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第1章
第2节　微生物的培养技术及应用
发酵工程
第2课时　微生物的选择培养和计数
学习目标 素养目标
1．举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物；阐明微生物选择培养的原理； 2．土壤中分解尿素的细菌的分离和计数(重难点) 生命观念：各类微生物都能适应其生活环境，树立生物与环境相适应的观点；
科学思维：根据微生物的代谢类型配制选择培养基；
科学探究：讨论土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的方法
核心概念
1．选择培养基和选择培养实例
选择培养基是允许____________的微生物生长，同时______________其他种类微生物生长的培养基。例如只有能够合成________的微生物才能分解尿素，利用以________为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
特定种类
抑制或阻止
脲酶
尿素
2．稀释涂布平板法
(1)将菌液进行一系列____________，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到________培养基的表面，进行培养。
梯度稀释
A
B
(2)基本操作：A．____________→B．____________。
固体
梯度稀释
涂布平板
3．[连线]微生物的数量测定
[概 念 辨 析]
(1)选择分解尿素的细菌的培养基为液体培养基。 (　　)
提示：选择分解尿素的细菌的培养基中含有琼脂，属于固体培养基。
(2)若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需要设置未接种的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照。 (　　)
提示：要判断选择培养基是否起到了选择作用，牛肉膏蛋白胨培养基上需要接种等量的微生物，若牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目多于选择培养基上的数目，则说明选择培养基具有选择性。
×
×
(3)分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使培养基的pH降低。 (　　)
提示：分解尿素的细菌将尿素转化为氨，会使培养基的pH升高。
(4)在用涂布器涂布平板时，为了操作方便，可完全打开培养皿盖。 (　　)
(5)因为土壤中各类微生物的数量不同，所以为获得不同类型的微生物，要按不同的稀释倍数进行分离。 (　　)
(6)如果得到了3个或3个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。 (　　)
×
×
√
√
(7)统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数目。 (　　)
提示：稀释涂布平板法统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
(8)统计菌落数目的理论依据是一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌。 (　　)
(9)在已涂布的平板上直接划线可以进一步纯化获得单菌落。 (　　)
提示：在已涂布的平板上，挑选菌落中的菌种接种到新的培养基上可以进一步纯化获得单菌落，也可以挑选菌落通过平板划线法进一步纯化获得单菌落。
(10)可用显微镜直接计数法统计菌液中的细菌数目，以确定接种时菌液的最佳稀释倍数。 (　　)
×
√
×
√
目标导学
怎样理解选择培养基的原理
1
目标
一
1．教材P16正文——选择培养
(1)自然界中目的菌的筛选
①实例：聚合酶链式反应(PCR)中用到的耐高温的DNA聚合酶，就是从热泉中筛选出的______________中提取出来的。
②依据：水生栖热菌能在____________的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
水生栖热菌
70～80 ℃
(2)实验室中目的菌的筛选
①原理：人为提供有利于__________生长的条件(包括营养、温度和pH等)，同时______________其他微生物的生长。
②方法：利用______________分离。
目的菌
抑制或阻止
选择培养基
2．教材P18——筛选分解尿素的细菌的选择培养基的配方如下表所示：
组分 含量
KH2PO4 1.4 g
Na2HPO4 2.1 g
MgSO4·7H2O 0.2 g
葡萄糖 10.0 g
尿素 1.0 g
琼脂 15.0 g
H2O 定容至1 000 mL
(1)在该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的物质分别是什么？
提示：葡萄糖是碳源，尿素是氮源。
(2)分离分解尿素的细菌的选择培养基是如何进行选择的？
提示：该选择培养基的配方中，尿素是其中唯一的氮源，因此，只有能够利用尿素的微生物才能够生长。
(3)为什么只有能分解尿素的微生物才能在该培养基上生长？
提示：分解尿素的微生物能合成脲酶，而脲酶可催化尿素分解产生NH3，NH3可作为微生物生长的氮源。
3．选择培养基类型
(1)加入某些特定的物质(前提是培养基具备全部营养成分)
(2)改变培养基的营养成分
(3)利用培养基“特定化学成分”分离
(4)通过某些“特殊环境”分离
特别提醒
能在选择培养基上生长的不一定是所需要的目的菌。一般利用选择培养基获得的单菌落即为目的菌，但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢物进行生长繁殖，因此还需进一步鉴定。
　　　(阜阳期中)在反刍动物的瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物以尿素为唯一氮源。某小组计划从牛的瘤胃中分离出该类微生物进行研究，下表是实验所用的培养基配方。下列说法错误的是 (　　)
1
B
A．该培养基为固体培养基，在倒平板操作前，要进行高压蒸汽灭菌
B．该培养基上只有尿素分解菌能够存活，因而长出的菌落无须菌种鉴定
C．接种针可以通过灼烧灭菌，灼烧时使用酒精灯的外焰效果更好
D．尿素分解菌能够使培养基的pH升高，可据此初步确定所需菌种
KH2PO4 Na2HPO4 MgSO4·7H2O 葡萄糖 尿素 琼脂
1.4 g 2.1 g 0.2 g 10.0 g 1.0 g 15.0 g
注：将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1 000 mL。 解析：表中培养基配方中含有琼脂，琼脂是一种凝固剂，则该培养基为固体培养基，在倒平板前，需要对培养基进行高压蒸汽灭菌，以防止杂菌污染，A正确；该培养基为以尿素为唯一氮源的选择培养基，能利用尿素的微生物才能在该培养基上生长，但也可能存在固氮菌，利用空气中的氮气获得氮源，因此，在该培养基上长出的菌落仍需要鉴定，B错误；接种针等金属用具可以通过灼烧灭菌，酒精灯外焰温度高，灭菌效果好，C正确；尿素分解菌能够将尿素分解为氨，氨呈碱性，会使培养基的pH升高，可在培养基中加入酚红指示剂用于菌种鉴定，D正确。
素养养成——能力迁移、科学探究
从自然菌样中筛选较理想生产菌种的一般步骤为：采集菌样→富集培养→纯种分离→性能测定。请回答下列问题：
(1)培养嗜盐菌的菌样应从________(填“高盐”或“低盐”)环境采集，培养厌氧菌的菌样应从________(填“有氧”或“无氧”)环境采集。
(2)对嗜盐菌富集培养的培养基应是________培养基；对含耐高温淀粉酶的微生物富集培养应选择____________________的培养基，并在________条件下培养。
高盐
无氧
加盐
以淀粉为唯一碳源
高温
微生物的选择培养
1
目标
二
1．教材P17“图1－7”——稀释涂布平板操作
(1)系列稀释操作(见下图)
操作步骤 操作内容
①取试管、编号 取盛有9 mL无菌水的试管6支，并编号为1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107
②系列稀释 取_________菌液，注入1×102倍稀释的试管中，使菌液与无菌水充分混匀
从1×102倍稀释的试管中吸取_________稀释液，注入1×103倍稀释的试管中使之混匀。依次类推，直到完成最后一支试管的稀释
1 mL
1 mL
(2)涂布平板操作(如图)
培养基
酒精
火焰
涂布
2．稀释涂布平板法注意事项
(1)10 g土样加入90 mL无菌水中后，已____________，在计算时，不要忽略。
(2)过程中所有操作都应在______________旁进行。
