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单元检测十　生物技术与工程
一、选择题(本题共15小题，每小题2分，共30分。每小题只有一个选项符合题目要求)
1．(2025·大同三模)发酵食品的制作离不开微生物。下列叙述正确的是(　　)
A．泡菜制作过程中，乳酸菌经细胞呼吸产生的气体会使坛盖边缘冒出气泡
B．豆腐中的蛋白质可被多种微生物产生的蛋白酶分解成小分子肽和氨基酸
C．家庭制作葡萄酒时，发酵前应对原材料进行灭菌处理
D．制作葡萄酒和泡菜所利用的主要微生物都含有细胞核
2．河南作为中华酒文化重要发源地，其传统酿酒技艺遵循“春曲夏酿，秋收冬藏”的时序规律。其中“春曲”指春季制作酒曲，富含霉菌和酵母菌；“夏酿”指夏季将蒸熟的米与曲混合，先置于敞口陶罐中数日，后密封发酵；“冬藏”指冬季将酒液密封于陶瓮，埋入深窖保存。下列叙述错误的是(　　)
A．制作“春曲”时需要提供适宜温度促进微生物的有氧呼吸
B．“夏酿”初期，敞口处理有利于霉菌的繁殖，促进淀粉分解
C．密封后陶罐中的酵母菌在线粒体基质中产生酒精和CO2
D．“冬藏”的低温环境能抑制微生物活动，延长酒液保存时间
3．某研究小组欲从碱性湖泥中分离获得耐碱细菌，对湖泥进行梯度稀释后接种到培养基A(pH＝9的基础培养基)上，实验流程如图，并对纯化后的菌种进行穿刺培养，观察其生长情况。下列叙述正确的是(　　)
A．若0.2 mL菌液经1号试管的稀释倍数与定容时相同，则y为1.8
B．可在A中加入酚红，挑选被染成红色的菌落，从而分离耐碱细菌
C．可将A中获得的耐碱细菌接种到pH＝7的固体培养基上进行扩大培养
D．进行图示纯化培养和穿刺培养时，接种环和接种针应在酒精灯火焰上灼烧灭菌
4.刚果红可与纤维素形成红色复合物，某同学以纤维素为唯一碳源制作的培养基中添加了刚果红，然后用如图的方法进行接种纤维素分解菌，下列叙述正确的是(　　)
A．该接种方法既能分离提纯微生物，还能对微生物进行计数
B．从用途的角度分，该培养基既是选择培养基，又是鉴别培养基
C．该过程中需对接种环进行灼烧灭菌，且灭菌次数为4次
D．划线区域形成的菌落周围显红色，且红色区域直径越大，说明纤维素分解菌的分解能力越强
5．(2025·河北，13)生物工程在社会生产中的应用日益广泛，下列关于相关技术和方法的叙述，错误的是(　　)
A．利用组织培养技术实现兰花的快速繁殖和优良性状的保持
B．在没有CO2的有氧环境中进行胚胎干细胞的培养
C．利用灭活的病毒诱导B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合
D．对供体母牛注射促性腺激素促使其超数排卵用于胚胎的制备
6．科研人员取胡萝卜部分韧皮部，放入含有植物激素、无机盐和糖类等物质的培养基中培养，最终长成了一株新的植株，如图所示，①～⑥表示过程。下列叙述错误的是(　　)
A．①所取的韧皮部组织要进行严格灭菌，防止杂菌污染
B．②为脱分化，使已分化的细胞失去其特有的结构和功能
C．经②③形成不定形的薄壁组织团块，该过程一般不需要光
D．生长素与细胞分裂素的使用比例会影响细胞的发育方向
7．(2025·阿拉善盟一模)紫杉醇是一种重要的抗癌药物，主要来源于红豆杉属植物。为了提高紫杉醇的产量，研究人员利用植物细胞培养技术进行生产，部分流程如图。下列叙述正确的是(　　)
A．植物激素的种类、浓度和比例等会影响过程①
B．生产过程中需要对外植体进行彻底的灭菌处理
C．紫杉醇在细胞内大量积累有利于提高其产量
D．该生产过程利用的原理是植物细胞的全能性
8．研究显示，为患有糖尿病的猴子移植由诱导多能干细胞(iPS细胞)增殖分化形成的胰岛，成功地降低了猴子的血糖水平。iPS细胞是利用皮肤细胞等体细胞经诱导因子(导入胚胎发育相关的特异性基因)处理后转化而成的，其功能和胚胎干细胞类似，能分化成多组织和器官。下列叙述错误的是(　　)
A．制备iPS细胞也可以直接将特定蛋白导入细胞中或用小分子化合物等来诱导
B．题述皮肤细胞等体细胞经诱导转化为iPS细胞的过程中遗传信息发生了改变
C．皮肤细胞经诱导因子处理后形成iPS细胞的过程体现了动物细胞的全能性
D．由于iPS细胞可由病人体细胞诱导转化而来，因此该方法可以避免免疫排斥反应
9．某研究团队运用基因编辑技术，针对小鼠卵母细胞实施了DNA甲基化重写操作，随后将一个极体注入经修饰的次级卵母细胞中，成功培育出孤雌小鼠，具体操作流程如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A．甲基化重写没有改变卵母细胞的遗传信息，属于不可遗传的变异
B．体外培养卵母细胞时，需要在95%O2和5%CO2的气体环境中培养
C．移植的囊胚进一步扩大，导致滋养层破裂，胚胎从其中伸展出来
D．孤雌小鼠一定为雌性，基因型不一定与提供卵母细胞的雌鼠相同
10．(2026·遂宁开学考)如图是几种不同限制性内切核酸酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述正确的是(　　)
A．切割产生①片段的限制酶识别序列由5个碱基对构成
B．限制酶只存在于原核生物，作用的化学键为磷酸二酯键和氢键
C．两个③片段连接形成重组DNA时，E.coli DNA连接酶催化效率更高
D．上述能进行连接的两个黏性末端，其连接后形成的DNA分子是
11．(2025·赤峰模拟)几种限制酶的识别序列和切割位点如表所示。下列叙述正确的是(　　)
限制酶 识别序列和切割位点
BamHⅠ 5′－G↓GATCC－3′
Sau3AⅠ 5′－↓GATC－3′
Acc65Ⅰ 5′－G↓GTACC－3′
A.3种限制酶切割形成的末端中，既有黏性末端又有平末端
B．经Acc65Ⅰ酶切后得到的黏性末端序列为5′－GTAC－3′
C．能用Sau3AⅠ酶切的DNA序列亦可被BamHⅠ酶切
D．目的基因和质粒分别用BamHⅠ和Sau3AⅠ酶切后，用DNA连接酶连接形成的重组质粒可被BamHⅠ酶切
12．下列关于“DNA的粗提取与鉴定实验”的叙述，正确的是(　　)
A．丝状物的粗细表示一个DNA分子直径的大小
B．用不同浓度的NaCl溶液进行DNA粗提取，原因是DNA不溶于NaCl溶液
C．搅拌时用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌，以保证DNA分子完整
D．用二苯胺试剂进行鉴定，原因是DNA溶液中加入二苯胺试剂即呈蓝色
13．检测甲流病毒(遗传物质为RNA)最常见的方法是实时荧光定量PCR，原理是在PCR反应体系中加入与某条模板链片段互补的荧光探针，其两端有荧光分子(R)和淬灭剂(Q)。当探针完整时，R不发出荧光，否则R发出荧光，具体过程见图。下列叙述正确的有几项(　　)
①该PCR扩增是直接以甲流病毒的遗传物质作为模板进行的
②此荧光探针是以甲流病毒遗传物质序列合成的短DNA单链，本身不发出荧光
③耐高温的DNA聚合酶可能还有水解荧光探针的作用，使R发出荧光
④检测到的荧光强度与反应体系中扩增出的DNA分子数成正比
A．3项 B．2项 C．1项 D．0项
14．SLPI蛋白是免疫应答的重要调节因子。通过基因工程技术，利用大肠杆菌表达系统表达的猪源SLPI蛋白，制备可稳定分泌抗SLPI单克隆抗体的杂交瘤细胞。利用该单克隆抗体以研究相关病原体的致病机理。下列关于此实验的叙述，正确的是(　　)
A．工程菌生产的SLPI蛋白是单细胞蛋白
B．PEG可介导甲细胞和乙细胞特异性融合
C．所有融合细胞均可在HAT培养基中生长
D．SLPI蛋白可参与到图中过程①和过程④
