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第3章
第1节　重组DNA技术的基本工具
基因工程
学习目标
1．简述限制性内切核酸酶的种类及其作用特点(重点)；
2．说出黏性末端与平末端的区别(重难点)；
3．简述DNA连接酶的种类及其作用(重点)；
4．理解作为基因工程的载体应具备的条件(重难点)；
5．初步掌握DNA的粗提取与鉴定方法
素养目标
生命观念：通过对基因的结构认识，结合必修2中DNA的结构形成生命的物质观、结构与功能观；通过学习，认识到遗传信息能在不同种生物的DNA分子之间传递，这体现了生物界的统一性；
科学思维：通过对转基因番木瓜对木瓜环斑病毒产生抗性问题以及对“到社会中去”栏目的探讨，培养和发展学生的科学思维能力；
科学探究：通过“探究·实践”活动“DNA的粗提取与鉴定”，在自主学习、选择材料和设计方案等环节中发展学生的科学探究素养；
社会责任：通过学习基因工程的基本原理和实质，以及了解相关应用的实例，使学生认同基因工程给我们的生产和生活带来的正面影响，引导学生理性、科学地看待问题
核心概念
1．基因工程的概念
按照人们的愿望，通过__________等技术，赋予生物新的____________，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。又叫作_________________。
2．[连线]重组DNA技术的基本工具
转基因
遗传特性
重组DNA技术
3．实验：DNA的粗提取与鉴定
(1)原理：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在________，对DNA进行提取。
(2)步骤：取洋葱________→过滤(用纱布或离心管)→析出(等体积的、预冷的体积分数为95%的________；用玻璃棒沿一个方向________卷起，或离心取______ ______)→鉴定(__________试剂鉴定，呈现______色)。
差异
研磨
酒精
搅拌
沉淀
(物)
二苯胺
蓝
[概 念 辨 析]
(1)通过基因工程产生的变异是不定向的。 (　　)
提示：基因工程可以实现遗传物质在不同物种间进行重组，并且方向性强，可以定向地改变生物的性状。
(2)限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。 (　　)
提示：大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
×
×
(3)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来。 (　　)
提示：DNA连接酶能将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
(4)E. coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。 (　　)
提示：E. coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端，只是连接具有平末端的DNA片段的效率远远低于T4 DNA连接酶。
(5)限制酶和解旋酶的作用部位相同。 (　　)
提示：限制酶和解旋酶的作用部位不同，限制酶作用于磷酸二酯键，解旋酶作用于氢键。
×
√
×
(6)作为载体的质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因。 (　　)
提示：作为载体的质粒通常采用抗生素抗性基因作为筛选标记基因，如氨苄青霉素抗性基因。
(7)质粒是环状双链DNA分子，是基因工程常用的载体。 (　　)
(8)载体(如质粒)和细胞膜中的载体蛋白的成分相同。 (　　)
提示：质粒作为基因工程的载体，其本质是环状DNA分子，而细胞膜中具有运输作用的载体蛋白的本质是蛋白质。
(9)作为载体，必须要有标记基因。 (　　)
×
√
×
√
目标导学
基因工程的工具及其作用是什么
1
目标
一
1．教材P71“图3－3”——限制酶的作用及特点
来源 主要来自____________
种类 数千种
作用 识别双链DNA分子的__________________，使每一条链中特定部位的______________断开
结果 当限制酶在它识别序列的中心轴线(图中虚线)________将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是____________；当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是__________
原核生物
特定核苷酸序列
磷酸二酯键
两侧
黏性末端
平末端
◆衍射思考
BamHⅠ和BclⅠ是两种限制酶，其识别序列及切割位点如下表所示。
限制酶 BamH Ⅰ Bcl Ⅰ
识别序列及 切割位点 GGATCC CCTAGG
TGATCA
ACTAGT
↓
↓
↑
↑
(1)限制酶______(填“能”或“不能”)切割原核细胞自身的DNA，试推测其理由是________________________________________________________________。
(2)若某链状DNA分子中含有两个BamH Ⅰ 的识别序列，该DNA分子将被切成_____个片段，共断裂_____个磷酸二酯键。
不能
原核细胞DNA中不存在限制酶的识别序列或能被识别的序列被修饰了
3
4
(3)同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？
提示：同种限制酶切割产生的黏性末端相同；不同的限制酶切割可能形成相同的黏性末端。
(4)BamH Ⅰ和Bcl Ⅰ切割后产生的黏性末端能否被DNA连接酶连接？为什么？连接完成后，该重组DNA分子的新连接处能否再被所用的限制酶识别？为什么？
提示：能。二者切割后产生的黏性末端相同，可被DNA连接酶连接。不能再被所用的限制酶识别。因为所用的两种限制酶均不能识别该重组DNA分子的新连接处的脱氧核苷酸序列。
拓展延伸
(1)回文序列
限制酶特异性识别和切割的部位具有回文序列，即在切割部位，一条链正向读的碱基顺序，与另一条链反向读的顺序完全一致。例如：EcoRⅠ限制酶识别的DNA序列为，为回文序列。
(2)同尾酶
识别DNA 分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。
2．教材P72——DNA连接酶
(1)作用
将两个______________连接起来，恢复被__________切开的两个核苷酸之间的______________。
(2)种类
DNA片段
限制酶
磷酸二酯键
种类 来源 特点
__________ DNA连接酶 ____________ 两者既可以“缝合”双链DNA片段互补的____________，又可以“缝合”双链DNA片段的_________，但______________________连接具有平末端的DNA片段的效率要远远________T4 DNA连接酶
T4 DNA 连接酶 T4噬菌体 E. coli
大肠杆菌
黏性末端
平末端
E. coli DNA连接酶
低于
　　　(亳州阶段练)EcoRⅠ和SmaⅠ限制酶识别的序列均由6个核苷酸组成，但切割后产生的结果不同，其识别序列和切割位点(图中箭头处)如下图所示。据图分析，下列说法正确的是 (　　)
A．所有限制酶的识别序列均由6个核苷酸组成
B．SmaⅠ切割后产生的是黏性末端
C．用DNA连接酶连接平末端和黏性末端的效率一样
D．细菌细胞内的限制酶可以切割外源DNA，防止外源DNA入侵
1
D
解析：不是所有限制酶的识别序列均由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4、5或8个核苷酸组成，A错误；据图可知，SmaⅠ酶在它识别序列的中心轴线处将DNA片段切开，产生的是平末端，B错误；用DNA连接酶连接平末端的效率比较低，C错误；细菌细胞内的限制酶可以切割外源DNA，防止外源DNA入侵，是一套完善的防御体系，D正确。
　　　(亳州期末)下列关于基因工程中的DNA连接酶的叙述，不正确的是 (　　)
A．DNA连接酶的化学本质是蛋白质
B．DNA连接酶能够连接两个DNA片段之间的磷酸二酯键
C．基因工程中可以用DNA聚合酶替代DNA连接酶
