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第3章
第2节　基因工程的基本操作程序
基因工程
第1课时　基因工程的基本操作程序
学习目标 素养目标
1．说出基因工程的基本操作程序(重点)； 2．说出PCR反应所需的条件和反应的过程(重难点)； 3．掌握基因表达载体的组成(重点)； 4．列举目的基因导入不同受体细胞的方法(重点)； 5．概述目的基因检测和鉴定的方法(重难点) 生命观念：通过一个培育转基因抗虫棉的贯穿大情境，帮助学生形成对基因工程的原理和基本操作程序的整体认识；
社会责任：能够基于对基因工程的原理和操作流程的认识，以理性的态度对待基因工程的研发和应用，认同我国科研工作者在基因工程领域取得的成就
核心概念
1．培育转基因抗虫棉的四个步骤
目的基因的______________→________________的构建→将目的基因导入____________→目的基因的检测与鉴定。
2．筛选合适的目的基因
从相关已知______________清晰的基因中进行筛选。可从遗传序列数据库(如GenBank)、序列比对工具(如BLAST)等获取基因信息。
3．利用PCR获取和扩增目的基因
(1)PCR原理：____________________。
(2)扩增条件：缓冲溶液、______________、2种________、4种______________和耐高温的DNA聚合酶等。
筛选和获取
基因表达载体
受体细胞
结构和功能
DNA半保留复制
DNA模板
引物
脱氧核苷酸
(3)[填图]PCR反应过程：按以下三步循环。
变性
复性
延伸
4．基因表达载体的构建
(1)基因表达载体的构建是基因工程中的________步骤。
(2)基因表达载体的作用：使目的基因在受体细胞中____________、复制并表达。
核心
稳定存在
(3)[填图]基因表达载体的组成
上游
RNA聚合酶
标记基因
目的基因
下游
转录
5．[连线]目的基因导入受体细胞的方法
受体细胞
方法
①植物细胞
②动物细胞
③微生物细胞
Ⅰ．农杆菌转化法
Ⅱ．显微注射技术
Ⅲ．Ca2+处理法(感受态细胞法)
Ⅳ．花粉管通道法
6．目的基因的检测与鉴定
(1)[连线]分子水平的检测：
检测目的
检测方法
①检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
a．PCR等技术
b．抗原—抗体杂交
(2)______________水平的鉴定：如饲喂法等。
个体生物学
[概 念 辨 析]
(1)从已知结构和功能清晰的基因中筛选目的基因是获取目的基因的一种有效方法。 (　　)
(2)PCR技术中，DNA聚合酶能够从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸。 (　　)
提示：DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
(3)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2+。 (　　)
(4)PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高。 (　　)
√
×
√
√
(5)基因表达载体中有的含有启动子和终止密码子。 (　　)
提示：基因表达载体中含有启动子和终止子，终止密码子位于mRNA上。
(6)标记基因不一定是抗生素抗性基因。 (　　)
(7)当诱导物存在时，诱导型启动子可以激活或抑制目的基因的表达。 (　　)
(8) 转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测才能达到目的。 (　　)
提示：转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定也可以通过害虫接种的个体生物学水平检测来达到目的。
×
√
√
×
(9)Ti质粒上的T-DNA可与植物受体细胞的染色体DNA整合在一起。 (　　)
(10)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体细胞。 (　　)
提示：培育抗除草剂的作物新品种，受体细胞可以是受精卵，也可以是体细胞。
(11)用PCR技术检测目的基因是否转录出mRNA，利用了碱基互补配对原则。 (　　)
√
×
√
目标导学
目的基因的筛选与获取及基因表达载体的构建
1
目标
一
1．教材P77正文及“相关信息”——PCR技术
(1)高温变性的目的是使______________________。
(2)什么是引物？PCR过程中为什么需要引物？__________________________ ___________________________________________________________________________________。
(3)PCR所需引物是依据____________的一段已知序列设计而成的，一对引物的序列是________(填“相同”或“不同”)的，其在PCR过程中________(填“能”或“不能”)重复利用。
(4)PCR过程中若模板DNA分子中G、C碱基对含量较多，则变性时间会________。
(5)PCR产物鉴定：常采用__________________来鉴定PCR的产物。
双链DNA解聚为单链
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始延伸DNA子链
目的基因
不同
不能
延长
琼脂糖凝胶电泳
(6)图示利用PCR技术扩增目的基因，从第几轮循环才会产生完整的目的基因(可用相关图解释)
提示：第3轮，如图所示：
2．教材P80“图3－6”——基因表达载体的构建
标记
基因
终止子
限制酶
限制酶
目的基因
连接酶
(1)填空：完成图中内容。
(2)启动子：一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的________(首端)，紧挨转录的起始位点，是________________识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。
(3)终止子： 一段有特殊序列结构的__________片段，位于基因的________(尾端)，标志着转录的________。
(4)处理含有目的基因的DNA片段和载体(质粒)的限制酶一般是同一种限制酶，可以产生________的末端，以便于将二者连接形成一个重组DNA分子。
上游
RNA聚合酶
DNA
下游
停止
相同
小结 启动子、终止子与起始密码子、终止密码子的区别
项目 位置 作用
启动子 位于DNA分子上 启动转录过程
起始密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的开始
终止子 位于DNA分子上 决定转录的结束
终止密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的结束
　　　(阜阳期中)PCR技术是在DNA聚合酶作用下，在体外进行DNA大量扩增的一种分子生物技术。下列相关叙述错误的是 (　　)
A．扩增过程中，延伸的温度大于复性的温度，而小于变性的温度
B．设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对，而造成引物自连
C．PCR扩增时，复性所需温度的设定与引物的长度和碱基组成无关
D．引物使TaqDNA聚合酶能从引物的3′端延伸DNA链
1
C
解析：延伸的温度(72 ℃左右)要大于复性温度(50 ℃左右)，但小于变性温度(90 ℃以上)，A正确；设计的引物之间不能有碱基互补配对，否则引物自连，而不能与模板相连，B正确；复性的温度与时间取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度，如果引物中G、C含量高，需要设定更高的复性温度，C错误；通过PCR技术扩增目的基因时，需要用耐高温的DNA聚合酶催化单个脱氧核苷酸加到引物的3′端，形成DNA子链，D正确。
　　　右图是利用基因工程技术构建重组表达载体的过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为4种限制酶。下列叙述错误的是 (　　)
A．需要用限制酶Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ来切割质粒
B．表达载体中的抗青霉素基因在受体细胞中能复制
1
C．表达载体中抗原基因的终止子位于青霉素抗性基因的下游
D．表达载体中目的基因的上游有启动子
C
解析：限制酶SmaⅠ的识别序列位于目的基因中，因此表达载体构建时不能用限制酶SmaⅠ，应用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ，A正确；表达载体中的青霉素抗性基因在受体细胞中能稳定存在且遗传给下一代，B正确；表达载体中抗原基因的终止子位于青霉素抗性基因的上游，C错误；表达载体中目的基因的上游有启动子，是RNA聚合酶识别和结合的部位，D正确。
将目的基因导入受体细胞及目的基因的检测与鉴定
1
目标
二
教材P81“资料卡”——农杆菌转化法分析
(1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持______________的过程。
(2)农杆菌的特点：农杆菌细胞内含有________质粒，在自然条件下感染__________植物和________植物细胞后，能将Ti质粒上的_________(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞内，并且将其整合到该细胞的______________上。
