
RY1 9.0 15.01 12.675
JW14 6.5 33.64 12.099
杨梅汁 － 78.80 10.737
RY1
酒精转化率高、酒精耐受力高
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专题八
生物技术与工程
素养提升6　科学思维之基因工程中的PCR
内容索引
素养概述
好题优选
素 养 概 述
科学思维是指在学习生物学过程中形成的基于科学方法论和逻辑推理的思维能力，旨在理解生命现象的本质及分析问题并作出合理判断。高中生物学课程的科学思维有归纳与演绎、模型与建模、批判性思维、逻辑推理、系统分析、科学论证等核心和维度。
好 题 优 选
1 归纳与演绎[2025盐城中学模拟]基因定点突变是指按照特定的要求，使基因的特定序列发生插入、删除、置换、重排等变异。下图是一种PCR介导的基因定点突变示意图，请回答下列问题。
(1) 进行基因定点突变的PCR反应体系中，除加入引物和模板DNA外，一般还需要加入___________________________________________；如图所示的基因定点突变技术需要______次PCR；获得产物A需要的引物是__________________。
(2) 研究人员对PCR的中间产物A、B进行纯化后，利用图中相关酶对基因M和产物A、B进行充分酶切后得到不同的片段，长度(kb)如下表，则图中基因敲除片段的长度为________________，基因M1的长度为___________。
项目 基因M A B
长度 3.24、2.8、0.15、0.13 2.8、0.09 3.24、0.05
Taq DNA聚合酶、dNTP(缓冲液、Mg2＋)等
3
引物1和引物3
0.23 kb
6.09 kb
【解析】 (1) 从图分析可知，从加入引物到获得基因M1总共经历了3次PCR。产物A的两端互补的引物是引物1和3。(2) 基因M上有3个酶切位点(箭头处)，完全酶切产生4个片段，分别为3.24 kb、2.8 kb、0.15 kb、0.13 kb，共6.32 kb，A片段酶切后产生2个片段，分别为2.8 kb、0.09 kb，B片段酶切后产生2个片段，分别为3.24 kb、0.05 kb，图中A片段和B片段的“……”是相同的，因此“……”处为0.05 kb，则基因M1的长度为2.8＋0.05＋3.24＝6.09(kb)，因此基因敲除片段的长度为6.32－6.09＝0.23(kb)。
2 模型与建构[2025淮安中学模拟]水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图。
注：图中的引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点。
(1) 由以上事例可知，要对蛋白质的结构进行改造，需要通过______ _________________________来完成。
(2) 若拟突变位点的碱基对为A—T，则需要让其突变为___________ ________才能达到目的。引物2的突变位点(突起处)应设计为__________ (假设引物为单链DNA)。
(3) 在第一阶段获得2种具有重叠片段DNA的过程中，引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制，共产生______种DNA分子。该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中，这是因为_____________________________________________ _________________________________。
改造
基因(基因定点突变)
T—A或
C—G
A或G
3
引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时它们会发生结合而失去作用
(4) 利用重叠延伸PCR技术还可以将两个不同来源的DNA片段拼接起来。有人想利用该技术把基因M和N拼接在一起，设计基因M的引物M1、M2，基因N的引物N1、N2。在设计这4种引物时，特别要注意的问题为___________________________________________________________ ________________。
M1、M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段
【解析】 (2) 若天冬酰胺密码子AAU对应基因的模板链中的碱基为TTA，赖氨酸密码子AAA对应基因的模板链中的碱基为TTT，因此将A—T突变为T—A，则可以得到TTT基因序列，从而转录出的RNA编码赖氨酸；若天冬酰胺密码子AAC对应基因的模板链中的碱基为TTG，赖氨酸密码子AAG对应基因为TTC，因此将G—C突变为C—G，则可以得到TTC基因序列，从而转录出的RNA编码赖氨酸。假设引物为单链DNA，引物2突变由于A—T突变成了T—A或者C—G，则原本A碱基(突变后的T或C碱基)所对应的引物2突起处应为A或G碱基。(3) 若两个反应系统均进行一次复制，则会产生三种不同的DNA分子，因为引物1和4产生的DNA分子是一样的。(4) 重叠互补引物的设计是重叠延伸PCR技术成功的关键。链接基因M和N时，引物设计需要注意的是，需要找到两种基因的重叠部分，即M1、M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段方便设计重叠引物。
3 逻辑推理[2025南京中华中学模拟]大引物PCR定点突变常用于研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变需要通过PCR获得，其过程如图所示。下列有关分析正确的是(　　)
A. 向PCR体系中加入Mg2＋的作用是维持体系的渗透压
B. PCR－Ⅰ经过一次循环即可获得大引物模板
C. PCR－Ⅰ得到的产物均作为PCR－Ⅱ的引物
D. PCR－Ⅱ选用大引物和引物乙以获得定点诱变的基因片段
D
【解析】 与重叠延伸PCR不同的是，大引物PCR只需要两轮PCR即可获得突变DNA。技术流程如图所示：第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。该技术的优点是目的性强、突变概率高。PCR反应缓冲液中一般要添加　Mg2＋，Mg2＋的作用是激活DNA聚合酶，A错误；大引物模板需要以含有诱变引物和引物甲的模板链复制获得，故PCR－Ⅰ至少经过两次循环，才能获得大引物模板，B错误；PCR－Ⅰ会得到多个产物如含原模
板链的不能全部作为PCR－Ⅱ的引物，只有含有诱变引物和引物甲的模板链复制获得的产物才能作为PCR－Ⅱ的引物，C错误；大引物中有定点诱变碱基，且大引物延伸方向由5′→3′，扩增一次可得到定点诱变的基因片段。PCR技术每扩增一次，要一对引物，引物乙与大引物结合的模板不同。因此，PCR－Ⅱ选用大引物和引物乙以获得定点诱变的基因片段，D正确。
4 系统分析[2025苏州中学模拟]酵母细胞基因转录需要转录因子，转录因子包括DNA结合功能域(DNA－BD)和转录激活结构域(DNA－AD)，两结构域分开时不能激活转录。如果将待测蛋白质X与DNA－BD融合，蛋白质Y与DNA－AD融合，蛋白质X和Y有相互作用时，两结构域能重新呈现完整转录因子活性，并可激活报告基因的转录，过程如图1所示。已知报告基因LacZ表达的酶可以将无色化合物X－gal水解成蓝色产物。研究人员为了验证蛋白质X和Y是否具有相互作用，分别构建不同的酵母表达载体(如图2和图3所示)，其中Ampr为氨苄青霉素(抑制细菌细胞壁的形成)抗性基因，HIS3和TRPⅠ分别为控制组氨酸和色氨酸合成的基因。请回答下列问题。
图4　巢式PCR的工作原理示意图
(1) 研究小组采用了巢式PCR技术获取蛋白质X和Y基因的编码区序列，技术原理是利用两套PCR引物进行两轮PCR扩增(如图4所示)，首先利用第一对引物(外引物)对目的基因所在DNA进行15～30个循环的扩增；第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板，利用第二对引物(内引物或巢式引物)进行15～30个循环扩增。相比于常规PCR获得的产物而言，巢式PCR获得的产物特异性______(“强”或“弱”)，原因是_____________　___________________________________________________________________________________。
强
如果利用外引物扩增产生了错误片段，再利用内引物扩增在错误片段上进行引物配对并扩增的概率低
(2) 研究人员的主要技术路线如下表所示，请完善下表。
实验目的 方法步骤要点(部分)
