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第3章 基因工程
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A考点归类·专项突破
考点01 重组DNA技术的基本工具（重点）
考点02 基因工程的基本操作程序（重点）
考点03 基因工程的应用
考点04 蛋白质工程的原理和应用（难点）
B系统整合·能力进阶
考点01 重组DNA技术的基本工具
1．（24-25高二下·安徽）如图为鸡血细胞中DNA的粗提取和鉴定实验过程中的部分操作示意图。下列相关叙述正确的是（ ）
A．该实验的正确操作顺序为a→e→b→c→d
B．步骤b完成后应取上清液继续进行实验
C．可以在离心管中进行离心分离替代步骤c
D．步骤e中加入的为NaCl溶液，步骤d试管中会出现紫色
【答案】C
【详解】A、DNA的粗提取和鉴定实验过程为提取鸡血细胞中的DNA→过滤获得DNA滤液→析出DNA沉淀→溶解絮状DNA→二苯胺鉴定DNA，故正确步骤应为a→c→b→e→d，A错误；
B、DNA不溶于酒精，故经过步骤b后应取沉淀物继续进行实验，B错误；
C、步骤c主要是对DNA进行初步的过滤和分离，也可用离心法代替，C正确；
D、DNA能溶于2mol/L的NaCl溶液，故步骤e中加入的为NaCl溶液，步骤d中需向试管内加入二苯胺试剂，沸水浴加热情况下DNA遇二苯胺试剂才会呈现蓝色，D错误。
故选C。
2．（2023·山东菏泽·一模）大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA。用三种限制酶处理提取的产物，电泳结果如图所示。下列关于质粒的粗提取和鉴定的叙述不正确的是（ ）
A．提取DNA时可加入酒精，使溶于酒精的蛋白质等物质溶解
B．将提取的DNA溶于2mol/LNaCl溶液后；可用二苯胺试剂进行鉴定
C．电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着它所带电荷相反的电极移动的原理
D．根据电泳结果，质粒上一定没有限制酶I和Ⅱ的切割位点，而有限制酶Ⅲ的切割位点
【答案】D
【分析】DNA的粗提取和鉴定：利用DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精，以及DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，可以将DNA与蛋白质分离开；在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。
【详解】A、由于蛋白质可溶于酒精，而DNA在冷酒精中溶解度很低，所以在提取DNA时加入酒精，使溶于酒精的蛋白质等物质溶解，而让DNA析出，A正确；
B、由于DNA在2mol/LNaCl溶液中溶解度较大，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，所以将提取的DNA溶于2mol/LNaCl溶液后，可用二苯胺试剂在沸水条件进行鉴定，B正确；
C、DNA带负电，电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着它所带电荷相反的电极移动的原理，C正确；
D、因为质粒的本质是环状的DNA，限制酶Ⅰ和Ⅱ处理后电泳只有一条条带，可能是该质粒上有一个切割位点，也可能没有切割位点，D错误。
故选D。
3．（23-24高三上·山西运城）如图为一个DNA分子片段，下列有关叙述正确的是（　　）

A．限制酶和DNA聚合酶、DNA连接酶均促使DNA分子中②处化学键的生成
B．图中有4种脱氧核苷酸，与RNA的核苷酸区别的是五碳糖不同
C．DNA发生初步水解的过程中，发生断裂的键是②④
D．DNA分子中的氮元素和磷元素，分布在其基本骨架上
【答案】C
【分析】图中②为磷酸二酯键，①③为脱氧核苷酸内脱氧核糖与磷酸、碱基结合的化学键，④为氢键。
【详解】A、②为磷酸二酯键，DNA聚合酶、DNA连接酶均促使DNA分子中磷酸二酯键的形成，限制酶促进磷酸二酯键的断裂，A错误；
B、图中有4种脱氧核苷酸，与RNA的核苷酸区别除了五碳糖不同，还有碱基T是RNA没有的，B错误；
C、DNA发生初步水解产物是脱氧核苷酸，发生断裂的键是②磷酸二酯键和④氢键，C正确；
D、DNA分子中的氮元素分布在碱基，磷元素分布在磷酸基团，其中磷酸基团和脱氧核糖交替连接形成DNA分子的基本骨架，碱基在内侧，D错误。
故选C。
4．（24-25高二下·河南·期末）某同学以鸡血细胞为材料进行“DNA粗提取和鉴定”实验。下列叙述错误的是（ ）
A．向鸡血细胞液中加入蒸馏水并搅拌，可加快血细胞破裂，释放DNA
B．向DNA溶液中加入2mol/LNaCl溶液，能析出DNA并提高其纯度
C．向DNA溶液中加入体积分数为95%的预冷酒精，可对DNA进行纯化
D．DNA溶液与二苯胺试剂反应后，溶液呈现的蓝色越深，说明提取的DNA越多
【答案】B
【详解】A、鸡血细胞为动物细胞，无细胞壁，加入蒸馏水可使细胞吸水涨破，释放DNA，A正确；
B、DNA在2mol/L NaCl溶液中溶解度较高，此时DNA溶解而非析出；析出DNA需将浓度降至0.14mol/L左右，B错误；
C、DNA不溶于体积分数95%的冷酒精，加入后可去除杂质并纯化DNA，C正确；
D、二苯胺试剂与DNA在沸水浴中显蓝色，蓝色深浅与DNA含量正相关，D正确；
故选B。
考点02 基因工程的基本操作程序
5．（24-25高三上·云南·阶段练习）研究人员欲将某动物体内基因X导入大肠杆菌的质粒中保存，质粒含有抗性基因与酶切位点，目的基因两端酶切位点如下图所示，下列叙述错误的是（　　）

A．使用HindⅢ和XbaI进行酶切能避免基因X与质粒反向连接
B．目的基因X与质粒连接可使用E.coliDNA连接酶
C．Ca2+处理大肠杆菌能降低细胞膜通透性，有利于重组质粒导入受体细胞
D．含有基因X的大肠杆菌能在氨苄青霉素选择培养基中生长
【答案】C
【分析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
【详解】A、分析题图可知，使用HindⅢ和XbaI进行酶切会产生不同的粘性末端，故能避免基因X与质粒反向连接，A正确；
B、目的基因X与质粒用HindⅢ和XbaI酶切会产生粘性末端，E.coliDNA连接酶可连接粘性末端，故目的基因X与质粒连接可使用E.coliDNA连接酶，B正确；
C、用Ca2+处理大肠杆菌，能提高细胞膜的通透性，使细胞处于感受态即能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，有利于重组质粒导入受体细胞，C错误；
