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热主题4　生物工程综合运用及其基础
整 合 构 建
典 题 固 法
(2022·广东卷)“绿水逶迤去，青山相向开。”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气(含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业)为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。请回答下列问题：
(1)研究者针对每个需要扩增的酶基因(如图)设计一对__ __，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。
(2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是__ __，终止子的作用是__ __。
(3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是__ __，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
(4)这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了__ __，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于__ __，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
(2025·惠州一模)科学家们正在开发一种混有枯草芽孢杆菌孢子的新型复合塑料，该孢子能耐受塑料生产工艺中的高温热熔条件。废弃复合塑料内的孢子在特定条件下能萌发产生大量枯草芽孢杆菌，从而有效分解塑料。请回答下列问题：
(1)在实验室中培养枯草芽孢杆菌时，可根据菌落的__ __将它与其他微生物初步区分开，再将接种有枯草芽孢杆菌的培养基置于__ __条件下培养来筛选所需的菌株。
(2)适应性实验室进化（ALE）是指通过模拟自然选择过程，在实验室中对微生物进行长期培养和筛选，使其逐渐适应特定环境条件。与其相比，利用基因工程直接改造微生物的优点是__ __。
(3)科学家对经过ALE处理的孢子进行了全基因组测序，发现fusA突变和abrB突变均能够显著提高孢子的耐热性。为了进一步探究这两种突变对提高孢子耐热性是否存在协同效应，请写出相关实验设计思路：__ __。
(4)科学家将表面蛋白基因cotB与绿色荧光蛋白基因gfp构建成基因表达载体，导入耐热孢子形成的菌株中表达出融合蛋白，从而使绿色荧光能锚定在细胞表面，显示材料中孢子的萌发状态。下图中最适合的表达载体是__ __，判断理由是__ __。
甲 乙
注：Ampr为氨芐青霉素抗体基因，?表示转录方向，UAG、UAA、UGA是终止密码子，AUG是起始密码子。
(5)未来若将该技术应用于生产实践中，还需考虑哪些具体问题：__ __(回答1点即可)。
(2025·深圳一模)乳糖操纵子是大肠杆菌中一个经典的基因表达调控系统，该系统在生物工程和分子生物学中有广泛应用。图1表示乳糖操纵子调控结构基因表达的过程，请回答下列问题：
图1
(1)大肠杆菌会优先利用葡萄糖，同时添加葡萄糖和乳糖的培养基培养大肠杆菌，早期大肠杆菌主要是利用__ __(填“①”或“②”)途径调控结构基因。当培养基中的葡萄糖消耗完，大肠杆菌开始利用乳糖进行自身代谢，此时乳糖作为__ __为大肠杆菌提供营养，阻遏蛋白主要与__ __结合，从而调控结构基因表达。
(2)研究人员对传统乳糖操纵子的阻遏蛋白进行分子内的光控化改造，利用蓝光可以改变阻遏蛋白的结构，如图2所示。用蓝光照射时，GFP基因的表达情况是__ __。
根据该原理，研究人员构建了如图3的基因表达载体，除未标出终止子外，该表达载体缺少的结构是__ __。
图2
KanR表示卡那霉素抗体基因
Ori表示复制原点
GFP为目的基因
图3
(3)为验证阻遏蛋白光控化改造后的调控效果，研究人员用野生型大肠杆菌、IPTG(诱导物)、光控化改造后的大肠杆菌进行验证实验，请完成以下表格中4组实验的设置情况，表格里用“－”和“＋”分别表示不处理和处理。
处理 组别
1 2 3 4
野生型大肠杆菌 光控化改造后的 大肠杆菌
IPTG － ＋ － －
蓝光 － － ＋ －