D．根据来源不同，DNA连接酶可分为E．coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶两大类
C
2
解析：DNA连接酶的作用是连接两个 DNA片段之间的磷酸二酯键，从而将两个DNA片段连接起来，而DNA聚合酶是将单个的脱氧核苷酸连接到正在合成的DNA链上(或连接DNA片段与游离脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键)，B正确，C错误。
方法规律 与DNA相关的几种酶的比较
项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶
作用部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键
作用对象 DNA片段 DNA 单个的脱氧核苷酸 双链DNA
作用结果 将两个DNA片段连接成完整的DNA分子 切割 DNA分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 将双链DNA分子局部解旋为单链
基因工程的载体需具备什么条件
1
目标
二
教材P72正文及“图3－4”——质粒作为载体应具备的条件
(1)本质
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞____________之外，并具有__________ ________的________双链DNA分子。
拟核DNA
自我复
制能力
环状
(2)质粒作为载体所具备的条件及原因
条件 原因
稳定存在并能_______________________ _________ 能使目的基因稳定存在且数量可扩增
有一个至多个______________位点 可携带多个或多种外源基因
具有特殊的____________ 便于重组DNA分子的________
无毒害作用 对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤
自我复制或整合到受体DNA上
限制酶切割
标记基因
筛选
(3)作用
①作为运输工具，将外源基因导入________。
②质粒携带________________在细胞内大量复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
【注意】真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。这些质粒常有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
细胞
外源DNA片段
◆衍射思考
将从苏云金杆菌中获取的Bt基因转入棉花细胞内培育转基因抗虫棉的过程中，需借助多种分子工具且经历多个操作步骤。实验人员使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割质粒。下图表示常用的限制酶识别序列和切割位点以及质粒上的限制酶切割位点。请思考以下问题：
(1)请用图示法写出限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割后形成黏性末端的过程。
限制酶EcoRⅠ：
限制酶NheⅠ：
(2)切割图示中的目的基因应选用哪类限制酶？请说明理由。
提示：用限制酶MunⅠ和SpeⅠ切割目的基因。限制酶MunⅠ和EcoRⅠ切割后形成的黏性末端相同，限制酶NheⅠ和SpeⅠ切割后形成的黏性末端相同，实验人员使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割质粒，应选用MunⅠ和SpeⅠ切割目的基因。
归纳总结 限制酶的选择
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因、启动子、终止子、复制原点，所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
甲　　　　　　　　　　　　乙
　　　 (蚌埠高中联考)经人工改造的质粒，携带有抗生素抗性基因，常作为研究细菌代谢和基因工程的关键工具，但其在工程菌中可能因复制分配机制或环境压力(如营养不足)而丢失。下列有关质粒的叙述，错误的是 (　　)
A．独立于拟核之外，主要参与细菌的初生代谢过程
B．因营养亏缺而丢失质粒，一般不会导致细菌增殖所需物质不能合成
C．用作基因工程的运载工具时，对运载基因的数量、大小有一定的限制
D．培养含质粒的工程菌时，常用抗生素持续筛选来确保工程目标的实现
A
3
解析：质粒是独立于拟核之外的小型环状DNA分子，在细菌中可能因营养不足而丢失，说明质粒主要参与细菌的次生代谢过程，A错误；质粒携带的基因并非细菌增殖所必需的，因营养亏缺而丢失质粒，一般不会导致细菌增殖所需物质不能合成，B正确；用作基因工程的运载工具时，载体的容量是有限的，对运载基因的数量、大小有一定的限制，C正确；人工改造的质粒携带有抗生素抗性基因，培养含质粒的工程菌时，常用抗生素持续筛选，只有含有质粒(即含有抗生素抗性基因)的工程菌才能存活，确保工程目标的实现，D正确。
　　　 某细菌质粒上有标记基因，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)示意图。请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是 (　　)
4
插入点 细菌在含氨苄青霉素 的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的
培养基上的生长状况
① 能生长 能生长
② 能生长 不能生长
③ 不能生长 能生长
A．①是c；②是b；③是a B．①是a和b；②是a；③是b
C．①是a和b；②是b；③是a D．①是c；②是a；③是b
A
解析：外源基因插入某个抗性基因中，会破坏该抗性基因，使细菌失去对对应抗生素的抗性，在含该抗生素的培养基上不能生长。分析插入点①，细菌在含四环素和含氨苄青霉素的培养基上都能生长，说明两抗性基因完整，则插入点在a、b点之外，即c处；分析插入点②，细菌在含四环素的培养基上不能生长，在含氨苄青霉素的培养基上能生长，说明四环素抗性基因被破坏，外源基因插入点是b；分析插入点③，细菌在含四环素的培养基上能生长，在含氨苄青霉素的培养基上不能生长，说明氨苄青霉素抗性基因被破坏，外源基因插入点是a，综上分析，A正确。
归纳总结 标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示：
实验：DNA的粗提取与鉴定
1
目标
三
1．实验原理
(1)提取DNA的原理
①DNA在酒精溶液中的溶解性：DNA__________酒精，但某些__________溶于酒精。
②DNA在NaCl溶液中的溶解性：DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于____________的NaCl溶液。
(2)鉴定DNA的原理
在一定温度下，DNA遇__________试剂会呈现________。
不溶于
蛋白质
2 mol·L－1
二苯胺
蓝色
2．实验材料与试剂
(1)凡是含有DNA的生物材料都可以考虑。但是，选用DNA含量相对较高的组织，成功的可能性更大。
(2)能否选取牛、羊、猪等哺乳动物成熟的红细胞作为DNA提取的材料？为什么？
___________________________________________________________________。
(3)[连线]实验中部分试剂的作用
①体积分数为95%的酒精
②2 mol·L－1 的NaCl溶液
③二苯胺试剂
不能，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA
A．溶解DNA
B．鉴定DNA
C．析出DNA
3．实验步骤相关分析
(1)研磨的目的是破碎细胞，使__________容易溶解在研磨液中。
(2)过滤后的上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？
___________________________________________。
(3)用纱布过滤的方法中，低温放置几分钟的作用：①低温抑制___________ _____的活性，进而抑制DNA降解；②抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出。