15．研究机构培育某新型转基因玉米，该玉米能高效合成一种蛋白酶抑制剂，让取食它的害虫的消化酶受抑制，导致害虫无法消化食物而死亡。但转基因食品是民众普遍不愿意接受的，请结合资料分析下列阐述，不具有科学性的是(　　)
A．该玉米不安全，其含有的蛋白酶抑制剂，使人食用后无法消化食物
B．该玉米不安全，蛋白酶抑制剂基因被人体摄食后，可在人的细胞内表达
C．该玉米安全，因为人与害虫消化酶的结构存在差异，蛋白酶抑制剂对人可能无影响
D．该玉米安全，人类通常食用煮熟的玉米，蛋白酶抑制剂已被高温破坏
二、选择题(本题共5小题，每小题3分，共15分。每小题有一个或多个选项符合题目要求，全部选对得3分，选对但不全的得1分，有选错的得0分)
16．谷氨酸棒状杆菌生长的最适pH为7.0，通过如图代谢途径发酵生产L－谷氨酰胺。下列叙述正确的是(　　)
A．提高谷氨酸脱氢酶和谷氨酸合成酶的活性有利于提高L－谷氨酰胺产量
B．发酵初期控制pH为7.0，后调为5.6，有利于提高L－谷氨酰胺产量
C．利用谷氨酸棒状杆菌进行发酵，其中心环节是发酵罐内发酵
D．发酵结束后，采用过滤、沉淀的方法将菌体分离和干燥即可获得产品
17．科研人员在开发成分明确的无血清培养基方面取得进展，提高了干细胞产品稳定性与安全性；同时利用重组蛋白和小分子化合物精细调节培养环境，提升了干细胞增殖效率和稳定性；此外，机器学习在诱导多能干细胞培养中的应用逐渐深入，可预测分化路径、优化诱导条件，AI驱动的自动化培养系统上线，有效提升了分化效率。下列叙述错误的是(　　)
A．干细胞移植到患者体内可以分化为任何一种类型的细胞
B．使用无血清培养基的前提是明确细胞生长、增殖所需的生长因子等成分
C．自动化的移液换液可以减少细胞代谢物的积累对细胞自身造成的危害
D．除重组蛋白和小分子化合物外，外源基因也可以诱导多能干细胞
18．(2025·鞍山二模)免疫PCR是对微量抗原的一种检测方法。如图是利用该技术检测牛乳中微量抗生素的流程：首先将抗体1固定在微板上，冲洗后加入待检的牛乳，再加入DNA标记的抗体2，进行PCR扩增，最后进行电泳检测，下列叙述正确的是(　　)
A．图中抗原检测过程发生两次抗原与抗体的结合
B．图中标记抗体2的DNA一般是牛细胞中的DNA片段
C．题图过程中三次冲洗的目的均不同
D．免疫PCR技术间接放大了微量抗生素，以达到可检测水平
19．(2025·吉安一模)将马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因Pin－Ⅱ导入杨树细胞，培育抗虫杨树。如图表示利用含目的基因的DNA分子和Ti质粒构建基因表达载体的过程，图中AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，NeoR表示新霉素抗性基因，箭头表示限制酶的酶切位点，相关酶的识别序列如表所示。下列叙述正确的是(　　)
A．利用PCR扩增目的基因时，应该选择引物2和引物3并在引物5′端添加相应酶切位点
B．为使目的基因与质粒高效重组，选用KpnⅠ和HindⅢ比选用KpnⅠ和SmaⅠ效果更好
C．为将表达载体导入农杆菌，可以使用离心法或PEG融合法处理农杆菌细胞
D．成功导入目的基因的杨树细胞既具有氨苄青霉素抗性，又有新霉素抗性
20．(2025·青岛期中)密码子偏好性是指在生物体中，编码相同氨基酸的不同密码子有着不同的使用频率。研究人员对短乳杆菌中的L—阿拉伯糖异构酶(L—AI)的基因进行密码子偏好性的优化，提高短乳杆菌L—AI合成速率，进而提高了D—塔格糖的生产效率。下列叙述正确的是(　　)
A．可以通过序列数据库等寻找短乳杆菌偏好的密码子对应序列
B．可以通过人工合成或基因突变等技术优化L—AI的基因碱基序列
C．密码子偏好性优化后L—AI的基因的表达水平得到一定程度提高
D．D—塔格糖的产量提高与优化后L—AI的空间结构发生改变有关
三、非选择题(本题共5小题，共55分)
21．(14分)图1表示苹果醋的简易制作装置和制作流程。发酵工程在医药上的应用非常广泛，其中青霉素的发现和产业化生产进一步推动了发酵工程在医药领域的应用和发展。产黄青霉菌是一种广泛存在于自然界中的霉菌，是生产青霉素的重要工业菌种。工业上生产青霉素的发酵工程流程如图2所示。据图回答下列问题：
(1)用图1装置酿酒结束后，若要直接转入果醋发酵，改变的环境条件是__________________。该过程进行的反应简式是____________________________________。
(2)(1分)图2在制备该培养基时，除了添加必要的营养成分外，还需要将pH在灭菌________(填“前”或“后”)调至酸性。
(3)(3分)欲从土壤中分离出能产生纤维素酶的纤维素分解菌，可用加入__________作为唯一碳源制成的选择培养基进行分离。若将样品接种到分离纤维素分解菌的培养基上，在该培养基中需要加入的特殊染料是__________，通过观察是否产生__________来筛选纤维素分解菌。
(4)对产黄青霉菌进行分离纯化并计数采用了________________法，其可以用来计数的原理为________________________________________________________________________。
为了避免混淆，本实验纯化菌种时使用的平板需要在培养皿的________(填“皿盖”或“皿底”)做好标记。然后在恒温培养箱中需培养1～2 d，每隔24 h统计一次菌落数目，选择菌落数目稳定时的记录作为结果。
22．(12分)我国科学家率先成功应用体细胞对非人灵长类动物进行克隆，获得两只克隆小猴——“中中”和“华华”。如图是该项技术的流程图，据图回答下列问题：
(1)科学家曾成功培育出胚胎细胞克隆猴，但“中中”和“华华”的出生仍然轰动世界，这是因为体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植，其原因是________________________________。
(2)体细胞核移植需借助去核的__________细胞，因其细胞质中含有促进核基因____________的物质。
(3)体外培养胎猴体细胞时，需定期更换培养液的原因是________________________________________________________________________。
(4)体细胞克隆猴的另外一个技术难点是胚胎发育率低。研究人员将组蛋白去甲基化酶Kdm4d的mRNA注入重构胚，可使胚胎的发育率明显提高，推测可能的原因是________________________________________________________________________。
(5)若获得的克隆动物与核供体动物性状不完全相同，分析其原因可能是____________________________________________________________________(答出一点)。
23．(9分)科研人员采用重叠延伸PCR技术，成功构建了突变的IKBA基因(以下称IKBAm)，使IKBA蛋白中第32、36位氨基酸由丝氨酸突变为丙氨酸，阻断了IKBA蛋白的磷酸化，IKBA蛋白磷酸化与哺乳动物组织中广泛存在的某种转录因子的功能有关。该技术采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来，获得定点突变的新基因，原理如图。回答下列问题：
(1)(3分)利用重叠延伸PCR技术诱变IKBA基因时，将预期的突变碱基设计在PCR的引物3和引物4中，分别进行PCR体系1和PCR体系2的扩增。PCR体系1中加入的引物是__________。PCR体系1和PCR体系2必须分开进行的原因是_______________________。