获取X和Y基因的编码区序列 巢式PCR扩增蛋白质Y编码区序列时需在两个①______(填“内”“外”或“内和外”)引物的5′端分别添加序列②______________________；为验证目的基因在PCR扩增时是否发生了基因突变，可对PCR产物进行③_____________。
内
GAATTC和CTCGAG
DNA测序
【解析】 (1) 巢式PCR通过两轮PCR反应，使用两套引物扩增特异性的DNA片段，第二对引物的功能是特异性的扩增位于首轮PCR产物内的一段DNA片段。第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增，从而提高反应的特异性，获得的产物特异性更强，如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。(2) 据图可知，pB42AD中目的基因的两端是GAATTC和CTCGAG序列，因此巢式PCR扩增蛋白质Y编码区序列时需在两个内引物的5′端分别添加序列GAATTC和CTCGAG。PCR扩增时是否发生了基因突变(判断基因中是否发生碱基对的增添、缺失或者替换)，可对PCR产物进DNA测序。
5 模型与建构[2025南通通州中学模拟]实时荧光定量PCR简称qPCR，灵敏度高特异性好，是目前检测微小残留病变的常用方法。将荧光标记的Taqman探针与待测样本DNA混合，当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被Taq DNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到在特定光激发下发出荧光(如图所示)，随着循环次数的增加，荧光信号强度增加，通过实时检测荧光信号强度，可得Ct值(该值与待测样本中目的基因的个数呈负相关)。下列相关叙述错误的是(　　)
D
注：R表示荧光基因，Q表示淬灭基因
A. 每个模板DNA分子含有2个游离的磷酸基团
B. 在反应过程中，无需ATP为新链的合成提供能量
C. 做qPCR之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成引物和Taq man探针
D. 荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明含有的病变的概率越小
【解析】 DNA分子为反向平行的两条链，每条链都含有一个游离的磷酸基团，则一个DNA分子含有2个游离的磷酸基团，A正确；在反应过程中，dNTP为新链的合成提供能量，无需ATP，B正确；做qPCR之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成1对引物和1种Taq man探针，C正确；若荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明更多的荧光探针与目的基因进行了碱基互补配对，可推测获得的核酸产物中含有的病变的概率越大，D错误。
6 批判性思维[2025南通中学模拟]IKK激酶由IKKα、IKKβ和IKKγ三种亚基组成，该酶参与动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷(SCID)患儿IKKB基因编码区第1183位碱基T突变为C，导致IKKβ上第395位酪氨酸被组氨酸代替。为研究该患儿发病机制，研究人员应用大引物PCR定点诱变技术获得突变基因，主要过程如图所示。分析并回答下列相关问题。
定点诱变获得突变基因
在获取突变基因过程中，需要以下3种引物：
引物A：5′—CCCCAACCGGAAAGTGTCA—3′
(下划线字母为突变碱基)
引物B：5′—TAAGCTTCGAACATCCTA—3′
(下划线部分为限制酶HindⅢ识别序列)
引物C：5′—GTGAGCTCGCTGCCCCAA—3′
(下划线部分为限制酶SacⅠ识别序列)
则PCR1中使用的引物有__________________，PCR2中使用的引物有__________和图中大引物的______(填“①”或“②”)链。
引物A和引物C
引物B
②
【解析】 分析题图可知，在PCR1中，需要两种引物，将来在切取IKKB基因时，需要在基因的左侧用限制酶HindⅢ来切割，在基因的右侧用限制酶SacⅠ来切割，因此在该基因的左端应有限制酶HindⅢ识别的序列，在基因的右端应有限制酶SacⅠ识别的序列，因此在PCR1中结合到基因右端的引物序列从5′到3′端的开始部位应含有限制酶SacⅠ识别的序列，所以要用到引物C，从题图中看，另一个引物从5′到3′端的序列中开始部位应含有突变碱基C，所以要用到引物A。从图中看，在PCR2中，有一个引物结合到了基因的左端，在它从5′到3′的序列的开始部位应含有限制酶HindⅢ识别的序列，所以要用到引物B，而另外的一个引物就是大引物中的一条链，它应该结合到基因的右端，且从5′到3′端的序列中开始部位应含有SacⅠ识别的序列，从图中看，它是大引物的②链。
7 逻辑推理[2025南通如东中学模拟]巢式PCR是指先后用外内引物扩增目的基因的方法。其原理为：先以比目的基因大的DNA片段为模板，用外引物(F1，R1)进行扩增，获得大量含目的基因的中间产物，再以扩增后的中间产物为模板，用内引物(F2，R2)扩增目的基因，如图所示。下列说法错误的是(　　)
A. 两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段
B. 第二轮PCR反应能否进行，是对第一轮PCR反应正确性的鉴定
C. 由于和两套引物都互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性
D. 如果两套引物一起加入反应体系中，外引物的复性温度应显著低于内引物
巢式PCR工作原理示意图
D
【解析】 两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段，以便与模板互补配对，A正确；第二轮PCR使内侧引物以第一轮PCR产物为模板进行再次扩增，第二轮PCR反应能否进行，是对第一轮PCR反应正确性的鉴定，B正确；由于和两套引物同时都互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性，将需要的目的基因扩增出来，C正确；如果两套引物一起加入反应体系中，外引物复性温度要明显高于内引物，使外引物先进行反应，D错误。
8 科学论证[2025南通如皋中学模拟]目前检测HIV病毒RNA最有效的方法是实时荧光RT－PCR(RT－qPCR)，该方法检测一个样品需要超过60分钟。图1为以cDNA为模板进行实时荧光PCR的示意图。请回答下列问题。
图1　　　　　　　　　　　　图2
(1) RT时，需从样本中提取病毒RNA，经_____________酶作用生成cDNA。
(2) PCR时，需加入荧光染料(如中的SYBR Green Ⅰ)。进行阶段2时，引物与cDNA按照________________原则进行特异性结合。进行阶段③时，_________________________________酶催化子链的合成。
逆转录
碱基互补配对
热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)
(3) 科研人员通过实时荧光RT－PCR检测病毒RNA时，荧光强度的变化如图2所示。
①平台期目的基因的数量几乎不再增长，原因可能是_____________ _______________________________________________。
②Ct值的含义是在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct值就________。
③病毒核酸检测说明书标明，Ct≤37判定为阳性，Ct>40或无Ct值判定为阴性。图2所示病毒核酸检测结果应判定为________。
越小
引物浓度下降、Taq酶的活性下降、原料dNTP浓度下降
阳性
(4) 科研人员又发明了一种无逆转录—指数扩增反应技术(RTF－EXPAR)，该技术可在10分钟内准确检测到低浓度HIV病毒RNA，反应机理如图3所示。研究人员设计的“结合DNA－X”含有切口酶识别位点以及与病毒基因组的保守基因Orflab的互补序列。若样本中存在该病毒，在切口酶的作用下生成的“触发DNA－X”可与两个重复序列(X′和X′)结合，该重复序列以切口酶识别序列分隔。
图3
①模板链X′—X′的序列如下：
5′—GGTATTTGGTTTACCCTGTGAGACTCTGGTATTTGGTT TACCCT—3′,其中的5′—GACTC—3′是切口酶特异性识别的序列,切口酶从其后4个碱基处将“触发DNA—X”延伸的DNA链切断，切口酶切开的是_________键。“触发DNA—X”的序列是5′—_____________ _______________—3′。
磷酸二酯
AGGGTAAA
CCAAATACC