(4)为验证阻遏蛋白光控化改造后的空间控制效果，将光控化改造后的大肠杆菌涂布在培养基上，蓝光环境下用三角形遮光板遮挡培养基(如图4)，适宜温度下培养一段时间后，描述紫外灯下培养基的实验现象：__ __。
若用成功转化后的大肠杆菌构建其他形状的荧光图案，需要进行的调控是__ __。
图4　培养基遮光示意图(黑色区域为遮光区)(共15张PPT)
大专题七
热主题建构
跨模块融合
热主题4　生物工程综合运用及其基础
整　合　构　建
典例1　(2022·广东卷)“绿水逶迤去，青山相向开。”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气(含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业)为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。请回答下列问题：
典　题　固　法
(1)研究者针对每个需要扩增的酶基因(如图)设计一对_______，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。
引物
(2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是_______________________________________________ ________________，终止子的作用是_____________。
(3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是_________________________________________________________，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
(4)这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了___________________________ ______，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于__________________________，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
作为标记基因，筛选含有目的基因/重组质粒/pMTL80k的细胞
使转录终止
酶蛋白大量表达消耗了大量物质和能量，而厌氧代谢供能不足
工业废气的资源化(废弃物再利用)
通过捕获CO2实现固碳减排
解析：利用PCR技术扩增目的基因，首先需要根据目标酶基因两端的碱基序列设计一对引物，引物分别与两条模板链互补配对，而后Taq酶才能从引物的3′端延伸子链。基因表达载体中，抗生素抗性基因作为标记基因，可用于筛选含有目的基因的细胞。终止子可以使转录终止。
典例2　(2025·惠州一模)科学家们正在开发一种混有枯草芽孢杆菌孢子的新型复合塑料，该孢子能耐受塑料生产工艺中的高温热熔条件。废弃复合塑料内的孢子在特定条件下能萌发产生大量枯草芽孢杆菌，从而有效分解塑料。请回答下列问题：
(1)在实验室中培养枯草芽孢杆菌时，可根据菌落的___________将它与其他微生物初步区分开，再将接种有枯草芽孢杆菌的培养基置于_____________条件下培养来筛选所需的菌株。
(2)适应性实验室进化(ALE)是指通过模拟自然选择过程，在实验室中对微生物进行长期培养和筛选，使其逐渐适应特定环境条件。与其相比，利用基因工程直接改造微生物的优点是___________________________。
形态特征
适宜的温度
定向改造微生物的遗传特性
(3)科学家对经过ALE处理的孢子进行了全基因组测序，发现fusA突变和abrB突变均能够显著提高孢子的耐热性。为了进一步探究这两种突变对提高孢子耐热性是否存在协同效应，请写出相关实验设计思路：_________________________________ ____________________________________________________________________。
构建同时具有fusA突变和abrB突变的菌株，与仅有fusA突变和仅具有abrB突变的菌株进行比较，观察耐热性表现
(4)科学家将表面蛋白基因cotB与绿色荧光蛋白基因gfp构建成基因表达载体，导入耐热孢子形成的菌株中表达出融合蛋白，从而使绿色荧光能锚定在细胞表面，显示材料中孢子的萌发状态。如图中最适合的表达载体是_____，判断理由是________ ___________________________________________________________。