(4)用玻璃棒搅拌析出的DNA时，应________、并沿____________搅拌，以减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子。
(5)用二苯胺试剂鉴定DNA时应________加热。
核物质
提示：可能含有核蛋白、多糖、RNA等杂质
DNA水解
酶
轻缓
一个方向
水浴
　　　 (淮北七中)如图为“DNA的粗提取与鉴定”实验的部分操作流程。下列相关叙述正确的是 (　　)
D
5
A．将图1中的研磨液过滤后保留沉淀
B．图2过程，用玻璃棒进行快速交叉搅拌会使DNA析出更快
C．图2析出得到的白色丝状物只能溶于2 mol·L－1的NaCl溶液
D．图3对提取后的DNA进行鉴定，两支试管中均要加入二苯胺试剂
图1　　　　　　　　　　图2　　　　　　　图3
解析：图1中新鲜洋葱研磨后DNA存在于研磨液中，过滤后应保留滤液，A错误；图2过程，玻璃棒要沿同一方向轻轻搅拌，防止DNA分子断裂，B错误；图2析出得到的白色丝状物主要成分是DNA，DNA在2 mol·L－1的NaCl溶液中溶解度高，并不是只能溶于2 mol·L－1的NaCl溶液，C错误；图3对提取后的DNA进行鉴定，作为对照，两支试管中均要加入等量的二苯胺试剂，D正确。
随堂内化
一、 知识自主构建
限制性内切核酸酶
DNA连接酶
质粒
二、 学情随堂评价
1．下列有关基因工程中载体的说法，正确的是 (　　)
A．基因工程中使用的载体只有质粒
B．质粒是细胞质中能够自我复制的环状DNA分子
C．噬菌体可以作为动物基因工程的载体
D．天然质粒均可以直接作为载体将目的基因送入受体细胞
B
解析：基因工程中常用的载体是质粒，此外还有噬菌体、动植物病毒等，A错误；噬菌体是专门寄生在细菌体内的病毒，不可以作为动物基因工程的载体，C错误；天然质粒往往不能直接作为载体，要根据不同的目的和需求进行人工改造，D错误。
2．(淮北期中)基因工程需要三种工具：限制酶、DNA连接酶和载体。下列相关叙述正确的是 (　　)
A．限制酶主要是从真核生物中分离纯化出来的
B．DNA连接酶与DNA聚合酶催化合成的化学键相同，催化的反应底物也相同
C．质粒的基本单位是核糖核苷酸，另外两种工具的基本单位是氨基酸
D．基因工程中常用的载体除质粒外，还包括噬菌体、动植物病毒等
D
解析：限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的，A错误；DNA连接酶连接的是两个DNA片段，催化形成磷酸二酯键，而DNA聚合酶是将单个脱氧核苷酸连接到正在合成的DNA子链上，催化形成磷酸二酯键，二者催化的反应底物不同，B错误；质粒是小型环状 DNA 分子，基本单位是脱氧核苷酸，限制酶和 DNA 连接酶的本质是蛋白质，基本单位是氨基酸，C错误。
3．(六安期末改编)某小组用限制酶处理DNA后获得了如图所示的3种黏性末端。下列相关叙述正确的是 (　　)
D
A．限制酶识别DNA序列不一定具有特异性
B．这3种黏性末端都是由同种限制酶切割获得的
C．T4 DNA连接酶不能连接互补的黏性末端
D．E．coli DNA连接酶可以将甲、乙连接起来
甲　　　　　　　　　乙　　　　　　　　丙
解析：限制酶能切割外源DNA，它具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子，A错误；同种限制酶切割产生的黏性末端应相同，图中甲、乙的黏性末端相同，但切割甲、乙序列的限制酶不同，即切割甲的限制酶识别序列为5′－GAATTC－3′，切割乙的限制酶识别序列为5′－CAATTG－3′，丙的黏性末端与甲、乙均不同，则由另一种限制酶切割形成，该酶识别序列为5′－CTTAAG－3′，因此，甲、乙、丙3种黏性末端是由不同的限制酶切割获得的，B错误；T4 DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端，C错误；甲、乙切割后形成的黏性末端都是5′－AATT－3′，可用E．coli DNA连接酶将甲、乙连接起来，D正确。
4．下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验中的选材或操作的叙述，正确的是 (　　)
A．选择兔的成熟红细胞作为材料时，需先加入柠檬酸钠溶液抗凝
B．利用DNA溶于酒精，而某些蛋白质不溶于酒精的特性，可以初步分离DNA与蛋白质
C．研磨液倒入离心管中进行离心5 min，然后取沉淀物置于烧杯中
D．二苯胺试剂需现配现用，若与DNA混合后直接观察无颜色反应，不能排除DNA存在的可能性
D
解析：兔的成熟红细胞无细胞核，无法作为提取DNA的实验材料，A错误；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可利用此原理将DNA与蛋白质分离，B错误；将研磨液倒入塑料离心管中离心5 min后，取上清液备用，C错误；二苯胺试剂需现配现用，与DNA溶剂混合后，在沸水浴条件下呈蓝色，若与DNA溶剂混合后直接观察无颜色反应，不能排除DNA存在的可能性，D正确。第1节　重组DNA技术的基本工具
1． (六安期末)下列关于基因工程基本工具的叙述，正确的是(　　)
A．DNA聚合酶能够催化形成磷酸二酯键，是基因工程中的“分子缝合针”
B．限制酶切割DNA分子一次可断开2个磷酸二酯键，产生2个游离的磷酸基团
C．T4 DNA连接酶既能连接双链DNA片段互补的黏性末端，又能连接双链DNA片段的平末端，从而恢复被限制酶切开的氢键
D．用做分子运输车的质粒有抗生素合成基因，便于重组DNA分子的筛选
2．科学家把兔子血红蛋白基因导入大肠杆菌细胞中，在大肠杆菌细胞中合成了兔子的血红蛋白。下列关于这一先进技术的理论依据，不正确的是(　　)
A．所有生物共用一套遗传密码
B．基因能控制蛋白质的合成
C．兔子血红蛋白基因与大肠杆菌的DNA都由4种脱氧核苷酸构成，都遵循相同的碱基互补配对原则
D．兔子与大肠杆菌有共同的原始祖先
3．(合肥六中)下表关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的表述，不正确的是(　　)
选项 试剂 操作 作用
A 研磨液 与生物材料混合 提取溶解DNA
B 2 mol·L-1 NaCl溶液 与提取出的DNA混合 溶解DNA
C 冷却的酒精 加到离心后的 上清液中 溶解DNA
D 二苯胺试剂 加到溶解有 DNA的NaCl溶液中 鉴定DNA
4．(安徽A10联盟期中)用限制酶EcoRⅤ单独切割某普通质粒，可产生14 kb(1 kb即1 000个碱基对)的长链，而同时用限制酶EcoRⅤ、MboⅠ联合切割该质粒，可得到三种长度的DNA片段，见下图(其中*表示EcoRⅤ限制酶切割后的一个黏性末端)。若用MboⅠ限制酶单独切割该普通质粒，则产生的DNA片段的长度为(　　)
A．2.5 kb和11.5 kb B．14 kb
C．5.5 kb和8.5 kb D．6 kb和8 kb
5．基因工程中需使用多种工具酶，几种限制酶的切割位点如图所示。下列说法正确的是(　　)
A．限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的末端，可以通过E.coliDNA连接酶相互连接，且效率较T4 DNA连接酶连接时高
B．DNA连接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯键的形成
C．限制酶EcoRⅠ进行一次切割，会切断2个磷酸二酯键，形成1个游离的5′末端
D．若两种限制酶的识别序列相同，则形成的末端一定能通过DNA连接酶相互连接
6．下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是(　　)
A．菜花提取的DNA滤液中，加入冷酒精不利于析出DNA
B．提取细胞中的DNA必须用蒸馏水涨破细胞
C．将丝状物加入二苯胺试剂，沸水浴冷却后呈蓝色
D．DNA不溶于体积分数为95%的冷酒精而溶于的NaCl溶液
7．(池州期末)以下是几种不同限制酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述正确的是(　　)
A．以上DNA片段是由4种限制酶切割后产生的
B．②片段是在识别序列为的限制酶作用下形成的
C．①和④两个片段在DNA聚合酶的作用下可形成重组DNA分子
D．限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键
8．限制性内切核酸酶是基因工程中常用的一种酶。以下是6种不同限制酶的识别序列和切割位点，下列叙述错误的是(　　)