(3)将涂布器从________中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
稀释10倍
酒精灯火焰
酒精
　　　(淮北期末)污泥堆肥过程中大量释放的含硫臭气会污染周围环境。研究人员从污泥堆肥物料中筛选纯化出一株耐高温硫氧化菌LYH-1，能减少含硫臭气的含量，流程图如图所示。下列叙述正确的是 (　　)



A．用湿热灭菌法可杀灭培养基中的所有微生物
B．③过程选择菌落数最少的平板来计数可精确推算出甲的密度
C．用来培养硫氧化菌的乙培养基中一定含硫而无需含磷
D．⑤过程仅通过高温条件即可筛选出目的菌
A
2
解析：培养基的灭菌常选用湿热灭菌法，灭菌是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子，A正确；稀释涂布平板法用于估算菌株密度，③过程选择菌落数为30～300的平板，菌落数太少会因偶然因素导致误差，菌落数太多难以计数，B错误；硫氧化菌生长、繁殖需要多种营养物质，除了硫作为能源或代谢底物外，磷是核酸、磷脂等重要生物分子的组成元素，培养基中必须含磷，C错误；⑤过程除高温条件外，还需检测含硫臭气的含量等才能筛选出目的菌，D错误。
测定微生物数量的方法有哪些
1
目标
三
1．两种计数方法的比较
比较项目 间接计数法(稀释涂布平板法) 直接计数法(显微镜直接计数法)
原理 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的____________。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌 利用特定的细菌计数板或血细胞计数板在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量
一个活菌
比较项目 间接计数法(稀释涂布平板法) 直接计数法(显微镜直接计数法)
公式 每克样品中的菌落数＝(C÷V) ×M C：某稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)；M：稀释倍数 每毫升原液所含微生物数量：每小格平均微生物数量×400×10 000×稀释倍数
缺点 当__________________________时，平板上观察到的只是一个菌落 不能区分死菌和活菌
结果 比实际值________ 比实际值________
两个或多个细胞连在一起
偏小
偏大
2．教材P18～19“探究·实践”——土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
(1)土壤中分解尿素细菌的鉴定原理
分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为NH3，使培养基的pH升高。在选择培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌，若指示剂变红，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素，如下图所示。
(2)用平板划线法接种培养结果的图片如下图所示。请结合图片分析，平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的？为什么？
提示：不能。平板划线法最开始的划线菌类很可能会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。
(3)实验流程
3～8
30～300
稀释涂布平板
30～37
菌落数目稳定
(4)结果分析与评价
①某同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。该同学对实验结果的处理__________(填“合理”或“不合理”)。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果差别很大的情况，应_____ _____________________________________________________________________________。
不合理
分析实验过程中可能的影响因素，从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因
②尝试完成下表中对微生物的分离与计数实验结果的分析。
目的 现象 结论
是否有杂菌污染的判断 ______________________________ 未被杂菌污染
培养物中菌落形态多样，菌落数偏高 培养物中混入其他杂菌
选择培养基是否起筛选作用 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目________选择培养基上的数目 选择培养基具有筛选作用
对照组的培养基中无菌落生长
多于
　　　(安徽A10联盟期中)伊红—亚甲蓝可以让大肠杆菌菌落呈现出有金属光泽的深紫色，常用于检测样品中大肠杆菌的数量，如图表示某次土壤样品检测过程，每种稀释梯度下接种三个平板，其中106稀释梯度下，三个平板上相应菌落见表格数据。下列相关叙述正确的是 (　　)
3
A．取上一稀释梯度菌液1 mL加入9 mL蒸馏水可将菌液稀释10倍
B．随培养时间延长，菌落数会发生变化，应以48 h时的数据为结果
C．用105、106、107三个稀释梯度下的计数取平均值作为结果更准确
D．从培养结果可以推测每克该土样中大约有3×107个大肠杆菌
D
解析：进行梯度稀释时，为保证无菌环境，应取上一稀释梯度菌液1 mL加入9 mL无菌水稀释10倍，A错误；随培养时间延长，菌落数会发生变化，应选择菌落数稳定时的数据作为结果，分析图中表格数据，应以60 h时的数据为结果，B错误；为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的稀释度进行计数，图中106稀释梯度下平板上大肠杆菌平均菌落数为3个，小于30个，不能选择该稀释度进行计数，C错误；106稀释度下，涂布的菌液体积为0.1 mL，大肠杆平均菌落数为3个，则每克该土样中大肠杆菌数为3÷0.1×106＝3×107个，D正确。
随堂内化
一、 知识自主构建
设计
选择
数量
直接
二、 学情随堂评价
1．下列不属于选择培养基的是 (　　)
A．培养金黄色葡萄球菌所用的加高浓度食盐的培养基
B．分离自养型细菌所用的不含碳源的培养基
C．用于检测大肠杆菌数量的伊红—亚甲蓝琼脂培养基
D．抑制乳酸菌生长而不抑制酵母菌生长的含抗生素的培养基
C
解析：检测大肠杆菌的培养基中加入伊红—亚甲蓝试剂，这样的培养基属于鉴别培养基。
2．(黄山期中)下列有关土壤中微生物的分离与计数的说法，错误的是(　　)
A．土壤中各类微生物的数量不同，为获得不同类型的微生物，要按不同的稀释倍数进行分离
B．测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围不同
C．可根据菌落的特征区分不同的微生物
D．牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目明显小于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些细菌菌落
D
解析：土壤中各种微生物数量不同，按不同稀释倍数分离，能使不同微生物在平板上形成单菌落，A正确；一般选择菌落数为30～300的平板进行计数，由于土壤中细菌的总量和能分解尿素的细菌的数量不同，故选用的稀释范围不同，B正确；一般来说，可根据菌落的形状、大小、颜色等特征区分不同的微生物，C正确；验证选择培养基是否具有选择作用，需设立牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，若牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数明显大于选择培养基，说明选择培养基具有筛选作用，D错误。
3．珠江口海域受聚乙烯微塑料污染严重，研究发现，某些细菌能分泌聚乙烯降解酶，这些酶可分解聚乙烯长链为小分子物质。为筛选高效降解菌，研究人员从红树林沉积物中分离细菌并进行如下实验：红树林沉积物→富集培养(以聚乙烯为唯一碳源)→梯度稀释→涂布接种→筛选透明圈大的菌落→酶活性测定。下列关于该实验的叙述，正确的是 (　　)
A．富集培养前需对沉积物样品进行彻底灭菌，避免杂菌干扰
B．选择培养基中需添加琼脂和聚乙烯，并加入刚果红染料便于观察
C．应选择透明圈直径与菌落直径比值最大的菌落进行扩大培养
D．酶活性测定时需设置以葡萄糖为碳源的对照组
C
解析：如果对沉积物进行彻底灭菌，所有微生物都会被杀死，无法筛选出目标细菌，A错误；刚果红染料通常用于筛选能够降解纤维素的细菌(纤维素与刚果红结合后，被降解的区域会出现透明圈)，聚乙烯的降解无法通过刚果红染料观察，B错误；透明圈直径与菌落直径的比值可以反映单个细菌菌落的降解能力(即降解效率)，比值越大，降解能力越强，因此，选择比值最大的菌落进行扩大培养，C正确；酶活性测定时，对照组应设置不含聚乙烯的培养基，而非以葡萄糖为碳源，D错误。
