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第3章　基因工程
第1节　重组DNA技术的基本工具
1．(教材P67)基因工程的概念
(1)手段：通过__________等技术，赋予生物新的遗传特性。
(2)目的：按照人们的愿望，创造出更符合人们需要的新的__________和__________。
(3)设计和施工水平：__________水平。
2．基因工程的基本操作工具
(1)(教材P71)限制性内切核酸酶(又称“__________”)——“分子手术刀”
①来源：主要从__________中分离纯化出来。
②种类：数千种。
③作用：识别双链DNA分子的______________，并使每一条链中特定部位的________________断开。
④结果：产生__________或平末端。
(2)(教材P72)______________——“分子缝合针”
种类 来源 特点 结果
E.coli DNA 连接酶 大肠 杆菌 两者既可以“缝合”双链DNA片段互补的①__________，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端；但E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远②__________T4 DNA连接酶 将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被③__________切开的两个核苷酸之间的④__________
T4 DNA 连接酶 T4噬 菌体
(3)(教材P72～73)基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
①作用：将__________送入受体细胞中。
②常用种类：质粒、__________、动植物病毒等。
③质粒：是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞________之外，并具有________能力的环状____________。
④作为基因的载体的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差别。
3．(教材P74～75)实验：DNA的粗提取与鉴定
(1)实验原理
①提取DNA的原理：利用DNA与__________________等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
②DNA的溶解性：________不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于________mol·L-1的NaCl溶液。
③DNA鉴定的原理：在一定温度下，DNA遇____________试剂会呈现________。
(2)方法步骤
步骤 操作
取材 称取约30 g洋葱并切碎
破碎细胞，获取含 DNA的________ 充分研磨，过滤后收集滤液，在4 ℃冰箱预冷后取上清液或将滤液离心后再取上清液
DNA的析出 向上清液中加入__________________________的酒精溶液，静置2～3 min，出现____________，并用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物
DNA的鉴定 将白色丝状物溶解于5 mL物质的量浓度为________的NaCl溶液中，再加入4 mL的________试剂，________中加热5 min。冷却后观察溶液的颜色，同时设计不含DNA的NaCl溶液作为对照
第2节　基因工程的基本操作程序
1．(教材P76)基因工程四步骤：________________、______________________、将目的基因导入________、目的基因的___________________________________ _____________________________________。
2．(教材P76～79)目的基因的筛选与获取
(1)目的基因
①概念：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。
②类型：根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指__________________的基因，如与生物抗逆性、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
(2)筛选合适的目的基因
①方法：从相关的________和________的基因中筛选。
②随着测序技术的发展，以及________________、________________等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，这也为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。
(3)利用PCR获取和扩增目的基因
①PCR的含义：PCR是__________________的缩写，它是一项根据____________的原理，在________提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的____________进行大量复制的技术。
②条件
参与的组分 在DNA复制中的作用
90 ℃以上高温(代替解旋酶) 打开DNA双链
DNA母链 提供DNA复制的________
4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料
________的DNA聚合酶 催化合成DNA子链
引物 使__________能够从引物的3′端 开始连接__________
