资源简介

阶段整合与提升(二)
概 念 导 图
主题1　基因工程中的遗传分子学基础
基因工程工具酶与体内的酶比较
(1)比较DNA酶、解旋酶、限制酶
(2)比较DNA聚合酶、逆转录酶、DNA连接酶
承前启后 基因工程的程序中涉及的遗传学分子基础
(1)在获取目的基因、构建基本的表达载体程序中，要注意联系必修2中“DNA的基本结构”内容，熟悉DNA为反向互补的双链，遵循的碱基互补配对原则及磷酸二酯键等。
(2)目的基因的检测，其实质就是在复制、转录和翻译三个水平，采用DNA分子杂交检测是否插入目的基因、采用DNA－RNA分子杂交检测是否转录出mRNA、采用抗原—抗体杂交检测是否翻译出相应蛋白质。明白了原理就能很快明确探针的选择等。
主题2　克隆动物、试管动物和转基因动物的比较
比较项目 克隆动物 试管动物 转基因动物
实例 “多莉”羊 试管牛 转基因羊
过程
概念 用核移植的方法获得的动物 用体外受精的方法获得的动物 由被转入了目的基因的受精卵发育成的动物
技术 核移植 体外受精 基因工程
遗传 特性 主要与供核个体相同 具备双亲的遗传性状 具备受精卵及被转入的目的基因两方的遗传性状　
相同点 三者均涉及早期胚胎培养、胚胎移植等技术，且移植所选胚胎一般是桑葚胚或囊胚期的胚胎
主题3　基因工程与细胞工程等的综合
实际生物工程中，往往综合了基因工程、细胞工程和胚胎工程中多种技术、方法，在整个过程中，基因工程往往属于上游技术。如在植物生物工程中，往往通过转基因技术获得重组细胞后就转入组织培养流程，最终获得转基因植株个体，也有转入细胞悬浮培养流程从而获得转基因产物，如下图所示。再如在动物生物工程中，转基因技术会与动物体细胞核移植及胚胎工程中胚胎移植等综合运用。
细胞工程中，植物体细胞杂交也会和植物组织培养结合，植物组织培养是植物生物工程中的基础操作。
对这类题目的解答，首先应仔细审题、读图，理清思路、方法，熟悉各生物工程中涉及的技术流程、理论基础、方法，了解操作流程中注意事项或其他相关细节知识，然后完成对该类问题的转化。
以微生物为主要操作对象的生物工程技术，可囊括基因工程、细胞工程、发酵技术和酶工程等方面，其中基因工程是先导，发酵技术与酶工程是基础。通过基因工程和细胞工程可以获得目标工程菌，再通过酶工程、发酵技术等为工程菌创造良好的生长、繁殖条件，进行大规模扩增培养，以获得大量的目标产物，如下图所示。
1．(安徽卷)细胞工程技术已在生物制药和物种繁育等领域得到了广泛应用。下列关于动物细胞工程的叙述，正确的是(　　)
A．从动物体内取出组织，用胰蛋白酶处理后直接培养的细胞称为传代细胞
B．将特定基因或特定蛋白导入已分化的T细胞，可将其诱导形成iPS细胞
C．将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞混合，经诱导融合的细胞即为能分泌所需抗体的细胞
D．采用胚胎分割技术克隆动物常选用桑葚胚或囊胚，因这两个时期的细胞未发生分化
2．(江苏卷)梅花鹿和马鹿杂交后代生命力强、茸质好，但自然杂交很难完成，人工授精能解决此难题。胚胎工程技术的应用可提高繁殖率，增加鹿场经济效益。下列相关叙述合理的是(　)
A．采集的精液无需固定、稀释，即可用血细胞计数板检测精子密度
B．人工授精时，采集的精液经获能处理后才能输入雌性生殖道
C．超数排卵处理时，常用含促性腺激素的促排卵剂
D．母体子宫对胚胎的免疫耐受性低下是胚胎移植的生理学基础
3．(广东卷)Solexa测序是一种将PCR与荧光检测相结合的高通量测序技术。为了确保该PCR过程中，DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的(　　)
A．1′-碱基　 B．2′-氢
C．3′-羟基　 D．5′-磷酸基团
4．(安徽卷)质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是(　　)
A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数
B．如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株
C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株
D．若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌
5．(安徽卷)植物细胞悬浮培养技术在生产中已得到应用。某兴趣小组尝试利用该技术培养胡萝卜细胞并获取番茄红素，设计了以下实验流程和培养装置(如图)，请同学们进行评议。下列评议不合理的是(　　)
　
A．实验流程中应该用果胶酶等处理愈伤组织，制备悬浮细胞
B．装置中的充气管应置于液面上方，该管可同时作为排气管
C．装置充气口需要增设无菌滤器，用于防止杂菌污染培养液
D．细胞培养需要适宜的温度，装置需增设温度监测和控制设备
6．(安徽卷)稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题：
(1)采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用________ ______ (填方法)将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是___________________。