②RTF－EXPAR比RT－qPCR更快速地检测病毒RNA的原因有____________________________________________________________________________________。
③尽管RTF－EXPAR在核酸检测的速度方面有优势，但仍存在一些局限性，例如由于模板是对称的，扩增过程中_______________________ _______________________，导致扩增效率降低。
避免耗时的逆转录步骤、避免了耗时的加热和冷却步骤、扩增的链相比RT－qPCR更小
触发DNA－X不可避免地与模板的5′端杂交
【解析】 (1) 由病毒RNA生成cDNA的过程属于逆转录，需要逆转录酶的催化。(2) PCR是一项根据DNA半保留复制原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，因此进行阶段②时，引物与cDNA按照碱基互补配对原则进行特异性结合。在PCR循环的③延伸阶段，Taq酶催化子链的合成。(3) 平台期目的基因的数量几乎不再增长，有可能是引物浓度下降、Taq酶的活性下降、原料dNTP浓度下降导致的。样本中初始模板越多时，达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数就越小，Ct值就越低。据图2可知病毒核酸检测结果应判定为阳性。(4) 根据题意可知，切口酶是
将DNA链切断，因此该酶破坏的是磷酸二酯键，根据题意可知5′—GACTC—3′是切口酶特异性识别的序列，切口酶从其后4个碱基处将“触发DNA－X”延伸的DNA链切断，所以可推测“触发DNA－X”的序列是5′—AGGGTAAACCAAATACC—3′。据图可知RTF－EXPAR的过程避免耗时的逆转录步骤、避免了耗时的加热和冷却步骤、扩增的链相比RT－qPCR更小，因此RTF－EXPAR比RT－qPCR能更快速地检测病毒RNA。RTF－EXPAR在核酸检测的速度方面有优势，但仍存在一些局限性，例如由于模板是对称的，扩增过程中触发DNA－X不可避免地与模板的5′端杂交，导致扩增效率低。
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专题八
生物技术与工程
第18讲　基因工程与蛋白质工程
内容索引
核心串讲
名卷优选
体系建构
基础回归
基 础 回 归
1判断下列说法是否正确。
(1) 切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。______
(2) 载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因。______
(3) 外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。______
(4) 表达载体的复制和目的基因的表达均启动于复制原点。______
(5) 以蛋白质的氨基酸序列为依据合成的目的基因与原基因的碱基序列相同。______
(6) 启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用。______
×
×
×
×
×
×
(7) 借助基因表达载体中的抗生素抗性基因可将导入了胰岛素基因的受体细胞筛选出来。______
(8) 表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA逆转录获得。______
(9) 抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上，也未必能正常表达。______
(10) 若转基因植物的外源基因来源于自然界，则不会存在安全性问题。______
(11) 转基因生物可能会破坏生态平衡。______
√
×
√
×
√
(12) 生殖性克隆人破坏了人类基因多样性的天然属性，不利于人类的生存和进化。______
(13) 天花病毒、波特淋菌、霍乱弧菌和炭疽杆菌都可以用来制造生物武器。______
(14) 生物武器可通过吸入、误食、接触带菌物品以及被带菌昆虫叮咬等侵入人体。______
(15) 通过转基因技术生产药物只是转基因微生物方面的应用。_____
√
√
√
×
2合成有生物活性的胰岛素，为什么受体细胞最好用单细胞真核生物？___________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________。
3自然界中生物的DNA复制和人工合成中的多聚酶链式反应(PCR)为什么需要引物？_________________________________________________ ______________________________________________________。
胰岛素是分泌蛋白，形成成熟的胰岛素需要内质网、高尔基体的加工、分泌，故最好选用真核生物如酵母菌作受体细胞，同时也便于从培养液中分离目的基因的表达产物
在DNA合成时，DNA聚合酶只能将游离的脱氧核苷酸连接到已有片段的3′端来合成子链(延伸方向是5′→3′)
体 系 建 构
核心考点1　基因工程的基本理论
核 心 串 讲
1 基因工程的三大操作工具
工具 限制性内切核酸酶 DNA连接酶 载体
作用 切割目的基因和载体 拼接DNA片段，形成重组DNA分子 携带目的基因进入受体细胞
作用 特点 识别特定的核苷酸序列； 在特定位点上切割DNA分子 能连接黏性末端和平末端 能在宿主细胞内稳定存在并大量复制；
有一个至多个限制酶切割位点；
具有特殊的标记基因
2 PCR技术
(1) PCR引物的设计原则
①引物长度要适宜，一般引物的长度为15～23 bp。过长会导致其延伸温度大于74 ℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应；引物过短特异性差，可导致引物与模板链随机结合。
②引物内部应避免自身互补。引物自身不能有连续4个碱基的互补，以免形成发夹状结构(如图)，这种结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。
③引物之间应避免互补。引物之间不能有连续4个碱基的互补，尤其应避免3′端的互补重叠以防形成引物二聚体(如图所示)。
(2) 引物的特异性和修饰
①引物的特异性是指针对目标DNA片段设计出来的引物只能扩增出此目标DNA片段，而不能扩增出其他DNA片段。
②引物的修饰：因为引物的延伸是从3′端开始的，所以引物的3′端不能进行任何修饰。引物的5′端可以修饰，包括添加酶切位点、引入启动子序列、插入突变序列等。
(3) 引物的数量计算
如图：一个DNA分子n次扩增，则：
①子代DNA分子中等长链的DNA分子数为2n－2n个；
②子代DNA分子中不等长链的DNA分子数为2n个；
③子代DNA分子中含模板链DNA分子数为2个；
④子代DNA分子中含引物A(或B)的DNA分子数为2n－1个；
⑤复制过程中共需引物2n＋1－2个；
⑥第n次复制需要引物2n个。
注意：已知引物1及引物2之间的序列为目的序列，若引物与DNA的结合位点如图所示，在第2轮循环产物中开始出现两条单链等长的目的片段。
3 PCR操作中温度的控制
变性：双链DNA模板的变性温度由其(G＋C)含量来决定，模板DNA的(G＋C)含量越高，变性温度也越高。
复性：复性过程采取的温度至关重要，复性温度过高，引物不能与模板很好地复性，扩增效率很低。复性温度太低，引物将产生非特异复性，导致非特异性的DNA片段的扩增。
延伸：在热稳定DNA聚合酶的最适温度下进行，对于Taq DNA聚合酶最适的温度一般为72～78 ℃。
4 基因表达载体
名 卷 优 选
　　　[2024江苏卷·9]酵母菌是基因工程中常用的表达系统。下列相关叙述正确的是(　　)
A. 酵母菌培养液使用前要灭活所有细菌，但不能灭活真菌
B. 酵母菌是真核细胞，需放置在CO2培养箱中进行培养
C. 可用稀释涂布平板法对酵母菌计数
D. 该表达系统不能对合成的蛋白质进行加工和修饰
1
C
【解析】 酵母菌培养液使用前要灭活所有细菌和真菌，A错误；将含有酵母菌的培养基放置在28 ℃恒温培养箱中进行培养，B错误；稀释涂布平板法常用来统计样品中活菌的数目，当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌，由此可知，可用稀释涂布平板法对酵母菌计数，C正确；酵母菌是真核细胞，具有高尔基体和内质网，可以对合成的蛋白质进行加工和修饰，D错误。
A. 基因A突变为a是一种碱基增添的突变
B. 用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末端类型不同
C. 用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小一致
D. 产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定
