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2027山东版高考生物学第一轮
第二十四章　基因工程
第1节　重组DNA技术的基本工具及DNA的粗提取与鉴定
五年高考
1.★(2025湖南,2,2分)用替代的实验材料或者试剂开展下列实验,不能达成实验目的的是(　　)
选项 实验内容 替代措施
A 用高倍显微镜观察叶绿体 用“菠菜叶”替代“藓类叶片”
B DNA的粗提取与鉴定 用“猪成熟红细胞”替代“猪肝细胞”
C 观察根尖分生区组织细胞的有丝分裂 用“醋酸洋红液”替代“甲紫溶液”
D 比较过氧化氢在不同条件下的分解 用“过氧化氢酶溶液”替代“肝脏研磨液”
2.★★(2024山东,13,2分)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法正确的是(　　)
A.整个提取过程中可以不使用离心机
B.研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,应充分摇匀再倒入烧杯中
C.鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
3.★★(2022山东,13,2分)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法错误的是(　　)
A.过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C.在一定温度下,DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质
4.★★(2021山东,13,2分)粗提取DNA时,向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌,过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤,在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是(　　)
A.加入适量的木瓜蛋白酶
B.37~40 ℃的水浴箱中保温10~15分钟
C.加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精
D.加入NaCl调节浓度至2 mol/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0.14 mol/L
5.★★★(新思维·酶切失败的原因和解决方法分析)(2024湖南,5,2分)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时,发现DNA完全没有被酶切,分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是(　　)
A.限制酶失活,更换新的限制酶
B.酶切条件不合适,调整反应条件如温度和酶的用量等
C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失,更换正常质粒DNA
D.酶切位点被甲基化修饰,换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
6.★★★(不定项)(新思维·正常基因和突变基因限制酶的识别位点)(2025江苏,19改编,3分)图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为,下列相关叙述正确的有(　　)
A.基因A突变为a是一种碱基增添的突变
B.用两种限制酶分别酶切A基因后,形成的末端类型不同
C.用两种限制酶分别酶切a基因后,产生的片段大小一致
D.产前诊断时,该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定
三年模拟
7.★★(2025届泰安肥城二模)下列关于DNA的提取和DNA片段的扩增及电泳鉴定的说法,正确的是(　　)
A.利用DNA和蛋白质在冷酒精中溶解性的差异可初步分离DNA
B.在提取白色丝状物时双向搅拌比单向搅拌更有利于获得结构完整的DNA
C.在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化前需将适量的核酸染料加入并进行混匀
D.鉴定DNA时,应将丝状物直接加入二苯胺试剂中进行沸水浴加热
8.★★★(2026届日照开学考)大肠杆菌经溶菌酶和去垢剂SDS(一端亲水、一端疏水的两性小分子)处理后,拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上,静置一段时间,质粒分布在上清液中,利用上述原理可初步获得质粒DNA,通过电泳可对质粒DNA进行鉴定。下列说法错误的是(　　)
A.提取质粒时溶菌酶和SDS能破坏细胞壁和细胞膜,释放DNA
B.提取质粒时将95%冷酒精加入上清液中,可使质粒DNA析出
C.电泳时载样缓冲液中的指示剂能与DNA结合,指示DNA位置
D.电泳时与加样孔距离相同的条带所含DNA分子大小可能不同
9.★★★(2025届名校联盟二模)R2逆转座子是真核生物中广泛存在的一种以RNA为媒介的逆转座子,它专一性地“定居”在宿主28S rDNA基因组位点上,借助宿主基因的启动子,合成自身的RNA和蛋白质并组装形成R2复合物。R2复合物可再次识别宿主28S rDNA上的专一性位点,通过逆转录最终合成R2基因序列,将R2基因序列重新整合到宿主基因组上,完成“复制—粘贴”。下列说法错误的是(　　)
A.宿主基因的启动子特定区域甲基化可能会使R2基因序列的“复制”过程无法完成
B.R2基因序列的“粘贴”过程需要RNA聚合酶、限制酶和DNA连接酶等参与
C.R2复合物的化学成分和核糖体相同
D.R2逆转座系统可实现RNA介导、高效精准的基因写入
10.★★★(2026届黑龙江哈尔滨六中开学考)用重组DNA技术可以赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中要使用多种工具酶,其中4种限制酶的切割位点如图所示。
回答下列问题:
(1)常用的DNA连接酶有　　　　　　　　和T4 DNA连接酶,图中　　　　　　　　酶切割后的DNA片段用T4 DNA连接酶比另一类DNA连接酶连接效率更高。
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与载体片段之间形成的化学键是　　　　　　。
(3)重组DNA技术中所用的质粒载体具有一些特征,如质粒DNA分子上有复制原点,可以保证质粒在受体细胞中　　　　;质粒DNA分子上有一至多个　　　　　　　　　,供外源DNA片段插入其中;质粒DNA分子上常有特殊的　　　　基因(如某种抗生素抗性基因),便于重组DNA分子的筛选。
(4)表达载体含有启动子,启动子是指位于基因上游的一段有特殊序列结构的DNA片段,是　　　　　　　　识别和结合的部位,能驱动　　　　过程。
第2节　PCR和电泳
五年高考
1.★★(2024黑、吉、辽,7,2分)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验,下列叙述正确的是(　　)
A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C.在同一电场作用下,DNA片段越长,向负极迁移速率越快
D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
2.★★(2022辽宁,12,2分)抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据,采用PCR方法进行目的基因监测,反应程序如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A.预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B.后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C.延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D.转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
3.★★★(2025全国,6,6分)琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析,样品1~4的电泳结果如图所示(“+”“-”分别代表电泳槽的阳极和阴极)。已知样品1和2中的DNA分子分别是甲和乙,甲只有限制酶R的一个酶切位点,样品3和4中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是(　　)
A.配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液
B.该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷
C.甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同
D.据图推测样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物
4.★★★(2025全国,34,12分)为在大肠杆菌中表达酶X,某同学将编码酶X的基因(目的基因)插入质粒P0,构建重组质粒PX,并转入大肠杆菌。该同学设计引物用PCR方法验证重组质粒构建成功(引物1~4结合位置如图所示,→表示引物5'→3'方向)。回答下列问题:
(1)PCR是根据DNA复制原理在体外扩增DNA的技术。在细胞中DNA复制时解开双链的酶是　　　　,而PCR过程中解开双链的方法是　　　　　　。
(2)PCR过程中,因参与合成反应、不断消耗而浓度下降的组分有　　　　　　　　　　　　。
(3)该同学进行PCR实验时,所用模板与引物见表。实验中①和④的作用是　　　　　　　　　　　　;②无扩增产物,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　;③、⑤和⑥有扩增产物,扩增出的DNA产物分别是　　　　　　　　　　　　　　　　　。
管号 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥
模板 无 P0 PX 无 P0 PX
引物对 引物1和引物2 引物3和引物4
(4)设计实验验证大肠杆菌表达的酶X有活性,简要写出实验思路和预期结果 　。
三年模拟
5.★★(2025届烟台三模)下列关于“DNA片段的扩增及电泳”实验的叙述,错误的是(　　)
A.进行PCR时设计的引物长度和GC含量对PCR均有影响
B.PCR组分添加完成后用移液器轻吸混匀立即置于仪器使反应充分进行
C.新的TaqDNA聚合酶可分装成小份并低温保存以防频繁取用导致酶失活
D.琼脂糖凝胶电泳时,电泳缓冲液可维持pH,使溶液具有导电性,利于核酸迁移
6.★★(2026届德州开学考)某研究小组针对植物抗逆基因进行了以下实验:首先从耐旱植物叶片中提取总DNA,再利用PCR技术扩增抗逆基因,最后通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测与鉴定。下列实验操作正确的是(　　)
A.叶片研磨液置于4 ℃冰箱中几分钟后,需充分摇匀再进行提取
B.PCR实验中设置75 ℃的目的是便于引物与模板链结合
C.配制琼脂糖凝胶浓度时需要考虑待分离的抗逆基因片段的大小
D.通过电泳鉴定PCR产物时,正常情况下会出现5条DNA带
7.★★★(2025届烟台三模)双脱氧核苷酸测序法可测定DNA的碱基序列。dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)是dATP、dGTP、dTTP、dCTP四种物质的统称,常在PCR中作原料。ddNTP(双脱氧核苷三磷酸)有ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP四种。在4组标准PCR反应体系中加入特定的ddNTP,ddNTP可取代相应的dNTP,终止DNA子链的延伸,反应后得到不同长度的DNA片段混合物,再进行凝胶电泳放射自显影测序。如图是利用该技术对某一单链DNA片段的测序电泳图谱。下列说法错误的是(　　)
A.该PCR反应体系中可不加入ATP供能,Mg2+可激活相关酶的活性
B.4组反应体系中除加入dNTP作原料外,还应分别加入某一种双脱氧核苷三磷酸
C.加入ddCTP的反应体系中最多获得3条长短不同的子链
D.根据测序电泳图谱分析,待测DNA的碱基序列是3'-GACTGCCA-5'
8.★★★(2026届重庆八中月考)双温PCR是一种通过合并复性与延伸步骤优化反应效率的核酸扩增技术。相较于传统PCR,双温PCR在保持特异性的同时显著缩短反应时间。已知公猪的Y染色体上存在SRY基因,在进行双温PCR时通常选GAPDH基因(在两种性别中均表达)作为内参基因。科研人员用电泳法检测了5份公猪和5份母猪全血DNA样品的扩增产物,结果如图。关于此项实验,下列说法最合理的是(　　)