(3)目的基因插入______质粒的__________中→导入____________→整合到受体细胞的______________上→表现出新性状的植株。
(4)将基因表达载体导入农杆菌细胞时，应怎样处理农杆菌细胞？
提示：基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时，要用Ca2+处理农杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，有利于重组质粒的导入。
稳定和表达
Ti
双子叶
裸子
T-DNA
染色体DNA
Ti
T-DNA
植物细胞
染色体DNA
(5)可用什么方法检测目的基因是否发挥作用？
提示：用PCR技术检测目的基因是否转录出mRNA；用抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否翻译出相应蛋白质。
(6)如果目的基因是抗虫基因，在个体水平上怎样检测？如果目的基因是耐盐基因呢？
提示：如果目的基因是抗虫基因，则要进行抗虫接种实验；如果目的基因是耐盐基因，则要用一定浓度的盐水浇灌。
　　　甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质，将甜蛋白基因导入黄瓜可提高黄瓜甜味。下图表示甜蛋白基因和Ti质粒上限制酶酶切位点。下列说法错误的是 (　　)
3
图1
图2
A．基因表达载体的构建是培育转基因黄瓜的核心工作
B．为保证甜蛋白基因正确插入，可用限制酶XbaⅠ和EcoRⅠ切割目的基因及质粒
C．T-DNA的作用是携带甜蛋白基因进入黄瓜细胞并整合到其染色体DNA上
D．为确定甜蛋白基因是否导入黄瓜细胞，可用PCR技术进行检测
B
解析：基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，即基因表达载体的构建是培育转基因黄瓜的核心工作，A正确。目的基因内有BamHⅠ识别序列，因此不能选择BamHⅠ切割目的基因，目的基因左侧只能选择限制酶XbaⅠ切割。由目的基因的转录方向可以推测，目的基因右侧应选择靠近终止子的限制酶HindⅢ，若用XbaⅠ和EcoRⅠ处理切割甜蛋白基因，则目的基因与质粒会发生反向连接，不能正常按转录方向转录，B错误。T-DNA是可以转移的DNA，其能将目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上，故能携带甜蛋白基因进入黄瓜细胞并整合到其染色体DNA上，C正确。目的基因的检测可以采用PCR技术或核酸分子杂交技术，为确定甜蛋白基因是否导入黄瓜细胞，可用PCR技术进行检测，D正确。
方法规律 农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析
(1)两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。
(2)两次导入：第一次导入是将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是将含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
　　　将荧光蛋白基因与目的基因连接后导入植物细胞中，其表达产物既具有荧光蛋白的特性，又保持了目的基因表达产物的活性，因此可以通过检测荧光强度来检测目的基因的表达水平。下列有关该技术的说法，错误的是 (　　)
A．荧光蛋白基因与目的基因都可通过 PCR 技术获得
B．需要将荧光蛋白基因和目的基因分别连接在不同的启动子后面
C．荧光强度高的细胞，目的基因的表达水平一般也高
D．荧光蛋白还可用于检测目的基因表达产物的转移和分布情况
B
4
解析：荧光蛋白基因和目的基因均为已知序列的DNA，可通过PCR技术扩增获得，A正确；需要将荧光蛋白基因和目的基因连接在相同的启动子后面，B错误；荧光蛋白基因进入受体细胞后会表达出荧光蛋白，荧光强度高的细胞，目的基因的表达水平一般也高，C正确；荧光蛋白基因与目的基因连接后导入植物体细胞中，其表达产物具有荧光蛋白的特性，可以通过检测荧光的转移和分布来检测目的基因表达产物的转移和分布情况，D正确。
方法规律 目的基因的检测与鉴定
随堂内化
一、 知识自主构建
基因工程的基本操作程序
PCR
启动子
基因工程的基本操作程序
农杆菌转化法
分子
二、 学情随堂评价
1．基因工程是在DNA分子水平上进行设计操作的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的是 (　　)
A．目的基因与载体的结合
B．将目的基因导入受体细胞
C．目的基因的表达
D．目的基因的人工合成
B
2．(安徽A10联盟期中)如图是利用基因工程技术培育新品种水稻的部分流程，序号代表操作过程。下列相关叙述不正确的是(　　)
A．利用PCR技术扩增目的基因需依次经过变性、延伸、复性阶段
B．为防止目的基因自身环化，过程①最好使用两种限制酶
C．过程③的目的是构建基因表达载体，需用DNA连接酶处理
D．重组Ti质粒上的T-DNA能将目的基因整合到宿主细胞染色体上
A
解析：利用PCR技术扩增目的基因需依次经过高温变性、低温复性、中温延伸阶段，A错误；构建重组质粒时用两种限制性内切核酸酶酶切，会形成不同的黏性末端或者平末端，可以防止目的基因的反向连接和质粒的自身环化，B正确；据图分析，过程③为基因表达载体的构建，该过程需用DNA连接酶将获取的目的基因和载体相连，C正确；农杆菌中Ti质粒上的T-DNA能转移到植物细胞，并将目的基因整合到宿主细胞染色体的DNA上，所以农杆菌转化法中常用Ti质粒作为基因工程的载体，D正确。
3．研究人员欲利用基因工程使家蚕分泌能发出绿色荧光的蚕丝，下列方法最合理的是 (　　)
A．将绿色荧光蛋白基因和蚕丝蛋白基因融合后插入蚕丝蛋白基因启动子下游
B．用绿色荧光蛋白基因替代细胞中的蚕丝蛋白基因
C．向表达蚕丝蛋白基因的受体细胞中导入绿色荧光蛋白基因
D．将蚕丝蛋白基因与绿色荧光蛋白基因融合后导入受体细胞
A
解析：欲利用基因工程使家蚕分泌能发出绿色荧光的蚕丝，构建的基因表达载体在受体细胞中应该能表达出蚕丝蛋白和绿色荧光蛋白，因此应将蚕丝蛋白基因和绿色荧光蛋白基因融合，以获得相应的融合基因，然后将该融合基因插入蚕丝蛋白基因的启动子下游，构建含有该融合基因的基因表达载体，再将该基因表达载体导入受体细胞。
4．(黄山期末)艾滋病(AIDS)是由HIV引起的获得性免疫缺陷综合征，HIV侵入人体后通常可以潜伏8～10年，甚至更长时间。医生常利用分子生物学技术检测受检人是否携带HIV，下列叙述错误的是 (　　)
A．DNA分子杂交技术可用来检测受检人是否携带HIV
B．可根据HIV的RNA序列合成小段DNA作为引物
C．可通过抗原—抗体杂交技术检测血液样品中HIV抗原
D．与检测抗原、核酸相比，检测抗体能更早诊断HIV感染
D
解析：采用DNA分子杂交技术检测HIV，将 HIV的遗传物质(RNA)逆转录形成 DNA 片段作为探针，若受检人携带HIV，探针就会与之结合出现杂交带，A正确；HIV为RNA病毒，先逆转录形成DNA，再用PCR技术检测该DNA，可根据HIV的RNA序列合成小段DNA作为引物扩增，B正确；HIV抗原的本质是蛋白质，可通过抗原—抗体杂交技术检测血液样品中的HIV抗原，C正确；HIV进入人体后，免疫系统经过一定的生理过程才会产生相应的抗体，需要耗费一定的时间，因此，检测抗体比检测抗原、核酸更晚诊断HIV感染，D错误。
5．(安徽皖南八校联考)图1为胰岛素基因结构与引物位置示意图，图2为pBR322质粒的结构示意图，图中EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ、BamH Ⅰ和Hind Ⅲ为限制酶，箭头或线段所指位点为对应酶切位点。研究人员欲用此质粒构建胰岛素基因的表达载体，培养能产生人胰岛素的大肠杆菌。请回答下列相关问题：
图1　胰岛素基因结构与引物位置示意图
图2　pBR322质粒的结构示意图
(1)若要进行胰岛素基因的扩增常采用__________技术。已知DNA新链的合成方向是5′→3′，若利用图2中质粒构建基因表达载体，应该选择图1中的引物为_______ _________。
(2)在构建基因表达载体时，选择____________________作为切割质粒和目的基因的限制酶，可提高目的基因和载体的正确连接效率，其原因是________________ _________________________________________________________________________________。
PCR
引物4、
引物5
BamH Ⅰ和Hind Ⅲ
这两种酶能切割质粒和目的基因，且能得到不同的黏性末端，避免质粒和目的基因自身环化及反向连接
(3)成功构建的基因表达载体含有人胰岛素基因及其启动子等，其中启动子的作用是________________________________________________________。
若利用酵母菌作受体细胞生产胰岛素，与大肠杆菌相比，利用酵母菌生产胰岛素的优势有______________________________________________________________ ______________。
若要检测导入酵母菌的胰岛素基因是否成功转录，常用____________________ (填“DNA-DNA分子杂交”或“DNA-RNA分子杂交”)技术。
提供RNA聚合酶特异性识别和结合的位点，驱动基因的转录
酵母菌为真核细胞，含有内质网和高尔基体，可对核糖体合成的蛋白质进行加工
DNA-RNA分子杂交