　
注：箭头表示识别序列中切断部位。
A．KpnⅠ和Acc65Ⅰ切割位点不同，但形成黏性末端是相同的
B．与EcoRⅠ相比，HhaⅠ识别序列较短，该序列在DNA中出现的概率高
C．BamHⅠ切割产生的黏性末端能够与MboⅠ切割成的黏性末端拼接
D．限制酶识别序列大多是沿中心轴回转180°相反重合
9．(淮南期中)研究人员比较了不同储藏条件对棉叶DNA纯度及提取率(提取率越高，获得的DNA越多)的影响，实验结果如图所示。下列有关叙述错误的是(　　)
A．提纯DNA时可加入体积分数为75%的酒精去除蛋白质等物质
B．新鲜棉叶提取的DNA纯度最高，但提取DNA的量不是最多的
C．用二苯胺试剂鉴定，蓝色最深的是冷冻3 d处理后提取的DNA
D．DNA不溶于酒精，在NaCl溶液中的溶解度随溶液浓度的不同而不同
10．某小组开展了DNA的粗提取与鉴定实验，选择了不同温度(20 ℃、－20 ℃)条件下保存的花菜、辣椒和蒜黄作为实验材料，部分实验步骤如图1所示。回答下列问题：
图1
(1)选择花菜等植物材料时，加入少量石英砂，其作用是____________________，同时加入洗涤剂可________________________________________________________________________。
(2)图1中，将获取的研磨液直接倒入塑料离心管中，进行离心处理，再取________(填“上清液”或“沉淀物”)放入烧杯中。加入体积分数为95%的预冷酒精溶液来初步提取DNA，这样做的原理是________________________________________________________________________。
(3)向其中加入NaCl溶液，调节浓度至0.14 mol·L-1时，DNA在溶液中溶解度________，从而析出。
(4)DNA鉴定结果如图2所示。据图2分析，相同温度条件下，________的DNA粗提取含量最低。
图2　DNA鉴定的实验结果
第1节　重组DNA技术的基本工具
题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9
答案 B D C D B D D D A
1．B　解析：基因工程中的“分子缝合针”是DNA连接酶，它催化形成磷酸二酯键连接DNA片段，A错误；限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，即一条链断开1个磷酸二酯键，产生1个游离的磷酸基团，故限制酶切割DNA分子一次可断开2个磷酸二酯键，产生2个游离的磷酸基团，B正确；T4 DNA连接酶可以连接黏性末端和平末端，但其连接的是磷酸二酯键，而不是氢键，C错误；质粒作为载体，常含抗生素抗性基因(如四环素抗性基因)，作为标记基因，便于重组DNA分子的筛选，D错误。
2．D　解析：题干表述的是目的基因导入受体细胞并得以表达的过程，目的基因在不同生物细胞中能够表达出相同的蛋白质，说明控制其合成的mRNA上的密码子是共用的，相同的密码子决定相同的氨基酸，A正确；基因通过转录获得mRNA，进而控制蛋白质的合成，B正确；基因通常是有遗传效应的DNA片段，双链DNA都遵循碱基互补配对原则，其组成原料都是4种脱氧核苷酸，C正确；生物之间是否有共同的原始祖先与转基因技术之间没有必然关系，D错误。
3．C　解析：DNA不溶于冷酒精，细胞中某些蛋白质溶于酒精，将冷却酒精加入离心后的上清液(含DNA等)，是为了让DNA析出，实现与蛋白质分离，C错误。
4．D　解析：用限制酶EcoRⅤ单独切割某普通质粒，可产生14 kb的长链，说明质粒中含有1个EcoRⅤ切点，且该质粒总长度为14 kb，同时用限制酶EcoRⅤ、MboⅠ联合切割该质粒，可得到三种长度的DNA片段，说明质粒中含有2个MboⅠ切点。根据EcoRⅤ限制酶切割后的一个黏性末端“*”，可推知MboⅠ酶切位点的位置，如下图：
若用MboⅠ限制酶单独切割该普通质粒，则产生的DNA片段的长度为6 kb、8 kb，D符合题意。
5．B　解析：限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的是平末端，E.coliDNA连接酶可以连接平末端和黏性末端，但其连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶，A错误。DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键；DNA聚合酶将单个脱氧核苷酸加到已有的核苷酸片段上，形成磷酸二酯键；RNA聚合酶将单个核糖核苷酸加到已有的核苷酸片段上，形成磷酸二酯键，B正确。一个限制酶切割一次，使DNA双链断开，会有2个磷酸二酯键断裂，形成2个游离的5′末端，C错误。若两种限制酶的识别序列相同，但识别的位点不同，则切割形成的末端不同，不能通过DNA连接酶相互连接，D错误。
6．D　解析：菜花提取的DNA滤液中，加入冷酒精有利于析出DNA，A错误；若实验材料是植物，则提取DNA时不能用蒸馏水涨破细胞，B错误；将DNA丝状物先溶解在2 mol·L-1的NaCl溶液中，然后加入二苯胺试剂并进行沸水浴，冷却后呈蓝色，C错误。
7．D　解析：图中①④是由同一种限制酶切割形成的黏性末端，②③由另外两种限制酶切割后产生，A错误；②片段是在识别序列为的限制酶作用下形成的，B错误；①④连接形成重组DNA分子需要的是DNA连接酶，C错误。
8．D　解析：KpnⅠ的切割位点在CC中间，Acc65Ⅰ切割位点在GG之间，KpnⅠ和Acc65Ⅰ切割形成的黏性末端都是，A正确；通常识别序列越短，其在DNA中出现的概率越高，B正确；BamHⅠ切割产生的黏性末端与MboⅠ切割成的黏性末端相同，故两者能够拼接，C正确；限制酶的识别序列通常是回文序列，即沿中心轴对称，D错误。
9．A　解析：DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，加入体积分数为95%的酒精可使DNA析出，去除蛋白质等杂质，而体积分数为75%的酒精常用于消毒等，不能有效去除DNA中的蛋白质杂质，A错误；分析题图，新鲜棉叶提取的DNA纯度最高，但DNA提取率较冷冻3 d低，因此新鲜棉叶提取DNA的量不是最多的，B正确；在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈蓝色，且DNA含量越高，蓝色越深，图中冷冻3 d处理后DNA提取率最高，DNA含量相对最多，蓝色最深，C正确；DNA不溶于酒精，且DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，D正确。
10．(1)有助于研磨得更充分　瓦解细胞膜，有利于DNA释放　(2)上清液　DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精　(3)最小　(4)辣椒
解析：(1)加入少量石英砂，其作用是有助于研磨更充分，因为石英砂硬度较大，在研磨过程中可以增加摩擦力，使植物细胞更好地破碎，从而释放出细胞内的DNA等物质；同时加入洗涤剂可以瓦解细胞膜，有利于DNA释放，洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜上的脂质和蛋白质，破坏细胞膜的结构，进而使细胞内的DNA更容易被释放到研磨液中。(2)将获取的研磨液直接倒入塑料离心管中进行离心处理，由于DNA溶解在溶液中，而一些不溶性的杂质会沉淀下来，所以要取上清液放入烧杯中。加入体积分数为95%的预冷酒精溶液来初步提取DNA，这样做的原理是DNA不溶于酒精溶液，某些蛋白质溶于酒精，通过加入预冷酒精，可使DNA析出，而杂质仍留在酒精溶液中，从而达到初步分离DNA的目的。(3)DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，当向其中加入NaCl溶液，调节浓度至0.14 mol·L-1时，DNA在溶液中溶解度最小，从而析出。(4)从图2中可以看出，在相同温度条件下，无论是20 ℃还是－20 ℃，辣椒对应的蓝色深浅相对程度都最低，而蓝色深浅程度可以反映DNA的含量(蓝色越深，DNA含量越高)，所以辣椒的DNA粗提取含量最低。第3章　基因工程
第1节　重组DNA技术的基本工具
学习目标 素养目标