A.该技术缩短反应时间的原因是其变性步骤所需温度更低、时间更短
B.合并复性和延伸时,应选择72 ℃保证DNA聚合酶活性最佳
C.内参基因309 bp的条带比SRY基因404 bp的条带在电泳时运动更快
D.该PCR反应体系中加入4种引物和其他PCR的材料才能实现实验目的
微专题　PCR引物设计、选择及应用
五年高考
1.★★(2023浙江6月选考,19,2分)某研究小组利用转基因技术,将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端,如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只,交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型,设计了引物1和引物2用于PCR扩增,PCR产物电泳结果如图乙所示。
下列叙述正确的是(　　)
A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达
B.翻译时先合成Gata3蛋白,再合成GFP蛋白
C.2号条带的小鼠是野生型,4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子
D.若用引物1和引物3进行PCR,能更好地区分杂合子和纯合子
2.★★★(2024山东,5,2分)制备荧光标记的DNA探针时,需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP)的反应管①~④中,分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则,且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有(　　)
A.①②　　　　B.②③
C.①④　　　　D.③④
3.★★★★(2025陕晋青宁,21,10分)马铃薯作为重要农作物,提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现,野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关,将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。
(1)PCR扩增目的基因时,需要模板DNA、引物、　　　　　　　　　　　、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的　　　　步骤中起作用。
(2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体,PCR扩增S基因时需在引物的　　　　(填“5'端”或“3'端”)添加限制酶识别序列,结合表分析,上游引物应添加的碱基序列是5'-　　　　-3',切割载体时应选用的两种限制酶是　　　　　　　。PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后,经纯化和连接,获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。
(3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时,基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞,将S基因整合到　　　　　　　　　　　,抗性基因　　　　可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经　　　　形成芽、根,继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。
4.★★★★(2023山东,25,10分)科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测,该质粒的部分结构如图甲所示。其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是　　　　。除图甲中标出的结构外,作为载体,质粒还需具备的结构有　　　　　　　　　　(答出2个结构即可)。
(2)构建重组质粒后,为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物　　　　。已知J基因转录的模板链位于b链,由此可知引物F1与图甲中J基因的　　　　(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平,结果如图乙所示。其中,出现条带1证明细胞内表达了　　　　　　,条带2所检出的蛋白　　　　(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。
5.★★★★(2025黑吉辽蒙,25,11分)香树脂醇具有抗炎等功效,从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N,可高效生产香树脂醇。回答下列问题。
(1)可从　　　　　中查询基因N的编码序列,设计特定引物。如图1所示,a链为转录模板链,为保证基因N与质粒pYL正确连接,需在引物1和引物2的5'端分别引入　　　　　和　　　　限制酶识别序列。PCR扩增基因N,特异性酶切后,利用　　　　连接DNA片段,构建重组质粒,大小约9.5 kb(kb为千碱基对),假设构建重组质粒前后,质粒pYL对应部分大小基本不变。
(2)进一步筛选构建的质粒,以1~4号菌株中提取的质粒为模板,使用引物1和引物2进行PCR扩增,电泳PCR产物,结果如图2。在第5组的PCR反应中,使用无菌水代替实验组的模板DNA,目的是检验PCR反应中是否有　　　　的污染。初步判断实验组　　　　(从“1~4”中选填)的质粒中成功插入了基因N,理由是　 　。
(3)为提高香树脂醇合酶催化效率,将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列,丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列),b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物,其配对模板与a的配对模板相同。据此分析,丙氨酸的密码子除GCA外,还有　　　　。
(4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的　　　　含量并进行比较,可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。
三年模拟
6.★★(2025届滨州二模)应用农杆菌转化法时,目的基因插入T-DNA后,需要对T-DNA测序。测序前根据目的基因的序列设计引物对T-DNA进行PCR扩增的过程如图所示。下列说法正确的是(　　)
注:图中a、b、c、d为引物。
A.实验需要清楚目的基因的全部碱基序列
B.L、R酶切位点需要在T-DNA外侧,且需用同种限制酶切割
C.引物设计时需要考虑目的基因两侧序列,选择引物b、c
D.1个环状DNA分子首次PCR后得到的DNA分子含有两个游离的磷酸基团
7.★★★(2026届湖北名校联考)某科研小组利用PCR定点突变技术培育抗冻蔬菜新品种。设计含有非特异性碱基配对的引物,将突变位点引入编码抗冻蛋白的基因中,获得抗冻能力更强的突变基因。下列叙述正确的是(　　)
A.过程②还需要四种核糖核苷酸和耐高温的DNA聚合酶
B.过程③至少需要两次循环才能得到两条链等长的DNA分子
C.过程④需要使用引物1和4才能获得目的基因
D.合成的DNA分子经混合、变性、杂交后发现,通过引物2和3延伸形成的两条链能杂交在一起,说明引物2和3的碱基序列相同
8.★★★(不定项)(2026届德州开学考)荧光定量PCR技术可定量检测样本中DNA含量,其原理是在PCR反应体系中加入与模板链互补的一种荧光探针,Taq DNA聚合酶催化子链延伸至探针处水解探针,释放出荧光分子,从而使荧光监测系统接收信号。如图为对甲、乙、丙三个样本进行荧光定量PCR获得的荧光强度变化曲线。a、b、c分别表示三个样本中荧光强度达到P时所经历的循环数。下列说法正确的是(　　)
A.确保复性时引物和荧光探针均与模板DNA结合
B.根据图中曲线可知丙样本中的DNA含量最多
C.平台期的出现说明PCR反应体系中引物和荧光探针已消耗完
D.PCR过程中若一个DNA分子扩增n轮,共消耗2n-1个探针
9.★★★(2026届省实验中学期中)T-DNA插入失活是研究植物基因功能的常用方法,研究者将带有卡那霉素抗性基因的T-DNA插入拟南芥2号染色体的A基因内,使其突变为丧失功能的a基因,花粉中A基因功能的缺失会造成其不育。
回答下列问题:
(1)上述拟南芥中发生的变异类型为　　　　　　　　　　　　　。
(2)为进一步验证基因A的功能,将另一个A基因插入Aa植株的3号染色体。仅考虑基因A和a,该植株会产生　　　种基因型的可育花粉,其中具有a基因的花粉占比为　　　。该植株自交得到F1。利用图1所示引物P1和P2、P1和P3分别对F1进行PCR检测,电泳结果如图2所示。根据电泳结果F1植株分为Ⅰ型和Ⅱ型,其中Ⅰ型植株占比为　　　　。F1中没有检测到仅扩增出600 bp条带的植株,其原因为　 　。
第3节　基因工程的基本操作程序
　　　　　　　　　　　　　　　　
五年高考
1.★★★(2024江西,12,2分)γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coli A,构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E.coli B。下列叙述正确的是(　　)
A.图中表明,可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB
B.E.coli B发酵生产γ-氨基丁酸时,L-谷氨酸钠的作用是供能
C.E.coli A和E.coli B都能高效降解γ-氨基丁酸
D.可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒
2.★★★(2024新课标,5,6分)某种二倍体植物的P1和P2植株杂交得F1,F1自交得F2。对个体的DNA进行PCR检测,产物的电泳结果如图所示,其中①~⑧为部分F2个体,上部2条带是一对等位基因的扩增产物,下部2条带是另一对等位基因的扩增产物,这2对等位基因位于非同源染色体上,下列叙述错误的是(　　)
A.①②个体均为杂合体,F2中③所占的比例大于⑤
B.还有一种F2个体的PCR产物电泳结果有3条带
C.③和⑦杂交子代的PCR产物电泳结果与②⑧电泳结果相同
D.①自交子代的PCR产物电泳结果与④电泳结果相同的占1/2
3.★★★★(2025四川,19,11分)杆菌M2合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉索西丁能与细菌的核糖体结合,阻止携带氨基酸的tRNA进入核糖体位点2。有人将合成拉索西丁的相关基因(lrcA-lrcF)导入链霉菌,基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如图。回答下列问题。
注:①F1、F2、F3和F4为与相应位置的DNA配对的单链引物,“→”指引物5'→3'方向。②密码子对应的氨基酸:AAA—赖氨酸;AUG—甲硫氨酸(起始);UUC—苯丙氨酸;ACA—苏氨酸;UCG—丝氨酸。
(1)用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF目的基因时,应选用　　　　　引物。本研究载体使用了链霉菌的复制原点,其目的是 　 。
(2)采用EcoRⅠ和BamHⅠ完全酶切构建的重组质粒,产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生　　　　条电泳条带,电泳检测酶切产物的目的是　 。
(3)由图可知,拉索西丁与核糖体结合后,会阻止携带　　　　(填氨基酸名称)的tRNA进入结合位点,导致　　　　,最终引起细菌死亡。
(4)重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性,但重组菌在实验室多次培养后,提取的目的基因产物杀菌活性丧失,可能的原因是　　　　　　　　　　　　　。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物,除产物活性外还需进一步研究的问题有　　　　　　　　(答出1点即可)。
4.★★★★(2025广东,21,11分)大肠杆菌是重要工业菌株之一,其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量,使细胞适配不同阶段的生产需求,研究者设计了两种质粒,并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白,测试质粒功能。
回答下列问题:
(1)研究者首先构建质粒①(图a)用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKate2,将质粒导入感受态细胞后,在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况,结合PCR及　　　　检测,筛选获得重组菌株W1。