乙中TAG对应终止密码子，会导致翻译完cotB蛋白后不能继续翻译gfp蛋白
甲
甲
乙
注：Ampr为氨芐青霉素抗体基因， 表示转录方向，UAG、UAA、UGA是终止密码子，AUG是起始密码子。
(5)未来若将该技术应用于生产实践中，还需考虑哪些具体问题：_______________ ____________________________(回答1点即可)。
确保孢子在不同环境条件下的稳定性和活性
解析：(3)该实验的目的是探究fusA突变和abrB突变对提高孢子耐热性是否存在协同效应，因此要构建同时具有fusA突变和abrB突变的菌株，可将实验分为三组，甲组为fusA突变的菌株，乙组为abrB突变的菌株，丙组为同时具有fusA突变和abrB突变的菌株，将三组菌株放到高温环境下培养一段(相同)时间，观察三组菌株的耐热性表现，若丙组菌株的耐热性大于甲和乙，则说明fusA突变和abrB突变对提高孢子耐热性存在协同效应，反之不存在。(4)根据题意分析，表面蛋白基因cotB与绿色荧光蛋白基因gfp构建成基因表达载体，载体乙cotB基因与gfp基因之间有对应终止密码子的序列(TAG)，导入耐热孢子形成的菌株中不能表达出融合蛋白，故选择载体甲。
典例3　(2025·深圳一模)乳糖操纵子是大肠杆菌中一个经典的基因表达调控系统，该系统在生物工程和分子生物学中有广泛应用。图1表示乳糖操纵子调控结构基因表达的过程，请回答下列问题：
图1
(1)大肠杆菌会优先利用葡萄糖，同时添加葡萄糖和乳糖的培养基培养大肠杆菌，早期大肠杆菌主要是利用_____(填“①”或“②”)途径调控结构基因。当培养基中的葡萄糖消耗完，大肠杆菌开始利用乳糖进行自身代谢，此时乳糖作为_______为大肠杆菌提供营养，阻遏蛋白主要与_______________________结合，从而调控结构基因表达。
①
碳源
诱导物(乳糖、半乳糖)
(2)研究人员对传统乳糖操纵子的阻遏蛋白进行分子内的光控化改造，利用蓝光可以改变阻遏蛋白的结构，如图2所示。用蓝光照射时，GFP基因的表达情况是________________。
根据该原理，研究人员构建了如图3的基因表达载体，除未标出终止子外，该表达载体缺少的结构是_______________________________________________________ _____。
光控化改造后的调节基因(表达光控化改造后的阻遏蛋白的基因)
GFP基因不表达
图2
KanR表示卡那霉素抗体基因
Ori表示复制原点
GFP为目的基因
图3
(3)为验证阻遏蛋白光控化改造后的调控效果，研究人员用野生型大肠杆菌、IPTG(诱导物)、光控化改造后的大肠杆菌进行验证实验，请完成以下表格中4组实验的设置情况，表格里用“－”和“＋”分别表示不处理和处理。
处理 组别
1 2 3 4
野生型大肠杆菌 光控化改造后的大肠杆菌
IPTG － ＋ － －
蓝光 － － ＋ －
(4)为验证阻遏蛋白光控化改造后的空间控制效果，将光控化改造后的大肠杆菌涂布在培养基上，蓝光环境下用三角形遮光板遮挡培养基(如图4)，适宜温度下培养一段时间后，描述紫外灯下培养基的实验现象：_______________________。
若用成功转化后的大肠杆菌构建其他形状的荧光图案，需要进行的调控是___________________________________________。
显示三角形的荧光区域
用相应图案的遮光板遮盖培养基并用蓝光照射
图4　培养基遮光示意图(黑色区域为遮光区)
解析：(1)根据图1所示，①途径中调节基因表达的阻遏蛋白阻断了乳糖代谢相关基因的表达，大肠杆菌会优先利用葡萄糖。在同时添加葡萄糖和乳糖的培养基中，早期由于有葡萄糖存在，大肠杆菌主要利用①途径调控结构基因，从而抑制结构基因(乳糖代谢相关基因)的表达，从而优先利用葡萄糖。当葡萄糖消耗完后，乳糖作为碳源为大肠杆菌提供营养。 阻遏蛋白主要与操纵序列(O序列)结合，当阻遏蛋白结合在O序列上时，会阻碍RNA聚合酶与启动子(P序列)结合，从而抑制结构基因的转录。当有乳糖存在时，诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白构象改变，从O序列上解离下来，结构基因得以表达。(2)由图2可知，用蓝光照射时，GFP基因表达受阻。图3完整的基因表达载体应包括目的基因(GFP)、启动子、终止子、标记基因、复制原点和操纵区。图中除未标出终止子外，还缺少光控化改造后的调节基因(表达光控化改造后的阻遏蛋白的基因)。