4．(安徽A10联盟期中)某城市自来水厂的水质检测实验室定期对出厂水样中的大肠杆菌数量进行定量测定，以确定水质，一般采用稀释涂布平板法进行计数。在整个操作及后续分析过程中，下列相关做法正确的是 (　　)
A．若想一次获取稀释倍数为103的水样，则可将1 mL 水样加入99 mL 无菌水中制取
B．梯度稀释后每个稀释度包括原水样均涂布 3 个平板，以减小实验误差，并预留一个空白平板
C．应配制选择培养基进行涂布，在完成涂布操作后，须立即将各组平板放入恒温培养箱中培养
D．培养时待菌落数稳定时选取菌落数最多的平板进行计数，也可用血细胞计数板显微观察计数
B
解析：想要稀释倍数为103，应将1 mL 水样加入999 mL 无菌水中，A错误；梯度稀释后每个稀释度包括原水样均涂布3个平板，重复实验可减少实验误差，预留空白平板(不接种)，用于检测培养基是否被污染，B正确；本实验目的为检测出厂水样中的大肠杆菌数量，应配制鉴别培养基进行涂布，涂布后需等待菌液被培养基吸收，再放入培养箱，否则菌液会在平板表面流动，影响菌落分布和计数，C错误；应选取菌落数在30～300的平板进行计数，取平均值，细菌可用细菌计数板进行直接计数，但是自来水中可能有多种细菌，显微镜观察难以区分，D错误。
5．产脂肪酶酵母可用于处理含油脂废水。为筛选产脂肪酶酵母菌株，科研人员开展了相关研究，实验流程如图所示。下列说法正确的是 (　　)
A．筛选产脂肪酶酵母可用牛肉膏蛋白胨培养基，接种完成后培养皿应倒置
B．用稀释涂布平板法获取Ⅰ号培养基的菌落数量通常会低于活菌的真实值
C．Ⅱ号培养基用平板划线法纯化菌种，接种环的灼烧次数与划线次数相同
D．若Ⅱ号培养基上菌落平均数为58个，则产脂肪酶酵母数量为5.8×105个
B
解析：牛肉膏蛋白胨富含氮源、碳源，基本上各种细菌、真菌都能在其上生长，该实验目的是筛选产脂肪酶酵母菌株，Ⅰ号培养基需要配制以油脂为唯一碳源的营养成分，能在上面生长的微生物即为能产脂肪酶的菌株，接种完成后培养皿应倒置，A错误；由图可知，Ⅰ号培养基使用的方法是稀释涂布平板法，由于会出现两个或多个细胞连在一起形成一个菌落，此时以菌落数进行计数，所得结果往往小于实际活菌数，B正确；由图可知，Ⅱ号培养基采用的是平板划线法，每次划线前后均需要对接种环灼烧，接种环的灼烧次数比划线次数多1次，C错误；由于平板划线法除了最后一次划线末端培养出的菌落是由单一酵母菌繁殖而来的，其他菌落往往由多个酵母菌一起繁殖而成，即一个菌落并非对应着一个酵母菌，因此，不管计算是否正确，平板划线法都不适合用来统计样品中的酵母菌数量，D错误。第2课时　微生物的选择培养和计数
1．(宣城期中)橘子等水果放久了，其表面会长出白色、黄色或绿色的霉斑。现用平板划线法和稀释涂布平板法分别接种同一霉斑于同种培养基甲、乙上，培养相同时间后得到菌落。下列相关叙述正确的是(　　)
A．进行微生物分离和纯化只能用平板划线法
B．两种接种方法都常用于样品中活菌的计数
C．甲、乙培养基上菌落的分布状况基本一致
D．甲、乙培养基上菌落的形态特征基本一致
2．(卓越县中联盟期中)某校生物兴趣小组通过稀释涂布平板法成功从土壤浸出液中分离得到耐高渗透压的金黄色葡萄球菌。下列相关叙述错误的是(　　)
A．分离金黄色葡萄球菌时，可在培养基中加入一定量的青霉素
B．接种后将平板倒置可以避免拿取时皿底和皿盖分离造成污染
C．可以通过菌落的形态、大小、颜色等特征来区分不同的菌种
D．土壤浸出液稀释倍数较低时，在高渗培养基上可能出现单菌落
3．变质的酸奶会因内部发酵而产生大量气体，如果看到包装很鼓，说明酸奶已经变质，不要喝。某同学选择过期的酸奶，按图中的操作流程，研究其中的某微生物生长情况，下列叙述正确的是(　　)
A．使用巴氏消毒法可以杀死牛奶中的微生物和芽孢，但不破坏其营养成分
B．变质的酸奶会由于其中的微生物进行有氧呼吸产生大量CO2
C．利用图示方法向培养基接种前和接种后都要对接种环进行灼烧灭菌
D．若3个平板的平均菌落数是180个，则1 mL酸奶中该微生物个数为9×106个
4．(池州期中)已知固体培养基会因碳酸钙存在而呈乳白色，且乳酸菌能分解培养基中的碳酸钙。某同学尝试用含有碳酸钙的固体培养基从新鲜的泡菜滤液中分离纯化乳酸菌，下列叙述错误的是(　　)
A．该同学所用的培养基属于选择培养基
B．分离纯化所用的培养基都要进行灭菌处理
C．需要用无菌水对泡菜滤液进行稀释
D．应挑选出具有透明圈的菌落作为候选菌
5．(安徽师范大学附中)如图所示，自来水经滤膜过滤后，转移到牛肉膏蛋白胨培养基上，适宜条件下培养48 h染色后统计变色菌落数目为165个。下列说法正确的是(　　)
A．若培养基含伊红—亚甲蓝，大肠杆菌菌落呈蓝绿色
B．自来水中大肠杆菌浓度是33个·L-1，比真实值偏大
C．为了提高准确度，需设重复实验，但不用空白对照
D．若培养基菌落数目大于300，可适当减少自来水量
6．研究小组利用稀释涂布平板法来探究某河流中大肠杆菌的数量，每一个浓度涂布四个平板，并且设置空白对照组。下列关于操作步骤的叙述，正确的是(　　)
A．涂布前，将沾有酒精的涂布器在火焰上引燃，燃尽、冷却
B．涂布完成后，在培养皿的皿盖上做标记，以避免混淆，并将培养皿倒置培养
C．计算平板上的菌落数时，4个培养皿上的菌落数无论多少，都要全部平均
D．若空白对照组上有7个菌落，则在实验组数据基础上减去7，以获得最准确数据
7．(六安二中)合理使用消毒液有助于减少传染病的传播。某同学比较了3款消毒液A、B、C杀灭大肠杆菌的效果。该同学将细菌原液稀释10倍后取0.2 mL涂布平板，进行菌落计数，结果如图所示，下列说法错误的是(　　)
A．伊红—亚甲蓝培养基可用于鉴定大肠杆菌
B．据该实验结果可知，三种消毒液中杀菌效果最好的是A消毒液
C．若某样品菌落计数的结果是100，则对应细菌原液中大肠杆菌的浓度为5 000个·mL-1
D．为避免混淆，应在培养皿的皿盖上做好标记，并将培养皿倒置培养
8．从土壤中筛选、计数某种细菌的实验流程如下，请回答：
―→―→―→
(1)采用________________法接种时需要将样液进行一系列梯度稀释，然后接种培养，统计菌落数量。通常统计的菌落数比活菌的实际数目________。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在________________________________________________________________________________旁操作。
(2)对培养基灭菌的常用方法是__________________。在接种前需要检测使用的培养基是否被污染，方法是___________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
(3)若要筛选出尿素分解菌，配制土壤溶液的土样应从________________________的土壤________层取样，培养用的培养基应为以________为唯一氮源的选择培养基。
(4)向培养基中加入酚红指示剂，若培养基中存在分解尿素的细菌，则其菌落周围会________，这是尿素被分解生成的________使酚红指示剂显色的结果。
9．灰霉病是由灰葡萄孢(一种真菌)引起的农作物病害。为了绿色、高效地防治灰霉病，科研人员从灰霉病多发的大棚土壤中取样、分离出多种单菌落并进行扩大培养，随后将各组微生物的无菌发酵滤液与未凝固的普通培养基混合后倒平板，冷却后在平板中央接种灰葡萄孢，通过比较灰葡萄孢菌丝生长情况，从而筛选出高效的灰葡萄孢拮抗菌。相关叙述错误的是(　　)
A．在灰霉病多发的大棚土壤取样，比普通土壤更有可能获得灰葡萄孢拮抗菌
B．取无菌发酵滤液的目的是用拮抗菌的代谢产物对灰葡萄孢产生抑制作用
C．为筛选出高效拮抗菌，只需要在普通培养基接种等量灰葡萄孢作为对照
D．灰葡萄孢菌丝生长最缓慢、稀疏的组别对应的微生物即为最高效拮抗菌
10．(安庆期中)高温淀粉酶在大规模工业生产中有很大的实用性。研究者从热泉中筛选了高效产生高温淀粉酶的嗜热菌，操作流程如图1：采集样品→富集培养→分离、纯培养→筛选高效产生高温淀粉酶的嗜热菌→保存备用。下列说法错误的是(　　)
图1
图2　Ⅰ号培养基放大示意图
A．从用途上来说，Ⅰ号培养基为鉴别培养基
B．应挑选图2所示的培养基中周围显蓝色的菌落接种于图1的Ⅱ号培养基
C．过程①②合称为稀释涂布平板，可统计嗜热菌数量，但统计数值往往偏小
D．获得高效嗜热菌后培养条件需要高温，但是保存菌种需设置低温
11．(芜湖阶段练)尿素[CO(NH2)2]是现代农业生产中一种重要的氮肥，施入土壤后会被某些细菌分解再被植物利用。某科研小组为了纯化培养土壤中分解尿素的细菌，按照下表制备了培养基，操作如图所示。请回答：
组分 KH2PO4 Na2HPO4 MgSO4· 7H2O 葡萄糖 X 琼脂 H2O