(2)经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R-U和下游片段R-D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。如图1所示。
图1
图2
采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的______。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落_______(填序号)，出现菌落④的可能原因是____________________。
(3)内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出实验思路：
7．(安徽卷)丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域。兴趣小组在已改造的大肠杆菌中引入合成丁二醇的关键基因X，以提高丁二醇的产量。回答下列问题：
(1)扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶，原因是______________________________________________。
(2)使用BamHⅠ和SalⅠ限制酶处理质粒和X基因，连接后转化大肠杆菌，并涂布在无抗生素平板上(如图)。在此基础上，进一步筛选含目的基因菌株的实验思路是___________________________________________。
(3)研究表明，碳源和氮源的种类、浓度及其比例会影响微生物生长和发酵产物积累。如果培养基中碳源相对过多，容易使其氧化不彻底，形成较多的________，引起发酵液pH下降。兴趣小组通过单因子实验确定了木薯淀粉和酵母粉的最适浓度分别为100 g·L－1和15 g·L－1。在此基础上，设置不同浓度的木薯淀粉(90 g·L－1、100 g·L－1、110 g·L－1)和酵母粉(12 g·L－1、15 g·L－1、18 g·L－1)筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，以获得较高发酵产量，理论上应设置________(填数字)组实验(重复组不计算在内)。
(4)大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高，其原因是________。
(5)发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经________，最终获得发酵产品。
话题重组DNA技术的方案设计、流程
—— 科学思维、社会责任
(全国甲卷)接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原(一种病毒蛋白)。回答下列问题：
(1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是________。
(2)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因(目的基因)导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是________。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是_________。
(3)目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取________进行DNA分子杂交，DNA分子杂交时应使用的探针是_____________________。
(4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路：____________________。
阶段整合与提升(二)
概 念 导 图
主题1　基因工程中的遗传分子学基础
基因工程工具酶与体内的酶比较
(1)比较DNA酶、解旋酶、限制酶
(2)比较DNA聚合酶、逆转录酶、DNA连接酶
承前启后 基因工程的程序中涉及的遗传学分子基础
(1)在获取目的基因、构建基本的表达载体程序中，要注意联系必修2中“DNA的基本结构”内容，熟悉DNA为反向互补的双链，遵循的碱基互补配对原则及磷酸二酯键等。
(2)目的基因的检测，其实质就是在复制、转录和翻译三个水平，采用DNA分子杂交检测是否插入目的基因、采用DNA－RNA分子杂交检测是否转录出mRNA、采用抗原—抗体杂交检测是否翻译出相应蛋白质。明白了原理就能很快明确探针的选择等。
主题2　克隆动物、试管动物和转基因动物的比较
比较项目 克隆动物 试管动物 转基因动物
实例 “多莉”羊 试管牛 转基因羊
过程
概念 用核移植的方法获得的动物 用体外受精的方法获得的动物 由被转入了目的基因的受精卵发育成的动物
技术 核移植 体外受精 基因工程
遗传 特性 主要与供核个体相同 具备双亲的遗传性状 具备受精卵及被转入的目的基因两方的遗传性状　
相同点 三者均涉及早期胚胎培养、胚胎移植等技术，且移植所选胚胎一般是桑葚胚或囊胚期的胚胎
主题3　基因工程与细胞工程等的综合