D、分析题图可知，重组质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，故含有基因X的大肠杆菌能在氨苄青霉素选择培养基中生长，D正确。
故选C。
6．（2025高三下·四川绵阳·专题练习）生命是物质、能量和信息的统一体，而遗传信息的流动要依赖于DNA复制和转录。下列关于DNA复制与转录过程的区别，不包括（　　）
A．直接能源物质有区别 B．发生的时期有区别
C．碱基配对原则有区别 D．利用的模板有区别
【答案】A
【分析】基因表达是指将来自基因的遗传信息合成功能性基因产物的过程。基因表达产物通常是蛋白质，所有已知的生命，都利用基因表达来合成生命的大分子。转录过程由RNA聚合酶进行，以DNA为模板，产物为RNA。RNA聚合酶沿着一段DNA移动，留下新合成的RNA链。翻译是以mRNA为模板合成蛋白质的过程，场所在核糖体。
【详解】A、DNA复制与转录过程直接能源物质都是ATP，A符合题意；
B、DNA复制主要发生在间期，转录可以发生在任何时期，B不符合题意；
C、DNA复制碱基配对原则为A-T、G-C，转录为A-U、G-C，C不符合题意；
D、DNA复制以DNA的两条链为模板，转录以DNA的一条链为模板，D不符合题意。
故选A。
7．（24-25高三下·云南昭通·阶段练习）如图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述错误的是（　　）
A．①→②过程可用不同的限制酶分别切割Ti质粒和含抗虫基因的DNA
B．②→③过程可用Ca2+处理农杆菌细胞
C．③→④过程是将重组Ti质粒整合到受体植物细胞的染色体DNA上
D．④→⑤过程体现了植物细胞的全能性，不同阶段所需的培养条件不同
【答案】C
【分析】图示是利用基因工程培育抗虫植物的示意图，其中①为质粒，作为运载体；②为重组质粒；③为含有重组质粒的农杆菌；④为含有目的基因的植物细胞；⑤为转基因植株。
【详解】A、①→②过程是构建基因表达载体，可用相同或不同的限制酶分别切割Ti质粒和含抗虫基因的DNA，Ti质粒和含抗虫基因的DNA能产生相同的末端即可，A正确；
B、②→③过程是将重组Ti质粒转入农杆菌，农杆菌是细菌，可用Ca2+处理农杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境DNA分子的生理状态，从而将重组Ti质粒转入农杆菌，B正确；
C、③→④过程是将重组Ti质粒导入植物细胞，重组Ti质粒上的T DNA才能整合到受体植物细胞的染色体DNA上，C错误；
D、④→⑤过程是植物组织培养，体现了植物细胞的全能性，不同阶段所需的光照、营养条件等不同，D正确。
故选C。
8．（24-25高三下·全国·阶段练习）研究人员用琼脂糖凝胶电泳对产物进行鉴定时，出现了“拖尾”现象，即产物在凝胶上呈弥散状态，条带模糊不清。已知蛋白质会阻碍分子在琼脂糖凝胶中的迁移，对其产生拖拽作用。下列对出现“拖尾”现象原因的分析，不合理的是（ ）
A．提取基因组时蛋白质等杂质过多
B．目标存在多种变异，PCR模板不纯
C．复性温度太低，引物与模板出现错配
D．配制琼脂糖溶液时没有添加核酸染料
【答案】D
【分析】在DNA粗提取和鉴定的实验中，检测DNA所用的试剂是二苯胺，在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。获得PCR产物后，用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率。
【详解】A、已知蛋白质会阻碍DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移，对其产生拖拽作用，若提取基因组DNA时蛋白质等杂质过多，会使DNA在凝胶上呈弥散状态，出现“拖尾”现象，A正确；
B、若目标DNA存在多种变异，PCR模板不纯，会出现过多的非特异性扩增产物，导致出现“拖尾”现象，B正确；
C、若PCR的复性温度太低，引物与模板出现错配，也会出现过多的非特异性扩增产物，导致出现“拖尾”现象，C正确；
D、若配制琼脂糖溶液时没有添加核酸染料，会导致观察不到条带，D错误。
故选D。
考点03 基因工程的应用
9．（24-25高二下·广西·阶段练习）多种方法获得的早期胚胎，均需移植给受体才能获得后代。据此分析，下列叙述错误的是（ ）
A．①②③均通过有性生殖的方式产生
B．胚胎移植前不需要对受体牛进行免疫抑制处理
C．受体必须是同种的且生理状况相同的雌性动物
D．③可通过②技术实现扩大化生产，①②可通过③技术实现性状改良
【答案】A
【详解】A、①③一般通过有性生殖的方式产生，②通过无性繁殖的方式产生，A错误；
B、受体不会对移植的胚胎产生免疫排斥反应，故胚胎移植前不需要对受体牛进行免疫抑制处理，B正确；
C、为保证移植的胚胎正常发育，受体必须是同种的且生理状况相同的雌性动物，C正确；
D、过程②克隆技术可得到大量同种个体，为过程③提供了扩大化生产方式；过程③是利用转基因技术导入外源优良基因，为过程①、②提供了改良性状的方式，D正确。
故选A。
10．（25-26高三上·广东·阶段练习）CRISPR/Cas9技术在遗传病治疗中展现出巨大潜力。镰刀型细胞贫血症是因β-珠蛋白基因（HBB）发生点突变所致，患者红细胞呈镰刀状。科学家计划利用CRISPR/Cas9技术治疗该疾病，流程大致为：设计靶向突变HBB基因的单链向导RNA（SgRNA），引导Cas9蛋白切割突变序列，同时导入正常HBB基因片段作为修复模板，最终使细胞表达正常β-珠蛋白。下列叙述错误的是（ ）
A．若sgRNA与某正常基因序列存在部分碱基互补，可能导致Cas9错误切割该基因（脱靶效应）
B．Cas9切割突变HBB基因后，细胞可利用导入的正常基因片段进行修复，但该过程易受细胞内酶的影响，导致修复片段降解
C．构建重组表达载体时，需包含sgRNA基因、Cas9基因和正常HBB基因模板，无需添加启动子，需添加特定的标记基因
D．不同患者的HBB基因突变位点可能存在差异，因此需根据患者具体突变序列设计特异性sgRNA
【答案】C
【详解】A、sgRNA通过碱基互补配对引导Cas9切割特定DNA序列，若与正常基因部分互补，可能引发脱靶效应，导致错误切割，A正确；
B、Cas9切割突变HBB基因后，细胞可利用导入的正常基因片段作为修复模板进行修复，但外源模板可能被细胞内核酸酶降解，影响修复效率，B正确；
C、基因表达载体需启动子驱动sgRNA基因和Cas9基因的转录，需要添加启动子，标记基因用于筛选成功转化的细胞，C错误；
D、不同患者的HBB基因突变位点不同，需设计特异性sgRNA靶向对应突变序列，D正确。
故选C。
11．（24-25高一下·湖南·期中）下表为四种细胞的部分结构、功能信息。下列叙述错误的是（　　）