(2)(2分)将PCR体系1、2的产物(图中a、b和c、d)混合后，继续进行下一次PCR反应。在该PCR反应体系中经过高温变性后，当温度下降到55 ℃，能够互补配对的DNA链相互结合，理论上有__________种结合的可能，其中能进行进一步延伸的是__________组合的DNA片段。
(3)(2分)质粒A上有限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ的识别序列，为将IKBAm与质粒A正确连接，在设计IKBAm的扩增引物时，需在引物__________的5′端分别添加相应的限制酶的识别序列。如表为重叠延伸PCR引物序列表，引物3的①位置上有关的碱基序列是______________(写出6个碱基)。
名称 引物序列5′－3′ 备注
引物1 GATCGGATCCCGTTCCAGGCGGCCGAGCGCCCCCA BamHⅠ的识别序列：G↓GATCC
引物2 TCCTGAATTCTCATAACGTCAGACGCTGGCC EcoRⅠ的识别序列：G↓AATTC
引物3 ____①____TTCATGGCGTCCAGGCCGGCGTCGTGGCG
引物4 CGCCACGAC……ATGAAAGACGA “…”表示省略的碱基
(4)已知IKBA基因的部分序列为：
数字94、95、96、106表示碱基位置，丙氨酸的密码子：GCU、GCC、GCA、GCG，则突变引物4中省略的碱基是__________(填“①”“②”“③”或“④”)。
①AGC、GGC、CTG、GAC、GCC
②UCG、GGC、CTG、GAC、ACC
③GCC、GGC、CTG、GAC、GCC
④TCG、CCG、GAC、CTG、AGG
24．(每空1分，共8分)(2025·四川，19)杆菌M2合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉索西丁能与细菌的核糖体结合，阻止携带氨基酸的tRNA进入核糖体位点2。有人将合成拉索西丁的相关基因(lrcA～lrcF)导入链霉菌，基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如图。回答下列问题：
注：①F1、F2、F3和F4为与相应位置的DNA配对的单链引物，“→”指引物5′－3′方向。②密码子对应的氨基酸：AAA－赖氨酸；AUG－甲硫氨酸(起始)；UUC－苯丙氨酸；ACA－苏氨酸；UCG－丝氨酸。
(1)用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA～lrcF目的基因时，应选用________引物。本研究载体使用了链霉菌的复制原点，其目的是_________________________________。
(2)采用EcoRⅠ和BamHⅠ完全酶切构建的重组质粒，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生________条电泳条带，电泳检测酶切产物的目的是________________________________。
(3)由图可知，拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带____________(填氨基酸名称)的tRNA进入结合位点，导致______________________________________________________，最终引起细菌死亡。
(4)重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性，但重组菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是______________________。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题有________________________(答出1点即可)。
25．(12分)(2025·安徽，20)稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题：
(1)采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用____________(填方法)将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是________________________________________________________________________。
(2)经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R－U和下游片段R－D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。如图1所示。
采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的____________。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落____________(填序号)，出现菌落④的可能原因是________________________________________________________________________。
(3)内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出实验思路：________________________________________________________________________。单元检测十　生物技术与工程
一、选择题(本题共15小题，每小题2分，共30分。每小题只有一个选项符合题目要求)
1．(2025·大同三模)发酵食品的制作离不开微生物。下列叙述正确的是(　　)
A．泡菜制作过程中，乳酸菌经细胞呼吸产生的气体会使坛盖边缘冒出气泡
B．豆腐中的蛋白质可被多种微生物产生的蛋白酶分解成小分子肽和氨基酸
C．家庭制作葡萄酒时，发酵前应对原材料进行灭菌处理
D．制作葡萄酒和泡菜所利用的主要微生物都含有细胞核
答案　B
解析　乳酸菌是厌氧微生物，进行无氧呼吸的产物是乳酸，没有气体产生，泡菜制作时产生的气泡是其他产气微生物，如酵母菌细胞呼吸产生的，A错误；家庭制作葡萄酒时，所需的微生物来源于葡萄本身，不能对原材料进行灭菌处理，C错误；制作泡菜时主要利用的是乳酸菌，乳酸菌没有以核膜为界限的细胞核，D错误。
2．河南作为中华酒文化重要发源地，其传统酿酒技艺遵循“春曲夏酿，秋收冬藏”的时序规律。其中“春曲”指春季制作酒曲，富含霉菌和酵母菌；“夏酿”指夏季将蒸熟的米与曲混合，先置于敞口陶罐中数日，后密封发酵；“冬藏”指冬季将酒液密封于陶瓮，埋入深窖保存。下列叙述错误的是(　　)
A．制作“春曲”时需要提供适宜温度促进微生物的有氧呼吸
B．“夏酿”初期，敞口处理有利于霉菌的繁殖，促进淀粉分解
C．密封后陶罐中的酵母菌在线粒体基质中产生酒精和CO2
D．“冬藏”的低温环境能抑制微生物活动，延长酒液保存时间
答案　C
解析　微生物的有氧呼吸需要酶的催化，酶需要适宜的温度和pH，所以制作“春曲”时需要提供适宜温度促进微生物的有氧呼吸，A正确；“夏酿”初期，敞口处理有利于霉菌的繁殖，霉菌可以产生淀粉酶，进而促进淀粉的分解，B正确；酵母菌是真核生物，其酒精发酵产生酒精和CO2的过程是在细胞质基质中进行的，C错误；低温会使酶的活性处于抑制状态，“冬藏”的低温环境能抑制微生物活动，延长酒液保存时间，D正确。