解析：(1)扩增目的基因常用 PCR 技术，它依据 DNA 半保留复制原理，在体外实现基因片段大量扩增。由于DNA新链的合成方向是5′→3′，故引物与胰岛素基因的3′互补配对，对于引物1～4，只能在引物3和引物4中选。同样，对于引物5～8，只能在引物5和引物6中选，若利用图2中质粒构建基因表达载体，则在扩增胰岛素基因两端应包含限制酶切位点，图中只有引物4和引物5扩增出来的胰岛素基因含有和图2相同的两种限制酶的识别位点，因此应选择的引物为4和5。(2)要提高目的基因和载体的正确连接效率，在构建基因表达载体时，应选择BamH Ⅰ和Hind Ⅲ，这两种酶能同时切割质粒和目的基因，且能得到不同的黏性末端，避免了质粒和目的基因自身环化及反向连接等问题。
(3)启动子的作用：启动子是 RNA 聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出 mRNA。胰岛素为分泌蛋白，需要内质网和高尔基体的加工，大肠杆菌属于原核生物，无内质网和高尔基体，而酵母菌属于真核生物，细胞含有内质网和高尔基体，可对胰岛素进行加工，形成有活性的胰岛素。为了检测目的基因是否成功转录，即检测是否存在胰岛素基因对应的mRNA，常用DNA-RNA分子杂交技术检测相应的mRNA，即利用与相应mRNA互补配对的DNA探针进行检测。第2节　基因工程的基本操作程序
第1课时　基因工程的基本操作程序
1． PCR技术在科研实践中有着广泛的应用，PCR过程如图所示。下列叙述错误的是(　　)
A．变性是指通过高温使双链DNA解聚为单链
B．图中55 ℃复性的目的是使引物与模板结合
C．在30次循环的过程中，DNA边解旋边复制
D．TaqDNA聚合酶在延伸过程中发挥作用
2．下列有关获取目的基因的叙述，错误的是(　　)
A．目的基因就是编码蛋白质的基因
B．筛选和获取目的基因是基因工程的第一步
C．来自苏云金杆菌的Bt基因可作为转基因抗虫棉的目的基因
D．序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会
3．(马鞍山期中)为提高大豆对磷元素的吸收能力，研究人员利用农杆菌转化法将水稻的耐低磷基因OsPTF转移到大豆植株中，下图为重组Ti质粒上T DNA的序列结构示意图。下列相关叙述错误的是(　　)
A．以水稻RNA为模板通过逆转录及PCR扩增可获得大量OsPTF基因
B．RNA聚合酶与启动子1识别并结合后，启动抗除草剂基因的转录
C．可通过含除草剂的选择培养基筛选含有目的基因的大豆愈伤组织
D．用EcoRⅠ、BamHⅠ酶同时切重组Ti质粒后，经电泳分离至少得到两条条带
4．(黄山期末)下列用于判断目的基因是否转移成功的方法，不属于分子水平的检测的是(　　)
A．通过观察害虫吃棉叶是否死亡
B．通过PCR检测棉花的染色体DNA上是否插入抗虫基因
C．检测转基因生物中是否转录出相应的mRNA
D．从转基因生物中提取的蛋白质利用抗原—抗体杂交检测是否翻译成功
5．(芜湖一中)若要利用某目的基因(图甲)和P1噬菌体载体(图乙)构建重组DNA(图丙)，限制性内切核酸酶的酶切位点分别是BglⅡ(A↓GATCT)、EcoRⅠ(G↓AATTC)和Sau3AⅠ(↓GATC)。下列分析合理的是(　　)
甲 乙
　
丙
A．用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
B．用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
6．下列关于基因表达载体的说法，不正确的是(　　)
A．基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤
B．基因表达载体包含启动子、目的基因、终止子、标记基因等
C．终止子位于目的基因的下游，能够终止翻译过程
D．不同的目的基因所需的启动子不一定相同
7．限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的识别序列及其切割位点分别如下： C↓AATTC 和 G↓AATTC ，下图表示某一目的基因片段与质粒拼接形成重组质粒的过程，下列叙述错误的是(　　)
A．限制酶作用于特定位点的磷酸二酯键
B．每一种限制酶只能识别双链DNA的特定核苷酸序列
C．限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ切割后形成的黏性末端的碱基可以互补配对
D．为了能够将目的基因拼接到质粒上，应同时用以上2种限制酶切割质粒
8．(安徽县中联盟期末)如图是基因工程培养转基因抗某真菌植物的简易流程，其中多个环节都需要检测与鉴定，下列说法错误的是(　　)
A．①可以用PCR获取
B．标记基因可用来筛选②中的重组质粒
C．④分子水平上的检测都可以用PCR技术
D．④还需要在个体水平上进行该真菌接种鉴定
9．双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了下图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析不正确的是(　　)
A．可用农杆菌转化法将构建好的表达载体导入植物细胞
B．为连入GUS基因，需用SalⅠ和SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒
C．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞
D．可通过观察是否出现荧光和蓝色物质确认双向启动子的作用
10．我国科研人员利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除了水稻香味抑制基因Badh2，获得了有香味的水稻，机理如图所示。下列叙述错误的是(　　)
A．sgRNA的识别序列过短可能会导致编辑对象出错
B．Cas9蛋白功能类似于限制酶，可以识别并剪切特定DNA片段
C．在培养基中加入潮霉素，可用于筛选导入基因敲除载体的植物细胞
D．构建好的基因敲除载体可用农杆菌转化法导入水稻细胞
11．将马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因Pin Ⅱ导入杨树细胞，培育抗虫杨树。如图表示利用含目的基因的DNA分子和Ti质粒构建基因表达载体的过程，图中AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，NeoR表示新霉素抗性基因，箭头表示限制酶的酶切位点，相关酶的识别序列如表所示。下列叙述正确的是(　　)
A．用PCR扩增目的基因时，应该选择引物2和引物3并在引物3′端添加相应酶切位点
B．为使目的基因与质粒高效重组，选用KpnⅠ和HindⅢ比选用KpnⅠ和SmaⅠ效果更好
C．为将表达载体导入农杆菌，可以使用离心法处理受体细胞
D．成功导入目的基因的杨树细胞既具有氨苄青霉素抗性，又有新霉素抗性
12．(安徽县中联盟期中)科学家利用基因工程改造的大肠杆菌基因组生产人胰岛素，如图是运用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。回答下列问题：
(1)适合作为目的基因的载体需要满足一些条件，根据基因表达载体的组成分析，图中质粒没有标出的结构是________，该结构的作用是________________________。
(2)大肠杆菌内目的基因转录时，转录的模板是________(填“a链”或“b链”)，目的基因表达产物没有生物学活性的原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
(3)某同学尝试用PCR扩增目的基因。PCR利用的原理是____________________，一次PCR一般要经历30次循环，每次循环的步骤是________________________________。
(4)在PCR反应体系中，主要成分有缓冲液、4种脱氧核苷酸、两种引物、____________________________等。其中引物的作用是________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
(5)PCR的产物一般通过________________来鉴定。
13．(芜湖质检)为提高棉花植株的抗虫特性，研究小组将抗虫基因Cry1A导入棉花细胞中以得到转基因抗虫棉，过程如图1。该过程涉及的各种限制酶及酶切位点如表。回答下列问题：
图1
限制酶 BamHⅠ EcoRⅠ SmaⅠ XmaⅠ HindⅢ
识别 序列 G↓GATCC G↓AATTC CCC↓GGG C↓CCGGG A↓AGCTT
(1)目的基因的筛选与获取：研究人员将苏云金杆菌中获取的Cry1A基因成功导入棉花细胞并表达，但产物表达量较低，需要将其中多个密码子替换为植物偏爱密码子。在已知Cry1A基因序列的前提下，可采用________方法获取新的目的基因。
(2)基因表达载体的构建：目的基因需要连接在启动子和终止子之间，为实现该操作，需要在目的基因两端添加HindⅢ限制酶识别序列，该方法的不足是________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
研究人员为改善该问题，在目的基因两侧增加了其他限制酶识别序列如图2，则可选择的限制酶组合有________种(不考虑连接效率)。
图2
(3)将目的基因导入受体细胞：除图示外的方法，将抗虫基因导入棉花细胞的方法还有________________，该方法相比于图示方法的优点是________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________(说出2点)。
(4)目的基因的检测与鉴定：除了利用PCR技术检测目的基因是否插入成功并转录外，还需在个体水平进行鉴定，为判断转基因抗虫棉是否培育成功，需要对其进行的操作是________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
