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第3章
第2节　基因工程的基本操作程序
基因工程
第2课时　实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定
学习目标 素养目标
1．DNA片段的扩增及电泳鉴定的原理(重点)； 2．DNA片段的扩增及电泳鉴定的方法步骤(难点) 科学探究：通过“探究·实践”活动“DNA片段的扩增及电泳鉴定”，使学生在学习相关操作并加深对PCR的认识中发展科学探究素养
核心概念
1．实验原理
(1)DNA片段的扩增
PCR利用了________________和DNA半保留复制的原理，通过调节________来控制DNA双链的解聚与结合。
(2)琼脂糖凝胶电泳
①带电粒子：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上__________或__________。
DNA的热变性
温度
正电荷
负电荷
②迁移动力与方向：在电场的作用下，带电分子会向着与它所带电荷________的电极移动，这个过程就是电泳。
③迁移速率：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的______和________等有关。
④检测：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的________灯下被检测出来。
相反
大小
构象
紫外
2．实验过程
微量移液器
PCR仪
核酸染料
加样
孔
凝胶边缘
[概 念 辨 析]
(1)离加样孔远的DNA片段小，近的DNA片段则大。 (　　)
提示：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，离加样孔远的DNA片段不一定小。
(2)该实验过程中可直接使用蒸馏水。 (　　)
提示：进行DNA片段的扩增及电泳鉴定实验所使用的是缓冲液。
(3) 待指示剂前沿迁移到达凝胶边缘时停止电泳。 (　　)
提示：待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时停止电泳。
×
×
×
(4) 缓冲液和酶应在－20 ℃储存，使用前迅速融化。 (　　)
提示：缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
(5) PCR时根据目的片段长度适当调整延伸时间。 (　　)
(6) DNA向着与其所带电荷相反的电极移动。 (　　)
(7)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 (　　)
×
√
√
√
目标导学
实验原理和材料用具
1
目标
一
教材P84“探究·实践”——实验原理
(1)DNA热变性的难易程度跟DNA分子中_________________________________有关，该比例越高，____________________越高，越______热变性。
(2)一般在PCR实验中引物的添加量________(填“大于”“小于”或“等于”)实际所需量，原因：______________________________________________________ ____________________。
能任意增大添加量吗？________。
(3)影响DNA分子迁移速率的因素
①______________：凝胶浓度高，则迁移速率______。
②_________________________：DNA分子大，则迁移速率______。
具有3个氢键的G—C碱基对的比例
DNA的热稳定性
难
大于
复性时不一定均为引物与DNA模板结合，也存在DNA解开的两条单链的结合
不能
凝胶的浓度
低
DNA分子的大小和构象
低
　　　利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似，过程如图所示。下列叙述错误的是 (　　)
A．引物A与引物B之间不能发生碱基互补配对
B．复性的目的是让两种引物与单链DNA相结合
1
C．第二轮循环产生的DNA分子中，有的含有两种引物序列
D．第二轮循环后才会出现两条链长度相等的DNA片段
D
解析：如果引物A和引物B发生碱基互补配对，则不能与相应模板链结合，无法完成子链的延伸，故引物A、B的碱基不能进行互补配对，A正确；复性的目的是让引物通过碱基互补配对与单链DNA结合，B正确；DNA复制为半保留复制，第二轮循环即DNA复制2次，共形成4个DNA分子，其中含有最初模板链的2个DNA分子含有引物A或引物B，其余2个DNA分子均含有引物A和引物B，4个DNA分子片段两条链长度均不相等，C正确；引物A和引物B均不在该片段的端点，因此第一轮循环后，得到的两个DNA片段中两条脱氧核苷酸链都不等长，由此推知，第三轮中才会出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段，D错误。
实验步骤、结果分析与评价
1
目标
二
1．教材P84～85“探究·实践”——实验步骤及注意事项
(1)按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分后，要进行________约10 s。目的：_____________________________________ ___________________。
(2)预变性条件：_________________, 预变性目的：________________________ _______________________。
离心
使反应液集中在离心管的底部(混合均匀，提高反应速率)
94 ℃、5 min
使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合
(3)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行________________处理。
(4)该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在____________条件下储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
(5)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须________。
(6)在进行操作时，一定要戴好______________。
高压蒸汽灭菌
－20 ℃
更换
一次性手套
2．教材P85“探究·实践”——结果分析与评价
(1)成功扩增出DNA片段的判断依据是__________________________________。
(2)进行电泳鉴定的结果应该是_____条条带。
(3)如图所示，该片段大小约为_______bp。
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带
1
750
　　　琼脂糖凝胶电泳可以根据DNA片段的大小(常以碱基对数计)对其进行分离，提取某哺乳动物和其母本以及几只可能为其父本的待测定雄性个体的DNA，经处理后进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图所示，其中M代表母本，C代表该哺乳动物，F1～F4代表待测雄性个体。下列相关叙述错误的是(　　)