实际生物工程中，往往综合了基因工程、细胞工程和胚胎工程中多种技术、方法，在整个过程中，基因工程往往属于上游技术。如在植物生物工程中，往往通过转基因技术获得重组细胞后就转入组织培养流程，最终获得转基因植株个体，也有转入细胞悬浮培养流程从而获得转基因产物，如下图所示。再如在动物生物工程中，转基因技术会与动物体细胞核移植及胚胎工程中胚胎移植等综合运用。
细胞工程中，植物体细胞杂交也会和植物组织培养结合，植物组织培养是植物生物工程中的基础操作。
对这类题目的解答，首先应仔细审题、读图，理清思路、方法，熟悉各生物工程中涉及的技术流程、理论基础、方法，了解操作流程中注意事项或其他相关细节知识，然后完成对该类问题的转化。
以微生物为主要操作对象的生物工程技术，可囊括基因工程、细胞工程、发酵技术和酶工程等方面，其中基因工程是先导，发酵技术与酶工程是基础。通过基因工程和细胞工程可以获得目标工程菌，再通过酶工程、发酵技术等为工程菌创造良好的生长、繁殖条件，进行大规模扩增培养，以获得大量的目标产物，如下图所示。
1．(安徽卷)细胞工程技术已在生物制药和物种繁育等领域得到了广泛应用。下列关于动物细胞工程的叙述，正确的是(　B　)
A．从动物体内取出组织，用胰蛋白酶处理后直接培养的细胞称为传代细胞
B．将特定基因或特定蛋白导入已分化的T细胞，可将其诱导形成iPS细胞
C．将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞混合，经诱导融合的细胞即为能分泌所需抗体的细胞
D．采用胚胎分割技术克隆动物常选用桑葚胚或囊胚，因这两个时期的细胞未发生分化
解析：胰蛋白酶处理后直接培养的细胞为原代细胞，A错误；将特定基因或特定蛋白(特定的转录因子如Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)导入已分化的T细胞，可将其诱导形成iPS细胞，B正确；融合细胞有具有同种核的融合细胞和杂交瘤细胞，需筛选才能获得分泌特定抗体的杂交瘤细胞，C错误；囊胚细胞已开始分化，D错误。
2．(江苏卷)梅花鹿和马鹿杂交后代生命力强、茸质好，但自然杂交很难完成，人工授精能解决此难题。胚胎工程技术的应用可提高繁殖率，增加鹿场经济效益。下列相关叙述合理的是(　C　)
A．采集的精液无需固定、稀释，即可用血细胞计数板检测精子密度
B．人工授精时，采集的精液经获能处理后才能输入雌性生殖道
C．超数排卵处理时，常用含促性腺激素的促排卵剂
D．母体子宫对胚胎的免疫耐受性低下是胚胎移植的生理学基础
解析：采集的精子需要经过稀释和固定处理，否则活动精子会影响计数准确性，A错误；人工授精时，精子在雌性生殖道内自然获能，无需提前体外处理，B错误；超数排卵通过注射促性腺激素(如FSH和LH)促进卵泡发育和排卵，C正确；胚胎移植的生理学基础是母体子宫对胚胎的免疫耐受性高，不会发生免疫排斥，D错误。
3．(广东卷)Solexa测序是一种将PCR与荧光检测相结合的高通量测序技术。为了确保该PCR过程中，DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的(　C　)
A．1′-碱基　 B．2′-氢
C．3′-羟基　 D．5′-磷酸基团
解析：已知DNA聚合酶催化延伸子链方向只能从5′→3′，原因是脱氧核苷酸的3′碳有羟基，可以结合下一个脱氧核苷酸的5′碳的磷酸基团，故为了DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的3′-羟基，使其不能结合下一个脱氧核苷酸的5′-磷酸基团，C正确。
4．(安徽卷)质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是(　C　)
A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数
B．如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株
C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株
D．若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌
解析：使用氯化钙处理大肠杆菌，可使其处于感受态，提高转化效率，即更多的大肠杆菌能吸收质粒，无论吸收的是含目的基因的重组质粒(可能形成白色菌落)还是未重组的质粒K(形成蓝色菌落)，都可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数，A正确；仅含卡那霉素的平板无法区分目的基因是否插入质粒中(无法确定β-半乳糖苷酶基因是否被破坏)，因此需进一步鉴定白色菌落是否为含目的基因的菌株，B正确；筛选平板中长出的白色菌落，可能是导入了重组质粒(含目的基因)且成功表达，但也可能是虽然导入了重组质粒但目的基因没有成功表达目标蛋白等，不能仅仅因为是白色菌落就判定为表达目标蛋白的菌株，C错误；若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌，因为自身环化的质粒K中β-半乳糖苷酶基因完整，能表达活性β-半乳糖苷酶，分解X-gal形成蓝色菌落，D正确。
5．(安徽卷)植物细胞悬浮培养技术在生产中已得到应用。某兴趣小组尝试利用该技术培养胡萝卜细胞并获取番茄红素，设计了以下实验流程和培养装置(如图)，请同学们进行评议。下列评议不合理的是(　B　)
　
A．实验流程中应该用果胶酶等处理愈伤组织，制备悬浮细胞
B．装置中的充气管应置于液面上方，该管可同时作为排气管