3．某研究小组欲从碱性湖泥中分离获得耐碱细菌，对湖泥进行梯度稀释后接种到培养基A(pH＝9的基础培养基)上，实验流程如图，并对纯化后的菌种进行穿刺培养，观察其生长情况。下列叙述正确的是(　　)
A．若0.2 mL菌液经1号试管的稀释倍数与定容时相同，则y为1.8
B．可在A中加入酚红，挑选被染成红色的菌落，从而分离耐碱细菌
C．可将A中获得的耐碱细菌接种到pH＝7的固体培养基上进行扩大培养
D．进行图示纯化培养和穿刺培养时，接种环和接种针应在酒精灯火焰上灼烧灭菌
答案　A
解析　据图可知，湖泥定容时的稀释倍数为10，可推知y＝0.2×10－0.2＝1.8(mL)，A正确；酚红在碱性条件下会变红，可用来指示培养基的pH，不能将耐碱细菌染成红色，B错误；在pH＝7的培养基中耐碱细菌的生长可能受抑制，且扩大培养不能用固体培养基，应用液体培养基，C错误；穿刺培养时，接种针在使用前需要在酒精灯火焰上灼烧灭菌，以防止杂菌污染，图示纯化培养采用的接种方法为稀释涂布平板法，使用涂布器而不是接种环，使用前均需灼烧灭菌，D错误。
4.刚果红可与纤维素形成红色复合物，某同学以纤维素为唯一碳源制作的培养基中添加了刚果红，然后用如图的方法进行接种纤维素分解菌，下列叙述正确的是(　　)
A．该接种方法既能分离提纯微生物，还能对微生物进行计数
B．从用途的角度分，该培养基既是选择培养基，又是鉴别培养基
C．该过程中需对接种环进行灼烧灭菌，且灭菌次数为4次
D．划线区域形成的菌落周围显红色，且红色区域直径越大，说明纤维素分解菌的分解能力越强
答案　B
解析　该接种方法为平板划线法，不能对微生物进行计数，A错误；从用途的角度分，该培养基既是选择培养基，可以对分解纤维素的微生物起到选择作用，又因为加入了刚果红试剂，又是鉴别培养基，B正确；该过程中需对接种环进行灼烧灭菌，但灭菌次数为5次，C错误；纤维素分解菌将纤维素分解掉了，该区域刚果红不能与纤维素形成红色复合物，故划线区域形成的菌落周围显白色，D错误。
5．(2025·河北，13)生物工程在社会生产中的应用日益广泛，下列关于相关技术和方法的叙述，错误的是(　　)
A．利用组织培养技术实现兰花的快速繁殖和优良性状的保持
B．在没有CO2的有氧环境中进行胚胎干细胞的培养
C．利用灭活的病毒诱导B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合
D．对供体母牛注射促性腺激素促使其超数排卵用于胚胎的制备
答案　B
解析　植物组织培养技术可以高效、快速地实现种苗的大量繁殖，还可以保持优良品种的遗传特性，因此兰花可以利用组织培养技术实现快速繁殖和优良性状的保持，A正确；胚胎干细胞培养时，需要一定浓度的CO2以维持培养液的pH，B错误；诱导动物细胞融合的常用方法有电融合法、聚乙二醇融合法和灭活病毒诱导法，C正确；在胚胎工程中，对供体母牛注射促性腺激素促使其超数排卵，从而获得更多的卵母细胞用于胚胎的制备，D正确。
6．科研人员取胡萝卜部分韧皮部，放入含有植物激素、无机盐和糖类等物质的培养基中培养，最终长成了一株新的植株，如图所示，①～⑥表示过程。下列叙述错误的是(　　)
A．①所取的韧皮部组织要进行严格灭菌，防止杂菌污染
B．②为脱分化，使已分化的细胞失去其特有的结构和功能
C．经②③形成不定形的薄壁组织团块，该过程一般不需要光
D．生长素与细胞分裂素的使用比例会影响细胞的发育方向
答案　A
解析　①所取的韧皮部组织要进行消毒，不能灭菌，否则外植体的细胞会死亡，A错误；②为脱分化，使已分化的细胞失去其特有的结构和功能，全能性增强，B正确；②③为脱分化形成愈伤组织的过程，愈伤组织的细胞排列疏松且无规则，是一种高度液泡化的呈不定形状态的薄壁细胞，脱分化过程一般不需要光，C正确；生长素和细胞分裂素的浓度、比例会影响细胞的发育方向，当生长素含量偏高时有利于生根，而生长素含量偏低时，可促进生芽，D正确。
7．(2025·阿拉善盟一模)紫杉醇是一种重要的抗癌药物，主要来源于红豆杉属植物。为了提高紫杉醇的产量，研究人员利用植物细胞培养技术进行生产，部分流程如图。下列叙述正确的是(　　)
A．植物激素的种类、浓度和比例等会影响过程①
B．生产过程中需要对外植体进行彻底的灭菌处理
C．紫杉醇在细胞内大量积累有利于提高其产量
D．该生产过程利用的原理是植物细胞的全能性
答案　A
解析　植物激素的种类、浓度和比例等会影响过程①脱分化，A正确；生产过程中需要对外植体进行消毒处理，B错误；紫杉醇是次生代谢物，在细胞内大量积累，会使细胞代谢产物过多，可能对细胞产生毒害作用，不利于细胞的生长和代谢，反而不利于提高紫杉醇的产量，C错误；该生产过程利用的原理是植物细胞的增殖，D错误。
8．研究显示，为患有糖尿病的猴子移植由诱导多能干细胞(iPS细胞)增殖分化形成的胰岛，成功地降低了猴子的血糖水平。iPS细胞是利用皮肤细胞等体细胞经诱导因子(导入胚胎发育相关的特异性基因)处理后转化而成的，其功能和胚胎干细胞类似，能分化成多组织和器官。下列叙述错误的是(　　)
A．制备iPS细胞也可以直接将特定蛋白导入细胞中或用小分子化合物等来诱导
B．题述皮肤细胞等体细胞经诱导转化为iPS细胞的过程中遗传信息发生了改变
C．皮肤细胞经诱导因子处理后形成iPS细胞的过程体现了动物细胞的全能性
D．由于iPS细胞可由病人体细胞诱导转化而来，因此该方法可以避免免疫排斥反应
答案　C
解析　皮肤细胞经诱导因子处理后形成iPS细胞的过程，没有形成新个体，没有体现动物细胞的全能性，C错误。
9．某研究团队运用基因编辑技术，针对小鼠卵母细胞实施了DNA甲基化重写操作，随后将一个极体注入经修饰的次级卵母细胞中，成功培育出孤雌小鼠，具体操作流程如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A．甲基化重写没有改变卵母细胞的遗传信息，属于不可遗传的变异
B．体外培养卵母细胞时，需要在95%O2和5%CO2的气体环境中培养
C．移植的囊胚进一步扩大，导致滋养层破裂，胚胎从其中伸展出来
D．孤雌小鼠一定为雌性，基因型不一定与提供卵母细胞的雌鼠相同
答案　D
解析　上述甲基化重写没有改变DNA的序列，则小鼠体内的遗传信息不会改变，但甲基化使得DNA无法转录，影响基因的表达，属于可遗传变异，A错误；体外培养卵母细胞时，需要在95%空气和5%CO2的气体环境中培养，B错误；囊胚进一步扩大，会导致透明带破裂，胚胎从其中伸展出来，这一过程叫作孵化，C错误；“孤雌小鼠”是由两个生殖细胞(修饰后的次级卵母细胞和另一个卵子的极体)结合后发育形成，同时由于配子在形成过程中会经历减数分裂的基因重组，或发生基因突变，将导致两个生殖细胞结合后的“孤雌小鼠”的基因型不一定与提供卵母细胞的雌鼠相同，但一定为雌性，D正确。
10．(2026·遂宁开学考)如图是几种不同限制性内切核酸酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述正确的是(　　)
A．切割产生①片段的限制酶识别序列由5个碱基对构成
B．限制酶只存在于原核生物，作用的化学键为磷酸二酯键和氢键
C．两个③片段连接形成重组DNA时，E.coli DNA连接酶催化效率更高
D．上述能进行连接的两个黏性末端，其连接后形成的DNA分子是
答案　D