细胞壁 核糖体 核膜 光合作用
甲 + + + —
乙 + + — —
丙 — + + —
丁 + + — +
A．甲可能是酵母菌，乙可能是乳酸菌
B．乙不能进行光合作用，属于异养型生物
C．甲和丙的细胞呼吸的场所和产物可能相同
D．丁可以进行光合作用是因为含有光合色素和相关酶等
【答案】B
【分析】有一类细胞没有成形的细胞核，如大肠杆菌和其他细菌细胞。科学家根据细胞内有无以核膜为界限的细胞核，把细胞分为真核细胞和原核细胞两大类。由真核细胞构成的生物叫作真核生物，如植物、动物、真菌等。由原核细胞构成的生物叫作原核生物。
【详解】A、甲为具有细胞壁且不能进行光合作用的真核生物，有可能是酵母菌；乙为原核生物，可能是乳酸菌，A正确；
B、乙可能是进行化能合成作用的自养生物，B错误；
C、如甲是植物根细胞，丙是人体肌肉细胞，均能进行有氧呼吸，细胞呼吸的场所和产物都可能相同，C正确；
D、丁为原核生物，可以进行光合作用是因为含有光合色素和相关酶等，D正确。
故选B。
12．（24-25高二下·辽宁沈阳·期中）为了救治患重度地中海贫血的女儿，一对夫妇在医院通过设计试管婴儿技术（植入前对胚胎进行遗传学诊断），生下了一个不携带地中海贫血致病基因且配型适合于患病姐姐的健康男婴，用他的脐带血帮助姐姐进行造血干细胞移植。下列叙述正确的是（ ）
A．植入前胚胎需培养在95%的O2和5%的CO2的气体环境中
B．伦理上禁止进行非医学必要的性别筛选和胚胎筛选
C．经遗传学诊断后，造血干细胞移植将不发生免疫排斥反应
D．设计试管婴儿技术利用了胚胎移植和胚胎分割技术
【答案】B
【分析】在胚胎发育成桑葚胚后，桑葚胚进一步发育，细胞开始出现分化，聚集在胚胎的一端，个体较大的细胞，称为内细胞团，内细胞团将来发育成胎儿的各种组织，而沿透明带内壁扩展和排列的，个体较小的细胞，称为滋养层细胞，它们将来发育成胎膜和胎盘。
【详解】A、植入前胚胎需培养在95%的空气和5%的CO2的气体环境中，A错误；
B、伦理上禁止进行非医学必要的性别筛选和胚胎筛选，B正确；
C、即使经过遗传学诊断和配型，造血干细胞移植仍可能发生免疫排斥反应，C错误；
D、设计试管婴儿的培育需经过体外受精、早期胚胎培养、遗传学诊断、胚胎移植以及在代孕母体中发育和产出等过程，故该技术应用了体外受精、早期胚胎培养胚胎移植、遗传学诊断等技术手段，但没有利用胚胎分割技术，D错误。
故选B。
考点04 蛋白质工程的原理和应用
13．（24-25高二下·黑龙江齐齐哈尔·期末）基于 AI（人工智能）的蛋白质设计方法可通过现有蛋白质数据库及机器深度“学习算法”来预测新型蛋白质的结构和功能。下列叙述错误的是（ ）
A．AI 预测新型蛋白质的结构和功能依据的原理是中心法则
B．AI 可帮助人们深入了解蛋白质分子结构和功能的关系
C．获得 AI 设计的蛋白质，可通过改造或合成基因来实现
D．AI 可帮助人们高效地设计出自然界没有的蛋白质
【答案】A
【分析】蛋白质的结构与其功能密切相关，结构决定功能是生物学的核心原则之一。蛋白质的结构具有多层次性（一级、二级、三级、四级结构），每一层结构的变化都会影响其功能，甚至导致功能异常。
【详解】A、AI预测蛋白质结构和功能主要基于机器学习算法和已有数据库，而非中心法则。中心法则描述遗传信息的传递，并未直接涉及蛋白质结构预测的原理，A错误；
B、AI通过分析大量数据，可揭示蛋白质结构与功能间的关联，帮助深入理解二者关系，B正确；
C、蛋白质由基因控制合成，通过基因改造或人工合成基因可实现AI设计的蛋白质表达，C正确；
D、AI能利用算法生成非天然存在的蛋白质结构，提高设计效率，D正确。
故选A。
14．（24-25高二下·云南·阶段练习）我国科学家将AI与蛋白质设计改造相结合，建立了全球最大的蛋白质数据集，基于该数据集训练的AI模型，能预测并设计蛋白质的功能。下列叙述错误的是（ ）
A．对蛋白质分子的设计和改造是通过蛋白质工程来实现的
B．蛋白质工程需改变蛋白质分子中的全部氨基酸序列
C．用AI预测新型蛋白质的基因结构应依据中心法则原理
D．根据AI设计的蛋白质推导出的对应基因序列不是唯一的
【答案】B
【详解】A、蛋白质工程是通过对基因的修饰或合成，实现对蛋白质分子的定向改造，A正确；
B、蛋白质工程只需改变与目标功能相关的部分氨基酸序列，而非改变全部氨基酸序列，B错误；
C、AI预测蛋白质对应的基因结构需基于中心法则中的信息传递，属于DNA→RNA→蛋白质的逆向推导，C正确；
D、由于密码子的简并性（不同密码子可能编码同一氨基酸），故推导出的基因序列可能存在多种可能性，D正确。
故选B。
15．（24-25高二下·福建厦门·期中）研究发现，通过蛋白质工程构建的三特异性抗体可实现对小鼠多发性骨髓瘤细胞（MM）的选择性杀伤。作用机理如图所示。下列叙述不正确的是（ ）

A．三特异性抗体是由三种抗体融合得到
B．正常小鼠的组织细胞中不会大量表达CD38
C．三特异性抗体通过T细胞的活化并释放细胞因子提高对MM的杀伤力
D．三特异性抗体与CD28结合抑制T细胞的死亡，从而使T细胞维持一定数量
【答案】A
【详解】A、三特异性抗体指的是一种抗体，通过蛋白质工程构建三特异性抗体的基因表达载体，然后获得相应的杂交瘤细胞，最终获得三特异性抗体，不是三种抗体融合而成，A错误；
B、小鼠多发性骨髓瘤（MM）细胞是癌细胞，其基因发生突变后会合成CD38，CD38主要在多发性骨髓瘤（MM）中表达，在正常细胞中不表达或少量表达，B正确；
C、从图中看出，三特异性抗体结合T淋巴细胞表面受体TCR，能促进T细胞活化产生并释放细胞因子，提高机体对MM细胞的杀伤力，C正确；
D、从图中看出，一方面三特异性抗体与T细胞膜上的CD28结合，抑制T细胞死亡，另一方面特异性抗体与T细胞膜上的TCR结合，促进T细胞活化，所以三抗与TCR和CD28结合可保持较高的T细胞数量和活性，D正确。
故选A。
16．（25-26高三上·江苏淮安·阶段练习）下图为利用定点突变技术改造基因的过程示意图，相关叙述正确的是（ ）
A．上述技术流程属于蛋白质工程的范畴
B．通过电泳检测，可确认基因突变是否成功
C．上述过程需要人工设计核糖核苷酸片段作为引物
D．导入受体细胞后复制产生的子代 DNA 大多为突变型
【答案】A
【详解】A、蛋白质工程是通过修改基因或创造合成新基因来改变生物的遗传和表型性状，合成新的蛋白质，上述技术流程属于蛋白质工程的范畴，A正确；
B、电泳可用于检测PCR产物或质粒大小，但确认突变需结合测序或限制性酶切分析，仅凭电泳无法直接确认突变，B错误；
C、定点突变通常使用脱氧核糖核酸（DNA）作为引物，C错误；
D、定点突变通常通过PCR或质粒复制实现，但子代DNA是否为突变型取决于突变效率和筛选方式，若未特别筛选，据图示过程，野生型和突变型可能相等，D错误。
