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专题十七 基因工程
1．(2025·广东一模)我国科学家利用外源抗虫基因——Bt基因成功培育出转基因抗虫棉，能专门破坏棉铃虫等鳞翅目害虫的消化系统，导致其死亡。下列说法正确的是(　　)
A．培育抗虫棉的原理是基因突变
B．相对普通棉花而言，抗虫棉是新物种
C．大面积推广种植抗虫棉以后，棉铃虫的基因频率将发生不定向改变
D．在抗虫棉附近种植少量普通棉花，可减少棉铃虫对抗虫棉的抗性
解析：D　培育抗虫棉是将外源抗虫基因(Bt基因)导入棉花细胞中，其原理是基因重组，A错误；相对普通棉花而言，抗虫棉只是转入了抗虫基因，并没有形成生殖隔离，所以抗虫棉不是新物种，B错误；大面积推广种植抗虫棉以后，由于抗虫棉对棉铃虫的选择作用，棉铃虫的基因频率将发生定向改变，C错误；在抗虫棉附近种植少量普通棉花，为棉铃虫提供了“避难所”，抗虫棉会优先选择食用普通棉花，使棉铃虫种群中不具有抗性的个体得以生存，可减少棉铃虫对抗虫棉的抗性，D正确。
2．(2025·汕头二模)利用人工智能模型(AI)预测蛋白质的结构和功能，极大地加速了人类对蛋白质的了解。下列叙述错误的是(　　)
A．AI可通过氨基酸序列预测蛋白质的空间结构
B．AI可基于大量数据构建结构与功能的匹配模型
C．AI分析氨基酸的差异可用于亲缘关系的比较
D．人工合成AI设计的蛋白质通常在细胞外进行
解析：D　蛋白质的空间结构与其氨基酸的排列顺序密切相关，AI可通过氨基酸序列预测蛋白质的空间结构，A正确；蛋白质的结构与功能是相适应的，基于大量已知蛋白质的结构和功能数据，AI可构建结构与功能的匹配模型，B正确；生物有共同祖先的分子生物学证据认为，不同生物中氨基酸的差异可反映它们之间的进化关系，AI分析氨基酸的差异可用于亲缘关系的比较，C正确；人工合成AI设计的蛋白质通常在细胞内合成，利用细胞内的核糖体、各种酶等来合成蛋白质，D错误。
3．(2025·佛山二模)某兴趣小组以香蕉为原材料进行DNA粗提取、扩增及电泳鉴定系列实验。下列叙述正确的是(　　)
A．提取DNA时，研磨后需用滤纸进行过滤
B．可利用DNA在酒精中溶解度大的特点来提取DNA
C．琼脂糖熔化前需将适量的核酸染料加入并进行混匀
D．若DNA带负电，则凝胶加样孔应位于电泳槽负极侧
解析：D　滤纸孔径较小，DNA容易吸附在滤纸上，提取DNA时，研磨后应该用纱布进行过滤，A错误；DNA不溶于酒精，利用这一特点，可向含DNA的滤液中加入冷酒精，使DNA析出，B错误；将琼脂糖熔化并稍微冷却后，再将适量的核酸染料加入并进行混匀，便于后续对DNA进行染色观察，C错误；若DNA带负电，在电泳过程中，DNA会向正极移动，所以凝胶加样孔应位于电泳槽负极侧，D正确。
4．(2025·揭阳一调)利用PCR 获得目的基因后，用限制酶EcoR Ⅰ同时处理目的基因与质粒，拼接后可得到重组基因表达载体，其部分DNA片段如下图所示。下列有关引物的分析正确的是(　　)
A．通过PCR获取目的基因时，所选的引物可为引物2和引物3
B．检测目的基因是否插入质粒且方向是否正确时，应选用引物1 和引物4进行PCR
C．若设计的引物与模板不完全配对，可适当提高 PCR 复性的温度
D．DNA聚合酶能与引物结合，并从引物的5′端连接脱氧核苷酸
解析：A　引物结合在模板链的3′端，通过PCR获取目的基因时，所选的引物可为引物2和引物3，A正确；引物结合在模板链的3′端，检测目的基因是否插入质粒且方向是否正确时，应选用引物2和引物4进行PCR，B错误；若设计的引物与模板不完全配对，可适当降低 PCR 复性的温度，以便引物与模板链结合，C错误；DNA聚合酶能与引物结合，并从引物的3′端连接脱氧核苷酸，D错误。
5．(2025·深圳一模)研究者从酵母菌中获取控制细胞色素氧化酶(存在于线粒体)的某一段肽合成的DNA片段，将其与小鼠的二氢叶酸还原酶(只存在于细胞质基质)基因融合。重组基因在酵母菌表达后，在线粒体中发现了二氢叶酸还原酶。该研究的目的是(　　)