A．PCR扩增技术利用了DNA半保留复制的原理
B．凝胶中DNA的迁移速率与DNA分子的大小和构象有关
C．由结果可知，PCR扩增后的产物中仅有12个DNA片段
D．由结果推测，待测雄性个体中的F2是该哺乳动物的父本
C
2
解析：PCR是在体外对DNA进行复制的过程，扩增利用了DNA半保留复制的原理，A正确；琼脂糖凝胶电泳可以根据DNA片段的大小对其进行分离，凝胶中DNA的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，B正确；由题图可知，每个样本的DNA电泳后都得到2个电泳条带，说明有2种大小不同的DNA片段，不一定只有2个DNA片段，即PCR扩增后的产物中不一定仅有12个DNA片段，C错误；该哺乳动物与M和F2各有一条相同的电泳条带，根据该结果推测，F2是其父本，D正确。
微课4　PCR技术中数量与关系分析
1．PCR技术与体内DNA复制的比较
项目 PCR技术 体内DNA复制
区 别 解旋方式 DNA在高温作用下变性解旋 解旋酶催化
场所 细胞外(主要在PCR仪内) 细胞内(主要在细胞核内)
酶 耐高温的DNA聚合酶 DNA解旋酶、普通的DNA聚合酶等
温度条件 需控制温度，在较高温度下进行 细胞内的温度条件
合成对象 DNA片段或基因 DNA分子
联系 ①模板：均需要脱氧核苷酸链作为模板进行物质合成； ②原料：均为四种脱氧核苷酸； ③酶：均需要DNA聚合酶进行催化； ④引物：均需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
2．PCR反应过程图解模型及相关数量、关系分析
图示显示一轮循环产生的子链长度小于互补链的长度，只有第三轮循环时才会合成出2个两条脱氧核苷酸链等长的子代DNA。PCR体系经过n次循环可使DNA数量得到约2n倍的扩增。
复制次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物的DNA分子数 2 4 8 2n
含其中一种引物的DNA分子数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1
同时含两种引物的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2
共消耗引物的对数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1
含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6 2n－2n
3．PCR中的数量关系
　　　(六安阶段练)利用PCR获取和扩增目的基因时，引物的选择非常关键，下列关于引物的说法，错误的是 (　　)
A．引物需要两种，可以在引物的3′端加修饰
B．若a个目的基因经PCR过程n次循环，则需要的引物总个数为a(2n+1－2)
C．若采用的引物G、C含量较高，则可以用较高的温度复性
D．设计引物时，引物内部和引物之间不能形成双链结构
A
解析：引物的延伸方向为5′→3′，因此DNA聚合酶需识别引物的3′端进行延伸，若在3′端添加修饰(如限制酶酶切位点)，会阻碍酶的作用，故修饰通常加在5′端，A错误；PCR扩增n次循环后，DNA分子数为a×2n，所需引物总数为a×(2n+1－2)，B正确；G、C碱基对含3个氢键，A、T碱基对间含2个氢键，引物G、C含量高时，需更高复性温度以保证特异性结合，C正确；引物内部或引物间若形成双链结构，会干扰与模板结合，导致非特异性扩增，D正确。
1
　　　微卫星DNA是广泛分布于真核生物基因组中的简单重复序列。由于重复单位和重复次数在个体间表现出一定的遗传性和差异性，因此微卫星DNA可以作为分子标记，并有着广泛应用。回答下列问题：
(1)扩增微卫星DNA序列A710的PCR反应体系中含缓冲液、模板DNA、dNTP(包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、引物及耐热的DNA聚合酶。其中dNTP的作用是_________________________________; PCR技术扩增目的基因的前提是___________ _________________________，以便根据这一序列合成引物，所以引物应选用下图中的_________(填图中标号)。
2
注：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ是引物，箭头是延伸方向。
作为合成DNA的原料、提供能量
有一段已
知目的基因的核苷酸序列
Ⅰ和Ⅳ
(2)PCR的基本反应步骤为_____________________________________________ ___________________________，其产物以_____________形式扩增。
DNA解链→引物结合到互补链→互补链的合成　 (或变性→复性/退火→延伸)
2n(或指数)
　　　通过设计引物、PCR 技术可以实现目的基因的定点诱变。图中引物1序列中含有一个碱基T，其不能与目的基因中的相应碱基配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5′端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。下列有关叙述不正确的是 (　　)
3
A．引物中设计不同的限制酶识别位点有利于目的基因定向插入质粒
B．在PCR反应体系中还需加入核糖核苷酸，但不需要加解旋酶
C．第3轮PCR中，引物1能与图中②链的3′端结合，形成两条链等长的突变基因
D．第3轮PCR结束后，含突变碱基对的DNA占1/2
B
解析：引物1和引物2的5′端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点，有利于目的基因定向插入质粒，A正确；PCR扩增利用了DNA半保留复制的特点，故在PCR反应体系中还需加入脱氧核苷酸、Taq酶等，不需要加入解旋酶，B错误；通过2轮复制后，可以获得以①链为模板合成的②链，经过第3轮复制，以②链为模板，引物1能与图中②链的3′端结合，形成两条链等长的突变基因，C正确；由于DNA半保留复制，第3轮PCR结束后，总DNA数目是23＝8个，含突变碱基对的DNA有4个，故含突变碱基对的DNA占1/2，D正确。
随堂内化
一、 知识自主构建
DNA
的热变性
DNA半保留复制
正电荷
或负电荷
变性
复性
延伸
核酸染料
标准参照物
接近
二、 学情随堂评价
1．(亳州期末)下列有关“DNA粗提取与鉴定”“PCR扩增”“琼脂糖凝胶电泳”实验的叙述，正确的是 (　　)
A．“DNA的粗提取与鉴定”实验中可利用DNA在酒精中溶解度较大的特点来提取DNA
B．电泳缓冲液配制的琼脂糖溶液中加入的核酸染料能与DNA分子结合，便于在紫外灯下观察
C．PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶在复性过程中起作用
D．将提取到的丝状物与二苯胺溶液充分混匀后，溶液变为蓝色
B