2
BD
【解析】 比较A基因和a基因的序列，A基因中间的碱基序列“AAGCTT”变为a基因相应位置中“AAGCTG”，即碱基对T—A被G—C替换，并非碱基增添，A错误；HindⅢ切割产生黏性末端，AluⅠ切割后产生的是平末端，二者末端类型不同，B正确；图示a基因中有2个HindⅢ切割位点，AluⅠ有3个切割位点(中间的碱基序列也被切割)，因此，用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小不一致，C错误；正常基因A和致病基因a的HindⅢ切割位点不同(分别有3个、2个)，HindⅢ切割基因A和致病基因a后DNA片段大小不同，所以产前诊断时，该致病基因可选HindⅢ限制酶开展酶切鉴定，D正确。
　　　(多选)[2014江苏卷·23]下列关于基因工程技术的叙述，错误的有(　　　)
A. 切割质粒的限制酶均特异性地识别6个核苷酸序列
B. PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应
C. 载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因
D. 抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达
3
ABC
【解析】 大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成，A错误；PCR中温度的周期性改变是因为不同反应步骤需要不同的温度，如高温解旋，低温复性，中温延伸，B错误；载体质粒通常采用抗生素抗性基因作为标记基因，C错误；外源基因导入受体细胞染色体上后未必能正常表达，D正确。
1[2025南通海安中学模拟]荧光原位杂交可用荧光标记的特异DNA片段为探针，与染色体上对应的DNA片段结合，从而将特定的基因在染色体上定位。下列叙述正确的是(　　)
图1　　　　　　　　　　　　　　图2
D
A. 图1中的DNA酶Ⅰ是一种随机性的外切核酸酶
B. DNA酶Ⅰ随机切割后产生的缺口由DNA聚合酶Ⅰ从5′端不断延伸补齐
C. 图2中的两条姐妹染色单体最多会有2条荧光标记的DNA片段
D. 该技术可用于21三体综合征和猫叫综合征的诊断
【解析】 观察图1可知，DNA酶Ⅰ作用后将DNA切割成片段，但它不是外切核酸酶(外切核酸酶是从核酸链的一端逐个水解下核苷酸)，而是一种可以随机切割DNA的内切核酸酶，A错误；从图1看到，DNA酶Ⅰ随机切割后，DNA聚合酶Ⅰ是从3′端不断延伸补齐缺口，而不是从5′端，B错误；图中两条姐妹染色单体中含有2个DNA分子共有4条链，所以最多可有4条荧光标记的DNA片段，C错误；21三体综合征是染色体数目变异(多了一条21号染色体，基因数量增多)，猫叫综合征是染色体结构变异(5号染色体部分缺失，基因数量减少)，该技术是将特定基因在染色体上定位，可用于21三体综合征和猫叫综合征的诊断，D正确。
2(多选)[2025盐城射阳中学模拟]用A和B两种限制酶同时和分别处理同一DNA片段，假设限制酶对应切点一定能切开。两种酶切位点及酶切产物电泳分离结果如图1和图2所示。下列叙述正确的有(　　　)
A. 用A和B两种限制酶同时处理图中同一DNA片段得到6个游离的磷酸基团
B. 图1中X代表的碱基对数为4 500，Y是限制酶A的酶切位点
C. 凝胶电泳中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子大小和构象等有关
D. 利用PCR技术从DNA中扩增出等长的X片段，至少需要3次循环
BCD
【解析】 图2中三列条带分别对应用A和B两种限制酶同时以及单独使用限制酶A、限制酶B处理DNA片段的酶切产物电泳分离结果，再通过①和②的结果结合图1，分析可知①是单独使用限制酶A处理DNA片段的酶切产物电泳分离结果，②是单独使用限制酶B处理DNA片段的酶切产物电泳分离结果。限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。用A和B两种限制酶同时处理图中同一DNA片段最终得到8个游离的磷酸基团，A错误；结合图1和图2中第一列A＋B酶同时处理的电泳条带结果分析可知，图1中X代表的碱基对数为4 500，根据图2中①电泳分离结果存在3 500 bp长度的条带可知①是单独使用限制酶A处理DNA
片段的酶切产物电泳分离结果，再根据①电泳分离结果存在500 bp长度和6 000 bp长度的条带可知Y是限制酶A的酶切位点，B正确；凝胶电泳中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子大小和构象等有关，C正确；设计引物从图1中完整DNA片段中扩增出完整X，至少需要3次PCR，D正确。
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专题八
生物技术与工程
第18讲　基因工程与蛋白质工程
核心考点2　基因工程的操作流程及应用
内容索引
核心串讲
名卷优选
检测反馈
核 心 串 讲
1限制酶的选取与基因表达载体的构建
(1) 看目的基因：目的基因要切完整。
(2) 看质粒：如图
【注意】检测目的基因是正向连接还是反向连接，一般利用电泳检测目的基因的长度，利用PCR检测目的基因能否正常进行扩增。
2 目的基因导入受体细胞的方法
细胞种类 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法 农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法 显微注射技术 感受态细胞法(Ca2＋处理法)
受体细胞 体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞
3 目的基因的检测与鉴定
4 CRISPR/Cas9基因编辑技术
[原理]由一条单链向导RNA(SgRNA)引导内切核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割(如图)。
[主要功能]CRISPR复合体中的SgRNA的主要功能是与靶向基因(目的基因)上特定碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合，并在特定位点切割DNA。
[优势与应用]CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物，与传统的基因工程相比，其明显优点是避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能等方面有广阔的应用前景。
5 Cre/LoxP重组酶系统
(1) Cre重组酶：由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，具有限制酶特性，能够特异性识别LoxP位点。能介导两个LoxP位点之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。
(2) LoxP序列：来源于P1噬菌体，包括两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的间隔区域，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了LoxP位点的方向。
图1　LoxP序列的结构示意图
(3) ①同向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列，仅保留一个LoxP。
②反向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位。
图2　Cre/LoxP重组酶系统的作用机理示意图
6 In-Fusion技术
In-Fusion技术即无缝克隆和组装技术，是一种新型的、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA片段的插入。
[具体原理]在载体末端和目的基因两端应具有15～25个同源碱基，而目的基因两端的同源序列往往是通过引物设计实现的，In-Fusion酶能够识别具有相同末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端，DNA连接酶再将两条DNA单链黏合起来。
[质粒构建过程]①采用酶切或者PCR扩增方法将载体线性化；②使用设计好的引物进行目的DNA片段的PCR扩增；③反应体系内形成重组质粒。
[与传统酶切、酶连相比的优势]①位点选择灵活，在载体任意位置进行基因克隆；②快速简便；③克隆效率高，阳性克隆高达90%以上；④可同时克隆两个或多个DNA片段。
名 卷 优 选
　　　[2021江苏卷·13]下图是剔除转基因植物中标记基因的一种策略。下列相关叙述错误的是(　　)