缓冲溶液(含Mg2+) 维持溶液pH的相对稳定
③过程
变性：温度上升到________ ℃以上，目的基因DNA受热变性后解聚为单链。
↓
复性：温度下降到________ ℃左右时，两种引物通过__________________与两条单链DNA结合。
↓
延伸：温度上升到________℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下加到引物的________端合成子链。
第一轮循环的产物作为第二轮反应的________，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物。
第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过________________________ ___________________________________________三步产生第三轮循环的产物。
④结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，即成____________形式扩增(约为2n)。
⑤反应场所及产物检测：上述过程可以在PCR扩增仪(PCR仪)中自动完成，完成以后，常采用__________________来鉴定PCR的产物。
(4)还可以通过构建__________获取目的基因。
3．(教材P80正文及“图3 6”)基因表达载体的构建(核心工作)
(1)构建基因表达载体的目的
①使目的基因在受体细胞中________，并且可以遗传给下一代。
②使目的基因能够________和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成：________、________、启动子和终止子等。
①启动子：是一段有特殊序列结构的____________，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是__________________的部位，有了它才可以驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。有时需要人工构建诱导型启动子。
②终止子：是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于____________，使转录在所需要的地方停下来。
(3)基因表达载体的构建过程
4．(教材P80～81正文及“资料卡”)将目的基因导入受体细胞
(1)转化：________进入受体细胞内，并在受体细胞内维持__________________的过程。
(2)目的基因导入受体细胞的方法
受体细胞 方法
植物细胞 ____________法(常用)
花粉管通道法(我国独创)
________细胞 显微注射技术
微生物细胞 ________处理法(感受态细胞法)
(3)农杆菌细胞中含有Ti质粒，Ti质粒的________(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其__________________________________________。
5．(教材P82)目的基因的检测与鉴定
(1)目的：检查目的基因进入受体细胞后，是否__________________和表达其遗传特性；检查转基因生物是否培育成功。
(2)方法
①分子水平检测：通过________等技术检测目的基因是否插入受体细胞染色体DNA上或是否转录出mRNA；通过____________杂交，检测目的基因是否翻译出蛋白质。
②个体生物学水平鉴定：观察是否出现相应性状。
6．(教材P84～85)实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理。PCR利用了DNA的________原理，通过________来控制__________________________，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历________次循环。
(2)DNA片段电泳鉴定的原理
①DNA分子具有________________，在一定的pH下，这些基团可以带上______________。在________的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷________的电极移动，这个过程就是________。
②PCR的产物一般通过__________________来鉴定。
③在凝胶中DNA分子的迁移速率与____________、DNA分子的____________等有关。
④凝胶中的DNA分子通过____________，可以在波长为300 nm的________下被检测出来。
(3)DNA片段的扩增步骤
循环程序 变性 复性 延伸
________ 94 ℃，5 min — —
30次 94 ℃，30 s 55 ℃，30 s 72 ℃，1 min
最后一次 94 ℃，1 min 55 ℃，30 s 72 ℃，10 min
(4)DNA片段的电泳鉴定步骤
第3节　基因工程的应用
1．(教材P87～89)基因工程在农牧业方面的应用
(1)基因工程在农牧业方面的应用概述
①美国是世界上转基因作物种植面积最大的国家。转基因棉花、大豆、玉米的种植面积占相关作物种植面积的比例都超过了90%。
②2015年11月，第一种用于食用的转基因动物——转基因大西洋鲑在美国获得批准上市。
(2)基因工程在农牧业方面的应用
可以培育转基因__________________植物；还可以改良植物品质，如培育富含________的转基因玉米；提高动物的________和改善__________________。