1．简述限制性内切核酸酶的种类及其作用特点(重点)； 2．说出黏性末端与平末端的区别(重难点)； 3．简述DNA连接酶的种类及其作用(重点)； 4．理解作为基因工程的载体应具备的条件(重难点)； 5．初步掌握DNA的粗提取与鉴定方法 生命观念：通过对基因的结构认识，结合必修2中DNA的结构形成生命的物质观、结构与功能观；通过学习，认识到遗传信息能在不同种生物的DNA分子之间传递，这体现了生物界的统一性； 科学思维：通过对转基因番木瓜对木瓜环斑病毒产生抗性问题以及对“到社会中去”栏目的探讨，培养和发展学生的科学思维能力； 科学探究：通过“探究·实践”活动“DNA的粗提取与鉴定”，在自主学习、选择材料和设计方案等环节中发展学生的科学探究素养； 社会责任：通过学习基因工程的基本原理和实质，以及了解相关应用的实例，使学生认同基因工程给我们的生产和生活带来的正面影响，引导学生理性、科学地看待问题
1．基因工程的概念
按照人们的愿望，通过__ __等技术，赋予生物新的__ __，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。又叫作__ __。
2．[连线]重组DNA技术的基本工具
3．实验：DNA的粗提取与鉴定
(1)原理：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在____，对DNA进行提取。
(2)步骤：取洋葱____→过滤(用纱布或离心管)→析出(等体积的、预冷的体积分数为95%的____；用玻璃棒沿一个方向____卷起，或离心取____)→鉴定(____试剂鉴定，呈现____色)。
[概 念 辨 析]
(1)通过基因工程产生的变异是不定向的。(　　)
(2)限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。(　　)
(3)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来。(　　)
(4)E．coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。(　　)
(5)限制酶和解旋酶的作用部位相同。(　　)
(6)作为载体的质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因。(　　)
(7)质粒是环状双链DNA分子，是基因工程常用的载体。(　　)
(8)载体(如质粒)和细胞膜中的载体蛋白的成分相同。(　　)
(9)作为载体，必须要有标记基因。(　　)
基因工程的工具及其作用是什么
1．教材P71“图3－3”——限制酶的作用及特点
,
,
来源 主要来自__ __
种类 数千种
作用 识别双链DNA分子的__ __，使每一条链中特定部位的__ __断开
结果 当限制酶在它识别序列的中心轴线(图中虚线)__ __将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是__ __；当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是__ __
◆衍射思考
BamHⅠ和BclⅠ是两种限制酶，其识别序列及切割位点如下表所示。
限制酶 BamH Ⅰ Bcl Ⅰ
识别序列及 切割位点 GGATCC CCTAGG TGATCA ACTAGT
(1)限制酶__ __(填“能”或“不能”)切割原核细胞自身的DNA，试推测其理由是__________________________。
(2)若某链状DNA分子中含有两个BamH Ⅰ 的识别序列，该DNA分子将被切成____个片段，共断裂____个磷酸二酯键。
(3)同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？
(4)BamH Ⅰ和Bcl Ⅰ切割后产生的黏性末端能否被DNA连接酶连接？为什么？连接完成后，该重组DNA分子的新连接处能否再被所用的限制酶识别？为什么？
拓展延伸
(1)回文序列
限制酶特异性识别和切割的部位具有回文序列，即在切割部位，一条链正向读的碱基顺序，与另一条链反向读的顺序完全一致。例如：EcoRⅠ限制酶识别的DNA序列为，为回文序列。
(2)同尾酶
识别DNA 分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。
2．教材P72——DNA连接酶
(1)作用
将两个__ __连接起来，恢复被__ __
切开的两个核苷酸之间的__________。
(2)种类
种类 来源 特点
_________ DNA连接酶 _________ 两者既可以“缝合”双链DNA片段互补的__________，又可以“缝合”双链DNA片段的_________，但_________连接具有平末端的DNA片段的效率要远远_________T4 DNA连接酶
T4 DNA 连接酶 T4噬菌体
(亳州阶段练)EcoRⅠ和SmaⅠ限制酶识别的序列均由6个核苷酸组成，但切割后产生的结果不同，其识别序列和切割位点(图中箭头处)如下图所示。据图分析，下列说法正确的是(　　)
A．所有限制酶的识别序列均由6个核苷酸组成
B．SmaⅠ切割后产生的是黏性末端
C．用DNA连接酶连接平末端和黏性末端的效率一样
D．细菌细胞内的限制酶可以切割外源DNA，防止外源DNA入侵
(亳州期末)下列关于基因工程中的DNA连接酶的叙述，不正确的是(　　)
A．DNA连接酶的化学本质是蛋白质
B．DNA连接酶能够连接两个DNA片段之间的磷酸二酯键
C．基因工程中可以用DNA聚合酶替代DNA连接酶
D．根据来源不同，DNA连接酶可分为E．coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶两大类
方法规律 与DNA相关的几种酶的比较
项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶
作用部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键
作用对象 DNA片段 DNA 单个的脱氧核苷酸 双链DNA
作用结果 将两个DNA片段连接成完整的DNA分子 切割 DNA 分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 将双链DNA分子局部解旋为单链
基因工程的载体需具备什么条件
教材P72正文及“图3－4”——质粒作为载体应具备的条件
(1)本质
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞__ __之外，并具有_________的________双链DNA分子。
(2)质粒作为载体所具备的条件及原因
条件 原因
稳定存在并能____________________ 能使目的基因稳定存在且数量可扩增
有一个至多个________位点 可携带多个或多种外源基因
具有特殊的_______ 便于重组DNA分子的________
无毒害作用 对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤
(3)作用
①作为运输工具，将外源基因导入_______。
②质粒携带_______在细胞内大量复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
【注意】真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。这些质粒常有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
◆衍射思考
将从苏云金杆菌中获取的Bt基因转入棉花细胞内培育转基因抗虫棉的过程中，需借助多种分子工具且经历多个操作步骤。实验人员使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割质粒。下图表示常用的限制酶识别序列和切割位点以及质粒上的限制酶切割位点。请思考以下问题：
(1)请用图示法写出限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割后形成黏性末端的过程。
限制酶EcoRⅠ：
限制酶NheⅠ：
(2)切割图示中的目的基因应选用哪类限制酶？请说明理由。
提示：用限制酶MunⅠ和SpeⅠ切割目的基因。限制酶MunⅠ和EcoRⅠ切割后形成的黏性末端相同，限制酶NheⅠ和SpeⅠ切割后形成的黏性末端相同，实验人员使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割质粒，应选用MunⅠ和SpeⅠ切割目的基因。