注:PGeo为大肠杆菌内源启动子,在细胞快速生长期开启基因转录,但进入生长稳定期后即停止基因转录;SsrA基因编码SsrA短肽;C-末端带有SsrA短肽的蛋白质可被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并以一定速率降解。
图a
(2)将W1在适宜条件下进行摇瓶培养,定时取样检测培养液中细胞密度,方法有　　　　　　　　　(答一种)。接种前需检测液体培养基的荧光强度,其作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。培养结果(图b)表明,进入生长稳定期后荧光强度快速下降,原因是　 　。
(3)研究者选用启动子PX、X基因(编码阻遏蛋白X,阻遏PX开启转录),重新构建质粒②(图a),导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养,W2的生长趋势不变,培养期间荧光强度的变化趋势为 　。
(4)莽草酸是一种重要工业化学品,其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱,且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物,因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长,并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累,利用上述两种质粒的调控功能,结合野生型菌株遗传物质的改造,提出重组生产菌株构建思路: 　。
图c
三年模拟
5.★★(2025届青岛三模)在构建基因表达载体时,需要遵循一定的规则。同时面对实际问题,可利用分子生物学原理加以解决。下列说法正确的是(　　)
A.利用不同的限制酶对载体和目的基因进行剪切而形成的黏性末端无法再次连接
B.若要降低细胞中某基因的表达,可将该基因的编码序列反向连接到基因表达载体中
C.如果目的基因没有合适的酶切位点,可以在引物3'端末尾设计加入酶切位点
D.表达载体中标记基因不需要启动子,可以在受体细胞中持续表达
6.★★(2025届校际联考)探针技术可以用来筛选目的基因。研究人员根据目的基因的一部分DNA序列,可以设计一个DNA单链作探针。DNA单链探针作用原理如图所示。下列说法错误的是(　　)
A.探针与目的基因某条链的部分碱基序列相同
B.若DNA样本具有目的基因,该DNA只有一条链能与探针结合
C.利用DNA单链探针,合成其互补链,两者可在PCR技术中用作目的基因的引物
D.若该DNA探针,与被测生物的mRNA未形成杂合双链,不能说明该生物不含目的基因
7.★★★(2025届泰安二模)双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达,研究人员构建了如图所示的表达载体,以检测双向启动子作用效果。下列分析正确的是(　　)
A.表达载体中GUS基因和LUC基因转录时使用同一条DNA单链为模板
B.通过观察是否出现荧光和蓝色物质可检测双向启动子的作用效果
C.在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的受体细胞
D.为连入GUS基因,需用SalⅠ和SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒
8.★★★★(2026届潍坊开学考)研究发现,COX-2基因表达产物可以促进肿瘤细胞的迁移,而HDAC2基因高表达会影响COX-2表达。科研人员利用siRNA干扰技术靶向抑制HDAC2表达,以研究HDAC2和COX-2表达情况对胃癌细胞迁移的影响。实验中使用的DNA结构如图1,A、B、C、D代表与DNA链互补的引物,BamHⅠ、SacⅠ为限制酶。
(1)启动子是一段有特殊结构的DNA片段,能被　　　　　识别并结合,驱动基因的　　　。
(2)已知COX-2基因的2链为转录的模板链,利用PCR扩增目的基因时,需要加入的引物为　　　　　(填字母)。为使基因准确插入质粒,引物　　　(填“3'端”或“5'端”)需添加限制酶　　　　和限制酶　　　　　的识别序列。
(3)siRNA可与特定基因的mRNA互补配对,从而导致　　　　　终止,达到抑制基因表达的目的。在设计siRNA时,其长度不能过短,原因是　。
(4)研究人员用不同的方式处理胃癌细胞,测出胃癌细胞迁移标志蛋白含量如图2所示。据此推测,HDAC2基因影响胃癌细胞迁移的原理是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
微专题　限制酶的选择和转基因“受体细胞”的筛选
五年高考
1.★★(2023湖北,4,2分)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　)
A.若用Hind Ⅲ酶切,目的基因转录的产物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因
C.若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
2.★★★(2025安徽,15,3分)质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因,将该质粒导入大肠杆菌细胞后,其编码的酶可分解X-gal,产生蓝色物质,进而形成蓝色菌落,如图所示。科研小组以该质粒作为载体,采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是　(　　)
A.使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率,可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数
B.如果筛选平板中仅含卡那霉素,生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株
C.因质粒K中含两个标记基因,筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株
D.若筛选平板中蓝色菌落偏多,原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌
3.★★★★(2025山东,25,12分)种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造,利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中,筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比,突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。
图甲　Ti质粒与抗除草剂基因信息
(1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为　　　　。选用图甲中的SmaⅠ对抗除草剂基因X进行完全酶切,再选择SmaⅠ和　　　　对Ti质粒进行完全酶切,将产生的黏性末端补平,补平时使用的酶是　　　　　　　　　。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接,构建重组载体,转化大肠杆菌;经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶　　　　　　　进行完全酶切并电泳检测,若电泳结果呈现一长一短2条带,较短的条带长度近似为　　　　bp,则一定为正向重组质粒。
(2)为证明这两个突变体是由T-DNA插入小麦基因组中同一基因导致的,提取基因组DNA,经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段(图乙)。在此酶切过程中,限于后续PCR难以扩增大片段DNA,最好使用识别序列为　　　　(填“4”“6”或“8”)个碱基对的限制酶,且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段　　　　,才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后,进行了一系列操作,其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为　　　　　　　　　(填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”)。
图乙　基因组DNA酶切后含T-DNA的片段
(3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株,如果检测到野生型基因,　　　　(填“能”或“不能”)确定该植株的表型为野生型。
4.★★★★★(2021山东,25,12分)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点,该位点结合BCL11A蛋白后,γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列,解除对γ基因表达的抑制,可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段,将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测,以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达,需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知,在F1~F7末端添加的序列所对应的限制酶是　　　　,在R末端添加的序列所对应的限制酶是　　　　　。本实验中,从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要　　　　种酶。
(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞,成功转化后,含F1~F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白,受体细胞有荧光,含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是　　　　　　　　　　　　　　 　。
(3)向培养液中添加适量的雌激素,含F1~F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光,而含F5~F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列,据此结果可推测,BCL11A蛋白结合位点位于　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　,理由是　 　。
5.★★★★★(2024山东,25,12分)研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L,可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列,将载体导入大豆细胞后,其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。
图甲:载体信息
LB/RB:T-DNA的边界序列;Kanr:卡那霉素抗性基因;Ampr:氨苄青霉素抗性基因
图乙:目标基因L部分序列
图丙:限制酶识别序列、切割位点及电泳结果
(1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时,所用的引物越短,引物特异性越　　　(填“高”或“低”)。限制酶在切开DNA双链时,形成的单链突出末端为黏性末端,若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA,理论上可产生的黏性末端最多有　　　种。载体信息如图甲所示,经BsaⅠ酶切后,载体上保留的黏性末端序列应为5'-　　　-3'和5'-　　　　-3'。
(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞,使用抗生素　　　　筛选到具有该抗生素抗性的植株①~④。为了鉴定基因编辑是否成功,以上述抗性植株的DNA为模板,通过PCR扩增目标基因L,部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示,PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是　　　,其中纯合的突变植株是　　　　(填序号)。