解析　切割产生①片段的限制酶，识别的碱基序列为－CTGCAG－，由6个碱基对构成，A错误；限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的，作用的化学键为磷酸二酯键，B错误；两个③片段属于平末端，E．coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率比T4 DNA连接酶低，C错误；图中①④具有相同的黏性末端，可被DNA连接酶连接，其连接后形成的DNA分子是，D正确。
11．(2025·赤峰模拟)几种限制酶的识别序列和切割位点如表所示。下列叙述正确的是(　　)
限制酶 识别序列和切割位点
BamHⅠ 5′－G↓GATCC－3′
Sau3AⅠ 5′－↓GATC－3′
Acc65Ⅰ 5′－G↓GTACC－3′
A.3种限制酶切割形成的末端中，既有黏性末端又有平末端
B．经Acc65Ⅰ酶切后得到的黏性末端序列为5′－GTAC－3′
C．能用Sau3AⅠ酶切的DNA序列亦可被BamHⅠ酶切
D．目的基因和质粒分别用BamHⅠ和Sau3AⅠ酶切后，用DNA连接酶连接形成的重组质粒可被BamHⅠ酶切
答案　B
解析　由表可知，BamHⅠ识别序列为5′－G↓GATCC－3′，Sau3AⅠ识别序列为5′－↓GATC－3′，Acc65Ⅰ识别序列为5′－G↓GTACC－3′，这三种限制酶切割后形成的都是黏性末端，没有平末端，A错误；Acc65Ⅰ的识别序列是5′－G↓GTACC－3′，切割位点在G和G之间，经Acc65Ⅰ酶切后得到的黏性末端序列为5′－GTAC－3′，B正确；BamHⅠ的识别序列是5′－G↓GATCC－3′，Sau3AⅠ的识别序列是5′－↓GATC－3′，能被Sau3AⅠ酶切的DNA序列不一定能被BamHⅠ酶切，因为BamHⅠ识别的序列是特定的，C错误；目的基因和质粒分别用BamHⅠ和Sau3AⅠ酶切后，用DNA连接酶连接形成的重组质粒可被Sau3AⅠ酶切，但不一定能被BamHⅠ酶切，D错误。
12．下列关于“DNA的粗提取与鉴定实验”的叙述，正确的是(　　)
A．丝状物的粗细表示一个DNA分子直径的大小
B．用不同浓度的NaCl溶液进行DNA粗提取，原因是DNA不溶于NaCl溶液
C．搅拌时用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌，以保证DNA分子完整
D．用二苯胺试剂进行鉴定，原因是DNA溶液中加入二苯胺试剂即呈蓝色
答案　C
解析　丝状物是由多个DNA分子形成的，不能代表DNA分子直径大小，A错误；用不同浓度的NaCl溶液进行DNA粗提取，原因是DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，B错误；搅拌时用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌，以避免DNA断裂，保证DNA分子完整，C正确；二苯胺试剂与DNA在沸水浴条件下呈现蓝色，D错误。
13．检测甲流病毒(遗传物质为RNA)最常见的方法是实时荧光定量PCR，原理是在PCR反应体系中加入与某条模板链片段互补的荧光探针，其两端有荧光分子(R)和淬灭剂(Q)。当探针完整时，R不发出荧光，否则R发出荧光，具体过程见图。下列叙述正确的有几项(　　)
①该PCR扩增是直接以甲流病毒的遗传物质作为模板进行的
②此荧光探针是以甲流病毒遗传物质序列合成的短DNA单链，本身不发出荧光
③耐高温的DNA聚合酶可能还有水解荧光探针的作用，使R发出荧光
④检测到的荧光强度与反应体系中扩增出的DNA分子数成正比
A．3项 B．2项 C．1项 D．0项
答案　A
解析　甲流病毒为RNA病毒，欲用PCR检测需先经逆转录形成cDNA，再以此为模板进行扩增，不能直接以RNA为模板，①错误。
14．SLPI蛋白是免疫应答的重要调节因子。通过基因工程技术，利用大肠杆菌表达系统表达的猪源SLPI蛋白，制备可稳定分泌抗SLPI单克隆抗体的杂交瘤细胞。利用该单克隆抗体以研究相关病原体的致病机理。下列关于此实验的叙述，正确的是(　　)
A．工程菌生产的SLPI蛋白是单细胞蛋白
B．PEG可介导甲细胞和乙细胞特异性融合
C．所有融合细胞均可在HAT培养基中生长
D．SLPI蛋白可参与到图中过程①和过程④
答案　D
解析　单细胞蛋白是微生物菌体，不是蛋白质，A错误；PEG可介导甲细胞和乙细胞融合，但不具有特异性，B错误；同种细胞核融合形成的细胞不能在HAT培养基中生长，C错误；猪源SLPI蛋白用于制备可稳定分泌抗SLPI单克隆抗体的杂交瘤细胞，在过程①中可以作为抗原刺激小鼠机体产生B淋巴细胞，过程④中可以用于抗体检测，D正确。
15．研究机构培育某新型转基因玉米，该玉米能高效合成一种蛋白酶抑制剂，让取食它的害虫的消化酶受抑制，导致害虫无法消化食物而死亡。但转基因食品是民众普遍不愿意接受的，请结合资料分析下列阐述，不具有科学性的是(　　)
A．该玉米不安全，其含有的蛋白酶抑制剂，使人食用后无法消化食物
B．该玉米不安全，蛋白酶抑制剂基因被人体摄食后，可在人的细胞内表达
C．该玉米安全，因为人与害虫消化酶的结构存在差异，蛋白酶抑制剂对人可能无影响
D．该玉米安全，人类通常食用煮熟的玉米，蛋白酶抑制剂已被高温破坏
答案　B
解析　该种玉米的种子也可能含有蛋白酶抑制剂，食用后使人因无法消化食物而患病，不安全，具有科学性，A不符合题意；生物体摄取的蛋白酶抑制剂基因会被生物体消化为小分子核苷酸被吸收，不会在体内表达，是安全的，不具有科学性，B符合题意；由于不同物种的酶在结构上有差异，该蛋白酶抑制剂对人体消化酶无影响，因此对人体是安全的，具有科学性，C不符合题意；人类通常食用煮熟的玉米，该抑制剂会被高温破坏，因此不会影响人体，是安全的，具有科学性，D不符合题意。
二、选择题(本题共5小题，每小题3分，共15分。每小题有一个或多个选项符合题目要求，全部选对得3分，选对但不全的得1分，有选错的得0分)
16．谷氨酸棒状杆菌生长的最适pH为7.0，通过如图代谢途径发酵生产L－谷氨酰胺。下列叙述正确的是(　　)
A．提高谷氨酸脱氢酶和谷氨酸合成酶的活性有利于提高L－谷氨酰胺产量
B．发酵初期控制pH为7.0，后调为5.6，有利于提高L－谷氨酰胺产量
C．利用谷氨酸棒状杆菌进行发酵，其中心环节是发酵罐内发酵
D．发酵结束后，采用过滤、沉淀的方法将菌体分离和干燥即可获得产品
答案　BC
解析　由图可知，提高谷氨酸脱氢酶和谷氨酰胺合成酶活性有利于提高L－谷氨酰胺产量，但谷氨酸合成酶会使L－谷氨酰胺再转化为L－谷氨酸，反而降低L－谷氨酰胺产量，A错误；谷氨酸棒状杆菌生长的最适pH为7.0，谷氨酰胺合成酶最适pH为5.6，因此发酵初期控制pH为7.0，有利于增加谷氨酸棒状杆菌的数量，后调为5.6，有利于提高谷氨酰胺合成酶的活性，进而提高L－谷氨酰胺产量，B正确；L－谷氨酰胺是细胞代谢产物，对细胞代谢产物可根据产物的性质通过提取、分离和纯化措施来获得产品，D错误。
17．科研人员在开发成分明确的无血清培养基方面取得进展，提高了干细胞产品稳定性与安全性；同时利用重组蛋白和小分子化合物精细调节培养环境，提升了干细胞增殖效率和稳定性；此外，机器学习在诱导多能干细胞培养中的应用逐渐深入，可预测分化路径、优化诱导条件，AI驱动的自动化培养系统上线，有效提升了分化效率。下列叙述错误的是(　　)
A．干细胞移植到患者体内可以分化为任何一种类型的细胞
B．使用无血清培养基的前提是明确细胞生长、增殖所需的生长因子等成分
C．自动化的移液换液可以减少细胞代谢物的积累对细胞自身造成的危害
D．除重组蛋白和小分子化合物外，外源基因也可以诱导多能干细胞
答案　A
解析　干细胞包括胚胎干细胞和成体干细胞等，胚胎干细胞具有分化为任何一种类型细胞的能力，成体干细胞具有组织特异性，A错误；动物细胞培养时，因促进细胞生长和增殖的一些成分未知，所以培养液中要加入动物血清，而弄清楚这些成分，就可以使用无血清培养基，B正确。
