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(共31张PPT)
旧知回顾：植物细胞融合技术
A细胞
B细胞
纤维素酶果胶酶
1.去壁
酶解法
正在融合的原生质体
再生出细胞壁
2.诱融
物理法：
化学法：
电融合法、离心法
聚乙二醇（PEG）融合法
高Ca2+ —高PH融合法等
脱分化
再分化
移栽
杂种植株
愈伤组织
A原生质体
B原生质体
移栽后的植株
植物细胞融合
植物组织培养
第2节 第2课时
动物细胞融合技术与单克隆抗体
近年来的科幻片常常创造出“双头人”、“兽人”等充满想象力的案例，这些案例无不围绕着“融合”这一关键词进行。从科学的角度而言，不同细胞的融合是形成新细胞、新物种的基础，科学家们也通过细胞融合技术成功创造了具有活力的多核细胞。在此之前我们学习过植物细胞的融合，那么动物细胞是否能发生融合？
一、动物细胞融合技术
合作探究一：请同学们自主阅读教材P48，小组合作思考讨论完成问题。
1.动物细胞融合技术的概念、原理、结果分别是什么？
2.动物细胞融合技术常用的诱导方法有哪些？
4.动物细胞融合技术有何意义？在现实生活中的应用有哪些？
3.什么是灭活？灭活病毒诱导融合的原理？融合实质及完成的标志？（教材P48的相关信息）
动物细胞融合
1.概念：使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。
2.原理：细胞膜具有一定的流动性。
ps：生物学必修一实验——人鼠细胞的融合
3.诱导方式：电融合法、PEG融合法、灭活病毒诱导法
动物细胞融合
灭活的仙台病毒用于细胞融合
灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能力，但是并不破坏病毒的抗原结构。
灭活病毒诱导法
灭活病毒诱导细胞融合的原理是病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
灭活的病毒诱导细胞融合的过程示意图
4.结果：形成杂交细胞。即融合后的细胞具有原来两个或多个细胞的遗传信息。
5.意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。
合作讨论：阅读教材，思考细胞融合技术有哪些应用？
（1）细胞融合技术已经成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。
6.应用
（2）利用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。
项目 植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理 生物膜的流动性,植物细胞的全能性 生物膜的流动性
杂交前处理 酶解法去壁 胰蛋白酶处理成单个细胞
融合手段 物理法（离心、电融合）、化学法（聚乙二醇、高Ca+—高PH融合法） 电融合法、化学法（聚乙二醇）
灭活的病毒
结果 形成杂种植株 形成杂种细胞
应用 培育作物新品种 主要用于制备单克隆抗体
比较：植物体细胞杂交与动物细胞融合的异同
二、单克隆抗体技术
分析资料，合作讨论，回答问题：
资料：传统蛇毒抗体血清的获取方法大致过程如下：先利用蛇毒反复注射到具有较强抗蛇毒的动物体内（如蛇獴）体内，一定时间（30min左右）后抗体浓度可达到巅峰，此刻抽取血液进行分离，在30ml血液中，抗体效价仅有200mlu.抗体的有效纯度仅占52%.
产量低、纯度低、特异性差、灵敏度低......
早期传统获取抗体的方法有何缺点？
一个极富创造力的方案：
动物细胞融合
杂交细胞
动物细胞培养
单克隆抗体
骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖
一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体
1975年，米尔斯坦和柯勒
1984年，诺贝尔生理学或医学奖
杂交瘤细胞
既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体
观看视频，合作讨论，回答有关问题：
单克隆抗体的制备
小组协作，完成下列过程
单抗制备过程分哪几步？请用箭头把以下代表单克隆抗体制备过程步骤的图解的字母按正确顺序连接起来。顺序是？
单克隆抗体的制备过程
（1）用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞。
将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合
培养骨髓瘤细胞
注射特定的抗原
能产生抗体，但不能大量增殖
不能产生抗体，但能大量增殖
诱导融合
PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法
多种B淋巴细胞
从脾中提取
骨髓瘤细胞
多种杂交细胞
第一次筛选
杂交瘤细胞
(既能迅速大量增殖，又能产生抗体)
合作讨论：若只考虑细胞的两两融合，融合形成的细胞有几种？需要的是？
（2）用特定的选择培养基（HAT培养基）进行筛选：
在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
B-B细胞
瘤-瘤细胞
B-瘤细胞
3种
单克隆抗体的制备
第一次筛选的具体方法
单克隆抗体的制备
①细胞合成 DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基蝶呤阻断。
②人B淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但不能分裂增殖。
③鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但能不断分裂增殖。
如果D途径被阻断，它会因不能合成DNA而死。
淋巴细胞
合成DNA
不能无限增殖
S途径
D途径
骨髓瘤细胞
合成DNA
能无限增殖
D途径
杂交瘤细胞
合成DNA
能无限增殖
D途径
S途径
可以通过加入氨基蝶呤阻断DNA复制的D途经来进行第一次筛选
合作讨论：得到上述杂交瘤细胞后，如何进一步制备大量能分泌特定抗体的细胞？
（3）对上述经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。
合作讨论：如何得知提取的抗体能够结合特定抗原？提供多孔板（每个孔只能接种一个杂交瘤细胞）、特定抗原，如何进一步筛选？
检测方法：抗原—抗体杂交技术
①将杂交瘤细胞群稀释，约每孔1个进行培养（克隆化培养）；
②一段时间后，用标记的抗原检测每个小孔上清液里是否含有我们需要的特异性的抗体（抗原抗体能结合即为阳性孔）；
单克隆抗体的制备
克隆化培养和抗体检测
杂交瘤细胞(多种)
克隆化培养
抗体检测
第二次筛选及方法
(抗原-抗体杂交技术)
能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
阳性细胞
阳性孔