解析：DNA的粗提取与鉴定实验中利用DNA不溶于酒精、但某些蛋白质溶于酒精的原理，初步分离DNA与蛋白质，A错误；琼脂糖凝胶电泳中，核酸染料(如溴化乙锭)能与DNA分子结合，在紫外灯下可观察到DNA条带，便于检测，B正确；PCR扩增过程包括变性、复性、延伸，其中耐高温的DNA聚合酶在延伸阶段起作用，即以单链DNA作为模板，DNA聚合酶将4种脱氧核苷酸加到引物的3′端，合成新的DNA链，C错误；将提取到的丝状物先溶解于2 mol·L－1的NaCl溶液，再加入适量二苯胺试剂充分混匀后，需要水浴加热，试管冷却后溶液呈现蓝色，D错误。
2．用PCR方法检测转基因植株中是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。
PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出的分析不合理的是 (　　)
A．PCR产物的分子大小在250～500 bp
B．3号样品为不含目的基因的载体DNA
C．9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D．10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
B
解析：PCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段。4～9号是转基因植株，理论上应包含目的基因，结合2号野生型和10号蒸馏水组的结果，推测包含目的基因的片段大小应为250～500 bp，A符合题意；3号PCR结果包含250～500 bp片段，应包含目的基因，B不符合题意；9号PCR结果不包含250～500 bp片段，所以不是所需转基因植株，C符合题意；10号放入蒸馏水，可排除反应体系等对结果的干扰，由图可知，10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰，D符合题意。
3．镰状细胞贫血是一种单基因遗传病，由正常血红蛋白基因(HbA)突变为异常血红蛋白基因(Hbs)引起，它们的某片段如图甲。现对一胎儿进行基因检测，主要原理：限制酶Mst Ⅱ处理扩增后的DNA，加热使酶切片段解旋后用荧光标记的CTGACTCCT序列与其杂交，最后电泳分离。图乙为电泳后荧光出现的三种可能性。下列叙述正确的是 (　　)
A．利用PCR扩增DNA时反应体系中应加入4种dNTP、Taq DNA聚合酶和2个引物
B．若检测结果为图乙中的a，则该胎儿为镰状细胞贫血患者
C．将荧光标记序列变长，图乙中的c中两个DNA条带间的距离基本不变
D．用限制酶Mst Ⅱ处理DNA不充分，可能把携带者误判为正常人
C
甲
乙
解析：PCR扩增的原理是DNA复制，需要原料和酶等，所以反应体系中应加入4种dNTP、TaqDNA聚合酶、含Mg2+的缓冲液以及2对引物若干，而不是2个引物，A错误。据图可知，正常血红蛋白基因(HbA)中含有MstⅡ限制酶的酶切位点，而异常血红蛋白基因(Hbs)中没有，限制酶MstⅡ处理扩增后的DNA，会导致正常血红蛋白基因(HbA)变短，DNA分子质量变小。出现图乙中的a DNA条带，DNA条带距离加样孔较远，说明DNA分子质量小，则表示含有正常血红蛋白基因(HbA)；出现图乙中的b DNA条带，DNA条带距离加样孔较近，说明DNA分子质量大，没有被切割，表示含有异常血红蛋白基因(Hbs)；
出现图乙中的c DNA条带，表示含有Hbs和HbA，因此若某胎儿检测结果为图乙中的b，则该胎儿为镰状细胞贫血患者，B错误。凝胶电泳中，DNA分子质量越大，电泳速度越慢，因此图乙中的c中两个DNA条带间的距离与切割后DNA分子质量的大小有关，与荧光标记序列长短无关，C正确。据图可知，用MstⅡ限制酶处理DNA不充分，HbA中间位置可能没有被切割，电泳结果可能与Hbs一样，因此可能把正常人误判为携带者，D错误。第2课时　实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定
1．利用PCR技术从某种生物的基因组DNA中获取目的基因。有关这一过程，下列说法错误的是(　　)
A．有目的基因的DNA片段作为模板
B．目的基因的一段核苷酸序列已知，以便根据这一序列合成两种引物
C．有足够的脱氧核苷酸作为原料
D．加入足够数量的DNA连接酶进行指数式扩增
2．PCR又称聚合酶链式反应，现在已成为分子生物学实验中的一种常规手段，它可以在体外很短的时间内将DNA大量扩增。你认为下列符合在体外进行PCR反应条件的一组是(　　)
①稳定的缓冲溶液环境　②DNA模板　③引物
④4种脱氧核苷酸　⑤耐高温的DNA聚合酶
⑥解旋酶　⑦限制性内切核酸酶　⑧温控设备
A．①②③④⑤⑥ B．①②③④⑤⑥⑦⑧
C．③④⑤⑥⑧ D．①②③④⑤⑧
3．下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是(　　)
A．二者子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端
B．二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋
C．体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量
D．二者遵循的碱基互补配对原则相同
4．(阜阳期中)下列关于“DNA的粗提取与鉴定”“核酸片段的扩增”及“电泳鉴定”实验的叙述，错误的是(　　)
A．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色
B．为了提升提取效果，在析出DNA时使用的酒精需要进行预冷
C．PCR反应需要在一定的缓冲液中才能进行
D．琼脂糖凝胶电泳中的缓冲液中含指示剂，其可以在紫外灯下被检测出来
5．(阜阳期中)DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下这些基团带有电荷，在电场的作用下带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这就是电泳。下列有关说法错误的是(　　)
A．制备凝胶所用琼脂糖溶液的浓度要根据待电泳的DNA分子大小进行调整
B．凝胶载样缓冲液注入凝胶加样孔后，要立即加入DNA样本
C．当指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，需要停止电泳
D．通过在紫外灯下切取电泳后的凝胶，可实现对样品中不同长度DNA的分离
6．某校学习小组进行PCR实验，甲、乙、丙三名同学均以酵母菌为材料，进行PCR扩增，各取20 μL产物进行凝胶电泳，得到的结果如下图所示。下列叙述正确的是(　　)
A．凝胶a端靠近电泳槽的正极接线柱
B．甲同学扩增得到的片段比乙同学的要大
C．丙同学扩增得到的片段比乙同学的要大
D．丙同学所用的引物可能与甲同学的不一样
7．(安徽师范大学附中)我国科学家用诱变剂处理野生型油菜，获得了新生叶黄化的隐性突变体。由于一个碱基对的改变，导致该突变基因上出现了一个限制酶B的酶切位点(如图所示)。该突变体与野生型杂交得F1，F1自交得F2，提取F2植株的基因组DNA→PCR→回收扩增产物→用限制酶B处理→电泳，电泳后得到的条带数最多为(　　)
A．0条 B．1条
C．2条 D．3条