C．装置充气口需要增设无菌滤器，用于防止杂菌污染培养液
D．细胞培养需要适宜的温度，装置需增设温度监测和控制设备
解析：植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，欲利用愈伤组织制备悬浮细胞，可用纤维素酶和果胶酶处理愈伤组织，A正确；装置中的充气管应置于液面下方，以利于培养液中的溶氧量的增加，该管不能同时作为排气管，B错误。
6．(安徽卷)稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题：
(1)采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用__稀释涂布平板法__(填方法)将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是__分离不同条件下生长的内生放线菌__。
(2)经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R-U和下游片段R-D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。如图1所示。
图1
图2
采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的__指数级扩增__。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落__②__(填序号)，出现菌落④的可能原因是__重组质粒通过(单交换)同源重组整合到了内生放线菌的基因组中__。
(3)内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出实验思路：__设置两组培养实验：对照组在低(或常规)铁浓度的培养基上进行，实验组在高铁浓度的培养基上进行。在两组培养基的相同位置分别接种内生放线菌和稻瘟病致病菌。在相同且适宜的条件下培养一段时间后，观察并比较两组中稻瘟病致病菌菌落的生长情况(如菌落大小或抑制圈大小)。若高铁组的抑制效果明显弱于低铁组，则支持该推测__。
解析：基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用同源DNA片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的，由此可见，基因敲除可定向改变生物体的某一基因。基因敲除既可以用突变基因或其他基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。(1) 从含有多种微生物的研磨液中分离出单一菌落，并接种到选择培养基中常用的接种方法是稀释涂布平板法。使用选择培养基和不同的温度条件，目的是抑制其他杂菌的生长，分离不同条件下生长的内生放线菌。(2)PCR技术的核心原理是通过多次循环(变性、复性、延伸)，使目标DNA片段的数量以指数形式快速增加，实现体外扩增。PCR鉴定是利用引物1和引物2进行的。 在野生型菌株中，引物1和引物2之间的DNA片段长度为R－U(500 bp)＋R基因中间序列(2 000 bp)＋R－D(500 bp)＝3 000 bp，对应图2中的菌落①和③。 在成功发生双交换的R基因敲除株中，R基因中间序列(2 000 bp)被替换，引物1和引物2之间的DNA片段长度约为R－U(500 bp)＋R－D(500 bp)＝1 000 bp，对应图2中的菌落②。 菌落④的PCR产物大小约为7 000 bp。这个大小可以通过以下方式解释：发生了单交换同源重组事件。整个重组质粒(大小为3 000 bp质粒骨架＋500 bp R－U＋500 bp R－D＝4 000 bp)整合到了基因组中。整合后，引物1和引物2之间的区域长度变为原来的长度(3 000 bp)加上整个质粒的长度(4 000 bp)，即3 000＋4 000＝7 000 bp。因此，这是单交换同源重组整合的结果。(3)设置两组培养实验：一组为对照组，在常规(或低铁)浓度的培养基上进行；另一组为实验组，在添加了足量铁离子的培养基上进行。在两组培养基的相同位置分别接种内生放线菌和稻瘟病致病菌。在相同且适宜的条件下培养一段时间后，观察并比较两组中稻瘟病致病菌菌落的生长情况(如菌落大小或抑制圈大小)。预期结果与结论：如果实验组(高铁培养基)中内生放线菌对稻瘟病致病菌的抑制作用明显减弱或消失，而对照组(低铁培养基)中抑制作用明显，则说明该内生放线菌是通过竞争铁离子来抑制稻瘟病致病菌生长的。
7．(安徽卷)丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域。兴趣小组在已改造的大肠杆菌中引入合成丁二醇的关键基因X，以提高丁二醇的产量。回答下列问题：
(1)扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶，原因是__在PCR反应中，需要利用高温使DNA双链解旋，普通的DNA聚合酶在高温下会变性失活，而Taq DNA聚合酶能够耐高温，在高温条件下依然具有活性__。
(2)使用BamHⅠ和SalⅠ限制酶处理质粒和X基因，连接后转化大肠杆菌，并涂布在无抗生素平板上(如图)。在此基础上，进一步筛选含目的基因菌株的实验思路是__在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成__。