(3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株,该植株具有抗生素抗性,检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代,其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为　　　　,筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
三年模拟
6.★★★(2026届九五协作体开学考)研究者欲将经RT-PCR技术(通过RNA形成DNA,并以此为模板进行扩增的技术)获得人的相关目的基因导入大肠杆菌的质粒中保存,相关质粒及目的基因如图1、2所示。该质粒上含有氨苄青霉素抗性基因、LacZ基因及一些酶切位点,相关限制酶识别序列和切割位点如表所示。LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解化合物X-gal产生蓝色物质,使菌落呈现蓝色,否则菌落为白色。
BamHⅠ 5'-G↓GATCC-3'
EcoRⅠ 5'-G↓AATTC-3'
MfeⅠ 5'-C↓AATTG-3'
KpnⅠ 5'-GGTAC↓C-3'
HindⅢ 5'-A↓AGCTT-3'
(1)已知图2中乙链为目的基因转录的模板链。为了将目的基因插入质粒正确位置,且避免质粒和目的基因自身环化,最好选择用限制酶　　　　　　　　处理质粒,选用限制酶　　　　　　　　处理目的基因。
(2)已知目的基因mRNA的序列为5'-UGAAC-GCUA…(中间序列)…GUCGACUCG-3'。研究人员欲对目的基因的mRNA进行RT-PCR,为了便于将扩增后的基因和载体成功构建成重组质粒,用于PCR扩增的引物为　　　　(填写序号)。
①5'-TGAACGCTA…　　　　②5'-AAGCTTCGA…
③5'-CGAGTCGAC…　　　　④5'-GAATTCTGA…
(3)启动子通常具有物种特异性,为使目的基因在大肠杆菌中表达,在质粒中插入目的基因时,其上游启动子应选择　　　　　(填“人”或“大肠杆菌”)的启动子。在目的基因表达过程中,与启动子结合的酶是　　　　　　。
(4)将重组质粒导入普通大肠杆菌中,为筛选含有目的基因的大肠杆菌,需要将导入操作之后的大肠杆菌接种到含　　　　　　　　　　的固体培养基中培养,挑选　　　　色的菌落进行纯化培养。为了确认目的基因在大肠杆菌中是否成功表达,从分子水平上通常使用　　　技术检测。
7.★★★★(2026届青岛开学考)2,3-丁二醇是一种在食品工业、医药行业等诸多领域具有广泛应用价值的化合物,可用产气肠杆菌进行生产。产气肠杆菌发酵产生2,3-丁二醇的同时,也会生成乳酸、甲酸、乙酸等多种副产物,影响产量。已知P基因(位于拟核DNA分子中)与产气肠杆菌发酵过程中副产物的生成有关,研究人员欲利用生物技术敲除P基因以获得高产2,3-丁二醇的产气肠杆菌。
(1)利用PCR技术扩增含有P基因上游片段和下游片段序列的融合片段N时,复性温度下发生的过程是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。PCR产物常采用　　　　来鉴定。
(2)融合片段N两端的酶切位点如图甲所示,为使融合片段N定向插入质粒中,应选择图甲中的限制酶　　　　和　　　　对质粒A(长度为2 800 bp)进行完全酶切,利用　　　　　酶将质粒特定的黏性末端补平后,在DNA连接酶的作用下可获得含有融合片段N的重组质粒B。已知限制酶SmaⅠ和BamHⅠ两酶切位点之间的序列长度为600 bp,用限制酶SmaⅠ和BamHⅠ对重组质粒B进行完全酶切后,电泳可得到　　　　条带。
图甲　融合片段N及质粒A限制酶酶切位点
(3)将重组质粒B导入用　　　　处理的产气肠杆菌细胞中,利用重组质粒B和产气肠杆菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理,对P基因进行敲除(如图乙),敲除后的P基因将被有关的酶降解。P基因敲除过程中,可发生多种形式的同源区段交换,交换后,用图乙中的引物1和2进行PCR扩增,检测结果如图丙所示,其中菌落　　　　(填序号)为P基因敲除株,出现菌落③的原因可能是　　　　　　　　　　　　　。
第4节　基因工程的应用和蛋白质工程
五年高考
1.★★(2024天津,5,4分)胰岛素的研发走过了:动物提取—化学合成—重组胰岛素生产—胰岛素类似物生产等历程。有关叙述错误的是(　　)
A.动物体内胰岛素由胰岛B细胞合成并胞吐出细胞
B.氨基酸是化学合成胰岛素的原料
C.用大肠杆菌和乳腺生物反应器生产胰岛素需相同的启动子
D.利用蛋白质工程可生产速效胰岛素等胰岛素类似物
2.★★★★(2025湖南,21,13分)非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒,可引起急性猪传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A,其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题:
(1)制备特定抗原
①获取基因A,构建重组质粒(该质粒的部分结构如图所示)。重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和　　　等;为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确,应选用图中的一对引物　　　　对待测质粒进行PCR扩增,预期扩增产物的片段大小为　　　　bp。
②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌,诱导蛋白A合成。收集重组菌发酵液进行离心,发现上清液中无蛋白A,可能的原因是


(答出两点即可)。
(2)制备抗蛋白A单克隆抗体
　　用蛋白A对小鼠进行免疫后,将免疫小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合,诱导融合的常用方法有　　　　　　(答出一种即可)。选择培养时,对杂交瘤细胞进行克隆化培养和　　　　　　　　,多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。体外培养或利用小鼠大量生产的抗蛋白A单克隆抗体,可用于非洲猪瘟的早期诊断。
3.★★★★(2025河南,21,11分)卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖,可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶(CG)的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题:
(1)选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。将培养后的菌液混匀并充分　　　　　,再接种至微孔板中,经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。
(2)为构建携带cg(CG的编码基因)的大肠杆菌表达载体(图1),对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切,随后用E.coli DNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率,cg转录模板链的5'端最好含有　　　　酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4 DNA连接酶重复上述实验,获得的部分重组质粒分子大小符合预期,但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割,其原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
限制酶的识别序列和切割位点如下:
(3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌,需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞,目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　,随后在含　　　和　　　的培养基中培养一段时间后,根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。
(4)已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键,从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG的耐热性,研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度(保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键),如图2所示。根据分析结果,选择第　　　位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适,原因是　 　。
4.★★★★(2022山东,25,12分)某种类型的白血病由蛋白P引发,蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解,药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理,需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-PΔ。PΔ是缺失特定氨基酸序列的P,FLAG是一种短肽,连接在P或PΔ的氨基端,使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合,但不影响P或PΔ的功能。
(1)为构建重组载体,需先设计引物,通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。为使PCR产物能被限制酶切割,需在引物上添加相应的限制酶识别序列,该限制酶识别序列应添加在引物的　　　(填“3'端”或“5'端”)。
(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后,与编码FLAG的序列形成一个融合基因,如图甲所示,其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后,融合基因转录出的mRNA序列正确,翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确,但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析,出现该问题的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题,具体修改方案是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
图甲
(3)融合蛋白表达成功后,将FLAG-P、FLAG-PΔ、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质,分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测,检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-PΔ不能降解UBC,由①②③组结果的差异推测,药物A的作用是　　　　　　　　　　　　　　　;由②④组或③⑤组的差异推测,PΔ中缺失的特定序列的作用是　　　　　　　　　　。
(4)根据以上结果推测,药物A治疗该病的机理是 　。
三年模拟
5.★★(2026届聊城阶段训练)普通大米中蛋白质含量较低,赖氨酸等必需氨基酸的含量无法满足人体营养需求。为提高其品质,科研工作者以普通大米为主要原料加入大米蛋白粉,经一系列工序制成高蛋白重组米。下列有关高蛋白重组米叙述中正确的是(　　)
A.生产中挤压升温会使高蛋白重组米不能与双缩脲试剂反应
B.加入大米蛋白粉后可以完全弥补普通大米各种营养物质组成的缺陷
C.其含有的DNA和淀粉在合成时均需模板和酶直接参与
D.可通过蛋白质工程改造大米蛋白基因来改善其营养组成
6.★★(2025届山东大联考)天然胰岛素易形成六聚体,皮下注射后往往要经历较长时间逐渐解离为单体,因此起效时间长,其过程如图所示。科学家将β链的第28位脯氨酸替换为天冬氨酸后能有效抑制胰岛素的聚合。下列说法正确的是(　　)
A.可根据预期蛋白质的结构来改造胰岛素基因序列
B.获得不形成六聚体的胰岛素的过程不遵循中心法则
C.一般可直接对β链的氨基酸改造,获得新型胰岛素
D.该方法的实质是通过基因重组获得新型蛋白质
7.★★★★(2025届青岛三模节选)SYS是调控番茄伤口反应的信号分子,由SYS基因编码,有利于伤口的再生修复。近年来新发现了一种番茄受伤后产生的信号分子REF,由REF基因编码,也能引起伤口再生修复。为探究REF的信号转导路径,科学家做了一系列实验。