8．(芜湖质检)反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程如下图所示。下列叙述错误的是(　　)
A．反向PCR应选择引物1和引物4进行PCR扩增
B．设计的引物不宜过短，否则扩增的特异性会下降
C．PCR产物是包含已知序列和所有未知序列的环状DNA分子
D．整个过程需用到限制酶、DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶
9．(阜阳期中)在某动物的黑色群体中偶然发现一只黄色雄性个体甲，让甲与纯合黑色个体杂交得到F1，F1随机交配，F2中黑色♂∶黑色♀∶黄色♂∶黄色♀＝3∶3∶1∶1。染色体上一些位置和序列已知的DNA序列被称为分子标记。为确定甲中黄色基因位于哪条染色体上，现用Ⅰ号和Ⅱ号染色体上的分子标记设计引物对实验中部分个体的DNA进行PCR扩增，将扩增产物电泳后，结果如图所示。下列说法错误的是(　　)
A．根据杂交结果可确定黄色基因为隐性基因，且位于常染色体上
B．不直接对目标基因进行PCR扩增的原因是目标基因位置未知，无法设计引物
C．制备电泳凝胶时，应向电泳缓冲液中加入琼脂糖，加热熔化并稍冷却后再加入核酸染料
D．根据实验结果可推测目标基因位于Ⅱ号染色体上
10．(黄冈模拟)研究发现，HIV通过细胞膜上的A蛋白侵染人体细胞，同时发现若A基因缺失了32个特定碱基对会导致A蛋白异常，故而aa个体天然免疫HIV。现为了快速辨别甲、乙、丙个体的基因型，用引物F和R分别对三人的基因组进行PCR，每组PCR产物都分为两份，一份直接电泳，一份用ApoⅠ酶切割后电泳，结果如图所示。下列叙述错误的是(　　)
A．2号加样孔中的样品均为PCR产物直接电泳结果
B．乙个体两个加样孔条带一致可能是ApoⅠ酶失活导致
C．测序比对3和4号条带可获得a基因缺失的序列
D．DNA分子迁移速率与凝胶浓度、DNA分子大小等有关
11．土壤重金属污染会对人类健康造成危害，是严重的环境问题。利用基因工程手段构建重金属富集植物是修复土壤重金属污染的重要方向之一。景天科植物伴矿景天是一种镉富集生物，研究人员将伴矿景天的SpHMA2基因(简称S基因)转入油菜，获得了镉富集转基因油菜。
图1
(1)提取伴矿景天DNA，经PCR扩增S基因，利用凝胶电泳对扩增片段进行鉴定，得到了图1所示的结果(1号泳道为样品，2号泳道为阴性对照)。由于DNA分子片段带负电荷，所以电泳开始前应将________(填“正”或“负”)电极插在凝胶板上靠近DNA样品的一端。根据图所示电泳结果，S基因长约________bp，回收S基因。
(2)将S基因导入植物受体细胞常用的方法是农杆菌转化法，因为农杆菌中含有________结构，将构建的农杆菌与野生型油菜外植体共培养，再通过________________技术获得转基因油菜植株，该过程中____________________两种植物激素的浓度比起着重要作用。
(3)为检测转基因油菜的镉富集能力，将野生型油菜(WT)和三个株系的转基因油菜(S1、S2、S3)种植于含200 μM氯化镉的培养液中，10 d后分别测定各油菜的镉含量，得到了图2所示的结果(*表示存在显著性差异)，该结果说明______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
图2
第2课时　实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定
题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
答案 D D B D B D D C B B
1．D　解析：用PCR技术扩增目的基因，应以含目的基因的DNA片段作为模板；PCR技术的前提条件是目的基因的一段核苷酸序列已知，以便合成一对引物；DNA复制需要有足够的脱氧核苷酸作为原料；PCR技术需要耐高温的DNA聚合酶，不需要DNA连接酶。
2．D　解析：PCR反应的实质是模拟体内DNA复制，因此需要稳定的缓冲溶液环境，①正确；PCR反应需要DNA模板，②正确；PCR反应需要一对引物，③正确；PCR反应需要以4种脱氧核苷酸为原料，④正确；PCR反应需要耐高温的DNA聚合酶催化延伸过程，⑤正确；PCR反应过程中通过高温使DNA变性解链，不需要解旋酶，⑥错误；PCR反应不需要限制性内切核酸酶，⑦错误；PCR反应过程中需要控制的关键因素是温度，因此需要温控设备，⑧正确。
3．B　解析：DNA体内复制与利用PCR技术扩增DNA时，子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端，A正确；PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，在高温条件下氢键断裂，B错误；DNA体内复制与利用PCR扩增DNA时都需要能量，但两者所需能量来源不同，C正确；DNA体内复制与利用PCR扩增DNA时，遵循的碱基互补配对原则相同，D正确。
4．D　解析：在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂会被染成蓝色，A正确；低温可抑制酶的活性，则为了提升提取效果，在析出DNA时使用的酒精需要进行预冷，B正确；PCR反应中的缓冲液是维护反应体系稳定、保障扩增顺利进行的关键成分，C正确；凝胶载样缓冲液中含指示剂，不能在紫外灯下被检测出来，凝胶中的DNA分子通过核酸染料染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，D错误。
5．B　解析：琼脂糖溶液浓度越高，DNA分子在凝胶中电泳时运动越慢，所以要根据待电泳的DNA分子大小调整琼脂糖溶液浓度，A正确；DNA样本要与凝胶载样缓冲液混合后注入凝胶加样孔，B错误；指示剂肉眼可见且比DNA电泳速度快，当指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，说明DNA电泳已经完成，C正确；电泳后的凝胶不同部位含有不同长度的DNA，可以在紫外灯下将特定部位的凝胶切出，以获得特定长度的DNA，D正确。
6．D　解析：DNA分子带负电荷，在电场的作用下会向正极移动，故凝胶a端靠近电泳槽的负极接线柱，A错误；甲、乙同学扩增得到的条带与点样孔的距离相同，说明两者扩增得到的片段一样大，甲同学的电泳条带比乙同学的宽，说明甲同学扩增的DNA产物多于乙同学，B错误；丙同学扩增产物的电泳条带比甲、乙条带位置距离点样孔更远，说明丙同学扩增的DNA分子小，扩散速率快，C错误；由图可知，丙同学扩增出来的产物与甲、乙同学产物不同，说明其DNA不同，碱基序列可能不同，故丙同学所用的引物可能与甲、乙同学的不一样，D正确。
7．D　解析：野生型基因电泳结果有一条条带，叶黄化的基因经过限制酶B处理后，基因被切成两段长度不一的片段，电泳后有2条条带，则F2中杂合子既有正常基因，也有突变基因，故电泳条带数目应为3条，D符合题意。
8．C　解析：反向PCR是对已知序列两侧的未知序列进行扩增，引物应与已知序列两端外侧的DNA链互补配对，而DNA子链合成的方向为5′端到3′端，据图分析应选择引物1和引物4进行PCR扩增，A正确；PCR技术设计的引物不宜过短，过短的引物容易与多个部位结合，导致扩增的特异性下降，B正确；PCR产物是包含部分已知序列和所有未知序列的链状DNA分子，C错误；实验中先用限制酶(如EcoRⅠ)切割DNA，然后用DNA连接酶将其环化，PCR过程需要耐高温的DNA聚合酶，D正确。