归纳总结 限制酶的选择
　　
甲　　　　　　　乙
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因、启动子、终止子、复制原点，所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
(蚌埠高中联考)经人工改造的质粒，携带有抗生素抗性基因，常作为研究细菌代谢和基因工程的关键工具，但其在工程菌中可能因复制分配机制或环境压力(如营养不足)而丢失。下列有关质粒的叙述，错误的是(　　)
A．独立于拟核之外，主要参与细菌的初生代谢过程
B．因营养亏缺而丢失质粒，一般不会导致细菌增殖所需物质不能合成
C．用作基因工程的运载工具时，对运载基因的数量、大小有一定的限制
D．培养含质粒的工程菌时，常用抗生素持续筛选来确保工程目标的实现
某细菌质粒上有标记基因，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)示意图。请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是(　　)
插入点 细菌在含氨苄青霉素 的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的 培养基上的生长状况
① 能生长 能生长
② 能生长 不能生长
③ 不能生长 能生长
A．①是c；②是b；③是a
B．①是a和b；②是a；③是b
C．①是a和b；②是b；③是a
D．①是c；②是a；③是b
归纳总结 标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示：
实验：DNA的粗提取与鉴定
1．实验原理
(1)提取DNA的原理
①DNA在酒精溶液中的溶解性：DNA______
酒精，但某些________溶于酒精。
②DNA在NaCl溶液中的溶解性：DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于________的NaCl溶液。
(2)鉴定DNA的原理
在一定温度下，DNA遇________试剂会呈现________。
2．实验材料与试剂
(1)凡是含有DNA的生物材料都可以考虑。但是，选用DNA含量相对较高的组织，成功的可能性更大。
(2)能否选取牛、羊、猪等哺乳动物成熟的红细胞作为DNA提取的材料？为什么？
(3)[连线]实验中部分试剂的作用
3．实验步骤相关分析
(1)研磨的目的是破碎细胞，使________容易溶解在研磨液中。
(2)过滤后的上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？
(3)用纱布过滤的方法中，低温放置几分钟的作用：①低温抑制_______的活性，进而抑制DNA降解；②抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出。
(4)用玻璃棒搅拌析出的DNA时，应________、并沿______搅拌，以减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子。
(5)用二苯胺试剂鉴定DNA时应________加热。
(淮北七中)如图为“DNA的粗提取与鉴定”实验的部分操作流程。下列相关叙述正确的是(　　)
图1
图2
　
图3
A．将图1中的研磨液过滤后保留沉淀
B．图2过程，用玻璃棒进行快速交叉搅拌会使DNA析出更快
C．图2析出得到的白色丝状物只能溶于2 mol·L－1的NaCl溶液
D．图3对提取后的DNA进行鉴定，两支试管中均要加入二苯胺试剂
一、 知识自主构建
二、 学情随堂评价
1．下列有关基因工程中载体的说法，正确的是(　)
A．基因工程中使用的载体只有质粒
B．质粒是细胞质中能够自我复制的环状DNA分子
C．噬菌体可以作为动物基因工程的载体
D．天然质粒均可以直接作为载体将目的基因送入受体细胞
2．(淮北期中)基因工程需要三种工具：限制酶、DNA连接酶和载体。下列相关叙述正确的是(　　)
A．限制酶主要是从真核生物中分离纯化出来的
B．DNA连接酶与DNA聚合酶催化合成的化学键相同，催化的反应底物也相同
C．质粒的基本单位是核糖核苷酸，另外两种工具的基本单位是氨基酸
D．基因工程中常用的载体除质粒外，还包括噬菌体、动植物病毒等
3．(六安期末改编)某小组用限制酶处理DNA后获得了如图所示的3种黏性末端。下列相关叙述正确的是(　)
甲
　
乙
　
丙
A．限制酶识别DNA序列不一定具有特异性
B．这3种黏性末端都是由同种限制酶切割获得的
C．T4 DNA连接酶不能连接互补的黏性末端
D．E．coli DNA连接酶可以将甲、乙连接起来
4．下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验中的选材或操作的叙述，正确的是(　　)
A．选择兔的成熟红细胞作为材料时，需先加入柠檬酸钠溶液抗凝
B．利用DNA溶于酒精，而某些蛋白质不溶于酒精的特性，可以初步分离DNA与蛋白质
C．研磨液倒入离心管中进行离心5 min，然后取沉淀物置于烧杯中
D．二苯胺试剂需现配现用，若与DNA混合后直接观察无颜色反应，不能排除DNA存在的可能性
第3章　基因工程
第1节　重组DNA技术的基本工具
学习目标 素养目标
1．简述限制性内切核酸酶的种类及其作用特点(重点)； 2．说出黏性末端与平末端的区别(重难点)； 3．简述DNA连接酶的种类及其作用(重点)； 4．理解作为基因工程的载体应具备的条件(重难点)； 5．初步掌握DNA的粗提取与鉴定方法 生命观念：通过对基因的结构认识，结合必修2中DNA的结构形成生命的物质观、结构与功能观；通过学习，认识到遗传信息能在不同种生物的DNA分子之间传递，这体现了生物界的统一性； 科学思维：通过对转基因番木瓜对木瓜环斑病毒产生抗性问题以及对“到社会中去”栏目的探讨，培养和发展学生的科学思维能力； 科学探究：通过“探究·实践”活动“DNA的粗提取与鉴定”，在自主学习、选择材料和设计方案等环节中发展学生的科学探究素养； 社会责任：通过学习基因工程的基本原理和实质，以及了解相关应用的实例，使学生认同基因工程给我们的生产和生活带来的正面影响，引导学生理性、科学地看待问题
1．基因工程的概念
按照人们的愿望，通过__转基因__等技术，赋予生物新的__遗传特性__，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。又叫作__重组DNA技术__。
2．[连线]重组DNA技术的基本工具
3．实验：DNA的粗提取与鉴定
(1)原理：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在__差异__，对DNA进行提取。
(2)步骤：取洋葱__研磨__→过滤(用纱布或离心管)→析出(等体积的、预冷的体积分数为95%的__酒精__；用玻璃棒沿一个方向__搅拌__卷起，或离心取__沉淀(物)__)→鉴定(__二苯胺__试剂鉴定，呈现__蓝__色)。
[概 念 辨 析]
(1)通过基因工程产生的变异是不定向的。(　×　)
提示：基因工程可以实现遗传物质在不同物种间进行重组，并且方向性强，可以定向地改变生物的性状。
(2)限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。(　×　)
提示：大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
(3)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来。(　×　)
提示：DNA连接酶能将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
(4)E．coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。(　√　)
提示：E．coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端，只是连接具有平末端的DNA片段的效率远远低于T4 DNA连接酶。
(5)限制酶和解旋酶的作用部位相同。(　×　)
提示：限制酶和解旋酶的作用部位不同，限制酶作用于磷酸二酯键，解旋酶作用于氢键。
(6)作为载体的质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因。(　×　)