1
A. 分别带有目的基因和标记基因的两个质粒，都带有T-DNA序列
B. 该方法建立在高转化频率基础上，标记基因和目的基因需转到不同染色体上
C. 若要获得剔除标记基因的植株，转化植株必须经过有性繁殖阶段遗传重组
D. 获得的无筛选标记转基因植株发生了染色体结构变异
D
【解析】 农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，故分别带有目的基因和标记基因的两个质粒，都带有T－DNA序列，进而成功整合到受体细胞染色体上，A正确；该方法需要利用农杆菌转化法，在高转化频率的基础上，将目的基因和标记基因整合到染色体上，由图可知，标记基因和目的基因位于细胞中不同的染色体上，B正确；通过杂交分离结果可知，经过有性繁殖阶段遗传重组后获得了三种类型细胞，其中包括只含目的基因的、只含标记基因的和既含目的基因又含标记基因的，C正确；获得的无筛选标记转基因植株发生了基因重组，D错误。
　　　[2024江苏卷·23]为了高效纯化超氧化物歧化酶(SOD)，科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达SOD-ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为限制酶a识别序列—(GTTCCTGGTGTTGGC)50—限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题。
2
图1
(1) 步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是________、__________。
(2) 步骤②转化时，科研人员常用_________处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有____________的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是________________。
EcoR Ⅰ
Hind Ⅲ
CaCl2
卡那霉素
S－F和E－R
(3) 步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与__________结合，驱动转录，翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11 kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是______(从图2的“A～D”中选填)。
图2
启动子
C
(4) 步骤④为探寻高效纯化SOD－ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD－ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。
图3
①20 ℃时，加入NaCl后实验结果是____________________________ ______________。
②100 ℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是_______________ _______。
③据图分析，融合表达SOD－ELP50蛋白的优点有_______________ _____________________________________________________________。
SOD－ELP50组纯化蛋白数量更多
高温使蛋白变性
低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持
【解析】 (1) 目的基因应插入启动子和终止子之间，结合题意可知，ELP50应插入pET－SOD之后，由图可知，限制酶a和限制酶b分别是EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ。(2) 将目的基因导入细菌时常用CaCl2处理细菌，使其处于感受态。由图可知，重组DNA含有标记基因卡那霉素抗性基因，所以转化后的大肠杆菌采用含有卡那霉素的培养基进行筛选。成功导入pET－SOD－ELP50同时含有pET－SOD和ELP50，结合图示可知，选引物S－F和E－R可特异性对pET－SOD－ELP50进行扩增。(3) RNA聚合酶与启动子结合后，启动转录。由图可知，决定SOD－ELP50融合蛋白的基因长度为462＋750＝1 212 bp，编码1 212÷3＝404个氨基酸，已
知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11 kDa，融合蛋白的相对分子质量约为404×0.11＝44.44 kDa，电泳后应该为条带C。(4) ①由图可知，20 ℃时，和不加NaCl比较，加入NaCl后纯化蛋白数量更多。②100 ℃时，温度过高，导致蛋白质变性而沉淀。③20 ℃，加入NaCl时，和SOD组比较，SOD－ELP50组沉淀中蛋白质相对含量较高，说明低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持。
　　　[2023江苏卷·22]为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题。
3
图1
(1) 分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有____________________________________，扩增程序中最主要的不同是______________。
(2) 有关基因序列如图2所示。引物F2－F、F1－R应在下列选项中选用__________(填字母)。
图2
A. ATGGTG……CAACCA B. TGGTTG……CACCAT
C. GACGAG……CTGCAG D. CTGCAG……CTCGTC
模板(片段F1、片段F2)、引物
退火的温度
C、D
(3) 将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有________________________。
(4) 转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有__________。
A. 稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落
B. 抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C. 抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D. 抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
限制酶、DNA连接酶
ABC
(5) 为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图3所示。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有______________。
(6) 对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是_______________________________________________ _________________________________________________。
图3
P3、P4
琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列
【解析】 (1) PCR反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg2＋)。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时， 配制的两个反应体系中不同的有模板(片段F1、片段F2)、引物。PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3′端通过碱基互补配对结合。引物不同将导致退火温度不同。(3) 传统重组质粒构建需要使用限制酶切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，由于PCR产物片段和线性质粒载体具有同源序列，可通过重组酶形成环化质粒。不需要使用限制酶和DNA连接酶。(4) 用稀释涂布平板法培养计数时，为了使结果更准确，应选择有30～300菌落数的平