含量 1.4 g 2.1 g 0.2 g 10.0 g 1.0 g 15.0 g 定容至 1 000 mL
　 (1)为分离出土壤中分解尿素的细菌，表中培养基组分X是________，该成分属于微生物营养构成中的________。从功能上分，该培养基属于________培养基。
(2)在图中3个平板上分别接种适量且等量的稀释液，培养后统计3个平板上菌落数分别是196、204、200，计算得知1 g土壤中的活菌数约为1×108个，则每个平板接种的稀释液的体积为________mL。
(3)采用平板划线法也可以分离土壤中的尿素分解菌。操作时接种环通过灼烧灭菌，在第二次及其以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，目的是________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________，
最后对分离纯化后的菌株加入________指示剂进行鉴定。
(4)土壤中的某些固氮菌可以利用空气中的氮气作为氮源(如圆褐固氮菌能将大气中的氮气转化为NH3)，请设计实验进一步确定平板上分离得到的细菌是不是圆褐固氮菌(写出简要思路、预期结果和结论)：________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
12．(合肥六校联考)苯丙酮尿症(PKU)患者表现为苯丙氨酸的代谢产物——苯丙酮酸过度积累，阻碍脑的发育，造成智力低下，因此患者需要严格限制饮食中苯丙氨酸和蛋白质的含量。科研人员尝试筛选能降解苯丙氨酸的乳酸杆菌，用于生产PKU患者可安全食用的酸奶。
(1)筛选苯丙氨酸降解菌的液体培养基成分如下：葡萄糖、磷酸氢二钾、乙酸钠、硫酸镁，还需加入________，加水定容后调节pH，用________________法灭菌，冷却后接种不同乳酸杆菌的菌种，25 ℃条件下培养3 d。
(2)筛选苯丙氨酸降解能力强的菌株，需计算不同菌株的苯丙氨酸降解率，计算公式为________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
(3)将筛选出的Y与F两种菌株制成菌悬液，取少量加至人工胃液中消化2 h，并使用稀释涂布平板法测定活菌数，检测其人工胃液耐受性。再转入人工肠液中，用同样的方法检测耐受性，结果如图：
据图判断，应选择Y菌株进行后续研究，依据是___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
(4)为研究Y菌株能否作为辅助发酵剂用于生产PKU患者可食用的酸奶，还需将其与目前常用的酸奶发酵剂YF L(以保加利亚乳杆菌为主)混合，进行酸奶发酵实验。请在下表中完善实验方案。
组别 实验处理 检测指标
对照组：YF L 将菌株接种于全脂复原乳中，42 ℃发酵至pH＝4.5左右，置于4 ℃下冷藏24 h __________________________________________(至少写出2个)
实验组：____________________________________________________________________________________________________________________________________________
第2课时　微生物的选择培养和计数
题号 1 2 3 4 5 6 7 9 10
答案 D A D A D A D C B
1．D　解析：平板划线法和稀释涂布平板法均可对微生物分离和纯化，A错误；稀释涂布平板法可用于样品中活菌的计数，平板划线法不可用于计数，B错误；平板划线法通过逐步划线稀释分散菌种，得到的菌落分布不均匀，稀释涂布平板法得到的菌落分布相对均匀，C错误；甲、乙培养基都是接种同一霉斑，含有的微生物种类相同，所以长出的菌落形态特征基本一致，D正确。
2．A　解析：青霉素属于抗生素，能抑制细菌的生长，而金黄色葡萄球菌属于细菌，因此，加入青霉素会抑制金黄色葡萄球菌生长，不能分离出该菌，A错误；接种后将平板倒置，可防止皿盖上的冷凝水落入培养基造成污染，也能避免拿取时皿底和皿盖分离引入杂菌，B正确；菌落特征(如菌落的形态、大小、颜色等)是微生物鉴定的重要依据，C正确；金黄色葡萄球菌能耐高渗透压，土壤浸出液稀释倍数较低时，在高渗培养基上可能出现单菌落，D正确。
3．D　解析：消毒是指使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)，使用巴氏消毒法不可以杀死牛奶中的芽孢，A错误；变质的酸奶会由于其中的微生物进行无氧呼吸产生大量CO2，B错误；图示接种方法为稀释涂布平板法，应该使用涂布器进行接种，C错误；利用公式C÷V×M计算，1 mL酸奶中该微生物数量为180÷0.2×104＝9×106个，D正确。
4．A　解析：该培养基含有碳酸钙，呈乳白色，乳酸菌能分解培养基中的碳酸钙形成透明圈，可根据透明圈来鉴别乳酸菌，故该培养基为鉴别培养基，A错误；为防止杂菌污染，分离纯化所用培养基需高压蒸汽灭菌处理，B正确；分离纯化乳酸菌时，需要用无菌水对泡菜滤液进行梯度稀释，以获得单个菌落，C正确；乳酸菌分解培养基中的碳酸钙，出现以乳酸菌菌落为中心的透明圈，故应挑选有透明圈的菌落作为候选菌，D正确。
5．D　解析：在含伊红—亚甲蓝的培养基上，大肠杆菌菌落呈深紫色并有金属光泽，A错误；自来水中大肠杆菌浓度是165÷5＝33个·L-1，两个或多个大肠杆菌可能长成一个菌落，因此计算出的数值比真实值偏小，B错误；需设重复实验，减少实验误差，提高准确度，同时需要设置空白对照，以检测培养基是否被污染，C错误；若培养基菌落数目大于300，说明细菌数目较多，可适当减少自来水量，使菌落数维持在30～300，保证计数准确，D正确。
6．A　解析：涂布完成后，在培养皿的皿底上做标记，B错误；计算平板上的菌落数时，应选择菌落数在30～300的平板进行计数，C错误；若空白对照组上有7个菌落，说明培养基灭菌不彻底，需要重新进行实验，D错误。
7．D　解析：大肠杆菌在伊红—亚甲蓝培养基上生长的菌落呈深紫色，并带有金属光泽，故可用该培养基鉴定大肠杆菌，A正确；分析题图，相同处理时间，A消毒液活菌减少量最多，杀菌效果最好，B正确；若计数结果是100，则1 mL细菌原液中有细菌＝(菌落数÷菌液体积)×稀释倍数＝(100÷0.2)×10＝5 000个，C正确；培养皿倒置培养是为了防止冷凝水滴落到培养基上造成污染，故应在培养皿的皿底做标记，容易观察，D错误。
8．(1)稀释涂布平板　少　酒精灯火焰　(2)高压蒸汽灭菌法　将未接种的培养基放在适宜温度的恒温箱中倒置培养一段时间，观察是否有菌落生成　(3)有机物含量丰富　表　尿素　(4)变红　氨(或NH3)
解析：(1)将样液进行一系列梯度稀释后进行接种的方法是稀释涂布平板法，该方法可以对菌落进行计数。利用稀释涂布平板法统计菌落数目时，当两个或多个细胞连在一起时，培养基上观察到的只是一个菌落，因此通常统计得到的菌落数比活菌的实际数目少。稀释涂布平板法的各步操作均应在酒精灯的火焰旁进行。(2)对培养基的灭菌通常采用高压蒸汽灭菌法，若要检测使用的培养基是否被污染，通常需要设置空白对照，即将未接种的培养基在适宜温度的恒温箱中倒置培养一段时间，观察是否有菌落生成，若无菌落生成，则说明培养基的制作是合格的。(3)土壤中分解尿素的细菌生活在有机物含量丰富的土壤表层，因此若要筛选出分解尿素的细菌，应从有机物含量丰富的土壤表层取样，培养基应以尿素为唯一氮源。(4)分解尿素的细菌能够合成脲酶，脲酶能将培养基中的尿素分解产生氨(NH3)，使培养基的pH升高，从而引起酚红指示剂变红。
9．C　解析：由题意可知，灰霉病是由灰葡萄孢(一种真菌)引起的农作物病害，因此在灰霉病多发的大棚土壤取样，比普通土壤更有可能获得灰葡萄孢拮抗菌，A正确；取无菌发酵滤液的目的是排除其他杂菌的干扰，利用拮抗菌的代谢产物对灰葡萄孢产生抑制作用，从而获得专一性的拮抗菌，B正确；为筛选出高效拮抗菌，需在普通培养基接种等量灰葡萄孢作为对照，还需要与其他菌落的无菌发酵滤液制成的培养基接种等量灰葡萄孢做对比，挑选出对灰葡萄孢拮抗效果最好的拮抗菌，C错误；最高效拮抗菌对灰葡萄孢的拮抗效果是最好的，导致灰葡萄孢菌丝生长最缓慢、稀疏，D正确。
10．B　解析：本实验目的为筛选高效产生高温淀粉酶的嗜热菌，分析图2(Ⅰ号培养基放大的示意图)，Ⅰ号培养基加入碘液，为鉴别培养基，能通过菌落周围是否显蓝色来鉴别是否为产高温淀粉酶的嗜热菌，若菌种能产生淀粉酶，能将淀粉水解，菌落周围不会出现蓝色，应挑选图2所示的培养基中周围不显蓝色的菌落接种于图1的Ⅱ号培养基，A正确，B错误；分析图1，①过程是梯度稀释(b试管中菌数比a少)，②过程是涂布接种，所以过程①②合称为稀释涂布平板法，可统计嗜热菌数量，当两个或多个细胞连在一起时，在培养基上看到的只是一个菌落，故统计数值往往比实际活菌数偏小，C正确；高效产生高温淀粉酶的嗜热菌适应高温环境，为避免杂菌污染，在培养时需要高温环境，而低温下微生物代谢缓慢，有利于菌种保存，D正确。