(3)研究表明，碳源和氮源的种类、浓度及其比例会影响微生物生长和发酵产物积累。如果培养基中碳源相对过多，容易使其氧化不彻底，形成较多的__乳酸或有机酸__，引起发酵液pH下降。兴趣小组通过单因子实验确定了木薯淀粉和酵母粉的最适浓度分别为100 g·L－1和15 g·L－1。在此基础上，设置不同浓度的木薯淀粉(90 g·L－1、100 g·L－1、110 g·L－1)和酵母粉(12 g·L－1、15 g·L－1、18 g·L－1)筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，以获得较高发酵产量，理论上应设置__9__(填数字)组实验(重复组不计算在内)。
(4)大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高，其原因是__大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量热量__。
(5)发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经__提取、分离、纯化__，最终获得发酵产品。
解析：(1)在PCR反应中，变性的温度需要90 ℃以上，需要利用高温使DNA双链解旋，普通的DNA聚合酶在高温下会变性失活，而Taq DNA聚合酶能够耐高温，在高温条件下依然具有活性，因此扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶。(2)据图可知，使用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ限制酶处理质粒和X基因，四环素抗性基因被破坏，氯霉素抗性基因被保留，因此能在氯霉素培养基上生存，不能在四环素培养基上生存的大肠杆菌即是含目的基因的菌株。(3)碳源是微生物生长所需的主要能量来源，而氮源则是构成细胞物质和合成蛋白质、核酸等生物大分子的基本原料。当培养基中碳源相对过多时，微生物可能会优先利用碳源进行能量代谢，而氮源的消耗相对较慢。这会导致碳源氧化不完全，形成较多的乳酸或有机酸。这些乳酸或有机酸会在溶液中解离，使发酵液的pH下降。因为要筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，木薯淀粉浓度有3种，酵母粉浓度也有3种，因此理论上应设置3×3＝9组实验。(4)大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量能量，绝大多数以热能形式释放，因此大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高。(5)发酵工程一般包括菌种的选育，扩大培养，培养基的配制、灭菌，接种，发酵，产品分离、提纯等方面，因此发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经提取、分离、纯化，最终获得发酵产品。
话题重组DNA技术的方案设计、流程
—— 科学思维、社会责任
(全国甲卷)接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原(一种病毒蛋白)。回答下列问题：
(1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是__重组乙肝疫苗成分为蛋白质，无法独立在宿主体内增殖__。
(2)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因(目的基因)导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是__筛选__。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是__RNA聚合酶__。
(3)目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取__核染色体DNA__进行DNA分子杂交，DNA分子杂交时应使用的探针是__被标记的目的基因的单链DNA片段__。
(4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路：__通过使用相应抗体，利用抗原—抗体杂交技术检测mRNA是否翻译形成蛋白质__。
解析：(1)重组乙肝疫苗的成分是乙肝病毒表面的一种病毒蛋白。蛋白质注入人体后，无法完成病毒遗传物质的复制与蛋白质的合成，无法独立增殖。(2)抗生素抗性基因作为标记基因，用于转化细胞的筛选。RNA聚合酶结合目的基因启动子并驱动转录。(3)检测的对象是目的基因是否插入染色体中，故提取酵母细胞染色体进行目的基因鉴定。基因探针是一段带有检测标记且顺序已知的与目的基因互补的核酸序列。(4)要检测目的基因是否表达，除了需要检测目的基因是否插入染色体外，还需要检查目的基因是否转录与翻译。检测是否转录，用核酸分子杂交技术，检测是否翻译，用抗原—抗体杂交技术。(共38张PPT)
第3章
阶段整合与提升(二)
基因工程
概 念 导 图
归纳拓展
主题1　基因工程中的遗传分子学基础
基因工程工具酶与体内的酶比较
(1)比较DNA酶、解旋酶、限制酶
(2)比较DNA聚合酶、逆转录酶、DNA连接酶
承前启后 基因工程的程序中涉及的遗传学分子基础