18．(2025·鞍山二模)免疫PCR是对微量抗原的一种检测方法。如图是利用该技术检测牛乳中微量抗生素的流程：首先将抗体1固定在微板上，冲洗后加入待检的牛乳，再加入DNA标记的抗体2，进行PCR扩增，最后进行电泳检测，下列叙述正确的是(　　)
A．图中抗原检测过程发生两次抗原与抗体的结合
B．图中标记抗体2的DNA一般是牛细胞中的DNA片段
C．题图过程中三次冲洗的目的均不同
D．免疫PCR技术间接放大了微量抗生素，以达到可检测水平
答案　ACD
解析　首先将抗体1固定在微板上，冲洗后加入待检的牛乳，此处发生第一次抗原与抗体的结合(牛乳中微量抗生素与抗体1的结合)，再加入DNA标记的抗体2，抗体2与牛乳中微量抗生素进行第二次抗原与抗体的结合，A正确；抗生素主要是由微生物产生的，图中标记抗体2的DNA一般是微生物中与抗生素相关的DNA片段，B错误；第一次冲洗是洗去未结合的抗体1，第二次冲洗是洗去未结合的牛乳中的物质，第三次冲洗是洗去未结合的抗体2，C正确；微量抗原抗体反应，是通过PCR技术扩增抗体2上连接的DNA，最后通过检测扩增产物DNA的量来确定抗生素的量的方法，因此抗原、抗体的数量可通过PCR技术间接扩增放大，D正确。
19．(2025·吉安一模)将马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因Pin－Ⅱ导入杨树细胞，培育抗虫杨树。如图表示利用含目的基因的DNA分子和Ti质粒构建基因表达载体的过程，图中AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，NeoR表示新霉素抗性基因，箭头表示限制酶的酶切位点，相关酶的识别序列如表所示。下列叙述正确的是(　　)
A．利用PCR扩增目的基因时，应该选择引物2和引物3并在引物5′端添加相应酶切位点
B．为使目的基因与质粒高效重组，选用KpnⅠ和HindⅢ比选用KpnⅠ和SmaⅠ效果更好
C．为将表达载体导入农杆菌，可以使用离心法或PEG融合法处理农杆菌细胞
D．成功导入目的基因的杨树细胞既具有氨苄青霉素抗性，又有新霉素抗性
答案　AB
解析　DNA聚合酶只能从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，利用PCR扩增目的基因时，应该选择引物2和引物3并在引物5′端添加相应酶切位点，A正确；为使目的基因与质粒高效重组，选用KpnⅠ和Hind Ⅲ比选用KpnⅠ和SmaⅠ效果更好，因为SmaⅠ切割DNA后形成平末端，T4 DNA连接酶连接平末端的效率相对较低，B正确；为将表达载体导入农杆菌，可以使用Ca2＋处理农杆菌细胞，使其处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组质粒导入其中，C错误；只有T－DNA区段会导入植物受体细胞，因此氨苄青霉素抗性基因不会导入植物受体细胞中，即成功导入目的基因的杨树细胞只能表现出新霉素抗性，D错误。
20．(2025·青岛期中)密码子偏好性是指在生物体中，编码相同氨基酸的不同密码子有着不同的使用频率。研究人员对短乳杆菌中的L—阿拉伯糖异构酶(L—AI)的基因进行密码子偏好性的优化，提高短乳杆菌L—AI合成速率，进而提高了D—塔格糖的生产效率。下列叙述正确的是(　　)
A．可以通过序列数据库等寻找短乳杆菌偏好的密码子对应序列
B．可以通过人工合成或基因突变等技术优化L—AI的基因碱基序列
C．密码子偏好性优化后L—AI的基因的表达水平得到一定程度提高
D．D—塔格糖的产量提高与优化后L—AI的空间结构发生改变有关
答案　ABC
解析　根据题意可知，对短乳杆菌中的L—阿拉伯糖异构酶(L—AI)的基因进行密码子偏好性的优化，会提高短乳杆菌L—AI合成速率，即L—AI的基因的表达水平得到一定程度提高，C正确；对L—AI的基因进行密码子偏好性优化，并没有改变氨基酸序列，优化后L—AI的空间结构不发生改变，D错误。
三、非选择题(本题共5小题，共55分)
21．(14分)图1表示苹果醋的简易制作装置和制作流程。发酵工程在医药上的应用非常广泛，其中青霉素的发现和产业化生产进一步推动了发酵工程在医药领域的应用和发展。产黄青霉菌是一种广泛存在于自然界中的霉菌，是生产青霉素的重要工业菌种。工业上生产青霉素的发酵工程流程如图2所示。据图回答下列问题：
(1)用图1装置酿酒结束后，若要直接转入果醋发酵，改变的环境条件是__________________。该过程进行的反应简式是____________________________________。
(2)(1分)图2在制备该培养基时，除了添加必要的营养成分外，还需要将pH在灭菌________(填“前”或“后”)调至酸性。
(3)(3分)欲从土壤中分离出能产生纤维素酶的纤维素分解菌，可用加入__________作为唯一碳源制成的选择培养基进行分离。若将样品接种到分离纤维素分解菌的培养基上，在该培养基中需要加入的特殊染料是__________，通过观察是否产生__________来筛选纤维素分解菌。
(4)对产黄青霉菌进行分离纯化并计数采用了________________法，其可以用来计数的原理为________________________________________________________________________。
为了避免混淆，本实验纯化菌种时使用的平板需要在培养皿的________(填“皿盖”或“皿底”)做好标记。然后在恒温培养箱中需培养1～2 d，每隔24 h统计一次菌落数目，选择菌落数目稳定时的记录作为结果。
答案　(1)通入无菌空气(氧气)、升高温度　C2H5OH＋O2CH3COOH＋H2O＋能量　(2)前　(3)纤维素　刚果红　透明圈　(4)稀释涂布平板　当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌　皿底
解析　(1)酿酒过程需要在无氧条件下进行，果醋发酵需要在有氧条件下发生，酿酒的适宜温度大约在18～30 ℃，而果醋酿造的适宜温度大约是30～35 ℃，因此用图1装置酿酒结束后，若要直接转入果醋发酵，改变的环境条件是通入无菌空气(氧气)、升高温度。果醋发酵过程进行的反应简式：C2H5OH＋O2CH3COOH＋H2O＋能量。(3)欲从土壤中分离出能产生纤维素酶的纤维素分解菌，可用加入纤维素作为唯一碳源制成的选择培养基进行分离，这样只有能分解利用纤维素的细菌才能在该培养基上生长。在分离纤维素分解菌的培养基中需要加入的特殊染料是刚果红。刚果红能与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红－纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，所以通过观察是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。(4)对产黄青霉菌进行分离纯化并计数采用了稀释涂布平板法，其可以用来计数的原理为当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。为了避免混淆，本实验纯化菌种时使用的平板需要在培养皿的皿底做好标记。
22．(12分)我国科学家率先成功应用体细胞对非人灵长类动物进行克隆，获得两只克隆小猴——“中中”和“华华”。如图是该项技术的流程图，据图回答下列问题：
(1)科学家曾成功培育出胚胎细胞克隆猴，但“中中”和“华华”的出生仍然轰动世界，这是因为体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植，其原因是________________________________。