9．B　解析：根据F2雌雄个体中黑色∶黄色均为3∶1，判断黄色基因为隐性基因，且位于常染色体上，A正确；不直接对目标基因进行PCR扩增的原因是目标基因的序列未知，无法设计引物，B错误；制备电泳凝胶时，应向电泳缓冲液中加入琼脂糖，在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化，稍冷却后再加入核酸染料，C正确；F2中几乎所有黄色个体的Ⅱ号染色体都来自亲本甲，可推测黄色基因位于Ⅱ号染色体上，D正确。
10．B　解析：A基因和a基因碱基对数量不同，电泳形成两种条带，根据图示可知，A基因具有ApoⅠ酶切位点，A基因被酶切后经过电泳会形成两个条带，a基因不能被酶切，因此PCR产物直接电泳最多有两个条带，用ApoⅠ切割后的电泳最多有三个条带，而甲的1号加样孔有三个条带，说明1号加样孔是用ApoⅠ切割后电泳结果，2号加样孔是直接电泳的结果。由于a基因是A基因缺失了32个特定碱基对突变而来的，A基因分子更大，电泳时移动速度更慢，故3表示A基因，4表示a基因，测序比对3和4号条带可获得a基因缺失的序列，A、C正确；根据乙的1号加样孔用ApoⅠ酶切割后电泳的产物可知，该个体的基因型为aa，由于a基因不能被ApoⅠ酶切，因此出现乙个体两个加样孔条带一致的情况，B错误；DNA分子迁移速率与凝胶浓度、DNA分子大小和构象等有关，D正确。
11．(1)负　3 000　(2)Ti质粒　植物组织培养　细胞分裂素、生长素　(3)与野生型油菜相比，转基因油菜镉富集能力明显提高，且S2株富集能力最强
解析：(1)电泳过程中，在电场的作用下，带电离子会向着与它所带电荷相反的电极移动，由于DNA分子片段带负电荷，所以电泳开始前应将负电极插在凝胶板上靠近DNA样品的一端，然后DNA片段向正极移动。1号泳道为样品，依据图示电泳结果，S基因长约3 000 bp。第2课时　实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定
学习目标 素养目标
1． DNA片段的扩增及电泳鉴定的原理(重点)； 2． DNA片段的扩增及电泳鉴定的方法步骤(难点) 科学探究：通过“探究·实践”活动“DNA片段的扩增及电泳鉴定”，使学生在学习相关操作并加深对PCR的认识中发展科学探究素养
1．实验原理
(1)DNA片段的扩增
PCR利用了_________和DNA半保留复制的原理，通过调节_______来控制DNA双链的解聚与结合。
(2)琼脂糖凝胶电泳
①带电粒子：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上________或________。
②迁移动力与方向：在电场的作用下，带电分子会向着与它所带电荷____的电极移动，这个过程就是电泳。
③迁移速率：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的____和____等有关。
④检测：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的____灯下被检测出来。
2．实验过程
[概 念 辨 析]
(1)离加样孔远的DNA片段小，近的DNA片段则大。(　　)
(2)该实验过程中可直接使用蒸馏水。(　　)
(3) 待指示剂前沿迁移到达凝胶边缘时停止电泳。(　　)
(4) 缓冲液和酶应在－20 ℃储存，使用前迅速融化。(　　)
(5) PCR时根据目的片段长度适当调整延伸时间。(　　)
(6) DNA向着与其所带电荷相反的电极移动。(　　)
(7)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。(　　)
实验原理和材料用具
教材P84“探究·实践”——实验原理
(1)DNA热变性的难易程度跟DNA分子中_________有关，该比例越高，_________越高，越________热变性。
(2)一般在PCR实验中引物的添加量_______ (填“大于”“小于”或“等于”)实际所需量，原因：__________________________________。
能任意增大添加量吗？______________。
(3)影响DNA分子迁移速率的因素
①_______________：凝胶浓度高，则迁移速率______________。
②___________________________：DNA分子大，则迁移速率_______。
利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似，过程如图所示。下列叙述错误的是(　　)
A．引物A与引物B之间不能发生碱基互补配对
B．复性的目的是让两种引物与单链DNA相结合
C．第二轮循环产生的DNA分子中，有的含有两种引物序列
D．第二轮循环后才会出现两条链长度相等的DNA片段
实验步骤、结果分析与评价
1．教材P84～85“探究·实践”——实验步骤及注意事项
(1)按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分后，要进行________约10 s。目的：__________________________。
(2)预变性条件：_________, 预变性目的：_____________________。
(3)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行_____________________处理。
(4)该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在__________条件下储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
(5)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须________。
(6)在进行操作时，一定要戴好________。
2．教材P85“探究·实践”——结果分析与评价
(1)成功扩增出DNA片段的判断依据是__ __________________。
(2)进行电泳鉴定的结果应该是___条条带。
(3)如图所示，该片段大小约为____________bp。
琼脂糖凝胶电泳可以根据DNA片段的大小(常以碱基对数计)对其进行分离，提取某哺乳动物和其母本以及几只可能为其父本的待测定雄性个体的DNA，经处理后进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图所示，其中M代表母本，C代表该哺乳动物，F1～F4代表待测雄性个体。下列相关叙述错误的是(　　)
A．PCR扩增技术利用了DNA半保留复制的原理
B．凝胶中DNA的迁移速率与DNA分子的大小和构象有关
C．由结果可知，PCR扩增后的产物中仅有12个DNA片段
D．由结果推测，待测雄性个体中的F2是该哺乳动物的父本
微课4　PCR技术中数量与关系分析
1．PCR技术与体内DNA复制的比较
项目 PCR技术 体内DNA复制
区 别 解旋方式 DNA在高温作用下变性解旋 解旋酶催化
场所 细胞外(主要在PCR仪内) 细胞内(主要在细胞核内)
酶 耐高温的DNA聚合酶 DNA解旋酶、普通的DNA聚合酶等