11．(1)尿素　氮源　选择　(2)0.2　(3)上一划线的末端菌种数量最少，通过划线次数的增加，使菌种数目逐渐减少，从而获得单菌落　酚红　(4)将平板上分离得到的细菌接种到无氮源的培养基上培养，若能生长，说明该菌为固氮菌，否则不是固氮菌
解析：(1)筛选土壤中分解尿素的细菌时，培养基应以尿素作唯一氮源，故X是尿素，尿素只能为所分离纯化的微生物提供氮源。不能利用尿素的生物一般无法在此培养基上存活，该培养基是选择培养基。(2)3个平板上平均菌落数是200，由图可知接种稀释液的稀释倍数是105，则(200÷接种稀释液的体积)×105＝1×108个，求得接种稀释液的体积为0.2 mL。(3)平板划线法进行分离纯化时，由于上一划线的末端菌种数量最少，通过划线次数的增加，使菌种数目逐渐减少，从而获得单菌落，故在第二次及以后的划线，总是从上一次划线的末端开始。尿素分解菌分解尿素，会引起培养基的pH发生改变，在培养基中加入酚红，会呈现红色，可以在培养基中加入酚红指示剂鉴定尿素分解菌。(4)圆褐固氮菌能将大气中的氮气转化为NH3来获取氮源，故分离得到的细菌接种到无氮源的培养基上培养，若能生长，说明该菌为固氮菌，否则不是固氮菌。
12．(1)苯丙氨酸　湿热灭菌(或高压蒸汽灭菌)　(2)(接种前的苯丙氨酸含量－培养后的苯丙氨酸含量)/接种前的苯丙氨酸含量×100%　(3)两种菌株在人工胃液中存活率无差异且均可繁殖，而Y菌株在人工肠液中存活率高于F菌株　(4)YF L中加入不同浓度的Y菌株　苯丙氨酸浓度、蛋白质含量、乳酸产量、菌落数、发酵过程中pH的变化等
解析：(1)选择培养基是指在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需要的微生物的生长的培养基，分析题意，本实验目的是筛选能降解苯丙氨酸的乳酸杆菌，故应以苯丙氨酸为唯一氮源，培养基需要再加入苯丙氨酸；对培养基进行灭菌的方法是高压蒸汽灭菌法(湿热灭菌法)。(2)筛选苯丙氨酸降解能力强的菌株，需计算不同菌株的苯丙氨酸降解率，计算公式为(接种前的苯丙氨酸含量－培养后的苯丙氨酸含量)/接种前的苯丙氨酸含量×100%。(3)能够测定活菌数目的接种方法是稀释涂布平板法；据图可知，两种菌株在人工胃液中存活率无差异且均可繁殖，而Y菌株在人工肠液中存活率高于F菌株，故应选择Y菌株进行后续研究。(4)分析题意，本实验目的是探究Y菌株能否作为辅助发酵剂用于生产PKU患者可食用的酸奶，则实验的自变量是Y菌的有无及浓度，因变量是酸奶品质，实验设计应遵循对照与单一变量原则，故据此可知，实验组是在YF L中加入不同浓度的Y菌株，检测指标是对因变量进行测定，可通过苯丙氨酸浓度、蛋白质含量、乳酸产量、菌落数、发酵过程中pH的变化等进行测定。第2课时　微生物的选择培养和计数
学习目标 素养目标
1．举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物；阐明微生物选择培养的原理； 2．土壤中分解尿素的细菌的分离和计数(重难点) 生命观念：各类微生物都能适应其生活环境，树立生物与环境相适应的观点； 科学思维：根据微生物的代谢类型配制选择培养基； 科学探究：讨论土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的方法
1．选择培养基和选择培养实例
选择培养基是允许___________的微生物生长，同时___________其他种类微生物生长的培养基。例如只有能够合成____________的微生物才能分解尿素，利用以___________为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
2．稀释涂布平板法
(1)将菌液进行一系列___________，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到_______________培养基的表面，进行培养。
A
B
(2)基本操作：A． _____________→B． _____________。
3．[连线]微生物的数量测定
[概 念 辨 析]
(1)选择分解尿素的细菌的培养基为液体培养基。 (　　)
(2)若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需要设置未接种的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照。(　　)
(3)分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使培养基的pH降低。(　　)
(4)在用涂布器涂布平板时，为了操作方便，可完全打开培养皿盖。(　　)
(5)因为土壤中各类微生物的数量不同，所以为获得不同类型的微生物，要按不同的稀释倍数进行分离。(　　)
(6)如果得到了3个或3个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。(　　)
(7)统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数目。(　)
(8)统计菌落数目的理论依据是一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌。(　　)
(9)在已涂布的平板上直接划线可以进一步纯化获得单菌落。(　)
(10)可用显微镜直接计数法统计菌液中的细菌数目，以确定接种时菌液的最佳稀释倍数。(　　)
怎样理解选择培养基的原理
1．教材P16正文——选择培养
(1)自然界中目的菌的筛选
①实例：聚合酶链式反应(PCR)中用到的耐高温的DNA聚合酶，就是从热泉中筛选出的_______________中提取出来的。
②依据：水生栖热菌能在_______________的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
(2)实验室中目的菌的筛选
①原理：人为提供有利于_____________生长的条件(包括营养、温度和pH等)，同时_____________其他微生物的生长。
②方法：利用____________分离。
2．教材P18——筛选分解尿素的细菌的选择培养基的配方如下表所示：
组分 含量
KH2PO4 1.4 g
Na2HPO4 2.1 g
MgSO4·7H2O 0.2 g
葡萄糖 10.0 g
尿素 1.0 g
琼脂 15.0 g
H2O 定容至1 000 mL
(1)在该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的物质分别是什么？
(2)分离分解尿素的细菌的选择培养基是如何进行选择的？
(3)为什么只有能分解尿素的微生物才能在该培养基上生长？
3．选择培养基类型
(1)加入某些特定的物质(前提是培养基具备全部营养成分)
(2)改变培养基的营养成分
(3)利用培养基“特定化学成分”分离
(4)通过某些“特殊环境”分离
特别提醒
能在选择培养基上生长的不一定是所需要的目的菌。一般利用选择培养基获得的单菌落即为目的菌，但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢物进行生长繁殖，因此还需进一步鉴定。
(阜阳期中)在反刍动物的瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物以尿素为唯一氮源。某小组计划从牛的瘤胃中分离出该类微生物进行研究，下表是实验所用的培养基配方。下列说法错误的是(　　)
KH2PO4 Na2HPO4 MgSO4·7H2O 葡萄糖 尿素 琼脂
1.4 g 2.1 g 0.2 g 10.0 g 1.0 g 15.0 g
注：将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1 000 mL。
A．该培养基为固体培养基，在倒平板操作前，要进行高压蒸汽灭菌
B．该培养基上只有尿素分解菌能够存活，因而长出的菌落无须菌种鉴定
C．接种针可以通过灼烧灭菌，灼烧时使用酒精灯的外焰效果更好
D．尿素分解菌能够使培养基的pH升高，可据此初步确定所需菌种
素养养成——能力迁移、科学探究
从自然菌样中筛选较理想生产菌种的一般步骤为：采集菌样→富集培养→纯种分离→性能测定。请回答下列问题：
(1)培养嗜盐菌的菌样应从__ __(填“高盐”或“低盐”)环境采集，培养厌氧菌的菌样应从___(填“有氧”或“无氧”)环境采集。
(2)对嗜盐菌富集培养的培养基应是__ __培养基；对含耐高温淀粉酶的微生物富集培养应选择_____________的培养基，并在__ __条件下培养。
微生物的选择培养
1．教材P17“图1－7”——稀释涂布平板操作
(1)系列稀释操作(见下图)
操作步骤 操作内容
①取试管、编号 取盛有9 mL无菌水的试管6支，并编号为1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107