14．(河北卷节选)为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。回答下列问题：
(1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是____________和________。模板与引物在PCR反应的________阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因是__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
(2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GP1两端应添加________________(填两种限制酶)的识别序列。用DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成____________键。
(3)若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为________________________，初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁镉离子含量比野生型衣藻细胞壁的________，则表明融合蛋白能结合镉离子。
15．(黑吉辽蒙卷)香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题：
图1
图2
(1)可从____________中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5′端分别引入________和________限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用____________连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5 kb(kb为千碱基对)，假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。
(2)进一步筛选构建的质粒，以1～4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有________的污染。初步判断实验组________(从“1～4”中选填)的质粒中成功插入了基因N，理由是________________________________________________________________________。
(3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列)，b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有________。
a：5′ …GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC… 3′
b：5′ …GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG… 3′
c：5′ …GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC… 3′
d：5′ …GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG… 3′
(4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的________含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。
第1课时　基因工程的基本操作程序
题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
答案 C A B A D C D C B B B
1．C　解析：PCR技术每一次循环可以分为变性、复性和延伸三步，其中变性是利用高温(如图中94 ℃)破坏DNA双链间的氢键，使双链DNA解聚为单链，A正确；复性(也叫退火)时，温度下降(如图中55 ℃)，引物与单链(模板链)相应互补序列结合，为后续延伸做准备，B正确；PCR技术中，DNA的解旋是通过高温变性实现的(先全部解旋再复制)，而体内DNA复制为边解旋边复制，C错误；延伸过程需要以DNA为模板，以脱氧核苷酸为原料，在耐高温的TaqDNA聚合酶催化下合成新的DNA链，D正确。
2．A　解析：目的基因主要是指编码蛋白质的基因，A错误；目的基因的筛选与获取是实施基因工程的第一步，B正确；苏云金杆菌的Bt基因是培育转基因抗虫棉用到的目的基因，C正确；随着测序技术的发展以及序列数据库和序列比对工具等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，这为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能，D正确。
3．B　解析：以水稻RNA为模板，经逆转录合成cDNA，再通过PCR扩增可获得大量OsPTF基因，A正确；启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，用于驱动基因的转录，图中抗除草剂基因位于启动子2的后面，故RNA聚合酶与启动子2识别并结合后，启动抗除草剂基因的转录，启动子1驱动OsPTF基因的转录，B错误；图中T DNA的序列中含有目的基因和抗除草剂基因，通过农杆菌转化法将T DNA整合到宿主细胞的染色体组的DNA上，可通过含除草剂的选择培养基筛选含有目的基因的大豆愈伤组织，C正确；图中重组Ti质粒上T DNA含EcoRⅠ、BamHⅠ酶切位点各一个，因此，它们切割重组Ti质粒(环状)后，可得到含耐低磷基因OsPTF的片段和Ti质粒上剩余的片段，即电泳分离至少得到两条条带，D正确。
4．A　解析：通过观察害虫吃棉叶是否死亡，属于个体生物学水平的鉴定，A符合题意。
5．D　解析：为防止自身环化，应选用目的基因两侧的两种不同的限制性内切核酸酶切割，另外也需注意切割后目的基因插入的方向，只有用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体，才能保证构建的重组DNA中RNA聚合酶在插入的目的基因上的移动方向与图丙相同。
6．C　解析：基因表达载体包括启动子、终止子、目的基因、标记基因等，其中启动子位于目的基因的上游，是启动转录的一段DNA片段，终止子位于目的基因的下游，能够终止转录过程，B正确，C错误；不同的目的基因具有不同的核苷酸序列，其启动子不一定相同，D正确。
7．D　解析：限制酶的作用是使特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，并具有专一性，A正确；每一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定位点进行切割，B正确；由题干信息给出的两种酶的识别序列可知，两种限制酶切割后形成的黏性末端的碱基可以互补配对，C正确；质粒上的标记基因中含有限制EcoRⅠ的切割位点，不能用限制酶EcoRⅠ切割，D错误。
8．C　解析：PCR技术可以获取目的基因，琼脂糖凝胶电泳能分离、鉴定DNA片段，可用于鉴定获取的目的基因，A正确；标记基因(如抗性基因)的作用是用来筛选含重组质粒的受体细胞，B正确；④分子水平检测包括检测目的基因(DNA)、mRNA(检测目的基因是否转录)、蛋白质(检测目的基因是否翻译)，PCR技术可以检测前两者，不能检测蛋白质，检测蛋白质的方法为抗原—抗体杂交，C错误；本实验目的为获得抗某真菌的转基因植物，可在个体水平上接种真菌进行抗性鉴定，D正确。
9．B　解析：将基因表达载体导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，A正确；要连入GUS基因，需用限制酶切割已整合了双向启动子及LUC基因的质粒，若用SphⅠ酶切割，则会导致质粒中的LUC基因受到破坏，不能检测双向启动子作用效果，应选用AgeⅠ和SalⅠ酶切，B错误；将图中表达载体导入微生物受体中，由于该表达载体含壮观霉素抗性基因，因此，在培养基中添加壮观霉素，成功导入表达载体的受体细胞具有抗壮观霉素的能力，在该培养基上能生存，C正确；双向启动子如果正常表达，就会驱动GUS基因表达形成β 葡萄糖苷酶，催化底物生成蓝色物质，同时也驱动LUC基因表达形成荧光素酶，催化底物产生荧光，D正确。
10．B　解析：分析题图可知，CRISPR/Cas9基因编辑技术原理：sgRNA与Cas9蛋白形成复合物，其中sgRNA与目标DNA序列进行碱基互补配对，Cas9蛋白则将该DNA序列切割，若sgRNA的识别序列过短，可能会与非目标DNA配对，导致切割对象出错，A正确；Cas9蛋白是在sgRNA引导下识别并切割特定DNA片段，识别特定序列的是sgRNA，Cas9蛋白不具有识别功能，B错误；基因敲除载体含潮霉素抗性基因，导入载体的植物细胞有潮霉素抗性，培养基加潮霉素可筛选出导入基因敲除载体的植物细胞，C正确；农杆菌转化法常用于将重组载体导入植物细胞，构建好的基因敲除载体可用此方法导入水稻细胞，D正确。