温度条件 需控制温度，在较高温度下进行 细胞内的温度条件
合成对象 DNA片段或基因 DNA分子
联系 ①模板：均需要脱氧核苷酸链作为模板进行物质合成； ②原料：均为四种脱氧核苷酸； ③酶：均需要DNA聚合酶进行催化； ④引物：均需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
2． PCR反应过程图解模型及相关数量、关系分析
图示显示一轮循环产生的子链长度小于互补链的长度，只有第三轮循环时才会合成出2个两条脱氧核苷酸链等长的子代DNA。PCR体系经过n次循环可使DNA数量得到约2n倍的扩增。
3．PCR中的数量关系
复制次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物的DNA分子数 2 4 8 2n
含其中一种引物的DNA分子数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1
同时含两种引物的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2
共消耗引物的对数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1
含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6 2n－2n
(六安阶段练)利用PCR获取和扩增目的基因时，引物的选择非常关键，下列关于引物的说法，错误的是(　　)
A．引物需要两种，可以在引物的3′端加修饰
B．若a个目的基因经PCR过程n次循环，则需要的引物总个数为a(2n+1－2)
C．若采用的引物G、C含量较高，则可以用较高的温度复性
D．设计引物时，引物内部和引物之间不能形成双链结构
微卫星DNA是广泛分布于真核生物基因组中的简单重复序列。由于重复单位和重复次数在个体间表现出一定的遗传性和差异性，因此微卫星DNA可以作为分子标记，并有着广泛应用。回答下列问题：
(1)扩增微卫星DNA序列A710的PCR反应体系中含缓冲液、模板DNA、dNTP(包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、引物及耐热的DNA聚合酶。其中dNTP的作用是___________________________________; PCR技术扩增目的基因的前提是____________________________________，以便根据这一序列合成引物，所以引物应选用下图中的____________(填图中标号)。
注：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ是引物，箭头是延伸方向。
(2)PCR的基本反应步骤为___________________________________，其产物以________________________形式扩增。
通过设计引物、PCR 技术可以实现目的基因的定点诱变。图中引物1序列中含有一个碱基T，其不能与目的基因中的相应碱基配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5′端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。下列有关叙述不正确的是(　　)
A．引物中设计不同的限制酶识别位点有利于目的基因定向插入质粒
B．在PCR反应体系中还需加入核糖核苷酸，但不需要加解旋酶
C．第3轮PCR中，引物1能与图中②链的3′端结合，形成两条链等长的突变基因
一、 知识自主构建
二、 学情随堂评价
1．(亳州期末)下列有关“DNA粗提取与鉴定”“PCR扩增”“琼脂糖凝胶电泳”实验的叙述，正确的是(　　)
A．“DNA的粗提取与鉴定”实验中可利用DNA在酒精中溶解度较大的特点来提取DNA
B．电泳缓冲液配制的琼脂糖溶液中加入的核酸染料能与DNA分子结合，便于在紫外灯下观察
C．PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶在复性过程中起作用
D．将提取到的丝状物与二苯胺溶液充分混匀后，溶液变为蓝色
2．用PCR方法检测转基因植株中是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出的分析不合理的是(　　)
A．PCR产物的分子大小在250～500 bp
B．3号样品为不含目的基因的载体DNA
C．9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D．10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
3．镰状细胞贫血是一种单基因遗传病，由正常血红蛋白基因(HbA)突变为异常血红蛋白基因(Hbs)引起，它们的某片段如图甲。现对一胎儿进行基因检测，主要原理：限制酶Mst Ⅱ处理扩增后的DNA，加热使酶切片段解旋后用荧光标记的CTGACTCCT序列与其杂交，最后电泳分离。图乙为电泳后荧光出现的三种可能性。下列叙述正确的是(　　)
甲
乙
A．利用PCR扩增DNA时反应体系中应加入4种dNTP、Taq DNA聚合酶和2个引物
B．若检测结果为图乙中的a，则该胎儿为镰状细胞贫血患者
C．将荧光标记序列变长，图乙中的c中两个DNA条带间的距离基本不变
D．用限制酶Mst Ⅱ处理DNA不充分，可能把携带者误判为正常人
第2课时　实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定
学习目标 素养目标
1． DNA片段的扩增及电泳鉴定的原理(重点)； 2． DNA片段的扩增及电泳鉴定的方法步骤(难点) 科学探究：通过“探究·实践”活动“DNA片段的扩增及电泳鉴定”，使学生在学习相关操作并加深对PCR的认识中发展科学探究素养
1．实验原理
(1)DNA片段的扩增
PCR利用了__DNA的热变性__和DNA半保留复制的原理，通过调节__温度__来控制DNA双链的解聚与结合。
(2)琼脂糖凝胶电泳
①带电粒子：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上__正电荷__或__负电荷__。
②迁移动力与方向：在电场的作用下，带电分子会向着与它所带电荷__相反__的电极移动，这个过程就是电泳。
③迁移速率：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的__大小__和__构象__等有关。
④检测：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的__紫外__灯下被检测出来。
2．实验过程
[概 念 辨 析]
(1)离加样孔远的DNA片段小，近的DNA片段则大。(　×　)
提示：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，离加样孔远的DNA片段不一定小。
(2)该实验过程中可直接使用蒸馏水。(　×　)
提示：进行DNA片段的扩增及电泳鉴定实验所使用的是缓冲液。
(3) 待指示剂前沿迁移到达凝胶边缘时停止电泳。(　×　)
提示：待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时停止电泳。