A．获得融合蛋白
B．研究该段肽的作用
C．引导二氢叶酸还原酶进入线粒体
D．研究重组基因的功能
解析：D　重组基因在酵母菌表达后，在线粒体中发现了二氢叶酸还原酶，该酶不是新融合蛋白，A不符合题意；获得的是二氢叶酸还原酶，它由二氢叶酸还原酶基因指导合成，跟该段肽没有关联，该研究的目的并不是研究该段肽的作用，B不符合题意；该实验没有体现引导二氢叶酸还原酶直接进入线粒体的过程，C不符合题意；该研究的目的是研究重组基因的功能，或者是表达情况，D符合题意。
6．(11分)(2025·东莞中学等六校二联)利用乳酸菌构建表达抗原蛋白的工程菌是研究抗原应用的重要手段之一，口服的乳酸菌可在消化道内定植存活，其表达的抗原蛋白可锚定于细胞表面(穿过细胞膜展示在细胞表面)，诱导机体产生免疫反应。科学家将某病毒抗原蛋白的部分编码序列(RBD)拼接成融合基因2RBD和3RBD，探究RBD的二聚体蛋白和三聚体蛋白能否模拟抗原蛋白中RBD的天然构象并获得高效免疫原性。重组质粒构建流程如图1所示，NcoⅠ和SacⅠ是pNZ8149质粒上的限制酶识别位点，U-M为信号肽—细胞壁锚定蛋白序列。回答下列问题：
图1
图2
(1)为满足乳酸菌生长的特殊需求，培养基除了必须提供___________等基本成分外，还需要添加________，并在无氧的环境条件下培养。
(2)拼接形成的融合基因不具备限制酶切割位点，利用PCR技术对融合基因进行扩增时，所用两种引物的________(填“5′”或“3′”)端应分别添加________序列，以实现融合基因定向插入质粒。
(3)为鉴定重组质粒是否构建成功，将重组质粒进行双酶切处理，之后进行电泳，结果如图2，泳道1的样品为经双酶切的pNZ8149-2RBD，泳道2的样品为经双酶切的pNZ8149-3RBD。泳道1两个条带大小分别为2 507 bp和2 020 bp，由此可知，融合基因3RBD的长度为______bp，泳道2呈现一个条带的原因是_________________________。
解析：(1)培养基的基本成分包括碳源、氮源、水和无机盐等，为满足乳酸菌生长的特殊需求，培养基除了必须提供碳源、氮源、水和无机盐等基本成分外，还需要添加维生素，此外乳酸菌属于厌氧菌，需要在无氧的环境条件下培养。(2)已知NcoⅠ和SacⅠ是pNZ8149质粒上的两种限制酶识别位点，为构建重组质粒，应在目的基因两侧添加限制酶NcoⅠ和SacⅠ的识别序列。利用PCR技术对融合基因进行扩增时，由于子链的延伸方向是5′端到3′端，故限制酶的识别序列应添加在两种引物的5′端。(3)由图可知，pNZ8149-2RBD和pNZ8149-3RBD的碱基对数目分别为4 527 bp和5 193 bp，两者相差一个RBD基因，所以RBD的长度为5 193－4 527＝666(bp)。泳道2的样品为经双酶切的pNZ8149-3RBD，泳道2上只有一个条带，说明pNZ8149-3RBD经双酶切后产生的两个片段大小相近，由于5 193÷2≈2 597(bp)，则3RBD的大小和2 597 bp相近，由于RBD的大小为666 bp，则2RBD的大小和1 931 bp(2 597－666＝1 931)相近，又知泳道1的样品为经双酶切的pNZ8149-2RBD，泳道1两个条带大小分别为2 507 bp和2 020 bp，综合上述分析可知，2RBD的大小为2 020 bp，则融合基因3RBD的大小为2 020＋666＝2 686(bp)。
答案：(1)碳源、氮源、水和无机盐　维生素　(2)5′　限制酶NcoⅠ和SacⅠ的识别
(3)2 686　双酶切pNZ8149-3RBD后产生的两个片段大小相近
7．(12分)(2025·广州综合测试)鹅源星状病毒属于RNA病毒，鹅群感染后死亡率高，对鹅类养殖构成巨大威胁。其全基因组结构模式图如图1所示，ORF2区域编码的纤突蛋白是该病毒的主要抗原性蛋白。研究人员以疑似感染该病毒死亡鹅的组织为样本，通过研磨提取上清液，进而制备单克隆抗体。回答下列问题：