(3)为验证阻遏蛋白光控化改造后的调控效果，表格中已知自变量之一为大肠杆菌种类，根据单一变量原则，野生型大肠杆菌由于对蓝光无反应，因此1组、2组均不给予蓝光。对于野生型大肠杆菌，只有在IPTG诱导时才会大量表达相关基因，1组作为空白对照，不添加IPTG，2组添加IPTG，得出诱导物对野生型大肠杆菌的影响；3组、4组均为光控化改造后的大肠杆菌，因此无需添加IPTG，一组给予蓝光、一组不给予，分析蓝光的作用。(4)结合图2可知，黑暗环境中荧光蛋白基因可以正常表达，因此在蓝光环境中，三角形遮光板区域的大肠杆菌中存在荧光蛋白，在紫外灯下发荧光，现象为三角形区域发荧光；想构建其他形状的荧光图案，只需改变遮光区形状即可，其余条件不变，仍放在蓝光下培养。热主题4　生物工程综合运用及其基础
整 合 构 建
典 题 固 法
(2022·广东卷)“绿水逶迤去，青山相向开。”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气(含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业)为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。请回答下列问题：
(1)研究者针对每个需要扩增的酶基因(如图)设计一对__引物__，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。
(2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是__作为标记基因，筛选含有目的基因/重组质粒/pMTL80k的细胞__，终止子的作用是__使转录终止__。
(3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是__酶蛋白大量表达消耗了大量物质和能量，而厌氧代谢供能不足__，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
(4)这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了__工业废气的资源化(废弃物再利用)__，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于__通过捕获CO2实现固碳减排__，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
解析：利用PCR技术扩增目的基因，首先需要根据目标酶基因两端的碱基序列设计一对引物，引物分别与两条模板链互补配对，而后Taq酶才能从引物的3′端延伸子链。基因表达载体中，抗生素抗性基因作为标记基因，可用于筛选含有目的基因的细胞。终止子可以使转录终止。
(2025·惠州一模)科学家们正在开发一种混有枯草芽孢杆菌孢子的新型复合塑料，该孢子能耐受塑料生产工艺中的高温热熔条件。废弃复合塑料内的孢子在特定条件下能萌发产生大量枯草芽孢杆菌，从而有效分解塑料。请回答下列问题：
(1)在实验室中培养枯草芽孢杆菌时，可根据菌落的__形态特征__将它与其他微生物初步区分开，再将接种有枯草芽孢杆菌的培养基置于__适宜的温度__条件下培养来筛选所需的菌株。
(2)适应性实验室进化(ALE)是指通过模拟自然选择过程，在实验室中对微生物进行长期培养和筛选，使其逐渐适应特定环境条件。与其相比，利用基因工程直接改造微生物的优点是__定向改造微生物的遗传特性__。
(3)科学家对经过ALE处理的孢子进行了全基因组测序，发现fusA突变和abrB突变均能够显著提高孢子的耐热性。为了进一步探究这两种突变对提高孢子耐热性是否存在协同效应，请写出相关实验设计思路：__构建同时具有fusA突变和abrB突变的菌株，与仅有fusA突变和仅具有abrB突变的菌株进行比较，观察耐热性表现__。
(4)科学家将表面蛋白基因cotB与绿色荧光蛋白基因gfp构建成基因表达载体，导入耐热孢子形成的菌株中表达出融合蛋白，从而使绿色荧光能锚定在细胞表面，显示材料中孢子的萌发状态。下图中最适合的表达载体是__甲__，判断理由是__乙中TAG对应终止密码子，会导致翻译完cotB蛋白后不能继续翻译gfp蛋白__。
甲 乙
注：Ampr为氨芐青霉素抗体基因，?表示转录方向，UAG、UAA、UGA是终止密码子，AUG是起始密码子。
(5)未来若将该技术应用于生产实践中，还需考虑哪些具体问题：__确保孢子在不同环境条件下的稳定性和活性__(回答1点即可)。