故选A。
1．（24-25高二下·广东·阶段练习）科研人员通过切割pET-SEA质粒上SEA基因和终止子之间的部分序列，将猪流行性腹泻病毒的S基因插入，以构建pET-SEA-S重组质粒，并在大肠杆菌中高效表达SEA-S融合蛋白。目的基因导入受体细胞后，可用PCR技术筛选出成功导入pET-SEA-S融合表达质粒的细菌。下列各项所列引物用来进行筛选最合适的是（　　）
A．引物1和引物4
B．引物3和引物4
C．引物1和引物5
D．引物2和引物5
【答案】A
【分析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，利用的原理是DNA复制，需要条件有模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶），过程包括：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。
【详解】据题干信息可知，需要用PCR技术筛选出含有pET-SEA-S融合表达质粒的细菌，即扩增出的DNA片段含有SEA基因和S基因，故选引物1和引物4，A正确，BCD错误。
故选A。
2．（24-25高二下·重庆·期中）工业化生产紫杉醇的过程如图所示，工作人员对红豆杉愈伤组织进行液体悬浮培养分离出单细胞，再用培养液培养获得大量红豆杉细胞.已知红豆杉愈伤组织在没有诱导因子的条件下几乎不合成紫杉醇。下列叙述错误的是（ ）
A．可通过向培养液中添加生长素和细胞分裂素来促进外植体愈伤化
B．图示生产过程中可选取红豆杉植株的幼嫩部位作为外植体
C．紫杉醇属于红豆杉细胞生长，发育所必需的营养物质
D．外植体的使用及整个培养过程中需要保证严格的无菌环境
【答案】C
【分析】植物组织培养技术是指将离体的植物器官、组织或细胞等，在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术。其具体流程为：接种外植体→诱导愈伤组织→诱导生芽→诱导生根→移栽成活。
【详解】A、通过向培养基中添加适宜比例的生长素和细胞分裂素，可以诱导外植体产生愈伤组织，该过程中生长素和细胞分裂素的比例适中，A正确；
B、幼嫩部位分裂旺盛，进行组织培养时，通常选用红豆杉等植物幼嫩部位作外植体，以利于诱导愈伤组织形成，B正确；
C、紫杉醇属于红豆杉产生的次生代谢产物，并非植物细胞生长发育所必需的营养物质，C错误；
D、外植体的获取和培养均需要在无菌条件下进行，以防止杂菌污染，D正确。
故选C。
3．（24-25高三上·山东日照·期末）为制备荧光标记的DNA探针，研究人员向①~④号反应管中分别添加了DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种dNTP（dATP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dCTP）以及适量单链DNA（如下）。实验中提供的温度条件不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区（遵循碱基互补配对原则）。实验结束后，能达到实验目的的是（　　）
反应管①：5'—ACCGGTGCATGCA—3'
反应管②：5'—AAGCATCGCGATG—3'
反应管③：5'-TGGACTACCGAAC—3；5'—GGTAGTCCACCGA—3'
反应管④：5'—GAGATAGAATAGC—3'；5'—CAGGGCTATTCTA—3'
A．①② B．①③ C．②④ D．③④
【答案】C
【分析】PCR反应体系需要耐高温的DNA聚合酶、扩增缓冲液、水等，还需要引物。各反应管均未单独加入引物，则需加入的单链间形成互补区段并存在未配对的区域。
【详解】提供的温度条件不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区，反应管①：单链DNA为5'—ACCGGTGCATGCA—3' ，提供的温度条件不能自身互补配对形成双链结构（只有8个碱基配对），不能达到实验的目的；
反应管②：单链DNA为5'—AAGCATCGCGATG—3' ，可以自身互补配对，可以形成大于9个连续碱基对的双链DNA区，能达到实验目的；
反应管③：两条单链DNA 5'-TGGACTACCGAAC—3和5'—GGTAGTCCACCGA—3 ，不能互补配对形成双链结构，不能形成大于9个连续碱基对的双链DNA区，在DNA聚合酶作用下利用含荧光标记的dCTP等原料无法合成荧光标记的DNA探针，不能达到实验的目的；
反应管④：两条单链DNA 5'—GAGATAGAATAGC—3'和5'—CAGGGCTATTCTA—3 ，可以相互配对形成双链结构，能形成大于9个连续碱基对的双链DNA区，能达到实验目的。
综上所述，实验结束后，能达到实验目的的是②④，即C正确，ABD错误。
故选C。
4．（24-25高三下·甘肃平凉·阶段练习）如图表示基因工程中两种工具酶的作用。下列叙述正确的是（ ）
A．a表示限制酶，不同限制酶识别序列不同，产生的末端也不同
B．b表示DNA连接酶，其与DNA聚合酶催化的底物完全相同
C．a的识别序列越长，该序列在DNA中出现的概率就越小
D．欲将图示中的切口“缝合”起来，必须使用E.coliDNA连接酶
【答案】C
【分析】关于限制酶，考生可以从以下几方面把握：（1）来源：主要从原核生物中分离纯化出来。（2）特异性：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。（3）结果：形成黏性末端或平末端。注意：用限制酶切割DNA时，每切开一个切口需要水解两个磷酸二酯键。
【详解】
A、据图可知，a表示限制酶，b表示DNA连接酶。通常情况下，不同限制酶识别双链DNA分子特定的核苷酸序列，切割产生不同的末端，有时不同限制酶虽然识别的序列不同，但是可以产生相同的末端，例如， BamH7和Sau3A7的识别序列及切割位点分别是、，产生的黏性末端都是5′-GATC-3′，A错误；
B、DNA连接酶和DNA聚合酶都能连接磷酸二酯键，但是DNA连接酶是将两个片段之间的磷酸二酯键连接起来，而DNA聚合酶需要依赖DNA作模板将单个的脱氧核苷酸与片段的3′—OH末端连接形成磷酸二酯键，二者催化的底物不同，B错误；
C、限制酶的识别序列越长，该序列在DNA中出现的概率就越小，C正确；
D、E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶都能够连接黏性末端，D错误。
故选C。
5．（2025·吉林松原·模拟预测）DNA的粗提取、PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中的重要程序，下列叙述正确的是（　　）