板，若只是为了筛选，可以少于30个，A错误；由于基因工程操作中转化率很低，故抗性平板上未长出菌落的原因一般是未接种到导入质粒的菌体，而接种时培养基已经过冷却处理了，故不可能是培养基温度太高导致抗性平板上未长出菌落，B错误；转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能长出菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误；本题最终需要筛选出的是导入重组质粒的工程菌，而不是仅仅有某种抗生素抗性的菌体，故用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落已选出了导入质粒的菌体，接下来需要用电泳分离出含重组质粒的菌体，故不需再用平板划线法进一步分离纯化，D正确。(5) EGFP为720 bp，AnB1为390 bp，二者的
总长大小为 720＋390＝1 100 bp，用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。(6) 琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。
　　　[2022江苏卷·24]纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。
图1
4
(1) 纤毛结构如图1所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是___________________________ _______________。
(2) 某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是______________。PCR扩增时，需在_________________________________催化下，在引物的________端进行DNA链的延伸，获得的扩增产物用于测序。
参与纺锤体的形成，是纺锤体形成中心
溶解DNA
耐高温DNA聚合酶(Taq酶)
3′
(3) 为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图2所示载体质粒Y，构建Y-M重组质粒(在EcoRⅤ位点插入片段)。请完成下表。
图2　　　　　　　　　　　　　图3
分步实验目标 简易操作、结果、分析
PCR鉴定正向重组质粒Y-M(图2中融合片段M中有白色的箭头，代表方向) ①选择图2引物__________
②PCR目的产物约为__________bp
确保M及连接处序列正确，Y-M的连接处上游含有HindⅢ＋EcoRⅤ的识别序列，下游含有EcoRⅤ＋BamHⅠ的识别序列 ③质粒测序，图3中正确的是_________ (填序列编号)
检测融合蛋白定位 ④对照质粒Y-GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y-M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明_________________ ____________________________
a、b
1 100
Q4
纤毛基部可能有与
蛋白质X特异性结合的物质
(4) 为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经__________形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20(Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的________倍。
逆转录
32
【解析】 (4) 研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经逆转录形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20(Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)，说明病人基因Z表达较弱，设健康人Z基因的cDNA数为x，病人Z基因的cDNA数为y，则有x×215＝y×220，从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的25＝32倍。
[2025常州模拟]hNADC3(人钠/二羧酸协同转运蛋白－3)主要分布于肾脏等重要器官。为进一步研究hNADC3的生理功能，科研人员利用基因工程技术构建了绿色荧光蛋白(GFP)基因与hNADC3基因的融合基因，其过程如图所示。下列相关叙述正确的是(　　)
A. 设计引物的目的是能够从其5′端开始连接脱氧核苷酸
B. 设计引物P1和P2的依据是GFP基因两端的核苷酸序列
C. PCR扩增GFP－hNADC3基因，经过1轮可形成所需的等长片段
D. 杂交链延伸生成GFP－hNADC3融合基因的过程中需要加入引物P1和P4
C
【解析】 DNA复制从子链的5′端→3′端，因此设计引物的目的是能够从其3′端开始连接脱氧核苷酸，A错误；设计引物P1和P2的依据是GFP基因两端的核苷酸序列以及引物P2和引物P3部分核苷酸序列的互补配对，B错误；PCR扩增GFP－hNADC3基因，利用引物P1和P4经过1轮可形成所需的等长片段，C正确；杂交链延伸生成GFP－hNADC3融合基因的过程中，不需要加入引物，两条母链的起始位置的碱基序列即为引物，可以作为子链合成的引物，为DNA聚合酶提供3′端，D错误。
检 测 反 馈
2
1
1[2025扬州模拟]喹诺酮类抗菌药作为广谱抗生素，细菌对其耐药性逐渐增强。基因测序表明耐药大肠杆菌(E. coli)中编码回旋酶的gyrA基因普遍发生突变。为进一步确认大肠杆菌gyrA基因特定位点的突变与喹诺酮类药物耐药性的因果关系，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对大肠杆菌标准株进行定点突变，并对耐药的临床株进行反向突变。部分研究流程及机理如图1、图2所示。请回答下列问题。
2
1
图1
大肠杆菌
图2
2
1
注：①cmR、AmpR、kanR分别为氯霉素、氨苄青霉素、卡那霉抗性基因；②pCRISPR质粒中crRNA区域插入特定寡核酸序列后可产生特定的向导RNA，可与gyrA基因特定位点结合；③pKD46质粒上的exo、bet和gam为编码Red蛋白(重组酶)的基因
(1) 研究表明，临床分离的耐药菌大多发生gyrA基因第248位碱基C突变为T或259位碱基G突变为T，该变异可能导致回旋酶第___________位氨基酸发生改变。
83或87
2
1
(2) 利用CRISPR/Cas9基因编辑系统完成定点突变，研究人员设计了下表序列用于：①对标准gyrA基因第248位碱基突变；②对标准株gyrA基因第259位碱基突变。
编号 序列 用途
g1 插入crRNA 区域的寡核 苷酸序列 (显示双链) 5′—CCATCCCCATGGTGACTCGG—3′ 3′—GGTAGGGGTACCACTGAGCC—5′ ①
g2 5′—TGGTGACTCGGCGGTTTATG—3′ 3′—ACCACTGAGCCGCCAAATAC—5′ ②
A 供应DNA 序列(仅显示单链) 5′—ACCATCCCCATGGTGACTCGGCGGT TTACACGATCGTCCGTATGGCGCAGCCATTC—3′ ？
B 5′—AATCGGTAAATACCATCCCCATGGT GACTTGGCGGTTTATGACACGATCGTCCGTATGG—3′ ？
2
1
表中g1、g2序列需根据_______________________________设计，大量获取这些序列最可能的途径是________________。重组后的pCRISPR质粒进行电转化时，应选用含有__________________质粒的菌株制备感受态细胞。在导入三种质粒的大肠杆菌内，向导RNA和Cas9蛋白复合体的作用是________________________________________。表中供体DNA序列A和B的用途依次是____________________(填“①”或“②”)。
gyrA基因(突变位点附近序列)
人工化学合成
pKD46和pCas9
识别并切割gyrA基因特定位点(定点切割)
②、①(顺序不能反)
2
1
(3) 科研人员根据纸片扩散法对五种菌株进行药敏实验，过程如下：在培养基表面均匀涂布菌液，用无菌镊子取3种喹诺酮类药物(环丙沙星、恩诺沙星、萘啶酸)的药敏纸片贴在琼脂平板表面，此过程的注意点有_____________________________________________________________ ________________________。将药敏平板置于37 ℃恒温培养箱培养18 h后，用电子游标卡尺测量______________________。实验结果如下(其中L和Y分别为标准株gyrA基因248和259位碱基突变形成的突变株)：