(1)为达到实验目的,需要使用基因编辑技术敲除SYS基因,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)将PORK基因敲除后,REF无法发挥作用。已知细胞膜上PORK蛋白包含了三个结构域,分别是膜外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。推测得知,PORK蛋白的功能是　。
(3)为探究SI蛋白在REF胞内转导路径中的作用,科学家将SI基因和GFP基因(编码绿色荧光蛋白)拼接成融合基因后,用农杆菌转化法获得了转基因番茄,部分过程如图1所示。
①已知SI基因的模板链是α链,GFP基因的模板链是β链。为获得融合基因,在设计引物时,引物F2和引物F3序列应分别选择　　　　。
A.5'-TCACTGAGCTCG-3'
B.5'-TTACGACTAGCG-3'
C.5'-CGAGCTCAGTGA-3'
D.5'-CGCTAGTCGTAA-3'
②融合基因两端不含酶切位点,为保证融合基因能正确连接在载体上,需要在引物F1和引物F4的一端分别添加　　　　　限制酶的识别序列。
③研究发现,转基因番茄的再生能力明显增强,进一步检测发现,SI蛋白与REF基因启动子结合来发挥作用。为进一步探究SI的具体作用,科研人员使用番茄si突变体(SI基因无法正常表达)进行实验,结果如图2所示。推测番茄受伤后,SI会　　　(填“促进”或“抑制”)REF基因的表达。REF引发的信号通路属于　　　(填“正反馈”或“负反馈”)。REF释放到其他组织后,引发再生相关基因的表达,植株再生修复。
微专题　基因编辑技术
五年高考
1.★★★★(2025甘肃,21,11分)水稻白叶枯病(植株的叶片上会出现逐渐扩大的黄白色至枯白色病斑)由白叶枯病菌引起,严重威胁水稻生产和粮食安全。科学家利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术,对水稻白叶枯病的感病基因SWEET(该基因被白叶枯病菌利用以侵染水稻)的启动子区进行了定点“修改”,编辑后的水稻幼胚通过植物组织培养技术获得抗病植株(如图)。回答下列问题。
(1)CRISPR-Cas9重组Ti质粒构建完成后,可通过　　　　　　　(方法)将该质粒转入植物细胞,并将　　　　　　　整合到该细胞的染色体上。为了能够筛选出转化成功的细胞,需要在植物组织培养基中添加　　　　　　　。
(2)实验中用到的水稻幼胚在植物组织培养中被称为　　　　,对其消毒时需依次使用酒精和　　　　处理。诱导形成再生植株的过程中需使用生长素和细胞分裂素,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(3)为了检测基因编辑水稻是否成功,首先需采用　　　　技术检测目标基因的启动子区是否被成功编辑;然后,在个体水平需将基因编辑后的水稻与野生型水稻分别接种白叶枯病菌,通过比较　　　　　　　　　　来验证抗病性。
(4)在该研究中,基因编辑成功后的水稻可以抗白叶枯病的原因为　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
2.★★★★(2024广西,21,14分)M蛋白与“记忆”的形成密切相关。科研人员制备了M基因表达可控的实验模型小鼠,主要制备流程如图所示,实验模型小鼠通过特异性表达Cre重组酶来敲除两个LoxP位点间的序列,同时利用体内表达的蛋白A激活诱导型T启动子。利用融合绿色荧光蛋白基因的M基因(M-GFP)的表达,恢复小鼠自身被敲除的M基因功能,同时便于示踪。回答下列问题:
注:基因型A/+指的是A基因被嵌合在细胞同源染色体中的一条,即可表示为Aa;两端添加上LoxP位点的M基因称为floxM。
(1)在PCR扩增片段①和②时,通常会在所用引物的一端添加被限制酶识别的序列,该序列添加的位置位于引物　　　(选填“3'端”或“5'端”)。在构建载体1时,为了阻断A基因的表达,从转录水平考虑,连接的片段可以是　　　　　　　　　　　　　　　　;而从翻译水平考虑,连接的片段可以是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。为了鉴定载体2是否构建成功,需要限制酶切割载体后,再进行　　　。
(2)培养小鼠胚胎干细胞需定时更换培养液,其目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(至少答2方面)。
(3)为了快速高效繁育出含有4对基因(遵循自由组合定律)的实验模型小鼠,应将培育出的基因型Cre/+A/+小鼠和M-GFP/+floxM/+小鼠分别与基因型floxM/floxM小鼠杂交,杂交获得的子代,再进行一代杂交后最终获得基因型为　　　　　　　　　　　　实验模型小鼠。
(4)为了实现M基因的表达可控,在实验模型小鼠喂食时,可添加竞争性结合A蛋白的四环素,抑制T启动子的活性。添加四环素与未添加相比,目的是 　。
三年模拟
3.★★★★(2026届山东大联考)无核葡萄品质优良,但抗寒性差。我国科学家以中国野生葡萄资源中抗寒性最强的山葡萄为材料,对抗寒基因Va的功能展开相关研究。
(1)通过前期研究结果,科研人员推测Va基因的产物可能为转录因子。转录因子是一类特定的蛋白,可以调控　　　　　与启动子的结合。
(2)研究者欲通过PCR扩增Va基因,可通过分析Va蛋白的氨基酸序列,依据这些氨基酸所对应的　　　　推测mRNA序列以确定DNA序列,进而设计特异性引物,并在引物的　　　端添加特定限制酶的识别序列。以山葡萄基因组DNA为模板进行PCR,利用　　　　　　凝胶电泳分离并纯化DNA片段。
(3)若在上述PCR扩增结果中,除获得一条阳性条带外,还出现了另外一条条带,可能的原因是　　　　。
A.DNA模板被其他葡萄细胞的基因组DNA污染
B.每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点
C.在基因组中Va基因有2个拷贝
D.在基因组中存在1个与Va基因序列高度相似的其他基因
(4)为进一步验证Va基因的转录激活功能,科研人员利用pG载体首先构建了重组质粒,导入到敲除GAL4基因的酵母菌AH109菌株中(图1)。GAL4基因可编码酵母菌中具有转录激活功能的蛋白,AH109菌株为色氨酸、组氨酸缺陷型菌株,只有在添加相应氨基酸的培养基中才能生长。
①敲除GAL4的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　。科学家运用CRISPR/Cas9基因编辑系统(图2)实现对GAL4的敲除,sgRNA(一种小RNA)有引导作用,使Cas9酶在配对区域定点切割,导致基因丧失功能,因此sgRNA序列必须以　　　　　　　　　　　　　　　为设计依据。如果要获得基因敲除酵母菌AH109菌株,应用　　　　法导入CRISPR/Cas9基因表达载体。
②为了能够筛选得到重组酵母,培养基的配方为下列选项中的　　　　组,此外还需额外添加　　　　　　,通过显色反应进一步验证。
A组:加色氨酸和组氨酸 B组:不加色氨酸和组氨酸
C组:加组氨酸,不加色氨酸 D组:加色氨酸,不加组氨酸
③研究人员运用GAL4基因和pG质粒构建了pG-GAL4重组载体,并将其导入酵母菌作为对照组1,那么实验组的处理是导入　　　　　　　　　。另外,还需设置一个对照组2,即导入　　　　　　,然后将上述三组酵母菌同时接种于同一块平板的三个区域。
④预测实验组和对照组1、2的菌落生成及颜色情况分别是　　　　　　　　;有菌落,蓝色;　　　　　　　　　　　　　　　。
第二十四章　基因工程
第1节　重组DNA技术的基本工具及DNA的粗提取与鉴定
五年高考
1.★(2025湖南,2,2分)用替代的实验材料或者试剂开展下列实验,不能达成实验目的的是(　　)
选项 实验内容 替代措施
A 用高倍显微镜观察叶绿体 用“菠菜叶”替代“藓类叶片”
B DNA的粗提取与鉴定 用“猪成熟红细胞”替代“猪肝细胞”
C 观察根尖分生区组织细胞的有丝分裂 用“醋酸洋红液”替代“甲紫溶液”
D 比较过氧化氢在不同条件下的分解 用“过氧化氢酶溶液”替代“肝脏研磨液”
答案　B　
2.★★(2024山东,13,2分)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法正确的是(　　)
A.整个提取过程中可以不使用离心机
B.研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,应充分摇匀再倒入烧杯中
C.鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
答案　A　
3.★★(2022山东,13,2分)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法错误的是(　　)
A.过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C.在一定温度下,DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质
答案　B　
4.★★(2021山东,13,2分)粗提取DNA时,向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌,过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤,在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是(　　)
A.加入适量的木瓜蛋白酶
B.37~40 ℃的水浴箱中保温10~15分钟
C.加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精
D.加入NaCl调节浓度至2 mol/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0.14 mol/L
答案　A　
5.★★★(新思维·酶切失败的原因和解决方法分析)(2024湖南,5,2分)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时,发现DNA完全没有被酶切,分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是(　　)
A.限制酶失活,更换新的限制酶
B.酶切条件不合适,调整反应条件如温度和酶的用量等
C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失,更换正常质粒DNA
D.酶切位点被甲基化修饰,换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
答案　B　
6.★★★(不定项)(新思维·正常基因和突变基因限制酶的识别位点)(2025江苏,19改编,3分)图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为,下列相关叙述正确的有(　　)
A.基因A突变为a是一种碱基增添的突变
B.用两种限制酶分别酶切A基因后,形成的末端类型不同
C.用两种限制酶分别酶切a基因后,产生的片段大小一致
D.产前诊断时,该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定
答案　BD　
三年模拟
7.★★(2025届泰安肥城二模)下列关于DNA的提取和DNA片段的扩增及电泳鉴定的说法,正确的是(　　)
A.利用DNA和蛋白质在冷酒精中溶解性的差异可初步分离DNA
B.在提取白色丝状物时双向搅拌比单向搅拌更有利于获得结构完整的DNA
C.在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化前需将适量的核酸染料加入并进行混匀
D.鉴定DNA时,应将丝状物直接加入二苯胺试剂中进行沸水浴加热
答案　A　
8.★★★(2026届日照开学考)大肠杆菌经溶菌酶和去垢剂SDS(一端亲水、一端疏水的两性小分子)处理后,拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上,静置一段时间,质粒分布在上清液中,利用上述原理可初步获得质粒DNA,通过电泳可对质粒DNA进行鉴定。下列说法错误的是(　　)
A.提取质粒时溶菌酶和SDS能破坏细胞壁和细胞膜,释放DNA
B.提取质粒时将95%冷酒精加入上清液中,可使质粒DNA析出
C.电泳时载样缓冲液中的指示剂能与DNA结合,指示DNA位置
D.电泳时与加样孔距离相同的条带所含DNA分子大小可能不同
答案　C　
9.★★★(2025届名校联盟二模)R2逆转座子是真核生物中广泛存在的一种以RNA为媒介的逆转座子,它专一性地“定居”在宿主28S rDNA基因组位点上,借助宿主基因的启动子,合成自身的RNA和蛋白质并组装形成R2复合物。R2复合物可再次识别宿主28S rDNA上的专一性位点,通过逆转录最终合成R2基因序列,将R2基因序列重新整合到宿主基因组上,完成“复制—粘贴”。下列说法错误的是(　　)
A.宿主基因的启动子特定区域甲基化可能会使R2基因序列的“复制”过程无法完成
B.R2基因序列的“粘贴”过程需要RNA聚合酶、限制酶和DNA连接酶等参与
C.R2复合物的化学成分和核糖体相同
D.R2逆转座系统可实现RNA介导、高效精准的基因写入
答案　B　
10.★★★(2026届黑龙江哈尔滨六中开学考)用重组DNA技术可以赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中要使用多种工具酶,其中4种限制酶的切割位点如图所示。