(1)在获取目的基因、构建基本的表达载体程序中，要注意联系必修2中“DNA的基本结构”内容，熟悉DNA为反向互补的双链，遵循的碱基互补配对原则及磷酸二酯键等。
(2)目的基因的检测，其实质就是在复制、转录和翻译三个水平，采用DNA分子杂交检测是否插入目的基因、采用DNA－RNA分子杂交检测是否转录出mRNA、采用抗原—抗体杂交检测是否翻译出相应蛋白质。明白了原理就能很快明确探针的选择等。
主题2　克隆动物、试管动物和转基因动物的比较
比较项目 克隆动物 试管动物 转基因动物
实例 “多莉”羊 试管牛 转基因羊
过程



比较项目 克隆动物 试管动物 转基因动物
概念 用核移植的方法获得的动物 用体外受精的方法获得的动物 由被转入了目的基因的受精卵发育成的动物
技术 核移植 体外受精 基因工程
遗传 特性 主要与供核个体相同 具备双亲的遗传性状 具备受精卵及被转入的目的基因两方的遗传性状　
相同点 三者均涉及早期胚胎培养、胚胎移植等技术，且移植所选胚胎一般是桑葚胚或囊胚期的胚胎 主题3　基因工程与细胞工程等的综合
实际生物工程中，往往综合了基因工程、细胞工程和胚胎工程中多种技术、方法，在整个过程中，基因工程往往属于上游技术。如在植物生物工程中，往往通过转基因技术获得重组细胞后就转入组织培养流程，最终获得转基因植株个体，也有转入细胞悬浮培养流程从而获得转基因产物，如下图所示。再如在动物生物工程中，转基因技术会与动物体细胞核移植及胚胎工程中胚胎移植等综合运用。
细胞工程中，植物体细胞杂交也会和植物组织培养结合，植物组织培养是植物生物工程中的基础操作。
对这类题目的解答，首先应仔细审题、读图，理清思路、方法，熟悉各生物工程中涉及的技术流程、理论基础、方法，了解操作流程中注意事项或其他相关细节知识，然后完成对该类问题的转化。
以微生物为主要操作对象的生物工程技术，可囊括基因工程、细胞工程、发酵技术和酶工程等方面，其中基因工程是先导，发酵技术与酶工程是基础。通过基因工程和细胞工程可以获得目标工程菌，再通过酶工程、发酵技术等为工程菌创造良好的生长、繁殖条件，进行大规模扩增培养，以获得大量的目标产物，如下图所示。
体验高考
1．(安徽卷)细胞工程技术已在生物制药和物种繁育等领域得到了广泛应用。下列关于动物细胞工程的叙述，正确的是 (　　)
A．从动物体内取出组织，用胰蛋白酶处理后直接培养的细胞称为传代细胞
B．将特定基因或特定蛋白导入已分化的T细胞，可将其诱导形成iPS细胞
C．将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞混合，经诱导融合的细胞即为能分泌所需抗体的细胞
D．采用胚胎分割技术克隆动物常选用桑葚胚或囊胚，因这两个时期的细胞未发生分化
B
解析：胰蛋白酶处理后直接培养的细胞为原代细胞，A错误；将特定基因或特定蛋白(特定的转录因子如Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)导入已分化的T细胞，可将其诱导形成iPS细胞，B正确；融合细胞有具有同种核的融合细胞和杂交瘤细胞，需筛选才能获得分泌特定抗体的杂交瘤细胞，C错误；囊胚细胞已开始分化，D错误。
2．(江苏卷)梅花鹿和马鹿杂交后代生命力强、茸质好，但自然杂交很难完成，人工授精能解决此难题。胚胎工程技术的应用可提高繁殖率，增加鹿场经济效益。下列相关叙述合理的是 (　　)
A．采集的精液无需固定、稀释，即可用血细胞计数板检测精子密度
B．人工授精时，采集的精液经获能处理后才能输入雌性生殖道
C．超数排卵处理时，常用含促性腺激素的促排卵剂
D．母体子宫对胚胎的免疫耐受性低下是胚胎移植的生理学基础
C
解析：采集的精子需要经过稀释和固定处理，否则活动精子会影响计数准确性，A错误；人工授精时，精子在雌性生殖道内自然获能，无需提前体外处理，B错误；超数排卵通过注射促性腺激素(如FSH和LH)促进卵泡发育和排卵，C正确；胚胎移植的生理学基础是母体子宫对胚胎的免疫耐受性高，不会发生免疫排斥，D错误。
3．(广东卷)Solexa测序是一种将PCR与荧光检测相结合的高通量测序技术。为了确保该PCR过程中，DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的 (　　)
A．1′-碱基　 B．2′-氢
C．3′-羟基　 D．5′-磷酸基团
C
解析：已知DNA聚合酶催化延伸子链方向只能从5′→3′，原因是脱氧核苷酸的3′碳有羟基，可以结合下一个脱氧核苷酸的5′碳的磷酸基团，故为了DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的3′-羟基，使其不能结合下一个脱氧核苷酸的5′-磷酸基团，C正确。
4．(安徽卷)质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。
下列叙述错误的是 (　　)
A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数
B．如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株
C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株
D．若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌
C