A．DNA不溶于NaCl溶液，但可以溶于酒精
B．PCR扩增过程中，缓冲液中需要加入Ca2+以激活DNA聚合酶
C．电泳过程中，DNA相对分子质量越小，移动的速度越快
D．对PCR扩增得到的DNA进行电泳后，加入核酸染料在紫外灯下进行观察
【答案】C
【分析】PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
【详解】A、DNA能溶于2mol/L的NaCl溶液，不溶于酒精，A错误；
B、真核细胞和细菌的DNA聚合酶需要Mg2+激活，因此，PCR反应缓冲液中一般需要加入Mg2+以激活DNA聚合酶，B错误；
C、在琼脂糖凝胶中，DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，DNA相对分子质量越小，移动的速度越快，C正确；
D、配制凝胶时加入核酸染料，将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合后，再进行电泳，待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳，取出凝胶置于紫外灯下观察和照相，D错误。
故选C。
6．（2025·广西柳州·二模）科学家常利用λ-Red同源重组酶系统进行基因敲除。图为科学家运用A-Red同源重组酶系统到大肠杆菌（E．coli）内进行靶基因敲除的过程，其中重组质粒pKD46在30℃时正常复制，而37℃时自动丢失。下列说法正确的是（　　）
A．HA1和HA2分别添加在两种引物的5'和3'端
B．过程I和Ⅱ的培养温度分别是30℃、37℃
C．靶基因敲除过程，只发生磷酸二酯键的断裂及合成
D．若过程I是使用含青霉素的培养基成功筛选出含质粒pKD46的大肠杆菌，则说明该大肠杆菌自身含有青霉素抗性基因
【答案】B
【分析】基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品．基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
【详解】A、HA1和HA2分别添加在两种引物的5'端，A错误；
B、过程Ⅰ是pKD46导入受体菌，并在受体菌内进行复制，因此所需温度为30℃，过程Ⅱ需除去重组质粒pKD46，所需温度为37℃，B正确；
C、为通过同源重组将大肠杆菌基因组DNA上的特定靶基因敲除，除发生磷酸二酯键的断裂及合成，也发生氢键的断裂和形成，C错误；
D、若过程I是使用含青霉素的培养基成功筛选出含质粒pKD46的大肠杆菌，导入的pKD46中含有青霉素抗性基因，并在大肠杆菌细胞中正常表达，因而能用含有青霉素的培养基将成功导入该质粒的大肠杆菌筛选出来，说明该大肠杆菌自身不含有青霉素抗性基因，D错误。
故选B。
7．（2025高三·河北·专题练习）基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是在体外构建重组DNA，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品的遗传技术。这一过程需要用到多种操作工具。下列有关基因工程工具的叙述中，错误的是（ ）
A．T4 DNA连接酶和E．coli DNA连接酶都能连接具有互补黏性末端的DNA片段
B．基因工程中被用作载体的质粒常有特殊的标记基因
C．携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，未整合到受体DNA上的也能复制
D．DNA连接酶作用于核糖核苷酸间的磷酸二酯键，其作用与DNA聚合酶相同
【答案】D
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】A、T4DNA连接酶和E．coli DNA连接酶都能连接具有互补黏性末端的DNA片段，A正确；
B、在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造。这些质粒上常有特殊的标记基因，如四环素抗性基因等，便于重组DNA分子的筛选，B正确；
C、携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制，C正确；
D、DNA连接酶是连接DNA片段间的磷酸二酯键，DNA聚合酶是DNA复制时起作用的酶，作用于DNA片段与游离的脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，两者作用不同，D错误。
故选D。
二、多选题
8．（24-25高二下·河北衡水·阶段练习）水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。研究人员发现，用赖氨酸替换水蛭素第47位的天冬酰胺可以提高它的抗凝血活性。下列关于这项替换研究工作的叙述，错误的是（　　）
A．可行的直接操作对象是水蛭素基因
B．该过程与中心法则的信息流动方向一致，即DNA→mRNA→蛋白质
C．该蛋白质工程进行中难度最大的操作是改造水蛭素基因
D．改造的水蛭素基因导入微生物后可利用发酵工程生产水蛭素
【答案】BC
【详解】A、蛋白质工程的直接操作对象是基因，用赖氨酸替换水蛭素第47位的天冬酰胺属于蛋白质工程范畴，可行的直接操作对象是水蛭素基因，A正确；
B、该过程与中心法则的信息流动方向相反，蛋白质工程中需先设计所需蛋白质结构，再反向推导并修改基因序列，B错误；
C、蛋白质工程进行中难度最大的操作是根据蛋白质的功能设计蛋白质的结构，C错误；
D、改造后的水蛭素基因导入微生物（如大肠杆菌或酵母菌）后，可通过发酵工程大规模生产水蛭素，D正确。
故选BC。
9．（24-25高二下·全国·课后作业）植物体细胞杂交过程中细胞融合的方式有对称融合和非对称融合。对称融合是将两个物种的两个完整的原生质体融合在一起，由于两个物种的全套基因组合在一起，有用基因和不利基因共处于一个杂种植株中，往往需要多次回交才能去除杂种植株中的不利基因。非对称融合是将一个物种的部分染色体和细胞质与另一个物种的一个完整原生质体融合在一起，可以较好地减少不利基因的重组，所得杂种植株只需较少次数的回交就可以达到改良作物的目的。下列相关叙述正确的是（　　）
A．植物体细胞杂交可以克服有性杂交的不亲和性，打破物种之间的生殖隔离
B．对称融合方式中，两个植物细胞完成融合的标志是两个细胞核融合形成一个细胞核
C．在非对称融合过程中，可以利用物理射线、化学试剂等方式去除部分染色体
D．在进行植物体细胞杂交之前，必须先利用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁
【答案】ACD