②系列稀释 取____菌液，注入1×102倍稀释的试管中，使菌液与无菌水充分混匀
从1×102倍稀释的试管中吸取____稀释液，注入1×103倍稀释的试管中使之混匀。依次类推，直到完成最后一支试管的稀释
(2)涂布平板操作(如图)
2．稀释涂布平板法注意事项
(1)10 g土样加入90 mL无菌水中后，已__ __，在计算时，不要忽略。
(2)过程中所有操作都应在__ __旁进行。
(3)将涂布器从__ __中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
(淮北期末)污泥堆肥过程中大量释放的含硫臭气会污染周围环境。研究人员从污泥堆肥物料中筛选纯化出一株耐高温硫氧化菌LYH-1，能减少含硫臭气的含量，流程图如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A．用湿热灭菌法可杀灭培养基中的所有微生物
B．③过程选择菌落数最少的平板来计数可精确推算出甲的密度
C．用来培养硫氧化菌的乙培养基中一定含硫而无需含磷
D．⑤过程仅通过高温条件即可筛选出目的菌
测定微生物数量的方法有哪些
1．两种计数方法的比较
比较 项目 间接计数法(稀释涂布平板法) 直接计数法(显微镜直接计数法)
原理 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的_____________。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌 利用特定的细菌计数板或血细胞计数板在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量
公式 每克样品中的菌落数＝(C÷V) ×M C：某稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)；M：稀释倍数 每毫升原液所含微生物数量：每小格平均微生物数量×400×10 000×稀释倍数
缺点 当_______________时，平板上观察到的只是一个菌落 不能区分死菌和活菌
结果 比实际值_______________ 比实际值_______________
2．教材P18～19“探究·实践”——土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
(1)土壤中分解尿素细菌的鉴定原理
分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为NH3，使培养基的pH升高。在选择培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌，若指示剂变红，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素，如下图所示。
(2)用平板划线法接种培养结果的图片如下图所示。请结合图片分析，平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的？为什么？
(3)实验流程
(4)结果分析与评价
①某同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。该同学对实验结果的处理__ __(填“合理”或“不合理”)。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果差别很大的情况，应_________________________________。
②尝试完成下表中对微生物的分离与计数实验结果的分析。
目的 现象 结论
是否有杂菌污染的判断 ____________________________________ 未被杂菌污染
培养物中菌落形态多样，菌落数偏高 培养物中混入其他杂菌
选择培养基是否起筛选作用 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目____选择培养基上的数目 选择培养基具有筛选作用
(安徽A10联盟期中)伊红—亚甲蓝可以让大肠杆菌菌落呈现出有金属光泽的深紫色，常用于检测样品中大肠杆菌的数量，如图表示某次土壤样品检测过程，每种稀释梯度下接种三个平板，其中106稀释梯度下，三个平板上相应菌落见表格数据。下列相关叙述正确的是(　　)
A．取上一稀释梯度菌液1 mL加入9 mL蒸馏水可将菌液稀释10倍
B．随培养时间延长，菌落数会发生变化，应以48 h时的数据为结果
C．用105、106、107三个稀释梯度下的计数取平均值作为结果更准确
D．从培养结果可以推测每克该土样中大约有3×107个大肠杆菌
一、 知识自主构建
二、 学情随堂评价
1．下列不属于选择培养基的是(　　)
A．培养金黄色葡萄球菌所用的加高浓度食盐的培养基
B． 分离自养型细菌所用的不含碳源的培养基
C． 用于检测大肠杆菌数量的伊红—亚甲蓝琼脂培养基
D． 抑制乳酸菌生长而不抑制酵母菌生长的含抗生素的培养基
2．(黄山期中)下列有关土壤中微生物的分离与计数的说法，错误的是(　　)
A．土壤中各类微生物的数量不同，为获得不同类型的微生物，要按不同的稀释倍数进行分离
B．测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围不同
C．可根据菌落的特征区分不同的微生物
D．牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目明显小于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些细菌菌落
3．珠江口海域受聚乙烯微塑料污染严重，研究发现，某些细菌能分泌聚乙烯降解酶，这些酶可分解聚乙烯长链为小分子物质。为筛选高效降解菌，研究人员从红树林沉积物中分离细菌并进行如下实验：红树林沉积物→富集培养(以聚乙烯为唯一碳源)→梯度稀释→涂布接种→筛选透明圈大的菌落→酶活性测定。下列关于该实验的叙述，正确的是(　　)
A．富集培养前需对沉积物样品进行彻底灭菌，避免杂菌干扰
B．选择培养基中需添加琼脂和聚乙烯，并加入刚果红染料便于观察
C．应选择透明圈直径与菌落直径比值最大的菌落进行扩大培养
D．酶活性测定时需设置以葡萄糖为碳源的对照组
4．(安徽A10联盟期中)某城市自来水厂的水质检测实验室定期对出厂水样中的大肠杆菌数量进行定量测定，以确定水质，一般采用稀释涂布平板法进行计数。在整个操作及后续分析过程中，下列相关做法正确的是(　　)
A．若想一次获取稀释倍数为103的水样，则可将1 mL 水样加入99 mL 无菌水中制取
B．梯度稀释后每个稀释度包括原水样均涂布 3 个平板，以减小实验误差，并预留一个空白平板
C．应配制选择培养基进行涂布，在完成涂布操作后，须立即将各组平板放入恒温培养箱中培养
D．培养时待菌落数稳定时选取菌落数最多的平板进行计数，也可用血细胞计数板显微观察计数
5．产脂肪酶酵母可用于处理含油脂废水。为筛选产脂肪酶酵母菌株，科研人员开展了相关研究，实验流程如图所示。下列说法正确的是(　　)
A．筛选产脂肪酶酵母可用牛肉膏蛋白胨培养基，接种完成后培养皿应倒置
B．用稀释涂布平板法获取Ⅰ号培养基的菌落数量通常会低于活菌的真实值
C．Ⅱ号培养基用平板划线法纯化菌种，接种环的灼烧次数与划线次数相同
D．若Ⅱ号培养基上菌落平均数为58个，则产脂肪酶酵母数量为5.8×105个
第2课时　微生物的选择培养和计数
学习目标 素养目标
1．举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物；阐明微生物选择培养的原理； 2．土壤中分解尿素的细菌的分离和计数(重难点) 生命观念：各类微生物都能适应其生活环境，树立生物与环境相适应的观点； 科学思维：根据微生物的代谢类型配制选择培养基； 科学探究：讨论土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的方法
1．选择培养基和选择培养实例
选择培养基是允许__特定种类__的微生物生长，同时__抑制或阻止__其他种类微生物生长的培养基。例如只有能够合成__脲酶__的微生物才能分解尿素，利用以__尿素__为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
2．稀释涂布平板法
(1)将菌液进行一系列__梯度稀释__，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到__固体__培养基的表面，进行培养。
A
B
(2)基本操作：A． __梯度稀释__→B． __涂布平板__。
3．[连线]微生物的数量测定
[概 念 辨 析]
(1)选择分解尿素的细菌的培养基为液体培养基。 (　×　)
提示：选择分解尿素的细菌的培养基中含有琼脂，属于固体培养基。