图1
(1)鹅死亡的原因还可能包括感染鹅细小病毒(一种DNA病毒)或感染致病细菌。为确定感染源，研究人员以样本总DNA为模板，在PCR反应体系中通过加入____________________进行特定片段的扩增并进行相应检测。同时，将样本上清液接种于固体培养基上，在适宜的条件下培养一段时间后，观察并鉴定培养基上是否出现______________________________。
(2)成功分离出鹅源星状病毒后，研究人员提取了该病毒的RNA，并通过__________获得该病毒的cDNA作为纤突蛋白基因序列的扩增模板。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，图2电泳结果中最有可能代表纤突蛋白基因序列的是________(填编号)。
注：M表示标准DNA片段，A～C为待测样品，bp指核苷酸对。
图2
(3)研究人员利用纤突蛋白制备获得了纤突蛋白单克隆抗体，该单克隆抗体可应用于__________________________________________(答出两点)。
解析：(1)鹅群的感染源可能是鹅源星状病毒(RNA病毒)或鹅细小病毒(DNA病毒)或致病细菌。确定感染源是否是鹅细小病毒(DNA病毒)，方法为以死亡鹅的组织样本总DNA为模板，并加入根据鹅细小病毒DNA设计的引物进行PCR扩增，再进行电泳检测。确定感染源是否是致病细菌，方法为将死亡鹅的组织样本上清液接种于固体培养基上，培养一段时间后观察是否出现致病细菌菌落。(2)研究人员提取了鹅源星状病毒的RNA，并通过逆转录过程获得该病毒的cDNA，以该cDNA作为纤突蛋白基因序列的扩增模板。由题干可知，图1中ORF2区域编码纤突蛋白，该区域含有的碱基对为6 939－4 807＋1＝2 133(bp)，所以图2电泳结果中最有可能代表纤突蛋白基因序列的是B。(3)纤突蛋白是鹅源星状病毒的主要抗原性蛋白，制备的纤突蛋白单克隆抗体会特异性结合鹅源星状病毒的纤突蛋白，一方面可快速诊断鹅是否感染鹅源星状病毒，另一方面可治疗鹅源星状病毒感染。
答案：(1)鹅细小病毒DNA引物　致病细菌菌落　(2)逆(反)转录　B　(3)快速诊断鹅是否感染鹅源星状病毒；治疗鹅源星状病毒感染
8．(11分)(2025·广东一模)通过科学选育和种植管理，我国已成为世界上最大的番茄生产国。
番茄的SlMlo1基因是参与白粉病(病菌侵染，会严重降低番茄的产量)发生的易感基因。科学家利用CRISPR/Cas9基因组编辑敲除了番茄的SlMlo1基因，获得了抗白粉病的新品种。如图为CRISPR/Cas9基因组编辑技术的工作原理：Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA(sgRNA)引导下切割DNA双链以敲除目标基因。
(1)过程②中，将重组质粒导入番茄细胞的常用方法是________________。
(2)在设计sgRNA碱基序列时，依据的是________________的部分碱基序列。Cas9蛋白切割DNA双链时作用的化学键是________________________。
(3)可采用DNA分子杂交技术检测是否成功敲除SlMlo1基因，则操作思路及预期结果是______________________________________。
解析：(1)过程②为将CRISPR/Cas9重组质粒导入番茄细胞，将重组质粒导入植物细胞的方法包括花粉管通道法和农杆菌转化法。(2)科学家利用CRISPR/Cas9基因组编辑敲除了番茄的SlMlo1基因，据图可知，其作用机理为Cas9蛋白与sgRNA形成复合体，该复合体中的sgRNA与目标DNA序列的部分碱基序列互补配对，引导Cas9蛋白切割基因组DNA，将目标基因切割下来从而实现敲除，要敲除SlMlo1基因，应根据SlMlo1基因的部分碱基序列设计sgRNA，引导Cas9蛋白将SlMlo1基因切割下来，作用的化学键为磷酸二酯键。(3)采用DNA分子杂交技术检测是否成功敲除SlMlo1基因，即利用放射性同位素标记的、能够与SlMlo1基因互补配对的DNA片段作探针，从新品种细胞中提取DNA，与SlMlo1基因探针进行杂交，若成功敲除，则不会出现杂交带；若出现杂交带，则说明未成功敲除目标基因。