11．B　解析：DNA聚合酶只能从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，利用PCR扩增目的基因时，应该选择引物2和引物3，但应该在引物5′端添加相应酶切位点，A错误；为使目的基因与质粒高效重组，选用KpnⅠ和HindⅢ比选用KpnⅠ和SmaⅠ效果更好，因为SmaⅠ切割DNA后形成平末端，平末端的连接效率相对较低，B正确；为将表达载体导入农杆菌，可以使用Ca2+处理受体细胞，使其处于能吸收周围环境中DNA分子的状态，然后再将重组质粒导入其中，而离心法是诱导植物原生质体融合的方法，C错误；只有T DNA区段会导入植物受体细胞，因此氨苄青霉素抗性基因不会导入植物受体细胞中，即成功导入目的基因的杨树细胞只能表现出新霉素抗性，D错误。
12．(1)终止子　终止基因的转录　(2)b链　大肠杆菌是原核生物，细胞内没有内质网、高尔基体，不能对表达产物进行加工　(3)DNA的半保留复制　变性→复性→延伸　(4)耐高温的DNA聚合酶、模板DNA　使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸　(5)琼脂糖凝胶电泳
解析：(1)适合作为目的基因的载体需要满足的条件：启动子(启动基因的转录)、终止子(终止基因的转录)、目的基因、标记基因(用于筛选)、复制原点(复制起始位点)、限制酶切割位点(有利于目的基因插入)，图中质粒没有标出的结构为终止子。(2)目的基因转录方向为从左到右，且子链延伸方向为5′→3′，所以该目的基因转录的模板是b链；胰岛素为分泌蛋白，需要内质网和高尔基体的加工才具有生物活性，而大肠杆菌是原核生物，细胞内没有内质网、高尔基体，不能对表达产物进行加工，因此目的基因表达产物没有生物学活性。(3)PCR利用了DNA的半保留复制原理在体外扩增DNA片段，一次PCR一般要经历30次循环，每次循环的步骤是变性→复性→延伸。(4)在PCR反应体系中，主要成分有缓冲液(维持反应环境)、4种脱氧核苷酸(原料)、两种引物(与模板链结合)、Taq酶(耐高温DNA聚合酶，催化子链合成)等；引物作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，启动DNA子链合成。(5)PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
13．(1)人工合成　(2)易出现目的基因和质粒的自身环化，及目的基因与质粒的错误连接　5　(3)花粉管通道法　无需进行组织培养，缩短培育周期；成本低，操作简单(言之有理即可)　(4)在转基因抗虫棉生长期喷洒一定浓度的除草剂并投放棉铃虫幼虫进行取食，观察抗虫棉的生长情况(合理即可)
解析：(1)已知Cry1A基因序列，且棉花细胞对Cry1A基因的表达效率较低，需要对密码子进行优化，即要将其中多个密码子替换为植物偏爱密码子来获取新的目的基因，可采用人工合成(化学合成)的方法，可以精确地按照设计序列合成DNA片段，实现对基因的精确修改，从而提高基因表达效率。为构建基因表达载体，在目的基因(Cry1A基因)两端添加HindⅢ限制酶识别序列，采用单酶切容易导致目的基因和质粒的自身环化，及目的基因与质粒的错误连接(反向连接)；为改善该问题，应选择双酶切，分析图2和表格，XmaⅠ和SmaⅠ的识别序列相同，只是酶切位点不同，因此，SmaⅠ识别的序列也能被XmaⅠ识别，不考虑连接效率，可选择的限制酶组合有：EcoRⅠ和BamHⅠ、EcoRⅠ和SmaⅠ、BamHⅠ和SmaⅠ、XmaⅠ和EcoRⅠ、XmaⅠ和BamHⅠ5种。(2)将目的基因导入棉花愈伤组织(植物细胞)，图1中采用的方法为农杆菌转化法，花粉管通道法也可将目的基因导入植物细胞；花粉管通道法的操作方式：可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中，也可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊，相对于农杆菌转化法，该方法的优点为操作简单，不需要进行组织培养，可缩短培育周期、成本低等。(3)在个体水平鉴定转基因抗虫棉是否培育成功，就是要检测其是否具有抗虫特性，操作方法：在转基因抗虫棉生长期喷洒一定浓度的除草剂并投放棉铃虫幼虫进行取食，观察抗虫棉的生长情况，若转基因抗虫棉被取食少，受害程度低，说明抗虫效果好，培育成功；反之则不成功。
14．(1)脱氧核苷酸　引物　复性　PCR反应需要在高温条件下进行变性步骤(90 ℃以上使双链DNA解旋为单链)，普通的DNA聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的DNA聚合酶能在高温环境中保持活性，保证PCR反应的正常进行　(2)SmaⅠ和EcoRⅠ　磷酸二酯　(3)细胞表面发出黄色荧光　高
解析：(1)在PCR反应中，原料是脱氧核苷酸，其随着反应进行不断被消耗，分子数量逐渐减少；引物在PCR过程中会结合到模板DNA上参与子链合成，也会逐渐减少，所以分子数量逐渐减少的是引物和脱氧核苷酸。在复性过程中，温度降低，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，是因为PCR反应需要在高温条件下进行变性步骤，使双链DNA解旋为单链，普通的DNA聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的DNA聚合酶能在高温环境中保持活性，保证PCR反应的正常进行。(2)根据题意，要将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体，又因为NheⅠ和XbaⅠ限制酶切割后产生的黏性末端相同，同时使用这两种酶会出现目的基因与载体反向连接等现象，因此这两种限制酶只能选一个，按照连接的顺序，在NheⅠ(或XbaⅠ)与SmaⅠ之间插入CADR，在SmaⅠ和EcoRⅠ之间插入GP1，在EcoRⅠ和EcoRⅤ之间插入YFP，从而逐步构建出融合基因。DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成磷酸二酯键，从而将载体和目的基因连接起来。(3)若在荧光显微镜下观察到细胞表面发出黄色荧光，初步表明融合蛋白表达成功，因为融合蛋白中有黄色荧光蛋白YFP，其表达后会发出黄色荧光。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比的镉离子含量野生型衣藻细胞壁的高，则表明融合蛋白能结合镉离子。因为融合蛋白中GP1能定位于细胞壁，CADR可吸附水体中的镉离子，若融合蛋白发挥作用，会使细胞壁镉离子含量升高。
15．(1)基因数据库　XhoⅠ　XbaⅠ　DNA连接酶　(2)试剂　1　目的基因N大小为2.3 kb　(3)GCC　(4)香树脂醇
解析：(1)GenBank是目前国际上广泛使用的序列数据库之一，它的数据主要是各国的实验室、测序机构等发布的序列信息。利用这个数据库，我们可以便捷地检索基因和蛋白质的序列信息；故可从序列数据库或基因数据库中查询基因N的编码序列，设计特定引物。保证基因N与质粒pYL正确连接，需要使用双酶切法，为了目的基因能正确表达，目的基因需要插入质粒的启动子和终止子之间，且质粒和目的基因需要使用相同的限制酶或能产生相同黏性末端的限制酶切割。分析图1可知，质粒pYL应该选用SpeⅠ和XhoⅠ酶切，由于目的基因N含有SpeⅠ识别序列，故N基因不能使用SpeⅠ酶切，但XbaⅠ与其具有相同的黏性末端，基因N酶切时可以用XbaⅠ替换SpeⅠ，即N基因两端应该含有XbaⅠ和XhoⅠ识别序列，再根据题干信息：N基因a链为转录模板链，故由引物1和引物2扩增N基因，则扩增后模板链的5′端含有引物1序列，而编码链的5′端含有引物2序列，结合质粒pYL上的启动子和终止子方向，可知应该在引物2的5′端添加XbaⅠ、引物1的5′端添加XhoⅠ识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用DNA连接酶连接DNA片段。(2)构建重组质粒，大小约9.5kb，假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变，而质粒pYL大小为7.2 kb，可知目的基因N大小为9.5－7.2＝2.3 kb；分析电泳图可知，初步判断实验组1的质粒中成功插入了基因N。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应体系是否存在污染，即检验PCR反应中是否有试剂污染，试剂的DNA污染可导致扩增出非目标片段。(3)a的序列为，c的序列为5′ …/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC… 3′，对比四条引物序列，a与c的灰色部分序列一致，符合二者结合同一条模板链的要求，虚线框为编码第240位氨基酸的序列，实线框即为编码第243位氨基酸的序列，该位置改为GCC后即可实现苯丙氨酸被丙氨酸替换，故推知GCC为丙氨酸的密码子，UUC(注意密码子不含T)为苯丙氨酸的密码子。(4)题干研究目的是通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇；由此可知，进一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。第2节　基因工程的基本操作程序
第1课时　基因工程的基本操作程序
学习目标 素养目标
1． 说出基因工程的基本操作程序(重点)； 2． 说出PCR反应所需的条件和反应的过程(重难点)； 3． 掌握基因表达载体的组成(重点)； 4． 列举目的基因导入不同受体细胞的方法(重点)； 5． 概述目的基因检测和鉴定的方法(重难点) 生命观念：通过一个培育转基因抗虫棉的贯穿大情境，帮助学生形成对基因工程的原理和基本操作程序的整体认识； 社会责任：能够基于对基因工程的原理和操作流程的认识，以理性的态度对待基因工程的研发和应用，认同我国科研工作者在基因工程领域取得的成就
1．培育转基因抗虫棉的四个步骤
目的基因的________→________的构建→将目的基因导入________→目的基因的检测与鉴定。