(2)体细胞核移植需借助去核的__________细胞，因其细胞质中含有促进核基因____________的物质。
(3)体外培养胎猴体细胞时，需定期更换培养液的原因是________________________________________________________________________。
(4)体细胞克隆猴的另外一个技术难点是胚胎发育率低。研究人员将组蛋白去甲基化酶Kdm4d的mRNA注入重构胚，可使胚胎的发育率明显提高，推测可能的原因是________________________________________________________________________。
(5)若获得的克隆动物与核供体动物性状不完全相同，分析其原因可能是____________________________________________________________________(答出一点)。
答案　(1)体细胞分化程度高，全能性表现困难
(2)卵母　重新表达　(3)清除代谢废物，补充营养物质，维持细胞正常代谢　(4)该mRNA能够使细胞表达组蛋白去甲基化酶Kdm4d，进而促进组蛋白去甲基化，使相关基因表达，从而提高胚胎的发育率　(5)卵母细胞质中的遗传物质影响性状；环境因素导致表型差异
解析　(1)体细胞分化程度高，表现全能性困难，而胚胎细胞分化程度低，表现全能性容易，因此动物体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植。(2)体细胞核移植需借助去核的卵母细胞。卵母细胞的细胞质中含有促进核基因重新表达的物质，能激发细胞核的全能性，使重组细胞能发育成完整的个体。(3)在体外培养细胞时，细胞会进行新陈代谢，产生一些代谢废物，如二氧化碳等。定期更换培养液可以清除代谢废物，补充营养物质，维持细胞正常代谢，为细胞提供一个相对稳定的生存环境，有利于细胞的生长和增殖。(4)研究人员将组蛋白去甲基化酶(Kdm4d)的mRNA注入重构胚，注入Kdm4d的mRNA可表达出Kdm4d，降低组蛋白的甲基化水平，调节相关基因的表达，使其完成细胞分裂和发育进程，提高了胚胎的发育率。(5)若获得的克隆动物与核供体动物性状不完全相同，这可能是因为卵母细胞的细胞质中的遗传物质会对克隆动物的性状产生影响(或克隆动物有部分遗传物质来自卵母细胞)，也可能是环境会对克隆小猴的性状产生影响。
23．(9分)科研人员采用重叠延伸PCR技术，成功构建了突变的IKBA基因(以下称IKBAm)，使IKBA蛋白中第32、36位氨基酸由丝氨酸突变为丙氨酸，阻断了IKBA蛋白的磷酸化，IKBA蛋白磷酸化与哺乳动物组织中广泛存在的某种转录因子的功能有关。该技术采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来，获得定点突变的新基因，原理如图。回答下列问题：
(1)(3分)利用重叠延伸PCR技术诱变IKBA基因时，将预期的突变碱基设计在PCR的引物3和引物4中，分别进行PCR体系1和PCR体系2的扩增。PCR体系1中加入的引物是__________。PCR体系1和PCR体系2必须分开进行的原因是_______________________。
(2)(2分)将PCR体系1、2的产物(图中a、b和c、d)混合后，继续进行下一次PCR反应。在该PCR反应体系中经过高温变性后，当温度下降到55 ℃，能够互补配对的DNA链相互结合，理论上有__________种结合的可能，其中能进行进一步延伸的是__________组合的DNA片段。
(3)(2分)质粒A上有限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ的识别序列，为将IKBAm与质粒A正确连接，在设计IKBAm的扩增引物时，需在引物__________的5′端分别添加相应的限制酶的识别序列。如表为重叠延伸PCR引物序列表，引物3的①位置上有关的碱基序列是______________(写出6个碱基)。
名称 引物序列5′－3′ 备注
引物1 GATCGGATCCCGTTCCAGGCGGCCGAGCGCCCCCA BamHⅠ的识别序列：G↓GATCC
引物2 TCCTGAATTCTCATAACGTCAGACGCTGGCC EcoRⅠ的识别序列：G↓AATTC
引物3 ____①____TTCATGGCGTCCAGGCCGGCGTCGTGGCG
引物4 CGCCACGAC……ATGAAAGACGA “…”表示省略的碱基
(4)已知IKBA基因的部分序列为：
数字94、95、96、106表示碱基位置，丙氨酸的密码子：GCU、GCC、GCA、GCG，则突变引物4中省略的碱基是__________(填“①”“②”“③”或“④”)。
①AGC、GGC、CTG、GAC、GCC
②UCG、GGC、CTG、GAC、ACC
③GCC、GGC、CTG、GAC、GCC
④TCG、CCG、GAC、CTG、AGG
答案　(1)引物1和引物3　引物3和引物4存在碱基互补配对片段，置于同一反应体系会导致引物失效(或若将两个体系混合扩增，引物1和引物2同时存在，会扩增出IKBA基因)　(2)4　a和d　(3)1和2　TCGTCT　(4)③
解析　(2)由于引物3和引物4碱基序列互补配对，PCR扩增产物经过高温变性后会形成a、b、c、d四种单链，当温度下降到55 ℃，能够互补配对的DNA链相互结合，a和b结合，a和d结合，b和c结合，c和d结合，共四种结合方式。a和b结合以及c和d结合没有突出的单链部分，不能延伸，b和c结合有突出的单链部分，但是DNA延伸方向必须是从自身的5′→3′，b和c结合也不能延伸，能进行进一步延伸的是a和d组合的DNA片段。(3)由于引物3和引物4是和目的基因的中间碱基序列互补配对的，要将目的基因和质粒连接形成重组的DNA分子，则需要在目的基因的两端增加限制酶识别序列，因此需要在引物1和2的5′端分别添加相应的限制酶的识别序列。由于引物3和4是碱基互补配对的，引物4的3′端的前6个碱基是AGCAGA，则引物3的①位置上有关的碱基序列是TCGTCT。(4)结合引物4的已知序列和IKBA基因的部分序列可知，引物4的碱基序列和图示中的IKBA基因的单链部分序列基本相同(除突变位点外)，已知第32位氨基酸需要是丙氨酸，根据丙氨酸对应的密码子分析，94、95、96对应的碱基是GCC,96和106号碱基之间的序列和图示相同，为GGCCTGGAC，第36位氨基酸也需要是丙氨酸，因此TCC改变为GCC，综合分析，突变引物4中省略的碱基是③GCC、GGC、CTG、GAC、GCC。
24．(每空1分，共8分)(2025·四川，19)杆菌M2合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉索西丁能与细菌的核糖体结合，阻止携带氨基酸的tRNA进入核糖体位点2。有人将合成拉索西丁的相关基因(lrcA～lrcF)导入链霉菌，基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如图。回答下列问题：
注：①F1、F2、F3和F4为与相应位置的DNA配对的单链引物，“→”指引物5′－3′方向。②密码子对应的氨基酸：AAA－赖氨酸；AUG－甲硫氨酸(起始)；UUC－苯丙氨酸；ACA－苏氨酸；UCG－丝氨酸。