菌株 抑菌圈直径/mm 环丙沙星 恩诺沙星 萘啶酸
标准株 30.05 30.78 34.37
L 22.73 24.43 6
Y 23.81 25.07 6
临床株 17.50 17.14 6
反向突变株 25.91 24.89 14.57
贴药敏纸片时注意相互间距离要适中均匀、粘贴后纸片不可移动、注意防止镊子的交叉使用
抑菌圈直径(大小)
2
1
分析实验数据可以得出的实验结论有__________(填序号)。
①gyrA基因第248位碱基和第259位碱基突变与喹诺酮耐药性有关
②突变株对萘啶酸的耐药性最强，对环丙沙星和恩诺沙星的耐药性相差不显著
③反向突变株可以进一步验证碱基突变与喹诺酮耐药性之间的相关性
④gyrA基因不同的突变株的产生说明基因突变具有随机性
①②③
2
1
【解析】 (1) 研究表明，临床分离的耐药菌大多发生gyrA基因第248位碱基C突变为T或259位碱基G突变为T，该变异可能导致回旋酶第83或第87位氨基酸发生改变。(2) 表中g1、g2序列需根据gyrA基因的目标突变位点的邻近序列设计，大量获取这些序列可通过人工化学合成方法获得。重组后的pCRISPR质粒进行电转化时，为了将cas9基因导入，需要pCas9质粒，同时需要pKD46上的相关基因编码Red蛋白，因此应选用含有pKD46和pCas9质粒的菌株制备感受态细胞。在导入三种质粒的大肠杆菌内，向导RNA和Cas9蛋白复合体的作用是识别并切割gyrA基因特定位点，实现定点切割。表中供体DNA序列A和B的用途依次是B用于248位突变，A用于259位突变，即A和B分别对应②、①。
2
1
(3) 将药敏平板置于37 ℃恒温培养箱培养18 h后，用电子游标卡尺测量抑菌圈直径(大小)，进而可以观察到相应菌液的抑菌效果。实验结果如下表：gyrA基因第248位碱基和第259位碱基突变与喹诺酮耐药性有关，因为实验结果表现为抑菌圈变小，①正确；根据抑菌圈的大小可以推测，突变株和临床株的抑菌圈均为6，说明它们对萘啶酸的耐药性最强，对环丙沙星和恩诺沙星的耐药性相差不显著，②正确；反向突变株抑菌圈恢复，因而可以进一步验证碱基突变与喹诺酮耐药性之间的相关性，③正确；gyrA基因不同的突变株的产生说明基因突变具有不定向性，④错误。
2
1
2 [2025盐城考前指导]甘蓝型油菜是我国种植面积最大的油料作物。生长素浓度梯度的时空变化对调控其生长发育至关重要。研究人员通过转基因技术构建生长素含量报告系统，将生长素响应序列DR5(接受生长素调控的一段序列，调控下游基因表达)与报告基因GUS(β－葡萄糖醛酸酶)结合，利用GUS催化β－葡萄糖醛酸反应生成蓝色产物的特性，通过染色结果评估生长素分布。具体步骤如下：
2
1
(1) 转化甘蓝油菜细胞
表1
实验目的 简要操作步骤
①获取GUS基因 在数据库中查阅大肠杆菌GUS基因序列，培养大肠杆菌并提取_________________，运用PCR技术扩增该序列
②构建增强报告基因表达的重组质粒 依次选择表2中的______－E－__________元件置于下图质粒中的a～d
③________________ ________ 将农杆菌从－80 ℃冰箱中取出置于________缓慢融化，诱导制成感受态细胞后，加入质粒转化，再将菌液涂布于添加____________的平板上培养
④转化甘蓝油菜细胞 将黑暗处理的甘蓝油菜下胚轴浸入筛选后的农杆菌菌液中一段时间
基因组DNA
D
B－A
将重组质粒导入
农杆菌
冰上
卡那霉素
2
1
注：KanR：卡拉霉素抗性基因；DR5：生长素响应序列；GenR：庆大霉素抗性基因；TMVΩ：翻译增强序列，促进核糖体与RNA结合
表2
A GUS基因
B 翻译增强序列TMVΩ
C RNA聚合酶基因RNApol
D 生长素响应序列DR5
E 启动子(方向和图中一致)
2
1
(2) 鉴定转基因甘蓝油菜细胞
已知相关元件长度以及两端序列信息如下表：
表3
元件 两端序列(方向5′→3′)
GUS基因 AGGATGGCCATGCATGCATGG……TGAACAACGAACTGAACTGGCAGA
DR5 GGATCCAAGCCTCCGACACCGAC……CCGACACCGACAAGACACCGACA
TMVΩ AGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAG……TTACTTACTTACTTCTTACCTGCAG
2
1
根据上表，结合上述步骤，以如图启动子方向为正向，分别选取以下引物__________作为正向和反向引物，对转基因甘蓝油菜组培幼苗中的核DNA为模板进行PCR扩增，电泳并观察到出现理想长度片段后，再依次通过______________、__________________以准确确定是否成功将生长素响应报告基因表达载体导入了甘蓝油菜。
A. 5′—CTGCAGGTAAGAAGTAAGTAAGTAA—3′
B. 5′—TGTCGGTGTCTTGTCGGTGTCGG—3′
C. 5′—TCTGCCAGTTCAGTTCGTTGTTCA—3′
D. 5′—GGATCCAAGCCTCCGACACCGAC—3′
E. 5′—AGGATGGCCATGCATGCATGG—3′
F. 5′—AGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAG—3′
D、C
DNA测序
与已知序列比对
2
1
(3) 转基因甘蓝油菜的染色鉴定
对转基因检测阳性的甘蓝油菜用NAA诱导后，取叶片放入90%丙酮进行________处理，再用GUS染色液染色，然后用70%乙醇以________ ____________，确定GUS基因能正常表达的转基因阳性植株，转移到温室培养。
脱色
洗去多
余染色液
2
1
【解析】 (1) ①要获取GUS基因，在培养大肠杆菌并提取时，应提取“基因组DNA”，因为GUS基因位于基因组DNA上，通过PCR从基因组DNA扩增目的基因；②要构建增强报告基因表达的重组质粒，根据题意，生长素响应序列DR5(D)调控下游基因表达，RNA聚合酶结合启动转录，启动子(E，方向和图一致)启动转录，翻译增强序列(B)促进核糖体与RNA结合，所以依次选择D、E、B、A；③将农杆菌从－80 ℃冰箱取出置于冰上缓慢融化，制成感受态细胞后加入质粒转化，再将菌液涂布于添加卡那霉素(因为重组质粒有KanR)的平板上培养，用于筛选含重组质粒的农杆菌；实验目的是将重组质粒导入甘蓝型油菜细胞，
2
1
所以③这一步实验目的是将重组质粒导入农杆菌(便于后续转化甘蓝型油菜细胞)。(2) 要扩增生长素响应报告基因表达载体相关序列，根据启动子方向(5′→3′)，正向引物选与元件一端匹配的，反向引物选与另一端匹配的，结合表格，应选D(正向，对应DR5 5′端序列)和C(反向，对应GUS基因3′端互补序列)。(3) 90%丙酮处理叶片是为了脱色，去除叶绿素等干扰，便于后续GUS染色观察。70%乙醇作用是洗去多余染色液，使染色结果更清晰，便于观察GUS基因表达情况。确定GUS基因能正常表达的转基因阳性植株，转移到温室培养。
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专题八
生物技术与工程
第16讲　微生物培养技术与发酵工程
内容索引
核心串讲
名卷优选
体系建构
基础回归
基 础 回 归
1判断下列说法是否正确。
(1) 各种培养基在配制时都应包含碳源、氮源、水和无机盐等。____
(2) 微生物、动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染。______
(3) 选育出的高产菌株经扩大培养后才可接种到发酵罐中。______
(4) 接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃。______
(5) 为防止蛋白质变性，不能用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌。______
×
×
√
×
×
(6) 将土壤稀释液彻底灭菌后再接种到培养基上，可以有效防止杂菌的污染。______
(7) 平板划线时，只有在最后一个划线区域才可得到所需单菌落。______
(8) 在统计样品活菌数时，需对每个稀释度进行涂布培养并计数。______
(9) 利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶(分解尿素)的微生物。______
(10) 可以利用加入刚果红染料的牛肉膏蛋白胨培养基筛选目标菌株。______
×
×
×
√
×
(11) 在发酵工程中，可通过诱变育种、基因工程育种获得菌种。______
(12) 在果酒发酵后期，拧松瓶盖的间隔时间可适当延长。______
(13) 葡萄糖转化为乙醇所需的酶既存在于细胞质基质，也存在于线粒体。______
(14) 果酒发酵过程中发酵液密度会逐渐减小。______