(4) 缓冲液和酶应在－20 ℃储存，使用前迅速融化。(　×　)
提示：缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
(5) PCR时根据目的片段长度适当调整延伸时间。(　√　)
(6) DNA向着与其所带电荷相反的电极移动。(　√　)
(7)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。(　√　)
实验原理和材料用具
教材P84“探究·实践”——实验原理
(1)DNA热变性的难易程度跟DNA分子中__具有3个氢键的G—C碱基对的比例__有关，该比例越高，__DNA的热稳定性__越高，越__难__热变性。
(2)一般在PCR实验中引物的添加量__大于__(填“大于”“小于”或“等于”)实际所需量，原因：__复性时不一定均为引物与DNA模板结合，也存在DNA解开的两条单链的结合__。
能任意增大添加量吗？__不能__。
(3)影响DNA分子迁移速率的因素
①__凝胶的浓度__：凝胶浓度高，则迁移速率__低__。
②__DNA分子的大小和构象__：DNA分子大，则迁移速率__低__。
利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似，过程如图所示。下列叙述错误的是(　D　)
A．引物A与引物B之间不能发生碱基互补配对
B．复性的目的是让两种引物与单链DNA相结合
C．第二轮循环产生的DNA分子中，有的含有两种引物序列
D．第二轮循环后才会出现两条链长度相等的DNA片段
解析：如果引物A和引物B发生碱基互补配对，则不能与相应模板链结合，无法完成子链的延伸，故引物A、B的碱基不能进行互补配对，A正确；复性的目的是让引物通过碱基互补配对与单链DNA结合，B正确；DNA复制为半保留复制，第二轮循环即DNA复制2次，共形成4个DNA分子，其中含有最初模板链的2个DNA分子含有引物A或引物B，其余2个DNA分子均含有引物A和引物B，4个DNA分子片段两条链长度均不相等，C正确；引物A和引物B均不在该片段的端点，因此第一轮循环后，得到的两个DNA片段中两条脱氧核苷酸链都不等长，由此推知，第三轮中才会出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段，D错误。
实验步骤、结果分析与评价
1．教材P84～85“探究·实践”——实验步骤及注意事项
(1)按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分后，要进行__离心__约10 s。目的：__使反应液集中在离心管的底部(混合均匀，提高反应速率)__。
(2)预变性条件：__94 ℃、5 min__, 预变性目的：__使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合__。
(3)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行__高压蒸汽灭菌__处理。
(4)该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在__－20 ℃__条件下储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
(5)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须__更换__。
(6)在进行操作时，一定要戴好__一次性手套__。
2．教材P85“探究·实践”——结果分析与评价
(1)成功扩增出DNA片段的判断依据是__ 可以在紫外灯下直接观察到DNA条带__。
(2)进行电泳鉴定的结果应该是__1__条条带。
(3)如图所示，该片段大小约为__750__bp。
琼脂糖凝胶电泳可以根据DNA片段的大小(常以碱基对数计)对其进行分离，提取某哺乳动物和其母本以及几只可能为其父本的待测定雄性个体的DNA，经处理后进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图所示，其中M代表母本，C代表该哺乳动物，F1～F4代表待测雄性个体。下列相关叙述错误的是(　C　)
A．PCR扩增技术利用了DNA半保留复制的原理
B．凝胶中DNA的迁移速率与DNA分子的大小和构象有关
C．由结果可知，PCR扩增后的产物中仅有12个DNA片段
D．由结果推测，待测雄性个体中的F2是该哺乳动物的父本
解析：PCR是在体外对DNA进行复制的过程，扩增利用了DNA半保留复制的原理，A正确；琼脂糖凝胶电泳可以根据DNA片段的大小对其进行分离，凝胶中DNA的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，B正确；由题图可知，每个样本的DNA电泳后都得到2个电泳条带，说明有2种大小不同的DNA片段，不一定只有2个DNA片段，即PCR扩增后的产物中不一定仅有12个DNA片段，C错误；该哺乳动物与M和F2各有一条相同的电泳条带，根据该结果推测，F2是其父本，D正确。
微课4　PCR技术中数量与关系分析
1．PCR技术与体内DNA复制的比较
项目 PCR技术 体内DNA复制
区 别 解旋方式 DNA在高温作用下变性解旋 解旋酶催化
场所 细胞外(主要在PCR仪内) 细胞内(主要在细胞核内)
酶 耐高温的DNA聚合酶 DNA解旋酶、普通的DNA聚合酶等
温度条件 需控制温度，在较高温度下进行 细胞内的温度条件
合成对象 DNA片段或基因 DNA分子
联系 ①模板：均需要脱氧核苷酸链作为模板进行物质合成； ②原料：均为四种脱氧核苷酸； ③酶：均需要DNA聚合酶进行催化； ④引物：均需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
2． PCR反应过程图解模型及相关数量、关系分析
图示显示一轮循环产生的子链长度小于互补链的长度，只有第三轮循环时才会合成出2个两条脱氧核苷酸链等长的子代DNA。PCR体系经过n次循环可使DNA数量得到约2n倍的扩增。
3．PCR中的数量关系
复制次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物的DNA分子数 2 4 8 2n
含其中一种引物的DNA分子数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1
同时含两种引物的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2
共消耗引物的对数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1
含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6 2n－2n
(六安阶段练)利用PCR获取和扩增目的基因时，引物的选择非常关键，下列关于引物的说法，错误的是(　A　)
A．引物需要两种，可以在引物的3′端加修饰
B．若a个目的基因经PCR过程n次循环，则需要的引物总个数为a(2n+1－2)
C．若采用的引物G、C含量较高，则可以用较高的温度复性
D．设计引物时，引物内部和引物之间不能形成双链结构