2．(教材P90正文及“资料卡”)基因工程在医药卫生领域的应用
(1)对微生物或动植物的细胞进行________，使它们能够生产药物，是目前基因工程取得实际应用成果非常多的领域。这些药物包括细胞因子、抗体、疫苗和激素等。
(2)乳腺生物反应器(乳房生物反应器)：科学家将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的________等调控元件重组在一起，通过显微注射的方法导入哺乳动物的________中，发育成的转基因动物在进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁来生产所需要的药物。
3．(教材P91)基因工程在食品工业方面的应用
(1)科学家将编码牛________的基因导入大肠杆菌、黑曲霉或酵母菌的基因组中，再通过工业发酵批量生产凝乳酶。
(2)加工转化糖浆需要的淀粉酶，加工烘烤食品要用到的脂肪酶等也都可以通过构建______________，然后用发酵技术大量生产。
(3)(教材P91“相关信息”)基因工程菌：用________的方法，使________得到高效表达的菌类。
第4节　蛋白质工程的原理和应用
1．(教材P93)蛋白质工程崛起的缘由
(1)基因工程的实质：将一种生物的________转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的________，进而表现出________。
(2)基因工程的不足：基因工程在原则上只能生产自然界中________的蛋白质。
(3)天然蛋白质的不足：天然蛋白质的结构和功能符合________生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。
2．(教材P93～94)蛋白质工程的概念
对蛋白质分子的设计和改造是通过________工程来实现的。蛋白质工程是指以蛋白质分子的____________________________________作为基础，通过改造或合成________，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
实例：玉米中赖氨酸含量低，将赖氨酸合成过程中两种酶的氨基酸________(填“敲除”或“替换”)，可以使玉米叶片和种子中游离赖氨酸分别提高了5倍和2倍。
3．(教材P94)蛋白质工程的基本原理
(1)基本原理：中心法则逆推，由预期的蛋白质找到相对应的________________。
(2)基本思路：预期的蛋白质功能→设计预期的____________→推测应有的________序列→找到并改变相对应的____________序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。
4．(教材P95)蛋白质工程的应用
(1)在医药工业方面对天然蛋白质进行改造。
(2)蛋白质工程被广泛用于改进酶的________或开发新的工业用酶。例如利用蛋白质工程生产枯草杆菌蛋白酶。
(3)在农业方面，科学家正在尝试改造某些参与调控光合作用的酶，以提高植物光合作用的效率，增加粮食的产量。
(4)利用蛋白质工程的思路来设计优良的________农药，通过改造微生物蛋白质的结构，使它防治病虫害的效果增强。
(5)蛋白质工程是一项难度很大的工程，主要是因为蛋白质发挥功能必须依赖于正确的________结构，而这结构往往十分________。
第3章　基因工程
第1节　重组DNA技术的基本工具
1．(1)转基因　(2)生物类型　生物产品　(3)DNA分子
2．(1)限制酶　①原核生物　③特定核苷酸序列　磷酸二酯键　④黏性末端
(2)DNA连接酶　①黏性末端　②低于　③限制酶　④磷酸二酯键　(3)①目的基因　②噬菌体　③拟核DNA　自我复制　双链DNA分子
3．(1)①RNA、蛋白质和脂质　②DNA
2　③二苯胺　蓝色　(2)上清液　等体积的、预冷的体积分数为95%　白色丝状物　2 mol·L-1　二苯胺　沸水浴
第2节　基因工程的基本操作程序
1．目的基因的筛选与获取　基因表达载体的构建　受体细胞　检测与鉴定
2．(1)②编码蛋白质　(2)①已知结构　功能清晰　②序列数据库　序列比对工具　(3)①聚合酶链式反应　DNA半保留复制　体外　核苷酸序列　②模板
耐高温　DNA聚合酶　脱氧核苷酸
③90　50　碱基互补配对　72　3′
模板　变性、复性和延伸　④指数
⑤琼脂糖凝胶电泳　(4)基因文库
3．(1)①稳定存在　②表达　(2)目的基因　标记基因　①DNA片段　RNA聚合酶识别和结合　②基因的下游　(3)同一种　DNA连接酶
4．(1)目的基因　稳定和表达　(2)农杆菌转化　动物　Ca2+　(3)T DNA
整合到该细胞的染色体DNA上
5．(1)稳定维持　(2)①PCR　抗原—抗体
6．(1)热变性　调节温度　DNA双链的解聚与结合　30　(2)①可解离的基团　正电荷或负电荷　电场　相反　电泳　②琼脂糖凝胶电泳　③凝胶的浓度　大小和构象　④染色　紫外灯
(3)微量离心管　集中在管的底部　PCR仪　预变性　(4)沸水浴或微波炉内　核酸染料　温热　加样孔　没过凝胶1 mm　凝胶载样缓冲液　一个加样孔　阳极至阴极之间的距离　指示剂前沿迁移接近凝胶边缘　紫外灯下
第3节　基因工程的应用
1．(2)抗虫、抗病、抗除草剂　赖氨酸　生长速率　畜产品的品质
2．(1)基因改造　(2)启动子　受精卵
3．(1)凝乳酶　(2)基因工程菌　(3)基因工程　外源基因
第4节　蛋白质工程的原理和应用
1．(1)基因　蛋白质　新的性状　(2)已存在　(3)特定物种
2．蛋白质　结构规律及其与生物功能的关系　基因　替换
3．(1)脱氧核苷酸序列(基因)　(2)蛋白质结构　氨基酸　脱氧核苷酸
4．(2)性能　(4)微生物　(5)高级　复杂

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