提示：作为载体的质粒通常采用抗生素抗性基因作为筛选标记基因，如氨苄青霉素抗性基因。
(7)质粒是环状双链DNA分子，是基因工程常用的载体。(　√　)
(8)载体(如质粒)和细胞膜中的载体蛋白的成分相同。(　×　)
提示：质粒作为基因工程的载体，其本质是环状DNA分子，而细胞膜中具有运输作用的载体蛋白的本质是蛋白质。
(9)作为载体，必须要有标记基因。(　√　)
基因工程的工具及其作用是什么
1．教材P71“图3－3”——限制酶的作用及特点
,
,
来源 主要来自__原核生物__
种类 数千种
作用 识别双链DNA分子的__特定核苷酸序列__，使每一条链中特定部位的__磷酸二酯键__断开
结果 当限制酶在它识别序列的中心轴线(图中虚线)__两侧__将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是__黏性末端__；当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是__平末端__
◆衍射思考
BamHⅠ和BclⅠ是两种限制酶，其识别序列及切割位点如下表所示。
限制酶 BamH Ⅰ Bcl Ⅰ
识别序列及 切割位点 GGATCC CCTAGG TGATCA ACTAGT
(1)限制酶__不能__(填“能”或“不能”)切割原核细胞自身的DNA，试推测其理由是__原核细胞DNA中不存在限制酶的识别序列或能被识别的序列被修饰了__。
(2)若某链状DNA分子中含有两个BamH Ⅰ 的识别序列，该DNA分子将被切成__3__个片段，共断裂__4__个磷酸二酯键。
(3)同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？
提示：同种限制酶切割产生的黏性末端相同；不同的限制酶切割可能形成相同的黏性末端。
(4)BamH Ⅰ和Bcl Ⅰ切割后产生的黏性末端能否被DNA连接酶连接？为什么？连接完成后，该重组DNA分子的新连接处能否再被所用的限制酶识别？为什么？
提示：能。二者切割后产生的黏性末端相同，可被DNA连接酶连接。不能再被所用的限制酶识别。因为所用的两种限制酶均不能识别该重组DNA分子的新连接处的脱氧核苷酸序列。
拓展延伸
(1)回文序列
限制酶特异性识别和切割的部位具有回文序列，即在切割部位，一条链正向读的碱基顺序，与另一条链反向读的顺序完全一致。例如：EcoRⅠ限制酶识别的DNA序列为，为回文序列。
(2)同尾酶
识别DNA 分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。
2．教材P72——DNA连接酶
(1)作用
将两个__DNA片段__连接起来，恢复被__限制酶__
切开的两个核苷酸之间的__磷酸二酯键__。
(2)种类
种类 来源 特点
__E．coli__ DNA连接酶 __大肠杆菌__ 两者既可以“缝合”双链DNA片段互补的__黏性末端__，又可以“缝合”双链DNA片段的__平末端__，但__E．coli DNA连接酶__连接具有平末端的DNA片段的效率要远远__低于__T4 DNA连接酶
T4 DNA 连接酶 T4噬菌体
(亳州阶段练)EcoRⅠ和SmaⅠ限制酶识别的序列均由6个核苷酸组成，但切割后产生的结果不同，其识别序列和切割位点(图中箭头处)如下图所示。据图分析，下列说法正确的是(　D　)
A．所有限制酶的识别序列均由6个核苷酸组成
B．SmaⅠ切割后产生的是黏性末端
C．用DNA连接酶连接平末端和黏性末端的效率一样
D．细菌细胞内的限制酶可以切割外源DNA，防止外源DNA入侵
解析：不是所有限制酶的识别序列均由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4、5或8个核苷酸组成，A错误；据图可知，SmaⅠ酶在它识别序列的中心轴线处将DNA片段切开，产生的是平末端，B错误；用DNA连接酶连接平末端的效率比较低，C错误；细菌细胞内的限制酶可以切割外源DNA，防止外源DNA入侵，是一套完善的防御体系，D正确。
(亳州期末)下列关于基因工程中的DNA连接酶的叙述，不正确的是(　C　)
A．DNA连接酶的化学本质是蛋白质
B．DNA连接酶能够连接两个DNA片段之间的磷酸二酯键
C．基因工程中可以用DNA聚合酶替代DNA连接酶
D．根据来源不同，DNA连接酶可分为E．coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶两大类
解析：DNA连接酶的作用是连接两个 DNA片段之间的磷酸二酯键，从而将两个DNA片段连接起来，而DNA聚合酶是将单个的脱氧核苷酸连接到正在合成的DNA链上(或连接DNA片段与游离脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键)，B正确，C错误。
方法规律 与DNA相关的几种酶的比较
项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶
作用部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键
作用对象 DNA片段 DNA 单个的脱氧核苷酸 双链DNA
作用结果 将两个DNA片段连接成完整的DNA分子 切割 DNA 分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 将双链DNA分子局部解旋为单链
基因工程的载体需具备什么条件
教材P72正文及“图3－4”——质粒作为载体应具备的条件
(1)本质
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞__拟核DNA__之外，并具有__自我复制能力__的__环状__双链DNA分子。
(2)质粒作为载体所具备的条件及原因
条件 原因
稳定存在并能__自我复制或整合到受体DNA上__ 能使目的基因稳定存在且数量可扩增
有一个至多个__限制酶切割__位点 可携带多个或多种外源基因
具有特殊的__标记基因__ 便于重组DNA分子的__筛选__
无毒害作用 对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤
(3)作用
①作为运输工具，将外源基因导入__细胞__。
②质粒携带__外源DNA片段__在细胞内大量复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
【注意】真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。这些质粒常有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
◆衍射思考
将从苏云金杆菌中获取的Bt基因转入棉花细胞内培育转基因抗虫棉的过程中，需借助多种分子工具且经历多个操作步骤。实验人员使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割质粒。下图表示常用的限制酶识别序列和切割位点以及质粒上的限制酶切割位点。请思考以下问题：
(1)请用图示法写出限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割后形成黏性末端的过程。
限制酶EcoRⅠ：
限制酶NheⅠ：
(2)切割图示中的目的基因应选用哪类限制酶？请说明理由。
提示：用限制酶MunⅠ和SpeⅠ切割目的基因。限制酶MunⅠ和EcoRⅠ切割后形成的黏性末端相同，限制酶NheⅠ和SpeⅠ切割后形成的黏性末端相同，实验人员使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割质粒，应选用MunⅠ和SpeⅠ切割目的基因。
归纳总结 限制酶的选择
　　
甲　　　　　　　乙
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因、启动子、终止子、复制原点，所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
(蚌埠高中联考)经人工改造的质粒，携带有抗生素抗性基因，常作为研究细菌代谢和基因工程的关键工具，但其在工程菌中可能因复制分配机制或环境压力(如营养不足)而丢失。下列有关质粒的叙述，错误的是(　A　)
A．独立于拟核之外，主要参与细菌的初生代谢过程
B．因营养亏缺而丢失质粒，一般不会导致细菌增殖所需物质不能合成