解析：引物的延伸方向为5′→3′，因此DNA聚合酶需识别引物的3′端进行延伸，若在3′端添加修饰(如限制酶酶切位点)，会阻碍酶的作用，故修饰通常加在5′端，A错误；PCR扩增n次循环后，DNA分子数为a×2n，所需引物总数为a×(2n+1－2)，B正确；G、C碱基对含3个氢键，A、T碱基对间含2个氢键，引物G、C含量高时，需更高复性温度以保证特异性结合，C正确；引物内部或引物间若形成双链结构，会干扰与模板结合，导致非特异性扩增，D正确。
微卫星DNA是广泛分布于真核生物基因组中的简单重复序列。由于重复单位和重复次数在个体间表现出一定的遗传性和差异性，因此微卫星DNA可以作为分子标记，并有着广泛应用。回答下列问题：
(1)扩增微卫星DNA序列A710的PCR反应体系中含缓冲液、模板DNA、dNTP(包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、引物及耐热的DNA聚合酶。其中dNTP的作用是__作为合成DNA的原料、提供能量__; PCR技术扩增目的基因的前提是__有一段已知目的基因的核苷酸序列__，以便根据这一序列合成引物，所以引物应选用下图中的__Ⅰ和Ⅳ__(填图中标号)。
注：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ是引物，箭头是延伸方向。
(2)PCR的基本反应步骤为__DNA解链→引物结合到互补链→互补链的合成(或变性→复性/退火→延伸)__，其产物以__2n(或指数)__形式扩增。
通过设计引物、PCR 技术可以实现目的基因的定点诱变。图中引物1序列中含有一个碱基T，其不能与目的基因中的相应碱基配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5′端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。下列有关叙述不正确的是(　B　)
A．引物中设计不同的限制酶识别位点有利于目的基因定向插入质粒
B．在PCR反应体系中还需加入核糖核苷酸，但不需要加解旋酶
C．第3轮PCR中，引物1能与图中②链的3′端结合，形成两条链等长的突变基因
D．第3轮PCR结束后，含突变碱基对的DNA占1/2
解析：引物1和引物2的5′端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点，有利于目的基因定向插入质粒，A正确；PCR扩增利用了DNA半保留复制的特点，故在PCR反应体系中还需加入脱氧核苷酸、Taq酶等，不需要加入解旋酶，B错误；通过2轮复制后，可以获得以①链为模板合成的②链，经过第3轮复制，以②链为模板，引物1能与图中②链的3′端结合，形成两条链等长的突变基因，C正确；由于DNA半保留复制，第3轮PCR结束后，总DNA数目是23＝8个，含突变碱基对的DNA有4个，故含突变碱基对的DNA占1/2，D正确。
一、 知识自主构建
二、 学情随堂评价
1．(亳州期末)下列有关“DNA粗提取与鉴定”“PCR扩增”“琼脂糖凝胶电泳”实验的叙述，正确的是(　B　)
A．“DNA的粗提取与鉴定”实验中可利用DNA在酒精中溶解度较大的特点来提取DNA
B．电泳缓冲液配制的琼脂糖溶液中加入的核酸染料能与DNA分子结合，便于在紫外灯下观察
C．PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶在复性过程中起作用
D．将提取到的丝状物与二苯胺溶液充分混匀后，溶液变为蓝色
解析：DNA的粗提取与鉴定实验中利用DNA不溶于酒精、但某些蛋白质溶于酒精的原理，初步分离DNA与蛋白质，A错误；琼脂糖凝胶电泳中，核酸染料(如溴化乙锭)能与DNA分子结合，在紫外灯下可观察到DNA条带，便于检测，B正确；PCR扩增过程包括变性、复性、延伸，其中耐高温的DNA聚合酶在延伸阶段起作用，即以单链DNA作为模板，DNA聚合酶将4种脱氧核苷酸加到引物的3′端，合成新的DNA链，C错误；将提取到的丝状物先溶解于2 mol·L－1的NaCl溶液，再加入适量二苯胺试剂充分混匀后，需要水浴加热，试管冷却后溶液呈现蓝色，D错误。
2．用PCR方法检测转基因植株中是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出的分析不合理的是(　B　)
A．PCR产物的分子大小在250～500 bp
B．3号样品为不含目的基因的载体DNA
C．9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D．10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
解析：PCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段。4～9号是转基因植株，理论上应包含目的基因，结合2号野生型和10号蒸馏水组的结果，推测包含目的基因的片段大小应为250～500 bp，A符合题意；3号PCR结果包含250～500 bp片段，应包含目的基因，B不符合题意；9号PCR结果不包含250～500 bp片段，所以不是所需转基因植株，C符合题意；10号放入蒸馏水，可排除反应体系等对结果的干扰，由图可知，10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰，D符合题意。
3．镰状细胞贫血是一种单基因遗传病，由正常血红蛋白基因(HbA)突变为异常血红蛋白基因(Hbs)引起，它们的某片段如图甲。现对一胎儿进行基因检测，主要原理：限制酶Mst Ⅱ处理扩增后的DNA，加热使酶切片段解旋后用荧光标记的CTGACTCCT序列与其杂交，最后电泳分离。图乙为电泳后荧光出现的三种可能性。下列叙述正确的是(　C　)
甲
乙
A．利用PCR扩增DNA时反应体系中应加入4种dNTP、Taq DNA聚合酶和2个引物
B．若检测结果为图乙中的a，则该胎儿为镰状细胞贫血患者
C．将荧光标记序列变长，图乙中的c中两个DNA条带间的距离基本不变
D．用限制酶Mst Ⅱ处理DNA不充分，可能把携带者误判为正常人
解析：PCR扩增的原理是DNA复制，需要原料和酶等，所以反应体系中应加入4种dNTP、TaqDNA聚合酶、含Mg2+的缓冲液以及2对引物若干，而不是2个引物，A错误。据图可知，正常血红蛋白基因(HbA)中含有MstⅡ限制酶的酶切位点，而异常血红蛋白基因(Hbs)中没有，限制酶MstⅡ处理扩增后的DNA，会导致正常血红蛋白基因(HbA)变短，DNA分子质量变小。出现图乙中的a DNA条带，DNA条带距离加样孔较远，说明DNA分子质量小，则表示含有正常血红蛋白基因(HbA)；出现图乙中的b DNA条带，DNA条带距离加样孔较近，说明DNA分子质量大，没有被切割，表示含有异常血红蛋白基因(Hbs)；出现图乙中的c DNA条带，表示含有Hbs和HbA，因此若某胎儿检测结果为图乙中的b，则该胎儿为镰状细胞贫血患者，B错误。凝胶电泳中，DNA分子质量越大，电泳速度越慢，因此图乙中的c中两个DNA条带间的距离与切割后DNA分子质量的大小有关，与荧光标记序列长短无关，C正确。据图可知，用MstⅡ限制酶处理DNA不充分，HbA中间位置可能没有被切割，电泳结果可能与Hbs一样，因此可能把正常人误判为携带者，D错误。

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