回答下列问题:
(1)常用的DNA连接酶有　　　　　　　　和T4 DNA连接酶,图中　　　　　　　　酶切割后的DNA片段用T4 DNA连接酶比另一类DNA连接酶连接效率更高。
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与载体片段之间形成的化学键是　　　　　　。
(3)重组DNA技术中所用的质粒载体具有一些特征,如质粒DNA分子上有复制原点,可以保证质粒在受体细胞中　　　　;质粒DNA分子上有一至多个　　　　　　　　　,供外源DNA片段插入其中;质粒DNA分子上常有特殊的　　　　基因(如某种抗生素抗性基因),便于重组DNA分子的筛选。
(4)表达载体含有启动子,启动子是指位于基因上游的一段有特殊序列结构的DNA片段,是　　　　　　　　识别和结合的部位,能驱动　　　　过程。
答案　(1)E.coli DNA连接酶　SmaⅠ和EcoRⅤ　(2)磷酸二酯键　(3)复制　限制酶的切割位点　标记　(4)RNA聚合酶　转录
第2节　PCR和电泳
五年高考
1.★★(2024黑、吉、辽,7,2分)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验,下列叙述正确的是(　　)
A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C.在同一电场作用下,DNA片段越长,向负极迁移速率越快
D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
答案　A　
2.★★(2022辽宁,12,2分)抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据,采用PCR方法进行目的基因监测,反应程序如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A.预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B.后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C.延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D.转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
答案　B　
3.★★★(2025全国,6,6分)琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析,样品1~4的电泳结果如图所示(“+”“-”分别代表电泳槽的阳极和阴极)。已知样品1和2中的DNA分子分别是甲和乙,甲只有限制酶R的一个酶切位点,样品3和4中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是(　　)
A.配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液
B.该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷
C.甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同
D.据图推测样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物
答案　D　
4.★★★(2025全国,34,12分)为在大肠杆菌中表达酶X,某同学将编码酶X的基因(目的基因)插入质粒P0,构建重组质粒PX,并转入大肠杆菌。该同学设计引物用PCR方法验证重组质粒构建成功(引物1~4结合位置如图所示,→表示引物5'→3'方向)。回答下列问题:
(1)PCR是根据DNA复制原理在体外扩增DNA的技术。在细胞中DNA复制时解开双链的酶是　　　　,而PCR过程中解开双链的方法是　　　　　　。
(2)PCR过程中,因参与合成反应、不断消耗而浓度下降的组分有　　　　　　　　　　　　。
(3)该同学进行PCR实验时,所用模板与引物见表。实验中①和④的作用是　　　　　　　　　　　　;②无扩增产物,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　;③、⑤和⑥有扩增产物,扩增出的DNA产物分别是　　　　　　　　　　　　　　　　　。
管号 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥
模板 无 P0 PX 无 P0 PX
引物对 引物1和引物2 引物3和引物4
(4)设计实验验证大肠杆菌表达的酶X有活性,简要写出实验思路和预期结果 　。
答案　(1)解旋酶　高温变性　(2)引物、脱氧核苷三磷酸　(3)作为对照(或答:鉴定反应体系是否有模板污染)　P0不含与引物1和引物2互补的碱基序列　目的基因、质粒片段、含目的基因和部分质粒序列的片段　(4)提取酶X,催化相应底物(反应物)的反应,检测是否有产物生成。若有产物生成,则证明酶X有活性
三年模拟
5.★★(2025届烟台三模)下列关于“DNA片段的扩增及电泳”实验的叙述,错误的是(　　)
A.进行PCR时设计的引物长度和GC含量对PCR均有影响
B.PCR组分添加完成后用移液器轻吸混匀立即置于仪器使反应充分进行
C.新的TaqDNA聚合酶可分装成小份并低温保存以防频繁取用导致酶失活
D.琼脂糖凝胶电泳时,电泳缓冲液可维持pH,使溶液具有导电性,利于核酸迁移
答案　B　
6.★★(2026届德州开学考)某研究小组针对植物抗逆基因进行了以下实验:首先从耐旱植物叶片中提取总DNA,再利用PCR技术扩增抗逆基因,最后通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测与鉴定。下列实验操作正确的是(　　)
A.叶片研磨液置于4 ℃冰箱中几分钟后,需充分摇匀再进行提取
B.PCR实验中设置75 ℃的目的是便于引物与模板链结合
C.配制琼脂糖凝胶浓度时需要考虑待分离的抗逆基因片段的大小
D.通过电泳鉴定PCR产物时,正常情况下会出现5条DNA带
答案　C　
7.★★★(2025届烟台三模)双脱氧核苷酸测序法可测定DNA的碱基序列。dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)是dATP、dGTP、dTTP、dCTP四种物质的统称,常在PCR中作原料。ddNTP(双脱氧核苷三磷酸)有ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP四种。在4组标准PCR反应体系中加入特定的ddNTP,ddNTP可取代相应的dNTP,终止DNA子链的延伸,反应后得到不同长度的DNA片段混合物,再进行凝胶电泳放射自显影测序。如图是利用该技术对某一单链DNA片段的测序电泳图谱。下列说法错误的是(　　)
A.该PCR反应体系中可不加入ATP供能,Mg2+可激活相关酶的活性
B.4组反应体系中除加入dNTP作原料外,还应分别加入某一种双脱氧核苷三磷酸
C.加入ddCTP的反应体系中最多获得3条长短不同的子链
D.根据测序电泳图谱分析,待测DNA的碱基序列是3'-GACTGCCA-5'
答案　D　
8.★★★(2026届重庆八中月考)双温PCR是一种通过合并复性与延伸步骤优化反应效率的核酸扩增技术。相较于传统PCR,双温PCR在保持特异性的同时显著缩短反应时间。已知公猪的Y染色体上存在SRY基因,在进行双温PCR时通常选GAPDH基因(在两种性别中均表达)作为内参基因。科研人员用电泳法检测了5份公猪和5份母猪全血DNA样品的扩增产物,结果如图。关于此项实验,下列说法最合理的是(　　)
A.该技术缩短反应时间的原因是其变性步骤所需温度更低、时间更短
B.合并复性和延伸时,应选择72 ℃保证DNA聚合酶活性最佳
C.内参基因309 bp的条带比SRY基因404 bp的条带在电泳时运动更快
D.该PCR反应体系中加入4种引物和其他PCR的材料才能实现实验目的
答案　D　
微专题　PCR引物设计、选择及应用
五年高考
1.★★(2023浙江6月选考,19,2分)某研究小组利用转基因技术,将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端,如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只,交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型,设计了引物1和引物2用于PCR扩增,PCR产物电泳结果如图乙所示。
下列叙述正确的是(　　)
A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达
B.翻译时先合成Gata3蛋白,再合成GFP蛋白
C.2号条带的小鼠是野生型,4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子
D.若用引物1和引物3进行PCR,能更好地区分杂合子和纯合子
答案　B　
2.★★★(2024山东,5,2分)制备荧光标记的DNA探针时,需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP)的反应管①~④中,分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则,且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有(　　)
A.①②　　　　B.②③
C.①④　　　　D.③④
答案　D　
3.★★★★(2025陕晋青宁,21,10分)马铃薯作为重要农作物,提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现,野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关,将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。
(1)PCR扩增目的基因时,需要模板DNA、引物、　　　　　　　　　　　、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的　　　　步骤中起作用。
(2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体,PCR扩增S基因时需在引物的　　　　(填“5'端”或“3'端”)添加限制酶识别序列,结合表分析,上游引物应添加的碱基序列是5'-　　　　-3',切割载体时应选用的两种限制酶是　　　　　　　。PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后,经纯化和连接,获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。
(3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时,基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞,将S基因整合到　　　　　　　　　　　,抗性基因　　　　可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经　　　　形成芽、根,继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。
答案　(1)4种脱氧核苷酸　延伸　(2)5'端　AGATCT　BamHⅠ、EcoRⅠ　(3)栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体上　2　再分化
4.★★★★(2023山东,25,10分)科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测,该质粒的部分结构如图甲所示。其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是　　　　。除图甲中标出的结构外,作为载体,质粒还需具备的结构有　　　　　　　　　　(答出2个结构即可)。
(2)构建重组质粒后,为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物　　　　。已知J基因转录的模板链位于b链,由此可知引物F1与图甲中J基因的　　　　(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平,结果如图乙所示。其中,出现条带1证明细胞内表达了　　　　　　,条带2所检出的蛋白　　　　(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。
答案　(1)RNA聚合酶　标记基因、复制原点(或限制性酶切位点)　(2)F2和R1(或“F1和R2”)　a链　(3)J-V5融合蛋白　不是
5.★★★★(2025黑吉辽蒙,25,11分)香树脂醇具有抗炎等功效,从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N,可高效生产香树脂醇。回答下列问题。