解析：使用氯化钙处理大肠杆菌，可使其处于感受态，提高转化效率，即更多的大肠杆菌能吸收质粒，无论吸收的是含目的基因的重组质粒(可能形成白色菌落)还是未重组的质粒K(形成蓝色菌落)，都可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数，A正确；仅含卡那霉素的平板无法区分目的基因是否插入质粒中(无法确定β-半乳糖苷酶基因是否被破坏)，因此需进一步鉴定白色菌落是否为含目的基因的菌株，B正确；筛选平板中长出的白色菌落，可能是导入了重组质粒(含目的基因)且成功表达，但也可能是虽然导入了重组质粒但目的基因没有成功表达目标蛋白等，不能仅仅因为是白色菌落就判定为表达目标蛋白的菌株，C错误；若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌，因为自身环化的质粒K中β-半乳糖苷酶基因完整，能表达活性β-半乳糖苷酶，分解X-gal形成蓝色菌落，D正确。
5．(安徽卷)植物细胞悬浮培养技术在生产中已得到应用。某兴趣小组尝试利用该技术培养胡萝卜细胞并获取番茄红素，设计了以下实验流程和培养装置(如图)，请同学们进行评议。下列评议不合理的是　 (　　)
A．实验流程中应该用果胶酶等处理愈伤组织，制备悬浮细胞
B．装置中的充气管应置于液面上方，该管可同时作为排气管
C．装置充气口需要增设无菌滤器，用于防止杂菌污染培养液
D．细胞培养需要适宜的温度，装置需增设温度监测和控制设备
B
解析：植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，欲利用愈伤组织制备悬浮细胞，可用纤维素酶和果胶酶处理愈伤组织，A正确；装置中的充气管应置于液面下方，以利于培养液中的溶氧量的增加，该管不能同时作为排气管，B错误。
6．(安徽卷)稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题：
(1)采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用__________________(填方法)将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是__________________________________。
稀释涂布平板法
分离不同条件下生长的内生放线菌
(2)经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R-U和下游片段R-D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。如图1所示。
图1
采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的_________ _____。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落_____ (填序号)，出现菌落④的可能原因是____________________________________________________________。
图2
指数级扩增
②
重组质粒通过(单交换)同源重组整合到了内生放线菌的基因组中
(3)内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出实验思路：__________________________________________________ __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
设置两组培养实验：对照组在低(或常规)铁浓度的培养基上进行，实验组在高铁浓度的培养基上进行。在两组培养基的相同位置分别接种内生放线菌和稻瘟病致病菌。在相同且适宜的条件下培养一段时间后，观察并比较两组中稻瘟病致病菌菌落的生长情况(如菌落大小或抑制圈大小)。若高铁组的抑制效果明显弱于低铁组，则支持该推测
解析：基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用同源DNA片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的，由此可见，基因敲除可定向改变生物体的某一基因。基因敲除既可以用突变基因或其他基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。(1) 从含有多种微生物的研磨液中分离出单一菌落，并接种到选择培养基中常用的接种方法是稀释涂布平板法。使用选择培养基和不同的温度条件，目的是抑制其他杂菌的生长，分离不同条件下生长的内生放线菌。(2)PCR技术的核心原理是通过多次循环(变性、复性、延伸)，使目标DNA片段的数量以指数形式快速增加，实现体外扩增。PCR鉴定是利用引物1和引物2进行的。 在野生型菌株中，引物1和引物2之间的DNA片段长度为R－U(500 bp)＋R基因中间序列(2 000 bp)＋R－D(500 bp)＝3 000 bp，对应图2中的菌落①和③。