2．筛选合适的目的基因
从相关已知_______清晰的基因中进行筛选。可从遗传序列数据库(如GenBank)、序列比对工具(如BLAST)等获取基因信息。
3．利用PCR获取和扩增目的基因
(1)PCR原理：________。
(2)扩增条件：缓冲溶液、__________、2种_________、4种__________和耐高温的DNA聚合酶等。
(3)[填图]PCR反应过程：按以下三步循环。
4．基因表达载体的构建
(1)基因表达载体的构建是基因工程中的________步骤。
(2)基因表达载体的作用：使目的基因在受体细胞中________、复制并表达。
(3)[填图]基因表达载体的组成
5．[连线]目的基因导入受体细胞的方法
6．目的基因的检测与鉴定
(1)[连线]分子水平的检测：
　　
(2)_ _______水平的鉴定：如饲喂法等。
[概 念 辨 析]
(1)从已知结构和功能清晰的基因中筛选目的基因是获取目的基因的一种有效方法。(　　)
(2)PCR技术中，DNA聚合酶能够从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸。(　　)
(3)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2+。(　　)
(4)PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高。(　　)
(5)基因表达载体中有的含有启动子和终止密码子。(　　)
(6)标记基因不一定是抗生素抗性基因。(　　)
(7)当诱导物存在时，诱导型启动子可以激活或抑制目的基因的表达。(　　)
(8) 转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测才能达到目的。(　　)
(9)Ti质粒上的T-DNA可与植物受体细胞的染色体DNA整合在一起。(　　)
(10)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体细胞。(　　)
(11)用PCR技术检测目的基因是否转录出mRNA，利用了碱基互补配对原则。(　　)
目的基因的筛选与获取及基因表达载体的构建
1．教材P77正文及“相关信息”——PCR技术
(1)高温变性的目的是使_______________。
(2)什么是引物？PCR过程中为什么需要引物？_____________________。
(3)PCR所需引物是依据________的一段已知序列设计而成的，一对引物的序列是________(填“相同”或“不同”)的，其在PCR过程中________(填“能”或“不能”)重复利用。
(4)PCR过程中若模板DNA分子中G、C碱基对含量较多，则变性时间会__________。
(5)PCR产物鉴定：常采用____________________来鉴定PCR的产物。
(6)图示利用PCR技术扩增目的基因，从第几轮循环才会产生完整的目的基因(可用相关图解释)
2． 教材P80“图3－6”——基因表达载体的构建
(1)填空：完成图中内容。
(2)启动子：一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的________ (首端)，紧挨转录的起始位点，是______________识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。
(3)终止子： 一段有特殊序列结构的________片段，位于基因的________(尾端)，标志着转录的________。
(4)处理含有目的基因的DNA片段和载体(质粒)的限制酶一般是同一种限制酶，可以产生________的末端，以便于将二者连接形成一个重组DNA分子。
小结 启动子、终止子与起始密码子、终止密码子的区别
项目 位置 作用
启动子 位于DNA分子上 启动转录过程
起始密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的开始
终止子 位于DNA分子上 决定转录的结束
终止密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的结束
(阜阳期中)PCR技术是在DNA聚合酶作用下，在体外进行DNA大量扩增的一种分子生物技术。下列相关叙述错误的是(　　)
A．扩增过程中，延伸的温度大于复性的温度，而小于变性的温度
B．设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对，而造成引物自连
C．PCR扩增时，复性所需温度的设定与引物的长度和碱基组成无关
D．引物使TaqDNA聚合酶能从引物的3′端延伸DNA链
下图是利用基因工程技术构建重组表达载体的过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为4种限制酶。下列叙述错误的是(　　)
A．需要用限制酶Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ来切割质粒
B．表达载体中的抗青霉素基因在受体细胞中能复制
C．表达载体中抗原基因的终止子位于青霉素抗性基因的下游
D．表达载体中目的基因的上游有启动子
将目的基因导入受体细胞及目的基因的检测与鉴定
教材P81“资料卡”——农杆菌转化法分析
(1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持________的过程。
(2)农杆菌的特点：农杆菌细胞内含有________质粒，在自然条件下感染__ _______植物和_________植物细胞后，能将Ti质粒上的__________(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞内，并且将其整合到该细胞的________上。
(3)目的基因插入________质粒的_______中→导入_______→整合到受体细胞的________上→表现出新性状的植株。
(4)将基因表达载体导入农杆菌细胞时，应怎样处理农杆菌细胞？
(5)可用什么方法检测目的基因是否发挥作用？
(6)如果目的基因是抗虫基因，在个体水平上怎样检测？如果目的基因是耐盐基因呢？
甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质，将甜蛋白基因导入黄瓜可提高黄瓜甜味。下图表示甜蛋白基因和Ti质粒上限制酶酶切位点。下列说法错误的是(　　)
图1
图2
A．基因表达载体的构建是培育转基因黄瓜的核心工作
B．为保证甜蛋白基因正确插入，可用限制酶XbaⅠ和EcoRⅠ切割目的基因及质粒
C．T-DNA的作用是携带甜蛋白基因进入黄瓜细胞并整合到其染色体DNA上
D．为确定甜蛋白基因是否导入黄瓜细胞，可用PCR技术进行检测
方法规律 农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析
(1)两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。
(2)两次导入：第一次导入是将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是将含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
将荧光蛋白基因与目的基因连接后导入植物细胞中，其表达产物既具有荧光蛋白的特性，又保持了目的基因表达产物的活性，因此可以通过检测荧光强度来检测目的基因的表达水平。下列有关该技术的说法，错误的是(　　)
A．荧光蛋白基因与目的基因都可通过 PCR 技术获得
B．需要将荧光蛋白基因和目的基因分别连接在不同的启动子后面
C．荧光强度高的细胞，目的基因的表达水平一般也高
D．荧光蛋白还可用于检测目的基因表达产物的转移和分布情况
方法规律 目的基因的检测与鉴定
一、 知识自主构建
二、 学情随堂评价
1．基因工程是在DNA分子水平上进行设计操作的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的是(　　)
A．目的基因与载体的结合
B．将目的基因导入受体细胞
C．目的基因的表达
D．目的基因的人工合成
2．(安徽A10联盟期中)如图是利用基因工程技术培育新品种水稻的部分流程，序号代表操作过程。下列相关叙述不正确的是(　　)
A．利用PCR技术扩增目的基因需依次经过变性、延伸、复性阶段
B．为防止目的基因自身环化，过程①最好使用两种限制酶
C．过程③的目的是构建基因表达载体，需用DNA连接酶处理
D．重组Ti质粒上的T-DNA能将目的基因整合到宿主细胞染色体上
3．研究人员欲利用基因工程使家蚕分泌能发出绿色荧光的蚕丝，下列方法最合理的是(　　)
A．将绿色荧光蛋白基因和蚕丝蛋白基因融合后插入蚕丝蛋白基因启动子下游
B．用绿色荧光蛋白基因替代细胞中的蚕丝蛋白基因
C．向表达蚕丝蛋白基因的受体细胞中导入绿色荧光蛋白基因
D．将蚕丝蛋白基因与绿色荧光蛋白基因融合后导入受体细胞
4．(黄山期末)艾滋病(AIDS)是由HIV引起的获得性免疫缺陷综合征，HIV侵入人体后通常可以潜伏8～10年，甚至更长时间。医生常利用分子生物学技术检测受检人是否携带HIV，下列叙述错误的是(　　)
A．DNA分子杂交技术可用来检测受检人是否携带HIV
B．可根据HIV的RNA序列合成小段DNA作为引物
C．可通过抗原—抗体杂交技术检测血液样品中HIV抗原
D．与检测抗原、核酸相比，检测抗体能更早诊断HIV感染
5．(安徽皖南八校联考)图1为胰岛素基因结构与引物位置示意图，图2为pBR322质粒的结构示意图，图中EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ、BamH Ⅰ和Hind Ⅲ为限制酶，箭头或线段所指位点为对应酶切位点。研究人员欲用此质粒构建胰岛素基因的表达载体，培养能产生人胰岛素的大肠杆菌。请回答下列相关问题：