【分析】1、植物体细胞杂交是两个不同物种的体细胞，在一定的条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的技术；
2、植物体细胞杂交可以克服远缘杂交不亲和的障碍，能够打破物种生殖隔离的限制。
【详解】A、植物体细胞杂交技术在打破生殖隔离、实现远缘杂交育种、培育植物新品种等方面展示出独特的优势，A正确；
B、对称融合方式中，两个植物细胞完成融合的标志是杂种细胞再生出新的细胞壁，B错误；
C、非对称融合是将一个物种的部分染色体和细胞质与另一个物种的一个完整原生质体融合在一起，利用物理射线、化学试剂等方式可去除部分染色体，C正确；
D、植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，细胞壁会阻碍细胞间的杂交，因此在进行植物体细胞杂交之前，必须先利用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，D正确。
故选ACD。
三、解答题
10．（24-25高二下·福建福州·期末）水蛭是我国传统中药材，主要药理成分水蛭素（由65个氨基酸组成的单链多肽）为水蛭蛋白中的重要成分，具有良好的抗凝血作用。研究人员拟通过蛋白质工程改造水蛭素，提高其抗凝血活性。请回答下列问题：
(1)蛋白质工程基本思路如下图所示，物质a是 ，物质b是 。
(2)若通过乳腺生物反应器生产水蛭素，简要实验思路为：将改造后的水蛭素基因与 的启动子重组在一起，构建好的表达载体通过 导入哺乳动物的 。
(3)与该方法相比，诱变育种的缺点是（写出两点） 。
(4)除乳腺生物反应器外，也可利用大肠杆菌为受体生产水蛭素，其中用 生产的水蛭素活性更高，原因是 。
(5)为检测受体细胞中的水蛭素基因是否翻译，可用 通过 技术进行检测。
【答案】(1) 多肽链 mRNA
(2) 乳腺蛋白基因 显微注射法 受精卵
(3)突变具有不定向性突变率低，需要大量处理实验材料
(4) 乳腺生物反应器 大肠杆菌是原核生物，没有内质网和高尔基体，不能对水蛭素进行加工，而乳腺生物反应器产生的水蛭素可经过加工具有活性
(5) 抗水蛭素的抗体 抗原-抗体杂交
【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。也就是说，蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是包含多学科的综合科技工程领域。
【详解】（1）蛋白质工程的基本思路是从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因。根据这个流程，物质a是多肽链，它是根据预期蛋白质结构推测出的氨基酸序列连接而成的，物质b是mRNA，基因转录形成mRNA，再由mRNA翻译形成蛋白质。
（2）将改造后的水蛭素基因与乳腺蛋白基因的启动子重组在一起，构建好的表达载体通过显微注射法导入哺乳动物的受精卵。
（3）突变具有不定向性突变率低，需要大量处理实验材料。
（4）利用乳腺生物反应器生产的水蛭素活性更高。原因是大肠杆菌是原核生物，没有内质网和高尔基体等细胞器，无法对水蛭素进行加工修饰；而乳腺生物反应器是真核生物细胞，有内质网和高尔基体等细胞器，能够对水蛭素进行加工修饰，使其空间结构更接近天然水蛭素，从而具有更高的活性
（5）检测受体细胞中的水蛭素基因是否翻译，可用抗水蛭素的抗体通过抗原-抗体杂交技术进行检测。
11．（23-24高一下·甘肃天水·阶段练习）“克隆猴”是中国科学家率先建立起可有效模拟人类疾病的动物模型，实现了我国在非人灵长类研究领域由国际“并跑”到“领跑”的转变。回答下列问题：
(1)相对于植物组织培养而言，动物尤其是高等动物的克隆比较困难的原因是 。克隆过程中一般利用未受精的去核卵细胞作为受体细胞，原因是 。
(2)克隆猴培养过程中需要用 酶处理使细胞从瓶壁上分离下来。
(3)克隆猴除了利用到动物细胞工程的相关生物技术手段外，还必须用到 。
(4)如果培育大量的转基因克隆猴，可采用 技术将药用蛋白基因导入到受精卵中，并采用 技术检测受体细胞中的染色体DNA上是否插入了目的基因。
【答案】(1) 动物细胞难以脱分化，体细胞核内大部分基因在分化后就不再表达，很难被激活 卵细胞体积大，易操作，营养丰富，未受精的卵细胞的细胞质中含有激活体细胞的细胞核全能性的物质
(2)胰蛋白/胶原蛋白
(3)早期胚胎培养、胚胎移植技术
(4) 显微注射 PCR
【分析】1、将动物的一个细胞的细胞核移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物。原理：动物细胞核的全能性。
2、取动物组织块→剪碎组织→用胰蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养液中（原代培养）→放入二氧化碳培养箱培养→贴满瓶壁的细胞用酶分散为单个细胞，制成细胞悬液→转入培养液（传代培养）→放入二氧化碳培养箱培养。
【详解】（1）动物细胞难以脱分化，体细胞核内虽然有全套基因，但大部分基因在分化后就不再表达，很难被激活，因此相对于植物组织培养而言，动物尤其是高等动物的克隆比较困难。
卵细胞体积大，易操作，营养丰富，未受精的卵细胞的细胞质中含有激活体细胞的细胞核全能性的物质，因此克隆过程中一般利用未受精的去核卵细胞作为受体细胞。
（2）克隆猴培养过程中需要用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理使细胞从瓶壁上分离下来。
（3）克隆猴除了利用到动物细胞工程的相关生物技术手段外，还必须用到早期胚胎培养、胚胎移植技术。
（4）如果培育大量的转基因克隆猴，可采用显微注射技术将药用蛋白基因导入到受精卵中，并采用PCR技术检测受体细胞中的染色体DNA上是否插入了目的基因。
12．（23-24高三上·浙江·阶段练习）人血清白蛋白（HSA）在临床上的需求量大，由于其来源有限和有生物污染的风险，重组人血清白蛋白（rHSA），成为其重要的替代品。回答下列（一）（二）小题：
（一）途径一：基因工程结合发酵工程构建人血清白蛋白工程菌：
科研人员将HSA基因转入酵母菌细胞，获得了重组人血清白蛋白。图为酵母菌基因改造以及工业化发酵生产rHSA的过程示意图，其中I、II、III、IV是四种不同的限制酶，具各自识别的酶切位点如表所示。

限制酶 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ
识别序列及切割位点
(1)随着测序技术的发展，为获取人血清白蛋白基因，可通过检索 获取其编码序列，用化学合成法制备得到。将HSA基因插入质粒中时，最好选择限制酶 进行共同切割。将受体酵母菌置于含有 的培养基中进行筛选培养，以获得能表达HSA的细胞。