答案：(1)农杆菌转化法　(2)SlMlo1基因　磷酸二酯键　(3)操作思路：从新品种细胞中提取DNA，与SlMlo1基因探针进行杂交。预期结果：若没有出现杂交带，则说明成功敲除了目标基因；若出现杂交带，则说明未成功敲除目标基因
9．(11分)γ-氨基丁酸是一种重要的神经递质，可调节情绪、缓解压力，能够有效减轻焦虑。L-谷氨酸脱羧酶是一种在神经系统等组织中发挥重要作用的酶，它能够催化L-谷氨酸进行脱羧反应，将L-谷氨酸转化为γ-氨基丁酸。研究人员将L-谷氨酸脱羧酶基因gadB与辅酶因子磷酸吡哆醛高效再生的两个关键基因SNO1和SNZ1(磷酸吡哆醛合酶基因SNO1和磷酸吡哆醛合酶基因SNZ1，二者均来源于酿酒酵母)构建成重组质粒pTrc99a-gadB-SNO1-SNZ1(如图1)，将其导入大肠杆菌可实现对γ-氨基丁酸的高效生产。回答下列问题：
(1)据图1分析，质粒pTrc99a作为合格的载体，除了上述元件，还必须有________，其作用是___________________________。
(2)构建重组质粒pTrc99a-gadB-SNO1-SNZ1，需先设计引物，如图2所示。通过PCR特异性扩增SNO1基因和SNZ1基因，需要提取____________________作为模板，在____________酶的作用下进行扩增。
(3)若SNO1基因没有相应限制酶识别序列，为使PCR产物能被限制酶切割并准确连接构建pTrc99a-gadB-SNO1-SNZ1，结合图1、图2分析，用于扩增SNO1基因的引物________(填“3′”或“5′”)端需要加入______________酶切位点，图2中SNZ1-R的限制酶是_________________________。
(4)将重组质粒pTrc99a-gadB-SNO1-SNZ1导入大肠杆菌之前，需使用______处理大肠杆菌，成功导入后，还需要哪些检测技术？________________(写出两点)。
解析：(1)质粒pTrc99a作为合格的载体，需要有一个或者多个限制酶切位点，复制原点、启动子、终止子以及特殊的标记基因，标记基因便于重组DNA分子的筛选。(2)通过PCR特异性扩增SNO1基因和SNZ1基因，由于二者均来源于酿酒酵母，故需要提取酿酒酵母基因组DNA作为模板，PCR特异性扩增基因时，需要耐高温的DNA聚合酶催化进行。(3)若SNO1基因没有相应限制酶切识别序列，引物引导子链合成的方向是5′→3′，因此为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需要在引物的5′端加上限制酶切位点。据图2分析，为使PCR产物能被限制酶切割并准确连接构建pTrc99a-gadB-SNO1-SNZ1，需要将SNO1基因插入gadB基因和SNZ1基因之间，需要在SNO1-F加入来自gadB-R的限制酶识别序列，即KpnⅠ，在SNO1-R加入来自SNZ1-F的限制酶识别序列，即BamHⅠ，结合图1质粒pTrc99a中的限制酶切位点以及所要构建pTrc99a-gadB-SNO1-SNZ1的基因表达载体，图2中SNZ1-R的限制酶是XbaⅠ。(4)将重组质粒pTrc99a-gadB-SNO1-SNZ1导入到大肠杆菌之前，需使用Ca2＋(或CaCl2)处理大肠杆菌，成功导入后，还需要PCR技术检测是否能够转录，抗原—抗体杂交技术检测能否正常表达出相应的酶。
答案：(1)标记基因　便于重组DNA分子的筛选　(2)酿酒酵母基因组DNA　耐高温的DNA聚合　(3)5′　KpnⅠ和BamHⅠ　XbaⅠ　(4)Ca2＋　PCR技术和抗原—抗体杂交技术专题十七 基因工程