图1　胰岛素基因结构与引物位置示意图
图2　pBR322质粒的结构示意图
(1)若要进行胰岛素基因的扩增常采用_________技术。已知DNA新链的合成方向是5′→3′，若利用图2中质粒构建基因表达载体，应该选择图1中的引物为_________。
(2)在构建基因表达载体时，选择________作为切割质粒和目的基因的限制酶，可提高目的基因和载体的正确连接效率，其原因是______________。
(3)成功构建的基因表达载体含有人胰岛素基因及其启动子等，其中启动子的作用是______________________。
若利用酵母菌作受体细胞生产胰岛素，与大肠杆菌相比，利用酵母菌生产胰岛素的优势有________________________________。
若要检测导入酵母菌的胰岛素基因是否成功转录，常用_______________(填“DNA-DNA分子杂交”或“DNA-RNA分子杂交”)技术。
第2节　基因工程的基本操作程序
第1课时　基因工程的基本操作程序
学习目标 素养目标
1． 说出基因工程的基本操作程序(重点)； 2． 说出PCR反应所需的条件和反应的过程(重难点)； 3． 掌握基因表达载体的组成(重点)； 4． 列举目的基因导入不同受体细胞的方法(重点)； 5． 概述目的基因检测和鉴定的方法(重难点) 生命观念：通过一个培育转基因抗虫棉的贯穿大情境，帮助学生形成对基因工程的原理和基本操作程序的整体认识； 社会责任：能够基于对基因工程的原理和操作流程的认识，以理性的态度对待基因工程的研发和应用，认同我国科研工作者在基因工程领域取得的成就
1．培育转基因抗虫棉的四个步骤
目的基因的__筛选和获取__→__基因表达载体__的构建→将目的基因导入__受体细胞__→目的基因的检测与鉴定。
2．筛选合适的目的基因
从相关已知__结构和功能__清晰的基因中进行筛选。可从遗传序列数据库(如GenBank)、序列比对工具(如BLAST)等获取基因信息。
3．利用PCR获取和扩增目的基因
(1)PCR原理：__DNA半保留复制__。
(2)扩增条件：缓冲溶液、__DNA模板__、2种__引物__、4种__脱氧核苷酸__和耐高温的DNA聚合酶等。
(3)[填图]PCR反应过程：按以下三步循环。
4．基因表达载体的构建
(1)基因表达载体的构建是基因工程中的__核心__步骤。
(2)基因表达载体的作用：使目的基因在受体细胞中__稳定存在__、复制并表达。
(3)[填图]基因表达载体的组成
5．[连线]目的基因导入受体细胞的方法
6．目的基因的检测与鉴定
(1)[连线]分子水平的检测：
　　
(2)__个体生物学__水平的鉴定：如饲喂法等。
[概 念 辨 析]
(1)从已知结构和功能清晰的基因中筛选目的基因是获取目的基因的一种有效方法。(　√　)
(2)PCR技术中，DNA聚合酶能够从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸。(　×　)
提示：DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
(3)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2+。(　√　)
(4)PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高。(　√　)
(5)基因表达载体中有的含有启动子和终止密码子。(　×　)
提示：基因表达载体中含有启动子和终止子，终止密码子位于mRNA上。
(6)标记基因不一定是抗生素抗性基因。(　√　)
(7)当诱导物存在时，诱导型启动子可以激活或抑制目的基因的表达。(　√　)
(8) 转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测才能达到目的。(　×　)
提示：转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定也可以通过害虫接种的个体生物学水平检测来达到目的。
(9)Ti质粒上的T-DNA可与植物受体细胞的染色体DNA整合在一起。(　√　)
(10)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体细胞。(　×　)
提示：培育抗除草剂的作物新品种，受体细胞可以是受精卵，也可以是体细胞。
(11)用PCR技术检测目的基因是否转录出mRNA，利用了碱基互补配对原则。(　√　)
目的基因的筛选与获取及基因表达载体的构建
1．教材P77正文及“相关信息”——PCR技术
(1)高温变性的目的是使__双链DNA解聚为单链__。
(2)什么是引物？PCR过程中为什么需要引物？__引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始延伸DNA子链__。
(3)PCR所需引物是依据__目的基因__的一段已知序列设计而成的，一对引物的序列是__不同__(填“相同”或“不同”)的，其在PCR过程中__不能__(填“能”或“不能”)重复利用。
(4)PCR过程中若模板DNA分子中G、C碱基对含量较多，则变性时间会__延长__。
(5)PCR产物鉴定：常采用__琼脂糖凝胶电泳__来鉴定PCR的产物。
(6)图示利用PCR技术扩增目的基因，从第几轮循环才会产生完整的目的基因(可用相关图解释)
提示：第3轮，如图所示：
2． 教材P80“图3－6”——基因表达载体的构建
(1)填空：完成图中内容。
(2)启动子：一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的__上游__(首端)，紧挨转录的起始位点，是__RNA聚合酶__识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。
(3)终止子： 一段有特殊序列结构的__DNA__片段，位于基因的__下游__(尾端)，标志着转录的__停止__。
(4)处理含有目的基因的DNA片段和载体(质粒)的限制酶一般是同一种限制酶，可以产生__相同__的末端，以便于将二者连接形成一个重组DNA分子。
小结 启动子、终止子与起始密码子、终止密码子的区别
项目 位置 作用
启动子 位于DNA分子上 启动转录过程
起始密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的开始
终止子 位于DNA分子上 决定转录的结束
终止密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的结束
(阜阳期中)PCR技术是在DNA聚合酶作用下，在体外进行DNA大量扩增的一种分子生物技术。下列相关叙述错误的是(　C　)
A．扩增过程中，延伸的温度大于复性的温度，而小于变性的温度
B．设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对，而造成引物自连
C．PCR扩增时，复性所需温度的设定与引物的长度和碱基组成无关
D．引物使TaqDNA聚合酶能从引物的3′端延伸DNA链
解析：延伸的温度(72 ℃左右)要大于复性温度(50 ℃左右)，但小于变性温度(90 ℃以上)，A正确；设计的引物之间不能有碱基互补配对，否则引物自连，而不能与模板相连，B正确；复性的温度与时间取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度，如果引物中G、C含量高，需要设定更高的复性温度，C错误；通过PCR技术扩增目的基因时，需要用耐高温的DNA聚合酶催化单个脱氧核苷酸加到引物的3′端，形成DNA子链，D正确。
下图是利用基因工程技术构建重组表达载体的过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为4种限制酶。下列叙述错误的是(　C　)
A．需要用限制酶Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ来切割质粒
B．表达载体中的抗青霉素基因在受体细胞中能复制
C．表达载体中抗原基因的终止子位于青霉素抗性基因的下游
D．表达载体中目的基因的上游有启动子
解析：限制酶SmaⅠ的识别序列位于目的基因中，因此表达载体构建时不能用限制酶SmaⅠ，应用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ，A正确；表达载体中的青霉素抗性基因在受体细胞中能稳定存在且遗传给下一代，B正确；表达载体中抗原基因的终止子位于青霉素抗性基因的上游，C错误；表达载体中目的基因的上游有启动子，是RNA聚合酶识别和结合的部位，D正确。
将目的基因导入受体细胞及目的基因的检测与鉴定
教材P81“资料卡”——农杆菌转化法分析
(1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持__稳定和表达__的过程。
(2)农杆菌的特点：农杆菌细胞内含有__Ti__质粒，在自然条件下感染__双子叶__植物和__裸子__植物细胞后，能将Ti质粒上的__T－DNA__(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞内，并且将其整合到该细胞的__染色体DNA__上。
(3)目的基因插入__Ti__质粒的__T－DNA__中→导入__植物细胞__→整合到受体细胞的__染色体DNA__上→表现出新性状的植株。
(4)将基因表达载体导入农杆菌细胞时，应怎样处理农杆菌细胞？