在成功发生双交换的R基因敲除株中，R基因中间序列(2 000 bp)被替换，引物1和引物2之间的DNA片段长度约为R－U(500 bp)＋R－D(500 bp)＝1 000 bp，对应图2中的菌落②。 菌落④的PCR产物大小约为7 000 bp。这个大小可以通过以下方式解释：发生了单交换同源重组事件。整个重组质粒(大小为3 000 bp质粒骨架＋500 bp R－U＋500 bp R－D＝4 000 bp)整合到了基因组中。整合后，引物1和引物2之间的区域长度变为原来的长度(3 000 bp)加上整个质粒的长度(4 000 bp)，即3 000＋4 000＝7 000 bp。因此，这是单交换同源重组整合的结果。
(3)设置两组培养实验：一组为对照组，在常规(或低铁)浓度的培养基上进行；另一组为实验组，在添加了足量铁离子的培养基上进行。在两组培养基的相同位置分别接种内生放线菌和稻瘟病致病菌。在相同且适宜的条件下培养一段时间后，观察并比较两组中稻瘟病致病菌菌落的生长情况(如菌落大小或抑制圈大小)。预期结果与结论：如果实验组(高铁培养基)中内生放线菌对稻瘟病致病菌的抑制作用明显减弱或消失，而对照组(低铁培养基)中抑制作用明显，则说明该内生放线菌是通过竞争铁离子来抑制稻瘟病致病菌生长的。
7．(安徽卷)丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域。兴趣小组在已改造的大肠杆菌中引入合成丁二醇的关键基因X，以提高丁二醇的产量。回答下列问题：
(1)扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶，原因是_________ __________________________________________________________________________________________________________________________________。
在PCR反应中，需要利用高温使DNA双链解旋，普通的DNA聚合酶在高温下会变性失活，而Taq DNA聚合酶能够耐高温，在高温条件下依然具有活性
(2)使用BamHⅠ和SalⅠ限制酶处理质粒和X基因，连接后转化大肠杆菌，并涂布在无抗生素平板上(如图)。在此基础上，进一步筛选含目的基因菌株的实验思路是________________ _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成
(3)研究表明，碳源和氮源的种类、浓度及其比例会影响微生物生长和发酵产物积累。如果培养基中碳源相对过多，容易使其氧化不彻底，形成较多的___________ _____，引起发酵液pH下降。兴趣小组通过单因子实验确定了木薯淀粉和酵母粉的最适浓度分别为100 g·L－1和15 g·L－1。在此基础上，设置不同浓度的木薯淀粉(90 g·L－1、100 g·L－1、110 g·L－1)和酵母粉(12 g·L－1、15 g·L－1、18 g·L－1)筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，以获得较高发酵产量，理论上应设置_____(填数字)组实验(重复组不计算在内)。
(4)大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高，其原因是____________ _____________________________。
(5)发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经___________________，最终获得发酵产品。
乳酸或有
机酸
9
大肠杆菌进
行细胞呼吸时会释放大量热量
提取、分离、纯化
解析：(1)在PCR反应中，变性的温度需要90 ℃以上，需要利用高温使DNA双链解旋，普通的DNA聚合酶在高温下会变性失活，而Taq DNA聚合酶能够耐高温，在高温条件下依然具有活性，因此扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶。(2)据图可知，使用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ限制酶处理质粒和X基因，四环素抗性基因被破坏，氯霉素抗性基因被保留，因此能在氯霉素培养基上生存，不能在四环素培养基上生存的大肠杆菌即是含目的基因的菌株。
(3)碳源是微生物生长所需的主要能量来源，而氮源则是构成细胞物质和合成蛋白质、核酸等生物大分子的基本原料。当培养基中碳源相对过多时，微生物可能会优先利用碳源进行能量代谢，而氮源的消耗相对较慢。这会导致碳源氧化不完全，形成较多的乳酸或有机酸。这些乳酸或有机酸会在溶液中解离，使发酵液的pH下降。因为要筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，木薯淀粉浓度有3种，酵母粉浓度也有3种，因此理论上应设置3×3＝9组实验。(4)大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量能量，绝大多数以热能形式释放，因此大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高。(5)发酵工程一般包括菌种的选育，扩大培养，培养基的配制、灭菌，接种，发酵，产品分离、提纯等方面，因此发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经提取、分离、纯化，最终获得发酵产品。

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