(2)采用PCR等技术可检测目的基因是否插入酵母菌染色体中，得到的PCR产物一般通过 来鉴定，DNA分子的迁移速率与 有关（答出2点即可）。
(3)工业化发酵生产rHSA的过程一般包括菌种的选育，扩大培养、 接种、发酵、产品的分离、提纯等方面，将rHSA工程菌接种至发酵罐内进行扩增，培养过程中可定期取样并使用细菌计数板对 （填“菌体”或“菌落”）进行直接计数，以评估增殖情况。发酵结束后，采用 （答出2点即可）等方法获得所需的发酵产品。
（二）途径二：基因工程结合细胞工程构建人血清白蛋白乳腺反应器
I.采集良种供体牛的卵母细胞和精液，通过体外受精，形成奶牛受精卵；
II.构建基因的表达载体，并将其导入奶牛受精卵，形成转基因细胞；
III.电脉冲刺激转基因细胞促使其形成早期胚胎；
IV.将胚胎移植到受体母牛的子宫中，最终发育成转基因小牛。
(4)实验步骤I中，在体外受精前，需要对奶牛的精子进行 处理。
(5)实验步骤II中，将人的血清白蛋白基因导入奶牛受精卵最为有效的方法是 。
(6)实验步骤III中进行动物早期胚胎的体外培养时，培养液中通常要加入 等天然成分，培养条件要求无毒、无菌的环境，具体措施有 （答出两点即可）。当胚胎发育至囊胚阶段，取其 做DNA分析来进行性别鉴定，筛选出发育状态良好的雄性胚胎进行移植。
(7)实验步骤IV进行胚胎移植，其实质是 。为实现这一工序，需用相应激素对受体进行 处理。
(8)有人提议将乳腺反应器改成膀胱反应器，请分析利用膀胱反应器比乳腺反应器产量高的原因 （答出两点即可）。
【答案】(1) 基因数据库 Ⅱ、Ⅳ 四环素
(2) 琼脂糖凝胶电泳 凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象
(3) 培养基的配制、灭菌 菌体 过滤、沉淀、离心、静置
(4)获能
(5)显微注射法
(6) 血清（或血清、血浆） 对培养液和所用培养用具进行无菌处理；培养液中添加一定量的抗生素；定期更换培养液以便清除代谢产物 滋养层细胞
(7) 早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移 同期发情
(8)雌性牛只有在哺乳期才能分泌乳汁，而尿液不会受到性别和发育期的影响，尿液的分泌总量要比乳汁的分泌量大
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）化学合成法可合成已知序列的基因，可以检索基因数据库获取目的基因的编码序列，用化学合成法制备。图中四环素抗性基因中含有酶切位点Ⅰ，氨苄青霉素抗性基因中含有Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ三种酶切位点，若切割时使用限制酶Ⅰ，则两种抗生素抗性基因均被破坏，若使用限制酶Ⅱ、Ⅳ进行酶切时，会将氨苄青霉素抗性基因破坏，为了能同时切割质粒和目的基因，防止反向连接和自身环化，同时使基因表达载体存在完整的标记基因，需要使用限制酶Ⅱ、Ⅳ。氨苄青霉素抗性基因被破坏，四环素抗性基因未被破坏，故筛选时可将受体酵母菌置于含有四环素的培养基中进行筛选培养，以获得能表达HSA的细胞。
（2）DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
（3）由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。微生物的纯培养包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。利用显微镜进行直接计数，也是一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法，该方法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物菌体的数量，统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。如果发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结束之后，采用过滤、沉淀、离心、静置等方法将菌体分离和干燥。
（4）精子经过获能后才具有与卵细胞结合形成受精卵的能力。
（5）将目的基因导入受体细胞最常用的方法是显微注射法。
（6）由于所需的成分可能有未知部分，动物细胞培养需要加入血清等天然成分；培养条件要求无毒无菌的环境，对培养液和所用培养用具进行无菌处理；培养液中添加一定量的抗生素；定期更换培养液以便清除代谢产物都有助于提供无毒、无菌的环境；滋养层细胞可发育成胎膜和胎盘，对个体发育的关键部分没有影响，故取滋养层细胞做DNA分析来进行性别鉴定。
（7）在胚胎移植操作中，应对供体和受体母牛进行同期发情处理，以使供体和受体处于相同的生理状态，使胚胎在移植前后所处的生理环境保持一致。由此可见，胚胎移植的实质是早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移。
（8）乳腺生物反应器具有一定的局限性，雌性牛只有在哺乳期才能分泌乳汁，而尿液不会受到性别和发育期的影响，尿液的分泌总量要比乳汁的分泌量大。
2 / 2第3章 基因工程
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A考点归类·专项突破
考点01 重组DNA技术的基本工具（重点）
考点02 基因工程的基本操作程序（重点）
考点03 基因工程的应用
考点04 蛋白质工程的原理和应用（难点）
B系统整合·能力进阶
考点01 重组DNA技术的基本工具
1．（24-25高二下·安徽）如图为鸡血细胞中DNA的粗提取和鉴定实验过程中的部分操作示意图。下列相关叙述正确的是（ ）
A．该实验的正确操作顺序为a→e→b→c→d
B．步骤b完成后应取上清液继续进行实验
C．可以在离心管中进行离心分离替代步骤c
D．步骤e中加入的为NaCl溶液，步骤d试管中会出现紫色
2．（2023·山东菏泽·一模）大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA。用三种限制酶处理提取的产物，电泳结果如图所示。下列关于质粒的粗提取和鉴定的叙述不正确的是（ ）
A．提取DNA时可加入酒精，使溶于酒精的蛋白质等物质溶解
B．将提取的DNA溶于2mol/LNaCl溶液后；可用二苯胺试剂进行鉴定
C．电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着它所带电荷相反的电极移动的原理
D．根据电泳结果，质粒上一定没有限制酶I和Ⅱ的切割位点，而有限制酶Ⅲ的切割位点