C．用作基因工程的运载工具时，对运载基因的数量、大小有一定的限制
D．培养含质粒的工程菌时，常用抗生素持续筛选来确保工程目标的实现
解析：质粒是独立于拟核之外的小型环状DNA分子，在细菌中可能因营养不足而丢失，说明质粒主要参与细菌的次生代谢过程，A错误；质粒携带的基因并非细菌增殖所必需的，因营养亏缺而丢失质粒，一般不会导致细菌增殖所需物质不能合成，B正确；用作基因工程的运载工具时，载体的容量是有限的，对运载基因的数量、大小有一定的限制，C正确；人工改造的质粒携带有抗生素抗性基因，培养含质粒的工程菌时，常用抗生素持续筛选，只有含有质粒(即含有抗生素抗性基因)的工程菌才能存活，确保工程目标的实现，D正确。
某细菌质粒上有标记基因，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)示意图。请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是(　A　)
插入点 细菌在含氨苄青霉素 的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的 培养基上的生长状况
① 能生长 能生长
② 能生长 不能生长
③ 不能生长 能生长
A．①是c；②是b；③是a
B．①是a和b；②是a；③是b
C．①是a和b；②是b；③是a
D．①是c；②是a；③是b
解析：外源基因插入某个抗性基因中，会破坏该抗性基因，使细菌失去对对应抗生素的抗性，在含该抗生素的培养基上不能生长。分析插入点①，细菌在含四环素和含氨苄青霉素的培养基上都能生长，说明两抗性基因完整，则插入点在a、b点之外，即c处；分析插入点②，细菌在含四环素的培养基上不能生长，在含氨苄青霉素的培养基上能生长，说明四环素抗性基因被破坏，外源基因插入点是b；分析插入点③，细菌在含四环素的培养基上能生长，在含氨苄青霉素的培养基上不能生长，说明氨苄青霉素抗性基因被破坏，外源基因插入点是a，综上分析，A正确。
归纳总结 标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示：
实验：DNA的粗提取与鉴定
1．实验原理
(1)提取DNA的原理
①DNA在酒精溶液中的溶解性：DNA__不溶于__
酒精，但某些__蛋白质__溶于酒精。
②DNA在NaCl溶液中的溶解性：DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于__2 mol·L－1__的NaCl溶液。
(2)鉴定DNA的原理
在一定温度下，DNA遇__二苯胺__试剂会呈现__蓝色__。
2．实验材料与试剂
(1)凡是含有DNA的生物材料都可以考虑。但是，选用DNA含量相对较高的组织，成功的可能性更大。
(2)能否选取牛、羊、猪等哺乳动物成熟的红细胞作为DNA提取的材料？为什么？
__不能，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA__。
(3)[连线]实验中部分试剂的作用
3．实验步骤相关分析
(1)研磨的目的是破碎细胞，使__核物质__容易溶解在研磨液中。
(2)过滤后的上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？__提示：可能含有核蛋白、多糖、RNA等杂质__。
(3)用纱布过滤的方法中，低温放置几分钟的作用：①低温抑制__DNA水解酶__的活性，进而抑制DNA降解；②抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出。
(4)用玻璃棒搅拌析出的DNA时，应__轻缓__、并沿__一个方向__搅拌，以减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子。
(5)用二苯胺试剂鉴定DNA时应__水浴__加热。
(淮北七中)如图为“DNA的粗提取与鉴定”实验的部分操作流程。下列相关叙述正确的是(　D　)
图1
图2
　
图3
A．将图1中的研磨液过滤后保留沉淀
B．图2过程，用玻璃棒进行快速交叉搅拌会使DNA析出更快
C．图2析出得到的白色丝状物只能溶于2 mol·L－1的NaCl溶液
D．图3对提取后的DNA进行鉴定，两支试管中均要加入二苯胺试剂
解析：图1中新鲜洋葱研磨后DNA存在于研磨液中，过滤后应保留滤液，A错误；图2过程，玻璃棒要沿同一方向轻轻搅拌，防止DNA分子断裂，B错误；图2析出得到的白色丝状物主要成分是DNA，DNA在2 mol·L－1的NaCl溶液中溶解度高，并不是只能溶于2 mol·L－1的NaCl溶液，C错误；图3对提取后的DNA进行鉴定，作为对照，两支试管中均要加入等量的二苯胺试剂，D正确。
一、 知识自主构建
二、 学情随堂评价
1．下列有关基因工程中载体的说法，正确的是(　B　)
A．基因工程中使用的载体只有质粒
B．质粒是细胞质中能够自我复制的环状DNA分子
C．噬菌体可以作为动物基因工程的载体
D．天然质粒均可以直接作为载体将目的基因送入受体细胞
解析：基因工程中常用的载体是质粒，此外还有噬菌体、动植物病毒等，A错误；噬菌体是专门寄生在细菌体内的病毒，不可以作为动物基因工程的载体，C错误；天然质粒往往不能直接作为载体，要根据不同的目的和需求进行人工改造，D错误。
2．(淮北期中)基因工程需要三种工具：限制酶、DNA连接酶和载体。下列相关叙述正确的是(　D　)
A．限制酶主要是从真核生物中分离纯化出来的
B．DNA连接酶与DNA聚合酶催化合成的化学键相同，催化的反应底物也相同
C．质粒的基本单位是核糖核苷酸，另外两种工具的基本单位是氨基酸
D．基因工程中常用的载体除质粒外，还包括噬菌体、动植物病毒等
解析：限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的，A错误；DNA连接酶连接的是两个DNA片段，催化形成磷酸二酯键，而DNA聚合酶是将单个脱氧核苷酸连接到正在合成的DNA子链上，催化形成磷酸二酯键，二者催化的反应底物不同，B错误；质粒是小型环状 DNA 分子，基本单位是脱氧核苷酸，限制酶和 DNA 连接酶的本质是蛋白质，基本单位是氨基酸，C错误。
3．(六安期末改编)某小组用限制酶处理DNA后获得了如图所示的3种黏性末端。下列相关叙述正确的是(　D　)
甲
　
乙
　
丙
A．限制酶识别DNA序列不一定具有特异性
B．这3种黏性末端都是由同种限制酶切割获得的
C．T4 DNA连接酶不能连接互补的黏性末端
D．E．coli DNA连接酶可以将甲、乙连接起来
解析：限制酶能切割外源DNA，它具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子，A错误；同种限制酶切割产生的黏性末端应相同，图中甲、乙的黏性末端相同，但切割甲、乙序列的限制酶不同，即切割甲的限制酶识别序列为5′－GAATTC－3′，切割乙的限制酶识别序列为5′－CAATTG－3′，丙的黏性末端与甲、乙均不同，则由另一种限制酶切割形成，该酶识别序列为5′－CTTAAG－3′，因此，甲、乙、丙3种黏性末端是由不同的限制酶切割获得的，B错误；T4 DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端，C错误；甲、乙切割后形成的黏性末端都是5′－AATT－3′，可用E．coli DNA连接酶将甲、乙连接起来，D正确。
4．下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验中的选材或操作的叙述，正确的是(　D　)
A．选择兔的成熟红细胞作为材料时，需先加入柠檬酸钠溶液抗凝
B．利用DNA溶于酒精，而某些蛋白质不溶于酒精的特性，可以初步分离DNA与蛋白质
C．研磨液倒入离心管中进行离心5 min，然后取沉淀物置于烧杯中
D．二苯胺试剂需现配现用，若与DNA混合后直接观察无颜色反应，不能排除DNA存在的可能性
解析：兔的成熟红细胞无细胞核，无法作为提取DNA的实验材料，A错误；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可利用此原理将DNA与蛋白质分离，B错误；将研磨液倒入塑料离心管中离心5 min后，取上清液备用，C错误；二苯胺试剂需现配现用，与DNA溶剂混合后，在沸水浴条件下呈蓝色，若与DNA溶剂混合后直接观察无颜色反应，不能排除DNA存在的可能性，D正确。

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