(1)可从　　　　　中查询基因N的编码序列,设计特定引物。如图1所示,a链为转录模板链,为保证基因N与质粒pYL正确连接,需在引物1和引物2的5'端分别引入　　　　　和　　　　限制酶识别序列。PCR扩增基因N,特异性酶切后,利用　　　　连接DNA片段,构建重组质粒,大小约9.5 kb(kb为千碱基对),假设构建重组质粒前后,质粒pYL对应部分大小基本不变。
(2)进一步筛选构建的质粒,以1~4号菌株中提取的质粒为模板,使用引物1和引物2进行PCR扩增,电泳PCR产物,结果如图2。在第5组的PCR反应中,使用无菌水代替实验组的模板DNA,目的是检验PCR反应中是否有　　　　的污染。初步判断实验组　　　　(从“1~4”中选填)的质粒中成功插入了基因N,理由是　 　。
(3)为提高香树脂醇合酶催化效率,将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列,丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列),b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物,其配对模板与a的配对模板相同。据此分析,丙氨酸的密码子除GCA外,还有　　　　。
(4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的　　　　含量并进行比较,可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。
答案　(1)序列数据库(如GenBank)　XhoⅠ　XbaⅠ　DNA连接酶/T4 DNA连接酶/E.coli DNA连接酶　(2)外源DNA/外源基因N　1　质粒pYL大小为7.2 kb,重组质粒大小约为9.5 kb,可推断插入的基因N约有2.3 kb(2 300个碱基对),与DNA电泳图中1号样品大小接近,因此判断该组基因N导入成功　(3)GCC　(4)香树脂醇
三年模拟
6.★★(2025届滨州二模)应用农杆菌转化法时,目的基因插入T-DNA后,需要对T-DNA测序。测序前根据目的基因的序列设计引物对T-DNA进行PCR扩增的过程如图所示。下列说法正确的是(　　)
注:图中a、b、c、d为引物。
A.实验需要清楚目的基因的全部碱基序列
B.L、R酶切位点需要在T-DNA外侧,且需用同种限制酶切割
C.引物设计时需要考虑目的基因两侧序列,选择引物b、c
D.1个环状DNA分子首次PCR后得到的DNA分子含有两个游离的磷酸基团
答案　D　
7.★★★(2026届湖北名校联考)某科研小组利用PCR定点突变技术培育抗冻蔬菜新品种。设计含有非特异性碱基配对的引物,将突变位点引入编码抗冻蛋白的基因中,获得抗冻能力更强的突变基因。下列叙述正确的是(　　)
A.过程②还需要四种核糖核苷酸和耐高温的DNA聚合酶
B.过程③至少需要两次循环才能得到两条链等长的DNA分子
C.过程④需要使用引物1和4才能获得目的基因
D.合成的DNA分子经混合、变性、杂交后发现,通过引物2和3延伸形成的两条链能杂交在一起,说明引物2和3的碱基序列相同
答案　B　
8.★★★(不定项)(2026届德州开学考)荧光定量PCR技术可定量检测样本中DNA含量,其原理是在PCR反应体系中加入与模板链互补的一种荧光探针,Taq DNA聚合酶催化子链延伸至探针处水解探针,释放出荧光分子,从而使荧光监测系统接收信号。如图为对甲、乙、丙三个样本进行荧光定量PCR获得的荧光强度变化曲线。a、b、c分别表示三个样本中荧光强度达到P时所经历的循环数。下列说法正确的是(　　)
A.确保复性时引物和荧光探针均与模板DNA结合
B.根据图中曲线可知丙样本中的DNA含量最多
C.平台期的出现说明PCR反应体系中引物和荧光探针已消耗完
D.PCR过程中若一个DNA分子扩增n轮,共消耗2n-1个探针
答案　ACD　
9.★★★(2026届省实验中学期中)T-DNA插入失活是研究植物基因功能的常用方法,研究者将带有卡那霉素抗性基因的T-DNA插入拟南芥2号染色体的A基因内,使其突变为丧失功能的a基因,花粉中A基因功能的缺失会造成其不育。
回答下列问题:
(1)上述拟南芥中发生的变异类型为　　　　　　　　　　　　　。
(2)为进一步验证基因A的功能,将另一个A基因插入Aa植株的3号染色体。仅考虑基因A和a,该植株会产生　　　种基因型的可育花粉,其中具有a基因的花粉占比为　　　。该植株自交得到F1。利用图1所示引物P1和P2、P1和P3分别对F1进行PCR检测,电泳结果如图2所示。根据电泳结果F1植株分为Ⅰ型和Ⅱ型,其中Ⅰ型植株占比为　　　　。F1中没有检测到仅扩增出600 bp条带的植株,其原因为　 　。
答案　(1)基因突变　(2)3　1/3　2/3　仅含a基因的花粉不育(或“可育花粉一定含A基因”或“F1没有基因型为aa的植株”或“F1植株必含有A基因”)
第3节　基因工程的基本操作程序
　　　　　　　　　　　　　　　　
五年高考
1.★★★(2024江西,12,2分)γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coli A,构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E.coli B。下列叙述正确的是(　　)
A.图中表明,可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB
B.E.coli B发酵生产γ-氨基丁酸时,L-谷氨酸钠的作用是供能
C.E.coli A和E.coli B都能高效降解γ-氨基丁酸
D.可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒
答案　D　
2.★★★(2024新课标,5,6分)某种二倍体植物的P1和P2植株杂交得F1,F1自交得F2。对个体的DNA进行PCR检测,产物的电泳结果如图所示,其中①~⑧为部分F2个体,上部2条带是一对等位基因的扩增产物,下部2条带是另一对等位基因的扩增产物,这2对等位基因位于非同源染色体上,下列叙述错误的是(　　)
A.①②个体均为杂合体,F2中③所占的比例大于⑤
B.还有一种F2个体的PCR产物电泳结果有3条带
C.③和⑦杂交子代的PCR产物电泳结果与②⑧电泳结果相同
D.①自交子代的PCR产物电泳结果与④电泳结果相同的占1/2
答案　D　
3.★★★★(2025四川,19,11分)杆菌M2合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉索西丁能与细菌的核糖体结合,阻止携带氨基酸的tRNA进入核糖体位点2。有人将合成拉索西丁的相关基因(lrcA-lrcF)导入链霉菌,基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如图。回答下列问题。
注:①F1、F2、F3和F4为与相应位置的DNA配对的单链引物,“→”指引物5'→3'方向。②密码子对应的氨基酸:AAA—赖氨酸;AUG—甲硫氨酸(起始);UUC—苯丙氨酸;ACA—苏氨酸;UCG—丝氨酸。
(1)用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF目的基因时,应选用　　　　　引物。本研究载体使用了链霉菌的复制原点,其目的是 　 。
(2)采用EcoRⅠ和BamHⅠ完全酶切构建的重组质粒,产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生　　　　条电泳条带,电泳检测酶切产物的目的是　 。
(3)由图可知,拉索西丁与核糖体结合后,会阻止携带　　　　(填氨基酸名称)的tRNA进入结合位点,导致　　　　,最终引起细菌死亡。
(4)重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性,但重组菌在实验室多次培养后,提取的目的基因产物杀菌活性丧失,可能的原因是　　　　　　　　　　　　　。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物,除产物活性外还需进一步研究的问题有　　　　　　　　(答出1点即可)。
答案　(1)F2、F4　保证载体能在链霉菌细胞中正常复制　(2)2　验证重组质粒是否构建成功
(3)苯丙氨酸　翻译受阻　(4)目的基因发生突变(或变异)　发酵条件优化(或产物的分离和纯化方法等)
4.★★★★(2025广东,21,11分)大肠杆菌是重要工业菌株之一,其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量,使细胞适配不同阶段的生产需求,研究者设计了两种质粒,并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白,测试质粒功能。
回答下列问题:
(1)研究者首先构建质粒①(图a)用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKate2,将质粒导入感受态细胞后,在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况,结合PCR及　　　　检测,筛选获得重组菌株W1。
注:PGeo为大肠杆菌内源启动子,在细胞快速生长期开启基因转录,但进入生长稳定期后即停止基因转录;SsrA基因编码SsrA短肽;C-末端带有SsrA短肽的蛋白质可被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并以一定速率降解。
图a
(2)将W1在适宜条件下进行摇瓶培养,定时取样检测培养液中细胞密度,方法有　　　　　　　　　(答一种)。接种前需检测液体培养基的荧光强度,其作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。培养结果(图b)表明,进入生长稳定期后荧光强度快速下降,原因是　 　。
(3)研究者选用启动子PX、X基因(编码阻遏蛋白X,阻遏PX开启转录),重新构建质粒②(图a),导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养,W2的生长趋势不变,培养期间荧光强度的变化趋势为 　。
(4)莽草酸是一种重要工业化学品,其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱,且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物,因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长,并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累,利用上述两种质粒的调控功能,结合野生型菌株遗传物质的改造,提出重组生产菌株构建思路: 　。
图c
答案　(1)荧光(强度)　(2)细菌计数板计数法(或显微镜直接计数法/稀释涂布平板法/血细胞板计数法)　作为mKate2蛋白的荧光对照　启动子PGeo停止驱动mKate2-SsrA基因的转录,(mKate2)蛋白合成减少,且持续被降解　(3)快速生长期荧光值较低,生长稳定期快速增强　(4)用酶A基因替换质粒②中mKate2基因,用酶B基因替换质粒①中mKate2基因,构建酶B基因缺失的大肠杆菌突变菌株,并导入上述质粒
三年模拟
5.★★(2025届青岛三模)在构建基因表达载体时,需要遵循一定的规则。同时面对实际问题,可利用分子生物学原理加以解决。下列说法正确的是(　　)
A.利用不同的限制酶对载体和目的基因进行剪切而形成的黏性末端无法再次连接
B.若要降低细胞中某基因的表达,可将该基因的编码序列反向连接到基因表达载体中
C.如果目的基因没有合适的酶切位点,可以在引物3'端末尾设计加入酶切位点
D.表达载体中标记基因不需要启动子,可以在受体细胞中持续表达
答案　B　
6.★★(2025届校际联考)探针技术可以用来筛选目的基因。研究人员根据目的基因的一部分DNA序列,可以设计一个DNA单链作探针。DNA单链探针作用原理如图所示。下列说法错误的是(　　)
A.探针与目的基因某条链的部分碱基序列相同
B.若DNA样本具有目的基因,该DNA只有一条链能与探针结合
C.利用DNA单链探针,合成其互补链,两者可在PCR技术中用作目的基因的引物
D.若该DNA探针,与被测生物的mRNA未形成杂合双链,不能说明该生物不含目的基因
答案　C　
7.★★★(2025届泰安二模)双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达,研究人员构建了如图所示的表达载体,以检测双向启动子作用效果。下列分析正确的是(　　)
A.表达载体中GUS基因和LUC基因转录时使用同一条DNA单链为模板
B.通过观察是否出现荧光和蓝色物质可检测双向启动子的作用效果
C.在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的受体细胞
D.为连入GUS基因,需用SalⅠ和SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒
答案　B　