(15) 在连续培养过程中补充的同种培养液和空气需先灭菌。______
(16) 发酵罐中微生物的生长繁殖、代谢物的形成速度都与搅拌速度有关。______
(17) 乳酸菌可以代替酵母菌用于乙醇的生产。______
√
√
×
√
√
√
×
2培养不同微生物，“搅拌”的目的有所不同，共同的作用是______ _____________________________________。培养醋酸菌还具有的作用是______________；培养小球藻还具有的作用是_____________________。
3啤酒生产中，发酵是重要环节，发酵后期如果密封不严，会使啤酒变酸。这是因为_________________________________________________ _________________________________________________。
让细胞与培养液充分接触，便于物质交换
增加溶氧量
获得更多光照和CO2
醋酸菌是一种好氧菌，若发酵罐密封不严，酒精就会在醋酸菌的作用下被氧化产生乙醛，最后变为乙酸
体 系 建 构
核心考点1　传统发酵和发酵工程
核 心 串 讲
1 果酒、果醋和泡菜的制作原理与发酵条件
类别 果酒制作 果醋制作 泡菜制作
菌种 酵母菌 醋酸菌 乳酸菌
发酵条件 温度 一般酒精发酵为18～30 ℃，繁殖最适为28 ℃左右 最适为30～35 ℃ 室温
氧气 前期需氧；后期不需氧 需要充足的氧气 无氧
时间 10～12 d 7～8 d 12 d左右
2 泡菜发酵的三个时期
比较项目 乳酸菌 乳酸 亚硝酸盐
前期 少(有氧，乳酸菌活动受抑制) 少 增加(硝酸盐还原菌的作用)
中期 最多(乳酸抑制其他菌的活动) 积累、增多、pH下降 下降(硝酸盐还原菌受抑制，部分亚硝酸盐被分解)
后期 减少(乳酸继续积累，pH继续下降，抑制其活动) 继续增加，pH继续下降 下降至相对稳定(硝酸盐还原菌被完全抑制)
比较项目 乳酸菌 乳酸 亚硝酸盐
含量曲 线图
3 制作果酒、果醋的装置图解读
(1) 各部位的作用
①充气口：在醋酸发酵时连接充气泵进行充气。
②排气口：排出酒精发酵时产生的CO2。
③与排气口相连的长而弯曲的胶管：防止空气中
微生物的污染。
④出料口：用于取样。
(2) 该装置的使用方法
使用该装置制酒时，应该关闭充气口；制醋时，应将充气口连接充气泵，输入氧气。
4发酵工程的基本环节
【注意】传统发酵食品制作过程中利用的是天然存在的菌种，不仅菌种存在差异，杂菌也是多样；而现代工业发酵工程通常通过微生物培养技术获得单一菌种进行发酵。
名 卷 优 选
　　　[2025江苏卷·6]某同学利用红叶李果实制作果醋，图示其操作的简易流程。下列相关叙述正确的是(　　)
A. 果酒、果醋发酵所需菌种的细胞结构相同
B. 过程①中添加适量果胶酶，有利于提高出汁率
C. 过程②中，为使菌种充分吸收营养物质，需每日多次开盖搅拌
D. 过程③发酵时会产生大量气泡，需拧松瓶盖放气
1
B
【解析】 果酒发酵的菌种是酵母菌，是真核生物，果醋发酵的菌种是醋酸菌，是原核生物，两者的细胞结构不同，A错误；过程①为榨汁，果胶酶能分解细胞壁中的果胶、果汁絮状物中的果胶，添加适量果胶酶，有利于水解果胶，提高出汁率，B正确；过程②为果酒发酵，酵母菌在无氧条件下进行酒精发酵，C错误；过程③为果醋发酵，醋酸菌利用酒精产醋过程中不产生气体，不会产生大量气泡，无需放气，D错误。
　　　[2024江苏卷·14]关于“利用乳酸菌发酵制作酸奶或泡菜”的实验，下列叙述正确的是(　　)
A. 制作泡菜的菜料不宜完全淹没在煮沸后冷却的盐水中
B. 制作酸奶的牛奶须经过高压蒸汽灭菌后再接种乳酸菌
C. 发酵装置需加满菜料或牛奶并封装，以抑制乳酸菌的无氧呼吸
D. 控制好发酵时间，以避免过量乳酸影响酸奶或泡菜的口味和品质
2
D
【解析】 制作泡菜是利用乳酸菌无氧呼吸产生乳酸，所以为制造无氧环境，制作泡菜的菜料要完全淹没在煮沸后冷却的盐水中，A错误；如果采用市售未开封的鲜奶，可直接使用，不需要灭菌，B错误；发酵时泡菜装至八成满，制作酸奶时倒入的奶液量不要超过奶瓶容积的2/3，C错误；制作酸奶或泡菜时，控制好发酵时间，以避免过量乳酸影响酸奶或泡菜的口味和品质，D正确。
　　　(多选)[2023江苏卷·16]某醋厂和啤酒厂的工艺流程如图所示。酒曲含有霉菌、酵母菌、乳酸菌；醋醅含有醋酸菌；糖化即淀粉水解过程。下列相关叙述正确的有(　　　)
A. 糯米“蒸熟”与大米“蒸煮”的目的是利于糖化和灭菌
B. 发酵原理是利用真菌的无氧呼吸与细菌的有氧呼吸
C. 醋酸发酵过程中经常翻动发酵物,可控制发酵温度和改善通气状况
D. 啤酒酿造流程中适当增加溶解氧可缩短发酵时间
3
ACD
【解析】 糯米“蒸熟”与大米“蒸煮”均有利于灭菌和糖化过程，A正确；图中制酒用到了酒曲，酒曲含有霉菌、酵母菌、乳酸菌，霉菌属于真菌，其为需氧型，该过程霉菌产生的淀粉酶有利于将糯米中的淀粉分解，其中的乳酸菌进行的是无氧呼吸，酵母菌主要进行无氧呼吸过程完成酿酒的过程，醋酸发酵过程中主要利用了醋酸杆菌的有氧呼吸进行醋酸发酵，B错误；醋酸发酵过程中利用了醋酸菌的有氧呼吸，在发酵过程中经常翻动发酵物，目的是控制发酵温度和改善通气状况，C正确；啤酒酿造流程中利用的原理是酵母菌无氧呼吸产生酒精，若适当增加溶解氧有利于酵母菌有氧呼吸产生更多的能量满足酵母菌自身增殖的需要，因而可缩短发酵时间，D正确。
　　　(多选)[2022江苏卷·16]在制作发酵食品的学生实践中，控制发酵条件至关重要。下列相关叙述错误的有(　　　)
A. 泡菜发酵后期，尽管乳酸菌占优势，但仍有产气菌繁殖，需开盖放气
B. 制作果酒的葡萄汁不宜超过发酵瓶体积的2/3，制作泡菜的盐水要淹没全部菜料
C. 葡萄果皮上有酵母菌和醋酸菌，制作好葡萄酒后，可直接通入无菌空气制作葡萄醋
D. 果酒与果醋发酵时，温度宜控制在18～30 ℃，泡菜发酵时，温度宜控制在30～35 ℃
4
ACD
【解析】 乳酸菌属于厌氧菌，开盖放气会影响乳酸菌发酵，因此不能开盖放气，A错误；制作果酒的葡萄汁不宜超过发酵瓶体积的2/3，是为了发酵初期让酵母菌进行有氧呼吸大量繁殖，同时为了防止发酵过程中发酵液溢出，制作泡菜的盐水要淹没全部菜料，以保证乳酸菌进行无氧呼吸，B正确；醋酸菌为需氧菌，且发酵温度高于果酒的发酵温度，因此制作好葡萄酒后，除通入无菌空气，还需要适当提高发酵装置的温度，C错误；果酒发酵时温度宜控制在18～30 ℃，果醋发酵时温度宜控制在30～35 ℃，泡菜的制作温度低于30～35 ℃，D错误。
1[2025南通考前模拟]传统发酵技术是人类利用微生物的智慧结晶，不仅丰富了饮食文化，也为现代发酵工业奠定了基础。相关叙述正确的是(　　)
A. 制作酸奶时，可将牛奶巴氏消毒后再接种乳酸菌在恒温箱中进行发酵
B. 酒精发酵一段时间后，适量补糖，可增加酒精浓度自制高度白酒
C. 泡菜制作过程中，常向水槽中补充水，目的是减少亚硝酸盐的产生
D. 醋酸菌在缺少糖源和O2时可直接将乙醇转化为乙醛，再转变为乙酸
A
【解析】 制作酸奶时，将牛奶巴氏消毒既可以杀死牛奶中的微生物，又能保证牛奶中的营养成分不被破坏，之后接种乳酸菌在恒温箱中进行发酵，乳酸菌在适宜温度下能将牛奶中的糖类等分解产生乳酸，从而制成酸奶，A正确；酒精发酵一段时间后适量补糖，可继续为酵母菌提供发酵底物，能增加酒精产量，但不能自制高度白酒，因为酵母菌发酵产生酒精的浓度一般较低，且酒精浓度过高会对酵母菌产生毒害作用，同时高度白酒的制作还需要蒸馏等后续工艺，B错误；泡菜制作过程中，常向水槽中补充水，目的是保证坛内处于无氧环境，因为乳酸菌是厌氧菌，无氧环境有利于其发酵，C错误；醋酸菌在缺少糖源时，在有氧气的条件下可直接将乙醇转化为乙醛，再转变为乙酸，缺少氧气醋酸菌无法进行相关转化，D错误。
2(多选)[2025徐州模拟]柠檬酸是一种常见的食品酸度调节剂，它可由黑曲霉(一种真菌，菌体呈丝状生长)在氧气充足的条件下发酵而来。在发酵过程中多个黑曲霉的菌丝体会相互缠绕,聚集成团形成菌球体，菌球体的大小由其中菌体的数量决定。下列相关叙述不正确的有(　　　)
A. 提高发酵罐中营养物质的浓度不一定会提高柠檬酸的产量
B. 可用稀释涂布平板法监测发酵过程中黑曲霉活菌数量的变化
C. 发酵结束后仅通过过滤、沉淀等方法获得柠檬酸产品
D. 相同菌体密度下，菌球体越大柠檬酸产生速率越快
BCD
【解析】 在一定范围内，提高发酵罐中营养物质的浓度会提高柠檬酸的产量，但营养物质浓度过高也会使菌体失水、代谢变慢，导致柠檬酸产量降低，A正确；黑曲霉菌体呈丝状生长，形成的菌落难以区分，因此，稀释涂布平板法不宜用于监测发酵过程中黑曲霉活菌数量的变化，B错误；柠檬酸是代谢物，获取该类产品时需要采用适当的提取、分离和纯化等措施，仅依赖过滤和沉淀达不到目的，C错误；相同菌体密度下，菌球体越大，其内部菌体获得的氧气越少，柠檬酸的产生速率越慢，D错误。
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