提示：基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时，要用Ca2+处理农杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，有利于重组质粒的导入。
(5)可用什么方法检测目的基因是否发挥作用？
提示：用PCR技术检测目的基因是否转录出mRNA；用抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否翻译出相应蛋白质。
(6)如果目的基因是抗虫基因，在个体水平上怎样检测？如果目的基因是耐盐基因呢？
提示：如果目的基因是抗虫基因，则要进行抗虫接种实验；如果目的基因是耐盐基因，则要用一定浓度的盐水浇灌。
甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质，将甜蛋白基因导入黄瓜可提高黄瓜甜味。下图表示甜蛋白基因和Ti质粒上限制酶酶切位点。下列说法错误的是(　B　)
图1
图2
A．基因表达载体的构建是培育转基因黄瓜的核心工作
B．为保证甜蛋白基因正确插入，可用限制酶XbaⅠ和EcoRⅠ切割目的基因及质粒
C．T-DNA的作用是携带甜蛋白基因进入黄瓜细胞并整合到其染色体DNA上
D．为确定甜蛋白基因是否导入黄瓜细胞，可用PCR技术进行检测
解析：基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，即基因表达载体的构建是培育转基因黄瓜的核心工作，A正确。目的基因内有BamHⅠ识别序列，因此不能选择BamHⅠ切割目的基因，目的基因左侧只能选择限制酶XbaⅠ切割。由目的基因的转录方向可以推测，目的基因右侧应选择靠近终止子的限制酶HindⅢ，若用XbaⅠ和EcoRⅠ处理切割甜蛋白基因，则目的基因与质粒会发生反向连接，不能正常按转录方向转录，B错误。T-DNA是可以转移的DNA，其能将目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上，故能携带甜蛋白基因进入黄瓜细胞并整合到其染色体DNA上，C正确。目的基因的检测可以采用PCR技术或核酸分子杂交技术，为确定甜蛋白基因是否导入黄瓜细胞，可用PCR技术进行检测，D正确。
方法规律 农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析
(1)两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。
(2)两次导入：第一次导入是将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是将含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
将荧光蛋白基因与目的基因连接后导入植物细胞中，其表达产物既具有荧光蛋白的特性，又保持了目的基因表达产物的活性，因此可以通过检测荧光强度来检测目的基因的表达水平。下列有关该技术的说法，错误的是(　B　)
A．荧光蛋白基因与目的基因都可通过 PCR 技术获得
B．需要将荧光蛋白基因和目的基因分别连接在不同的启动子后面
C．荧光强度高的细胞，目的基因的表达水平一般也高
D．荧光蛋白还可用于检测目的基因表达产物的转移和分布情况
解析：荧光蛋白基因和目的基因均为已知序列的DNA，可通过PCR技术扩增获得，A正确；需要将荧光蛋白基因和目的基因连接在相同的启动子后面，B错误；荧光蛋白基因进入受体细胞后会表达出荧光蛋白，荧光强度高的细胞，目的基因的表达水平一般也高，C正确；荧光蛋白基因与目的基因连接后导入植物体细胞中，其表达产物具有荧光蛋白的特性，可以通过检测荧光的转移和分布来检测目的基因表达产物的转移和分布情况，D正确。
方法规律 目的基因的检测与鉴定
一、 知识自主构建
二、 学情随堂评价
1．基因工程是在DNA分子水平上进行设计操作的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的是(　B　)
A．目的基因与载体的结合
B．将目的基因导入受体细胞
C．目的基因的表达
D．目的基因的人工合成
2．(安徽A10联盟期中)如图是利用基因工程技术培育新品种水稻的部分流程，序号代表操作过程。下列相关叙述不正确的是(　A　)
A．利用PCR技术扩增目的基因需依次经过变性、延伸、复性阶段
B．为防止目的基因自身环化，过程①最好使用两种限制酶
C．过程③的目的是构建基因表达载体，需用DNA连接酶处理
D．重组Ti质粒上的T-DNA能将目的基因整合到宿主细胞染色体上
解析：利用PCR技术扩增目的基因需依次经过高温变性、低温复性、中温延伸阶段，A错误；构建重组质粒时用两种限制性内切核酸酶酶切，会形成不同的黏性末端或者平末端，可以防止目的基因的反向连接和质粒的自身环化，B正确；据图分析，过程③为基因表达载体的构建，该过程需用DNA连接酶将获取的目的基因和载体相连，C正确；农杆菌中Ti质粒上的T-DNA能转移到植物细胞，并将目的基因整合到宿主细胞染色体的DNA上，所以农杆菌转化法中常用Ti质粒作为基因工程的载体，D正确。
3．研究人员欲利用基因工程使家蚕分泌能发出绿色荧光的蚕丝，下列方法最合理的是(　A　)
A．将绿色荧光蛋白基因和蚕丝蛋白基因融合后插入蚕丝蛋白基因启动子下游
B．用绿色荧光蛋白基因替代细胞中的蚕丝蛋白基因
C．向表达蚕丝蛋白基因的受体细胞中导入绿色荧光蛋白基因
D．将蚕丝蛋白基因与绿色荧光蛋白基因融合后导入受体细胞
解析：欲利用基因工程使家蚕分泌能发出绿色荧光的蚕丝，构建的基因表达载体在受体细胞中应该能表达出蚕丝蛋白和绿色荧光蛋白，因此应将蚕丝蛋白基因和绿色荧光蛋白基因融合，以获得相应的融合基因，然后将该融合基因插入蚕丝蛋白基因的启动子下游，构建含有该融合基因的基因表达载体，再将该基因表达载体导入受体细胞。
4．(黄山期末)艾滋病(AIDS)是由HIV引起的获得性免疫缺陷综合征，HIV侵入人体后通常可以潜伏8～10年，甚至更长时间。医生常利用分子生物学技术检测受检人是否携带HIV，下列叙述错误的是(　D　)
A．DNA分子杂交技术可用来检测受检人是否携带HIV
B．可根据HIV的RNA序列合成小段DNA作为引物
C．可通过抗原—抗体杂交技术检测血液样品中HIV抗原
D．与检测抗原、核酸相比，检测抗体能更早诊断HIV感染
解析：采用DNA分子杂交技术检测HIV，将 HIV的遗传物质(RNA)逆转录形成 DNA 片段作为探针，若受检人携带HIV，探针就会与之结合出现杂交带，A正确；HIV为RNA病毒，先逆转录形成DNA，再用PCR技术检测该DNA，可根据HIV的RNA序列合成小段DNA作为引物扩增，B正确；HIV抗原的本质是蛋白质，可通过抗原—抗体杂交技术检测血液样品中的HIV抗原，C正确；HIV进入人体后，免疫系统经过一定的生理过程才会产生相应的抗体，需要耗费一定的时间，因此，检测抗体比检测抗原、核酸更晚诊断HIV感染，D错误。
5．(安徽皖南八校联考)图1为胰岛素基因结构与引物位置示意图，图2为pBR322质粒的结构示意图，图中EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ、BamH Ⅰ和Hind Ⅲ为限制酶，箭头或线段所指位点为对应酶切位点。研究人员欲用此质粒构建胰岛素基因的表达载体，培养能产生人胰岛素的大肠杆菌。请回答下列相关问题：
图1　胰岛素基因结构与引物位置示意图
图2　pBR322质粒的结构示意图
(1)若要进行胰岛素基因的扩增常采用__PCR__技术。已知DNA新链的合成方向是5′→3′，若利用图2中质粒构建基因表达载体，应该选择图1中的引物为__引物4、引物5__。
(2)在构建基因表达载体时，选择__BamH Ⅰ和Hind Ⅲ__作为切割质粒和目的基因的限制酶，可提高目的基因和载体的正确连接效率，其原因是__这两种酶能切割质粒和目的基因，且能得到不同的黏性末端，避免质粒和目的基因自身环化及反向连接__。
(3)成功构建的基因表达载体含有人胰岛素基因及其启动子等，其中启动子的作用是__提供RNA聚合酶特异性识别和结合的位点，驱动基因的转录__。
若利用酵母菌作受体细胞生产胰岛素，与大肠杆菌相比，利用酵母菌生产胰岛素的优势有__酵母菌为真核细胞，含有内质网和高尔基体，可对核糖体合成的蛋白质进行加工__。
若要检测导入酵母菌的胰岛素基因是否成功转录，常用__DNA-RNA分子杂交__(填“DNA-DNA分子杂交”或“DNA-RNA分子杂交”)技术。
解析：(1)扩增目的基因常用 PCR 技术，它依据 DNA 半保留复制原理，在体外实现基因片段大量扩增。由于DNA新链的合成方向是5′→3′，故引物与胰岛素基因的3′互补配对，对于引物1～4，只能在引物3和引物4中选。同样，对于引物5～8，只能在引物5和引物6中选，若利用图2中质粒构建基因表达载体，则在扩增胰岛素基因两端应包含限制酶切位点，图中只有引物4和引物5扩增出来的胰岛素基因含有和图2相同的两种限制酶的识别位点，因此应选择的引物为4和5。(2)要提高目的基因和载体的正确连接效率，在构建基因表达载体时，应选择BamH Ⅰ和Hind Ⅲ，这两种酶能同时切割质粒和目的基因，且能得到不同的黏性末端，避免了质粒和目的基因自身环化及反向连接等问题。(3)启动子的作用：启动子是 RNA 聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出 mRNA。胰岛素为分泌蛋白，需要内质网和高尔基体的加工，大肠杆菌属于原核生物，无内质网和高尔基体，而酵母菌属于真核生物，细胞含有内质网和高尔基体，可对胰岛素进行加工，形成有活性的胰岛素。为了检测目的基因是否成功转录，即检测是否存在胰岛素基因对应的mRNA，常用DNA-RNA分子杂交技术检测相应的mRNA，即利用与相应mRNA互补配对的DNA探针进行检测。

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