(1)用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA～lrcF目的基因时，应选用________引物。本研究载体使用了链霉菌的复制原点，其目的是_________________________________。
(2)采用EcoRⅠ和BamHⅠ完全酶切构建的重组质粒，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生________条电泳条带，电泳检测酶切产物的目的是________________________________。
(3)由图可知，拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带____________(填氨基酸名称)的tRNA进入结合位点，导致______________________________________________________，最终引起细菌死亡。
(4)重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性，但重组菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是______________________。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题有________________________(答出1点即可)。
答案　(1)F2、F4　保证载体能在链霉菌中正常复制　(2)2　检测重组质粒是否构建成功　(3)苯丙氨酸　翻译过程无法正常进行，细菌无法合成蛋白质　(4)目的基因发生突变(或目的基因表达受到抑制等)　发酵的最佳条件(或提高发酵产物产量的方法、产物的分离和纯化方法等)
解析　(1)引物需要结合到模板的3′端，且与目的基因的部分碱基序列互补配对，子链延伸方向为5′→3′，因此用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA～lrcF目的基因时，应选用F2、F4引物。载体使用链霉菌的复制原点，是为了保证载体在链霉菌细胞中能正常复制，使目的基因能够在链霉菌中稳定存在并遗传给后代。(2)采用EcoRⅠ和BamHⅠ完全酶切构建的重组质粒，会得到载体片段和目的基因片段，共2条电泳条带。电泳检测酶切产物的目的是检测重组质粒是否构建成功，若能得到预期的载体片段和目的基因片段大小的条带，说明酶切成功，重组质粒构建可能成功。但是还需要进一步的鉴定。(3)观察拉索西丁的作用机制图，结合所给密码子信息，可知拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带苯丙氨酸的tRNA进入结合位点。因为位点2对应的密码子是UUC，编码苯丙氨酸。拉索西丁阻止携带苯丙氨酸的tRNA进入结合位点，会导致翻译过程无法正常进行，进而使细菌无法合成蛋白质，最终引起细菌死亡。(4)重组链霉菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是目的基因发生突变，导致其表达的产物结构改变，从而失去杀菌活性；也可能是目的基因的表达受到抑制等。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题：发酵的最佳条件，如温度、pH、溶氧量等；如何提高发酵产物的产量；产物的分离和纯化方法等。
25．(12分)(2025·安徽，20)稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题：
(1)采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用____________(填方法)将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是________________________________________________________________________。
(2)经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R－U和下游片段R－D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。如图1所示。
采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的____________。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落____________(填序号)，出现菌落④的可能原因是________________________________________________________________________。
(3)内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出实验思路：________________________________________________________________________。
答案　(1)稀释涂布平板法　分离不同条件下生长的内生放线菌　(2)指数级扩增　②　重组质粒通过(单交换)同源重组整合到了内生放线菌的基因组中　(3)设置两组培养实验：对照组在低(或常规)铁浓度的培养基上进行，实验组在高铁浓度的培养基上进行。在两组培养基的相同位置分别接种内生放线菌和稻瘟病致病菌。在相同且适宜的条件下培养一段时间后，观察并比较两组中稻瘟病致病菌菌落的生长情况。若高铁组的抑制效果明显弱于低铁组，则支持该推测
解析　(1)从含有多种微生物的研磨液中分离出单一菌落，并接种到选择培养基中常用的接种方法是稀释涂布平板法。使用选择培养基和不同的温度条件，目的是抑制其他杂菌的生长，分离不同条件下生长的内生放线菌。(2)PCR技术的核心原理是通过多次循环(变性、复性、延伸)，使目标DNA片段的数量以指数形式快速增加，实现体外扩增。PCR鉴定是利用引物1和引物2进行的。在野生型菌株中，引物1和引物2之间的DNA片段长度为R－U(500 bp)＋R基因(2 000 bp)＋R－D(500 bp)＝3 000 (bp)。对应图2中的菌落①和③。在成功发生双交换的R基因敲除株中，R基因(2 000 bp)被替换，引物1和引物2之间的DNA片段长度为R－U(500 bp)＋R－D(500 bp)＝1 000 (bp)。对应图2中的菌落②。菌落④的PCR产物大小约为7 000 bp。这个大小可以通过以下方式解释：发生了单交换同源重组事件。整个重组质粒[大小为3 000 bp质粒骨架＋500 bp R－U＋500 bp R－D＝4 000 (bp)]整合到了基因组中。整合后，引物1和引物2之间的区域长度变为原来的长度(3 000 bp)加上整个重组质粒的长度(4 000 bp)，即3 000＋4 000＝7 000(bp)。(3)设置两组培养实验：一组为对照组，在低(或常规)铁浓度的培养基上进行；另一组为实验组，在添加了足量铁离子的培养基上进行。在两组培养基的相同位置分别接种内生放线菌和稻瘟病致病菌。在相同且适宜的条件下培养一段时间后，观察并比较两组中稻瘟病致病菌菌落的生长情况。预期结果与结论：如果实验组(高铁培养基)中内生放线菌对稻瘟病致病菌的抑制作用明显减弱或消失，而对照组(低铁培养基)中抑制作用明显，则说明该内生放线菌是通过竞争铁离子来抑制稻瘟病致病菌生长的。

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