1．(2025·广东一模)我国科学家利用外源抗虫基因——Bt基因成功培育出转基因抗虫棉，能专门破坏棉铃虫等鳞翅目害虫的消化系统，导致其死亡。下列说法正确的是(　　)
A．培育抗虫棉的原理是基因突变
B．相对普通棉花而言，抗虫棉是新物种
C．大面积推广种植抗虫棉以后，棉铃虫的基因频率将发生不定向改变
D．在抗虫棉附近种植少量普通棉花，可减少棉铃虫对抗虫棉的抗性
2．(2025·汕头二模)利用人工智能模型(AI)预测蛋白质的结构和功能，极大地加速了人类对蛋白质的了解。下列叙述错误的是(　　)
A．AI可通过氨基酸序列预测蛋白质的空间结构
B．AI可基于大量数据构建结构与功能的匹配模型
C．AI分析氨基酸的差异可用于亲缘关系的比较
D．人工合成AI设计的蛋白质通常在细胞外进行
3．(2025·佛山二模)某兴趣小组以香蕉为原材料进行DNA粗提取、扩增及电泳鉴定系列实验。下列叙述正确的是(　　)
A．提取DNA时，研磨后需用滤纸进行过滤
B．可利用DNA在酒精中溶解度大的特点来提取DNA
C．琼脂糖熔化前需将适量的核酸染料加入并进行混匀
D．若DNA带负电，则凝胶加样孔应位于电泳槽负极侧
4．(2025·揭阳一调)利用PCR 获得目的基因后，用限制酶EcoR Ⅰ同时处理目的基因与质粒，拼接后可得到重组基因表达载体，其部分DNA片段如下图所示。下列有关引物的分析正确的是(　　)
A．通过PCR获取目的基因时，所选的引物可为引物2和引物3
B．检测目的基因是否插入质粒且方向是否正确时，应选用引物1 和引物4进行PCR
C．若设计的引物与模板不完全配对，可适当提高 PCR 复性的温度
D．DNA聚合酶能与引物结合，并从引物的5′端连接脱氧核苷酸
5．(2025·深圳一模)研究者从酵母菌中获取控制细胞色素氧化酶(存在于线粒体)的某一段肽合成的DNA片段，将其与小鼠的二氢叶酸还原酶(只存在于细胞质基质)基因融合。重组基因在酵母菌表达后，在线粒体中发现了二氢叶酸还原酶。该研究的目的是(　　)
A．获得融合蛋白
B．研究该段肽的作用
C．引导二氢叶酸还原酶进入线粒体
D．研究重组基因的功能
6．(11分)(2025·东莞中学等六校二联)利用乳酸菌构建表达抗原蛋白的工程菌是研究抗原应用的重要手段之一，口服的乳酸菌可在消化道内定植存活，其表达的抗原蛋白可锚定于细胞表面(穿过细胞膜展示在细胞表面)，诱导机体产生免疫反应。科学家将某病毒抗原蛋白的部分编码序列(RBD)拼接成融合基因2RBD和3RBD，探究RBD的二聚体蛋白和三聚体蛋白能否模拟抗原蛋白中RBD的天然构象并获得高效免疫原性。重组质粒构建流程如图1所示，NcoⅠ和SacⅠ是pNZ8149质粒上的限制酶识别位点，U-M为信号肽—细胞壁锚定蛋白序列。回答下列问题：
图1
图2
(1)为满足乳酸菌生长的特殊需求，培养基除了必须提供___________等基本成分外，还需要添加________，并在无氧的环境条件下培养。
(2)拼接形成的融合基因不具备限制酶切割位点，利用PCR技术对融合基因进行扩增时，所用两种引物的________(填“5′”或“3′”)端应分别添加________序列，以实现融合基因定向插入质粒。
(3)为鉴定重组质粒是否构建成功，将重组质粒进行双酶切处理，之后进行电泳，结果如图2，泳道1的样品为经双酶切的pNZ8149-2RBD，泳道2的样品为经双酶切的pNZ8149-3RBD。泳道1两个条带大小分别为2 507 bp和2 020 bp，由此可知，融合基因3RBD的长度为______bp，泳道2呈现一个条带的原因是_________________________。
7．(12分)(2025·广州综合测试)鹅源星状病毒属于RNA病毒，鹅群感染后死亡率高，对鹅类养殖构成巨大威胁。其全基因组结构模式图如图1所示，ORF2区域编码的纤突蛋白是该病毒的主要抗原性蛋白。研究人员以疑似感染该病毒死亡鹅的组织为样本，通过研磨提取上清液，进而制备单克隆抗体。回答下列问题：
图1