8.★★★★(2026届潍坊开学考)研究发现,COX-2基因表达产物可以促进肿瘤细胞的迁移,而HDAC2基因高表达会影响COX-2表达。科研人员利用siRNA干扰技术靶向抑制HDAC2表达,以研究HDAC2和COX-2表达情况对胃癌细胞迁移的影响。实验中使用的DNA结构如图1,A、B、C、D代表与DNA链互补的引物,BamHⅠ、SacⅠ为限制酶。
(1)启动子是一段有特殊结构的DNA片段,能被　　　　　识别并结合,驱动基因的　　　。
(2)已知COX-2基因的2链为转录的模板链,利用PCR扩增目的基因时,需要加入的引物为　　　　　(填字母)。为使基因准确插入质粒,引物　　　(填“3'端”或“5'端”)需添加限制酶　　　　和限制酶　　　　　的识别序列。
(3)siRNA可与特定基因的mRNA互补配对,从而导致　　　　　终止,达到抑制基因表达的目的。在设计siRNA时,其长度不能过短,原因是　。
(4)研究人员用不同的方式处理胃癌细胞,测出胃癌细胞迁移标志蛋白含量如图2所示。据此推测,HDAC2基因影响胃癌细胞迁移的原理是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
答案　(1)RNA聚合酶　转录　(2)B和C　5'端　BamHⅠ　SacⅠ　(3)翻译　避免siRNA与非目标mRNA结合　(4)HDAC2基因高表达会促进COX-2基因的表达,从而抑制肿瘤细胞的转移
微专题　限制酶的选择和转基因“受体细胞”的筛选
五年高考
1.★★(2023湖北,4,2分)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　)
A.若用Hind Ⅲ酶切,目的基因转录的产物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因
C.若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
答案　D　
2.★★★(2025安徽,15,3分)质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因,将该质粒导入大肠杆菌细胞后,其编码的酶可分解X-gal,产生蓝色物质,进而形成蓝色菌落,如图所示。科研小组以该质粒作为载体,采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是　(　　)
A.使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率,可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数
B.如果筛选平板中仅含卡那霉素,生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株
C.因质粒K中含两个标记基因,筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株
D.若筛选平板中蓝色菌落偏多,原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌
答案　C　
3.★★★★(2025山东,25,12分)种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造,利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中,筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比,突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。
图甲　Ti质粒与抗除草剂基因信息
(1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为　　　　。选用图甲中的SmaⅠ对抗除草剂基因X进行完全酶切,再选择SmaⅠ和　　　　对Ti质粒进行完全酶切,将产生的黏性末端补平,补平时使用的酶是　　　　　　　　　。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接,构建重组载体,转化大肠杆菌;经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶　　　　　　　进行完全酶切并电泳检测,若电泳结果呈现一长一短2条带,较短的条带长度近似为　　　　bp,则一定为正向重组质粒。
(2)为证明这两个突变体是由T-DNA插入小麦基因组中同一基因导致的,提取基因组DNA,经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段(图乙)。在此酶切过程中,限于后续PCR难以扩增大片段DNA,最好使用识别序列为　　　　(填“4”“6”或“8”)个碱基对的限制酶,且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段　　　　,才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后,进行了一系列操作,其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为　　　　　　　　　(填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”)。
图乙　基因组DNA酶切后含T-DNA的片段
(3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株,如果检测到野生型基因,　　　　(填“能”或“不能”)确定该植株的表型为野生型。
答案　(1)复制原点　XbaⅠ　DNA聚合酶　Spe Ⅰ、Sma Ⅰ　550　(2)4　连接(或环化)　测序和序列比对　(3)不能
4.★★★★★(2021山东,25,12分)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点,该位点结合BCL11A蛋白后,γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列,解除对γ基因表达的抑制,可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段,将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测,以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达,需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知,在F1~F7末端添加的序列所对应的限制酶是　　　　,在R末端添加的序列所对应的限制酶是　　　　　。本实验中,从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要　　　　种酶。
(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞,成功转化后,含F1~F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白,受体细胞有荧光,含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是　　　　　　　　　　　　　　 　。
(3)向培养液中添加适量的雌激素,含F1~F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光,而含F5~F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列,据此结果可推测,BCL11A蛋白结合位点位于　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　,理由是　 　。
答案　(1)SalⅠ(2分)　EcoRⅠ(2分)　6(3分)　(2)F7与R扩增产物不含完整的启动子,荧光蛋白基因不表达(2分)　(3)引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上(1分)　根据有无荧光情况判断,F1~F4与R扩增产物上均有结合位点,因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧);F5~F6与R扩增产物上均无结合位点,可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧),所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上(2分)
5.★★★★★(2024山东,25,12分)研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L,可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列,将载体导入大豆细胞后,其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。
图甲:载体信息
LB/RB:T-DNA的边界序列;Kanr:卡那霉素抗性基因;Ampr:氨苄青霉素抗性基因
图乙:目标基因L部分序列
图丙:限制酶识别序列、切割位点及电泳结果
(1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时,所用的引物越短,引物特异性越　　　(填“高”或“低”)。限制酶在切开DNA双链时,形成的单链突出末端为黏性末端,若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA,理论上可产生的黏性末端最多有　　　种。载体信息如图甲所示,经BsaⅠ酶切后,载体上保留的黏性末端序列应为5'-　　　-3'和5'-　　　　-3'。
(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞,使用抗生素　　　　筛选到具有该抗生素抗性的植株①~④。为了鉴定基因编辑是否成功,以上述抗性植株的DNA为模板,通过PCR扩增目标基因L,部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示,PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是　　　,其中纯合的突变植株是　　　　(填序号)。
(3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株,该植株具有抗生素抗性,检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代,其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为　　　　,筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
答案　(1)低　256　CAAT　GTTT　(2)卡那霉素　SacⅠ　④　(3)1/4
三年模拟
6.★★★(2026届九五协作体开学考)研究者欲将经RT-PCR技术(通过RNA形成DNA,并以此为模板进行扩增的技术)获得人的相关目的基因导入大肠杆菌的质粒中保存,相关质粒及目的基因如图1、2所示。该质粒上含有氨苄青霉素抗性基因、LacZ基因及一些酶切位点,相关限制酶识别序列和切割位点如表所示。LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解化合物X-gal产生蓝色物质,使菌落呈现蓝色,否则菌落为白色。
BamHⅠ 5'-G↓GATCC-3'
EcoRⅠ 5'-G↓AATTC-3'
MfeⅠ 5'-C↓AATTG-3'
KpnⅠ 5'-GGTAC↓C-3'
HindⅢ 5'-A↓AGCTT-3'
(1)已知图2中乙链为目的基因转录的模板链。为了将目的基因插入质粒正确位置,且避免质粒和目的基因自身环化,最好选择用限制酶　　　　　　　　处理质粒,选用限制酶　　　　　　　　处理目的基因。
(2)已知目的基因mRNA的序列为5'-UGAAC-GCUA…(中间序列)…GUCGACUCG-3'。研究人员欲对目的基因的mRNA进行RT-PCR,为了便于将扩增后的基因和载体成功构建成重组质粒,用于PCR扩增的引物为　　　　(填写序号)。
①5'-TGAACGCTA…　　　　②5'-AAGCTTCGA…
③5'-CGAGTCGAC…　　　　④5'-GAATTCTGA…
(3)启动子通常具有物种特异性,为使目的基因在大肠杆菌中表达,在质粒中插入目的基因时,其上游启动子应选择　　　　　(填“人”或“大肠杆菌”)的启动子。在目的基因表达过程中,与启动子结合的酶是　　　　　　。
(4)将重组质粒导入普通大肠杆菌中,为筛选含有目的基因的大肠杆菌,需要将导入操作之后的大肠杆菌接种到含　　　　　　　　　　的固体培养基中培养,挑选　　　　色的菌

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