(2)若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需要设置未接种的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照。(　×　)
提示：要判断选择培养基是否起到了选择作用，牛肉膏蛋白胨培养基上需要接种等量的微生物，若牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目多于选择培养基上的数目，则说明选择培养基具有选择性。
(3)分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使培养基的pH降低。(　×　)
提示：分解尿素的细菌将尿素转化为氨，会使培养基的pH升高。
(4)在用涂布器涂布平板时，为了操作方便，可完全打开培养皿盖。(　×　)
(5)因为土壤中各类微生物的数量不同，所以为获得不同类型的微生物，要按不同的稀释倍数进行分离。(　√　)
(6)如果得到了3个或3个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。(　√　)
(7)统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数目。(　×　)
提示：稀释涂布平板法统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
(8)统计菌落数目的理论依据是一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌。(　√　)
(9)在已涂布的平板上直接划线可以进一步纯化获得单菌落。(　×　)
提示：在已涂布的平板上，挑选菌落中的菌种接种到新的培养基上可以进一步纯化获得单菌落，也可以挑选菌落通过平板划线法进一步纯化获得单菌落。
(10)可用显微镜直接计数法统计菌液中的细菌数目，以确定接种时菌液的最佳稀释倍数。(　√　)
怎样理解选择培养基的原理
1．教材P16正文——选择培养
(1)自然界中目的菌的筛选
①实例：聚合酶链式反应(PCR)中用到的耐高温的DNA聚合酶，就是从热泉中筛选出的__水生栖热菌__中提取出来的。
②依据：水生栖热菌能在__70～80 ℃__的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
(2)实验室中目的菌的筛选
①原理：人为提供有利于__目的菌__生长的条件(包括营养、温度和pH等)，同时__抑制或阻止__其他微生物的生长。
②方法：利用__选择培养基__分离。
2．教材P18——筛选分解尿素的细菌的选择培养基的配方如下表所示：
组分 含量
KH2PO4 1.4 g
Na2HPO4 2.1 g
MgSO4·7H2O 0.2 g
葡萄糖 10.0 g
尿素 1.0 g
琼脂 15.0 g
H2O 定容至1 000 mL
(1)在该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的物质分别是什么？
提示：葡萄糖是碳源，尿素是氮源。
(2)分离分解尿素的细菌的选择培养基是如何进行选择的？
提示：该选择培养基的配方中，尿素是其中唯一的氮源，因此，只有能够利用尿素的微生物才能够生长。
(3)为什么只有能分解尿素的微生物才能在该培养基上生长？
提示：分解尿素的微生物能合成脲酶，而脲酶可催化尿素分解产生NH3，NH3可作为微生物生长的氮源。
3．选择培养基类型
(1)加入某些特定的物质(前提是培养基具备全部营养成分)
(2)改变培养基的营养成分
(3)利用培养基“特定化学成分”分离
(4)通过某些“特殊环境”分离
特别提醒
能在选择培养基上生长的不一定是所需要的目的菌。一般利用选择培养基获得的单菌落即为目的菌，但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢物进行生长繁殖，因此还需进一步鉴定。
(阜阳期中)在反刍动物的瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物以尿素为唯一氮源。某小组计划从牛的瘤胃中分离出该类微生物进行研究，下表是实验所用的培养基配方。下列说法错误的是(　B　)
KH2PO4 Na2HPO4 MgSO4·7H2O 葡萄糖 尿素 琼脂
1.4 g 2.1 g 0.2 g 10.0 g 1.0 g 15.0 g
注：将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1 000 mL。
A．该培养基为固体培养基，在倒平板操作前，要进行高压蒸汽灭菌
B．该培养基上只有尿素分解菌能够存活，因而长出的菌落无须菌种鉴定
C．接种针可以通过灼烧灭菌，灼烧时使用酒精灯的外焰效果更好
D．尿素分解菌能够使培养基的pH升高，可据此初步确定所需菌种
解析：表中培养基配方中含有琼脂，琼脂是一种凝固剂，则该培养基为固体培养基，在倒平板前，需要对培养基进行高压蒸汽灭菌，以防止杂菌污染，A正确；该培养基为以尿素为唯一氮源的选择培养基，能利用尿素的微生物才能在该培养基上生长，但也可能存在固氮菌，利用空气中的氮气获得氮源，因此，在该培养基上长出的菌落仍需要鉴定，B错误；接种针等金属用具可以通过灼烧灭菌，酒精灯外焰温度高，灭菌效果好，C正确；尿素分解菌能够将尿素分解为氨，氨呈碱性，会使培养基的pH升高，可在培养基中加入酚红指示剂用于菌种鉴定，D正确。
素养养成——能力迁移、科学探究
从自然菌样中筛选较理想生产菌种的一般步骤为：采集菌样→富集培养→纯种分离→性能测定。请回答下列问题：
(1)培养嗜盐菌的菌样应从__高盐__(填“高盐”或“低盐”)环境采集，培养厌氧菌的菌样应从__无氧__(填“有氧”或“无氧”)环境采集。
(2)对嗜盐菌富集培养的培养基应是__加盐__培养基；对含耐高温淀粉酶的微生物富集培养应选择__以淀粉为唯一碳源__的培养基，并在__高温__条件下培养。
微生物的选择培养
1．教材P17“图1－7”——稀释涂布平板操作
(1)系列稀释操作(见下图)
操作步骤 操作内容
①取试管、编号 取盛有9 mL无菌水的试管6支，并编号为1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107
②系列稀释 取__1 mL__菌液，注入1×102倍稀释的试管中，使菌液与无菌水充分混匀
从1×102倍稀释的试管中吸取__1 mL__稀释液，注入1×103倍稀释的试管中使之混匀。依次类推，直到完成最后一支试管的稀释
(2)涂布平板操作(如图)
2．稀释涂布平板法注意事项
(1)10 g土样加入90 mL无菌水中后，已__稀释10倍__，在计算时，不要忽略。
(2)过程中所有操作都应在__酒精灯火焰__旁进行。
(3)将涂布器从__酒精__中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
(淮北期末)污泥堆肥过程中大量释放的含硫臭气会污染周围环境。研究人员从污泥堆肥物料中筛选纯化出一株耐高温硫氧化菌LYH-1，能减少含硫臭气的含量，流程图如图所示。下列叙述正确的是(　A　)
A．用湿热灭菌法可杀灭培养基中的所有微生物
B．③过程选择菌落数最少的平板来计数可精确推算出甲的密度
C．用来培养硫氧化菌的乙培养基中一定含硫而无需含磷
D．⑤过程仅通过高温条件即可筛选出目的菌
解析：培养基的灭菌常选用湿热灭菌法，灭菌是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子，A正确；稀释涂布平板法用于估算菌株密度，③过程选择菌落数为30～300的平板，菌落数太少会因偶然因素导致误差，菌落数太多难以计数，B错误；硫氧化菌生长、繁殖需要多种营养物质，除了硫作为能源或代谢底物外，磷是核酸、磷脂等重要生物分子的组成元素，培养基中必须含磷，C错误；⑤过程除高温条件外，还需检测含硫臭气的含量等才能筛选出目的菌，D错误。
测定微生物数量的方法有哪些
1．两种计数方法的比较
比较 项目 间接计数法(稀释涂布平板法) 直接计数法(显微镜直接计数法)
原理 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的__一个活菌__。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌 利用特定的细菌计数板或血细胞计数板在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量
公式 每克样品中的菌落数＝(C÷V) ×M C：某稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)；M：稀释倍数 每毫升原液所含微生物数量：每小格平均微生物数量×400×10 000×稀释倍数
缺点 当__两个或多个细胞连在一起__时，平板上观察到的只是一个菌落 不能区分死菌和活菌
结果 比实际值__偏小__ 比实际值__偏大__