解析：(3)该实验的目的是探究fusA突变和abrB突变对提高孢子耐热性是否存在协同效应，因此要构建同时具有fusA突变和abrB突变的菌株，可将实验分为三组，甲组为fusA突变的菌株，乙组为abrB突变的菌株，丙组为同时具有fusA突变和abrB突变的菌株，将三组菌株放到高温环境下培养一段(相同)时间，观察三组菌株的耐热性表现，若丙组菌株的耐热性大于甲和乙，则说明fusA突变和abrB突变对提高孢子耐热性存在协同效应，反之不存在。(4)根据题意分析，表面蛋白基因cotB与绿色荧光蛋白基因gfp构建成基因表达载体，载体乙cotB基因与gfp基因之间有对应终止密码子的序列(TAG)，导入耐热孢子形成的菌株中不能表达出融合蛋白，故选择载体甲。
(2025·深圳一模)乳糖操纵子是大肠杆菌中一个经典的基因表达调控系统，该系统在生物工程和分子生物学中有广泛应用。图1表示乳糖操纵子调控结构基因表达的过程，请回答下列问题：
图1
(1)大肠杆菌会优先利用葡萄糖，同时添加葡萄糖和乳糖的培养基培养大肠杆菌，早期大肠杆菌主要是利用__①__(填“①”或“②”)途径调控结构基因。当培养基中的葡萄糖消耗完，大肠杆菌开始利用乳糖进行自身代谢，此时乳糖作为__碳源__为大肠杆菌提供营养，阻遏蛋白主要与__诱导物(乳糖、半乳糖)__结合，从而调控结构基因表达。
(2)研究人员对传统乳糖操纵子的阻遏蛋白进行分子内的光控化改造，利用蓝光可以改变阻遏蛋白的结构，如图2所示。用蓝光照射时，GFP基因的表达情况是__GFP基因不表达__。
根据该原理，研究人员构建了如图3的基因表达载体，除未标出终止子外，该表达载体缺少的结构是__光控化改造后的调节基因(表达光控化改造后的阻遏蛋白的基因)__。
图2
KanR表示卡那霉素抗体基因
Ori表示复制原点
GFP为目的基因
图3
(3)为验证阻遏蛋白光控化改造后的调控效果，研究人员用野生型大肠杆菌、IPTG(诱导物)、光控化改造后的大肠杆菌进行验证实验，请完成以下表格中4组实验的设置情况，表格里用“－”和“＋”分别表示不处理和处理。
处理 组别
1 2 3 4
野生型大肠杆菌 光控化改造后的 大肠杆菌
IPTG － ＋ － －
蓝光 － － ＋ －
(4)为验证阻遏蛋白光控化改造后的空间控制效果，将光控化改造后的大肠杆菌涂布在培养基上，蓝光环境下用三角形遮光板遮挡培养基(如图4)，适宜温度下培养一段时间后，描述紫外灯下培养基的实验现象：__显示三角形的荧光区域__。
若用成功转化后的大肠杆菌构建其他形状的荧光图案，需要进行的调控是__用相应图案的遮光板遮盖培养基并用蓝光照射__。
图4　培养基遮光示意图(黑色区域为遮光区)
解析：(1)根据图1所示，①途径中调节基因表达的阻遏蛋白阻断了乳糖代谢相关基因的表达，大肠杆菌会优先利用葡萄糖。在同时添加葡萄糖和乳糖的培养基中，早期由于有葡萄糖存在，大肠杆菌主要利用①途径调控结构基因，从而抑制结构基因(乳糖代谢相关基因)的表达，从而优先利用葡萄糖。当葡萄糖消耗完后，乳糖作为碳源为大肠杆菌提供营养。 阻遏蛋白主要与操纵序列(O序列)结合，当阻遏蛋白结合在O序列上时，会阻碍RNA聚合酶与启动子(P序列)结合，从而抑制结构基因的转录。当有乳糖存在时，诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白构象改变，从O序列上解离下来，结构基因得以表达。(2)由图2可知，用蓝光照射时，GFP基因表达受阻。图3完整的基因表达载体应包括目的基因(GFP)、启动子、终止子、标记基因、复制原点和操纵区。图中除未标出终止子外，还缺少光控化改造后的调节基因(表达光控化改造后的阻遏蛋白的基因)。(3)为验证阻遏蛋白光控化改造后的调控效果，表格中已知自变量之一为大肠杆菌种类，根据单一变量原则，野生型大肠杆菌由于对蓝光无反应，因此1组、2组均不给予蓝光。对于野生型大肠杆菌，只有在IPTG诱导时才会大量表达相关基因，1组作为空白对照，不添加IPTG，2组添加IPTG，得出诱导物对野生型大肠杆菌的影响；3组、4组均为光控化改造后的大肠杆菌，因此无需添加IPTG，一组给予蓝光、一组不给予，分析蓝光的作用。(4)结合图2可知，黑暗环境中荧光蛋白基因可以正常表达，因此在蓝光环境中，三角形遮光板区域的大肠杆菌中存在荧光蛋白，在紫外灯下发荧光，现象为三角形区域发荧光；想构建其他形状的荧光图案，只需改变遮光区形状即可，其余条件不变，仍放在蓝光下培养。

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