用96孔板培养和筛选能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
（每个孔只接种一个细胞）
多孔细胞培养板
项目 第一次筛选 第二次筛选
筛选 原因 诱导融合后得到多种融合细胞，还有未融合的细胞等 由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞
筛选 目的 筛选出杂交瘤细胞 筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
筛选 方法 用特定的选择培养基筛选：未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。 用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。
单克隆抗体制备过程中两次筛选的比较
单克隆抗体的制备
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
注射到小鼠腹腔内
体外培养
单克隆抗体
细胞培养液提取
小鼠腹水中提取
特异性强，灵敏度高，可大量制备
（4）将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞在体外条件下大规模培养，或注射到小鼠腹腔内增殖。
（5）从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体。
扩大培养两种方法的比较
项目 腹腔培养 体外培养
优点 易于控制培养条件(如无需提供无菌 环境等),操作简单，成本较低 可大规模培养，大量生产
缺点 规模小，产量少 需要人为控制培养条件，成本相对较高
给小鼠注射特定抗原
多种B淋巴细胞
（产生抗体）
小鼠骨髓瘤细胞
（能无限增殖）
多种杂交细胞及未融合的细胞
杂交瘤细胞
（既能迅速大量增殖，又能产生抗体）
足够数量的能产生所需抗体的杂交瘤细胞
提取
诱导 融合
第一次筛选
第二次筛选
克隆化培养、抗体检测
（可进行多次）
注射到小鼠腹腔
体外培养
大量单克隆抗体
从腹腔液中提取
从培养液中提取
既能迅速大量增殖
又能产生特异性抗体
建模归纳
用特定的选择培养基
单克隆抗体制备过程中的相关考点总结
（1）该过程中应用到的技术：
（2）原理：
（3）注射特定抗原的目的：
（4）诱导融合的方法：
动物细胞特有的诱导融合方法为：
（5）第一次筛选的目的：
第一次如何筛选：
筛选原理：
动物细胞融合、动物细胞培养
细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖
用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中
PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法
灭活病毒诱导法
筛选获得杂交瘤细胞
用特定的选择培养基进行筛选
在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长
得到能产生特定抗体的B淋巴细胞
单克隆抗体制备过程中的相关考点总结
（6）杂交瘤细胞的特点：
（7）第二次筛选的目的：
如何筛选：
选择抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞，即：
（8）抗体检测原理：
（9）如何获取大量所需杂交瘤细胞：
（10）如何获取单克隆抗体
①体外培养:
②小鼠腹腔内培养:
（11）单克隆抗体的优点：
获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）
分泌的抗体能与特定的抗原结合
抗原和抗体能够特异性结合(分子水平的鉴定）
既能迅速大量增殖，又能产生抗体
在体外条件下大规模培养（接种于培养液中）或注射到小鼠腹腔内增殖
从细胞培养液中获取
从小鼠腹水中获取
与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备。
诊断试剂
作为药物治疗疾病
运载药物
作用机制示意图
A
D
C
使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应 用 。抗体一药物偶联物(antibody-drugconjugate,ADC) 通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC 通常由抗体、接头和药物(如细胞毒素)三部分组成，它的作用机制如下图所示。
资料
1.ADC的抗体和药物各具有什么作用？
抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞
2.除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？
①可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗；
②可以将阻断肿瘤细胞的信号通路的药物与单克隆抗体结合来抑制肿瘤细胞的生长
3.单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？
①单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；
②生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒；
③ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点
动物细胞融合技术
单克隆抗体的制备
原理
结果
融合方法
意义
过程
应用
免疫处理
诱导融合
第一次筛选
第二次筛选
扩大培养
诊断试剂
运载药物和治疗疾病
选择培养基
克隆化培养
抗体检测
体外培养
小鼠腹腔
动物细胞融合技术与单克隆抗体
A.①过程需多次向小鼠体内注射S蛋白，以便于从
脾脏中获得致敏的B淋巴细胞
B.②过程可通过电融合法使两个细胞融合
C.经③过程筛出的细胞既能无限增殖又能产生识别
S蛋白的单克隆抗体
D.S蛋白的单克隆抗体能够阻断病毒入侵正常细胞以减弱对机体的毒害
1.新型冠状病毒表面的刺突蛋白(S蛋白)与人呼吸道黏膜上皮细胞ACE2受体结合，入侵细胞后可引起肺炎。针对此环节研发单克隆抗体是治疗新冠肺炎的研究热点之一，下列相关叙述错误的是( )
√
不一定全部都能无限增殖
A.抗体进入细胞后激活溶酶体酶，导致细胞凋亡
B.ADC可通过胞吞方式进入肿瘤细胞
C.单克隆抗体携带细胞毒素与肿瘤细胞特异性结合
D.肿瘤细胞凋亡是细胞主动死亡的过程，会产生新的蛋白质
2.抗体—药物偶联物(ADC)通过将细胞毒素与单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤，过程如图所示。下列叙述不正确的是( )
√
使溶酶体裂解

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