(1)鹅死亡的原因还可能包括感染鹅细小病毒(一种DNA病毒)或感染致病细菌。为确定感染源，研究人员以样本总DNA为模板，在PCR反应体系中通过加入____________________进行特定片段的扩增并进行相应检测。同时，将样本上清液接种于固体培养基上，在适宜的条件下培养一段时间后，观察并鉴定培养基上是否出现______________________________。
(2)成功分离出鹅源星状病毒后，研究人员提取了该病毒的RNA，并通过__________获得该病毒的cDNA作为纤突蛋白基因序列的扩增模板。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，图2电泳结果中最有可能代表纤突蛋白基因序列的是________(填编号)。
注：M表示标准DNA片段，A～C为待测样品，bp指核苷酸对。
图2
(3)研究人员利用纤突蛋白制备获得了纤突蛋白单克隆抗体，该单克隆抗体可应用于__________________________________________(答出两点)。
8．(11分)(2025·广东一模)通过科学选育和种植管理，我国已成为世界上最大的番茄生产国。
番茄的SlMlo1基因是参与白粉病(病菌侵染，会严重降低番茄的产量)发生的易感基因。科学家利用CRISPR/Cas9基因组编辑敲除了番茄的SlMlo1基因，获得了抗白粉病的新品种。如图为CRISPR/Cas9基因组编辑技术的工作原理：Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA(sgRNA)引导下切割DNA双链以敲除目标基因。
(1)过程②中，将重组质粒导入番茄细胞的常用方法是________________。
(2)在设计sgRNA碱基序列时，依据的是________________的部分碱基序列。Cas9蛋白切割DNA双链时作用的化学键是________________________。
(3)可采用DNA分子杂交技术检测是否成功敲除SlMlo1基因，则操作思路及预期结果是______________________________________。
9．(11分)γ-氨基丁酸是一种重要的神经递质，可调节情绪、缓解压力，能够有效减轻焦虑。L-谷氨酸脱羧酶是一种在神经系统等组织中发挥重要作用的酶，它能够催化L-谷氨酸进行脱羧反应，将L-谷氨酸转化为γ-氨基丁酸。研究人员将L-谷氨酸脱羧酶基因gadB与辅酶因子磷酸吡哆醛高效再生的两个关键基因SNO1和SNZ1(磷酸吡哆醛合酶基因SNO1和磷酸吡哆醛合酶基因SNZ1，二者均来源于酿酒酵母)构建成重组质粒pTrc99a-gadB-SNO1-SNZ1(如图1)，将其导入大肠杆菌可实现对γ-氨基丁酸的高效生产。回答下列问题：
(1)据图1分析，质粒pTrc99a作为合格的载体，除了上述元件，还必须有________，其作用是___________________________。
(2)构建重组质粒pTrc99a-gadB-SNO1-SNZ1，需先设计引物，如图2所示。通过PCR特异性扩增SNO1基因和SNZ1基因，需要提取____________________作为模板，在____________酶的作用下进行扩增。
(3)若SNO1基因没有相应限制酶识别序列，为使PCR产物能被限制酶切割并准确连接构建pTrc99a-gadB-SNO1-SNZ1，结合图1、图2分析，用于扩增SNO1基因的引物________(填“3′”或“5′”)端需要加入______________酶切位点，图2中SNZ1-R的限制酶是_________________________。
(4)将重组质粒pTrc99a-gadB-SNO1-SNZ1导入大肠杆菌之前，需使用______处理大肠杆菌，成功导入后，还需要哪些检测技术？________________(写出两点)。

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