2．教材P18～19“探究·实践”——土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
(1)土壤中分解尿素细菌的鉴定原理
分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为NH3，使培养基的pH升高。在选择培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌，若指示剂变红，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素，如下图所示。
(2)用平板划线法接种培养结果的图片如下图所示。请结合图片分析，平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的？为什么？
提示：不能。平板划线法最开始的划线菌类很可能会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。
(3)实验流程
(4)结果分析与评价
①某同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。该同学对实验结果的处理__不合理__(填“合理”或“不合理”)。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果差别很大的情况，应__分析实验过程中可能的影响因素，从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因__。
②尝试完成下表中对微生物的分离与计数实验结果的分析。
目的 现象 结论
是否有杂菌污染的判断 __对照组的培养基中无菌落生长__ 未被杂菌污染
培养物中菌落形态多样，菌落数偏高 培养物中混入其他杂菌
选择培养基是否起筛选作用 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目__多于__选择培养基上的数目 选择培养基具有筛选作用
(安徽A10联盟期中)伊红—亚甲蓝可以让大肠杆菌菌落呈现出有金属光泽的深紫色，常用于检测样品中大肠杆菌的数量，如图表示某次土壤样品检测过程，每种稀释梯度下接种三个平板，其中106稀释梯度下，三个平板上相应菌落见表格数据。下列相关叙述正确的是(　D　)
A．取上一稀释梯度菌液1 mL加入9 mL蒸馏水可将菌液稀释10倍
B．随培养时间延长，菌落数会发生变化，应以48 h时的数据为结果
C．用105、106、107三个稀释梯度下的计数取平均值作为结果更准确
D．从培养结果可以推测每克该土样中大约有3×107个大肠杆菌
解析：进行梯度稀释时，为保证无菌环境，应取上一稀释梯度菌液1 mL加入9 mL无菌水稀释10倍，A错误；随培养时间延长，菌落数会发生变化，应选择菌落数稳定时的数据作为结果，分析图中表格数据，应以60 h时的数据为结果，B错误；为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的稀释度进行计数，图中106稀释梯度下平板上大肠杆菌平均菌落数为3个，小于30个，不能选择该稀释度进行计数，C错误；106稀释度下，涂布的菌液体积为0.1 mL，大肠杆平均菌落数为3个，则每克该土样中大肠杆菌数为3÷0.1×106＝3×107个，D正确。
一、 知识自主构建
二、 学情随堂评价
1．下列不属于选择培养基的是(　C　)
A．培养金黄色葡萄球菌所用的加高浓度食盐的培养基
B． 分离自养型细菌所用的不含碳源的培养基
C． 用于检测大肠杆菌数量的伊红—亚甲蓝琼脂培养基
D． 抑制乳酸菌生长而不抑制酵母菌生长的含抗生素的培养基
解析：检测大肠杆菌的培养基中加入伊红—亚甲蓝试剂，这样的培养基属于鉴别培养基。
2．(黄山期中)下列有关土壤中微生物的分离与计数的说法，错误的是(　D　)
A．土壤中各类微生物的数量不同，为获得不同类型的微生物，要按不同的稀释倍数进行分离
B．测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围不同
C．可根据菌落的特征区分不同的微生物
D．牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目明显小于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些细菌菌落
解析：土壤中各种微生物数量不同，按不同稀释倍数分离，能使不同微生物在平板上形成单菌落，A正确；一般选择菌落数为30～300的平板进行计数，由于土壤中细菌的总量和能分解尿素的细菌的数量不同，故选用的稀释范围不同，B正确；一般来说，可根据菌落的形状、大小、颜色等特征区分不同的微生物，C正确；验证选择培养基是否具有选择作用，需设立牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，若牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数明显大于选择培养基，说明选择培养基具有筛选作用，D错误。
3．珠江口海域受聚乙烯微塑料污染严重，研究发现，某些细菌能分泌聚乙烯降解酶，这些酶可分解聚乙烯长链为小分子物质。为筛选高效降解菌，研究人员从红树林沉积物中分离细菌并进行如下实验：红树林沉积物→富集培养(以聚乙烯为唯一碳源)→梯度稀释→涂布接种→筛选透明圈大的菌落→酶活性测定。下列关于该实验的叙述，正确的是(　C　)
A．富集培养前需对沉积物样品进行彻底灭菌，避免杂菌干扰
B．选择培养基中需添加琼脂和聚乙烯，并加入刚果红染料便于观察
C．应选择透明圈直径与菌落直径比值最大的菌落进行扩大培养
D．酶活性测定时需设置以葡萄糖为碳源的对照组
解析：如果对沉积物进行彻底灭菌，所有微生物都会被杀死，无法筛选出目标细菌，A错误；刚果红染料通常用于筛选能够降解纤维素的细菌(纤维素与刚果红结合后，被降解的区域会出现透明圈)，聚乙烯的降解无法通过刚果红染料观察，B错误；透明圈直径与菌落直径的比值可以反映单个细菌菌落的降解能力(即降解效率)，比值越大，降解能力越强，因此，选择比值最大的菌落进行扩大培养，C正确；酶活性测定时，对照组应设置不含聚乙烯的培养基，而非以葡萄糖为碳源，D错误。
4．(安徽A10联盟期中)某城市自来水厂的水质检测实验室定期对出厂水样中的大肠杆菌数量进行定量测定，以确定水质，一般采用稀释涂布平板法进行计数。在整个操作及后续分析过程中，下列相关做法正确的是(　B　)
A．若想一次获取稀释倍数为103的水样，则可将1 mL 水样加入99 mL 无菌水中制取
B．梯度稀释后每个稀释度包括原水样均涂布 3 个平板，以减小实验误差，并预留一个空白平板
C．应配制选择培养基进行涂布，在完成涂布操作后，须立即将各组平板放入恒温培养箱中培养
D．培养时待菌落数稳定时选取菌落数最多的平板进行计数，也可用血细胞计数板显微观察计数
解析：想要稀释倍数为103，应将1 mL 水样加入999 mL 无菌水中，A错误；梯度稀释后每个稀释度包括原水样均涂布3个平板，重复实验可减少实验误差，预留空白平板(不接种)，用于检测培养基是否被污染，B正确；本实验目的为检测出厂水样中的大肠杆菌数量，应配制鉴别培养基进行涂布，涂布后需等待菌液被培养基吸收，再放入培养箱，否则菌液会在平板表面流动，影响菌落分布和计数，C错误；应选取菌落数在30～300的平板进行计数，取平均值，细菌可用细菌计数板进行直接计数，但是自来水中可能有多种细菌，显微镜观察难以区分，D错误。
5．产脂肪酶酵母可用于处理含油脂废水。为筛选产脂肪酶酵母菌株，科研人员开展了相关研究，实验流程如图所示。下列说法正确的是(　B　)
A．筛选产脂肪酶酵母可用牛肉膏蛋白胨培养基，接种完成后培养皿应倒置
B．用稀释涂布平板法获取Ⅰ号培养基的菌落数量通常会低于活菌的真实值
C．Ⅱ号培养基用平板划线法纯化菌种，接种环的灼烧次数与划线次数相同
D．若Ⅱ号培养基上菌落平均数为58个，则产脂肪酶酵母数量为5.8×105个
解析：牛肉膏蛋白胨富含氮源、碳源，基本上各种细菌、真菌都能在其上生长，该实验目的是筛选产脂肪酶酵母菌株，Ⅰ号培养基需要配制以油脂为唯一碳源的营养成分，能在上面生长的微生物即为能产脂肪酶的菌株，接种完成后培养皿应倒置，A错误；由图可知，Ⅰ号培养基使用的方法是稀释涂布平板法，由于会出现两个或多个细胞连在一起形成一个菌落，此时以菌落数进行计数，所得结果往往小于实际活菌数，B正确；由图可知，Ⅱ号培养基采用的是平板划线法，每次划线前后均需要对接种环灼烧，接种环的灼烧次数比划线次数多1次，C错误；由于平板划线法除了最后一次划线末端培养出的菌落是由单一酵母菌繁殖而来的，其他菌落往往由多个酵母菌一起繁殖而成，即一个菌落并非对应着一个酵母菌，因此，不管计算是否正确，平板划线法都不适合用来统计样品中的酵母菌数量，D错误。

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