3．（23-24高三上·山西运城）如图为一个DNA分子片段，下列有关叙述正确的是（　　）

A．限制酶和DNA聚合酶、DNA连接酶均促使DNA分子中②处化学键的生成
B．图中有4种脱氧核苷酸，与RNA的核苷酸区别的是五碳糖不同
C．DNA发生初步水解的过程中，发生断裂的键是②④
D．DNA分子中的氮元素和磷元素，分布在其基本骨架上
4．（24-25高二下·河南·期末）某同学以鸡血细胞为材料进行“DNA粗提取和鉴定”实验。下列叙述错误的是（ ）
A．向鸡血细胞液中加入蒸馏水并搅拌，可加快血细胞破裂，释放DNA
B．向DNA溶液中加入2mol/LNaCl溶液，能析出DNA并提高其纯度
C．向DNA溶液中加入体积分数为95%的预冷酒精，可对DNA进行纯化
D．DNA溶液与二苯胺试剂反应后，溶液呈现的蓝色越深，说明提取的DNA越多
考点02 基因工程的基本操作程序
5．（24-25高三上·云南·阶段练习）研究人员欲将某动物体内基因X导入大肠杆菌的质粒中保存，质粒含有抗性基因与酶切位点，目的基因两端酶切位点如下图所示，下列叙述错误的是（　　）

A．使用HindⅢ和XbaI进行酶切能避免基因X与质粒反向连接
B．目的基因X与质粒连接可使用E.coliDNA连接酶
C．Ca2+处理大肠杆菌能降低细胞膜通透性，有利于重组质粒导入受体细胞
D．含有基因X的大肠杆菌能在氨苄青霉素选择培养基中生长
6．（2025高三下·四川绵阳·专题练习）生命是物质、能量和信息的统一体，而遗传信息的流动要依赖于DNA复制和转录。下列关于DNA复制与转录过程的区别，不包括（　　）
A．直接能源物质有区别 B．发生的时期有区别
C．碱基配对原则有区别 D．利用的模板有区别
7．（24-25高三下·云南昭通·阶段练习）如图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述错误的是（　　）
A．①→②过程可用不同的限制酶分别切割Ti质粒和含抗虫基因的DNA
B．②→③过程可用Ca2+处理农杆菌细胞
C．③→④过程是将重组Ti质粒整合到受体植物细胞的染色体DNA上
D．④→⑤过程体现了植物细胞的全能性，不同阶段所需的培养条件不同
8．（24-25高三下·全国·阶段练习）研究人员用琼脂糖凝胶电泳对产物进行鉴定时，出现了“拖尾”现象，即产物在凝胶上呈弥散状态，条带模糊不清。已知蛋白质会阻碍分子在琼脂糖凝胶中的迁移，对其产生拖拽作用。下列对出现“拖尾”现象原因的分析，不合理的是（ ）
A．提取基因组时蛋白质等杂质过多
B．目标存在多种变异，PCR模板不纯
C．复性温度太低，引物与模板出现错配
D．配制琼脂糖溶液时没有添加核酸染料
考点03 基因工程的应用
9．（24-25高二下·广西·阶段练习）多种方法获得的早期胚胎，均需移植给受体才能获得后代。据此分析，下列叙述错误的是（ ）
A．①②③均通过有性生殖的方式产生
B．胚胎移植前不需要对受体牛进行免疫抑制处理
C．受体必须是同种的且生理状况相同的雌性动物
D．③可通过②技术实现扩大化生产，①②可通过③技术实现性状改良
10．（25-26高三上·广东·阶段练习）CRISPR/Cas9技术在遗传病治疗中展现出巨大潜力。镰刀型细胞贫血症是因β-珠蛋白基因（HBB）发生点突变所致，患者红细胞呈镰刀状。科学家计划利用CRISPR/Cas9技术治疗该疾病，流程大致为：设计靶向突变HBB基因的单链向导RNA（SgRNA），引导Cas9蛋白切割突变序列，同时导入正常HBB基因片段作为修复模板，最终使细胞表达正常β-珠蛋白。下列叙述错误的是（ ）
A．若sgRNA与某正常基因序列存在部分碱基互补，可能导致Cas9错误切割该基因（脱靶效应）
B．Cas9切割突变HBB基因后，细胞可利用导入的正常基因片段进行修复，但该过程易受细胞内酶的影响，导致修复片段降解
C．构建重组表达载体时，需包含sgRNA基因、Cas9基因和正常HBB基因模板，无需添加启动子，需添加特定的标记基因
D．不同患者的HBB基因突变位点可能存在差异，因此需根据患者具体突变序列设计特异性sgRNA
11．（24-25高一下·湖南·期中）下表为四种细胞的部分结构、功能信息。下列叙述错误的是（　　）
细胞壁 核糖体 核膜 光合作用
甲 + + + —
乙 + + — —
丙 — + + —
丁 + + — +
A．甲可能是酵母菌，乙可能是乳酸菌
B．乙不能进行光合作用，属于异养型生物
C．甲和丙的细胞呼吸的场所和产物可能相同
D．丁可以进行光合作用是因为含有光合色素和相关酶等
12．（24-25高二下·辽宁沈阳·期中）为了救治患重度地中海贫血的女儿，一对夫妇在医院通过设计试管婴儿技术（植入前对胚胎进行遗传学诊断），生下了一个不携带地中海贫血致病基因且配型适合于患病姐姐的健康男婴，用他的脐带血帮助姐姐进行造血干细胞移植。下列叙述正确的是（ ）
A．植入前胚胎需培养在95%的O2和5%的CO2的气体环境中
B．伦理上禁止进行非医学必要的性别筛选和胚胎筛选
C．经遗传学诊断后，造血干细胞移植将不发生免疫排斥反应
D．设计试管婴儿技术利用了胚胎移植和胚胎分割技术
考点04 蛋白质工程的原理和应用
13．（24-25高二下·黑龙江齐齐哈尔·期末）基于 AI（人工智能）的蛋白质设计方法可通过现有蛋白质数据库及机器深度“学习算法”来预测新型蛋白质的结构和功能。下列叙述错误的是（ ）
A．AI 预测新型蛋白质的结构和功能依据的原理是中心法则
B．AI 可帮助人们深入了解蛋白质分子结构和功能的关系
C．获得 AI 设计的蛋白质，可通过改造或合成基因来实现
D．AI 可帮助人们高效地设计出自然界没有的蛋白质
14．（24-25高二下·云南·阶段练习）我国科学家将AI与蛋白质设计改造相结合，建立了全球最大的蛋白质数据集，基于该数据集训练的AI模型，能预测并设计蛋白质的功能。下列叙述错误的是（ ）
A．对蛋白质分子的设计和改造是通过蛋白质工程来实现的
B．蛋白质工程需改变蛋白质分子中的全部氨基酸序列
C．用AI预测新型蛋白质的基因结构应依据中心法则原理
D．根据AI设计的蛋白质推导出的对应基因序列不是唯一的
15．（24-25高二下·福建厦门·期中）研究发现，通过蛋白质工程构建的三特异性抗体可实现对小鼠多发性骨髓瘤细胞（MM）的选择性杀伤。作用机理如图所示。下列叙述不正确的是（ ）

A．三特异性抗体是由三种抗体融合得到
B．正常小鼠的组织细胞中不会大量表达CD38
C．三特异性抗体通过T细胞的活化并释放细胞因子提高对MM的杀伤力
D．三特异性抗体与CD28结合抑制T细胞的死亡，从而使T细胞维持一定数量
16．（25-26高三上·江苏淮安·阶段练习）下图为利用定点突变技术改造基因的过程示意图，相关叙述正确的是（ ）
A．上述技术流程属于蛋白质工程的范畴
B．通过电泳检测，可确认基因突变是否成功
C．上述过程需要人工设计核糖核苷酸片段作为引物
D．导入受体细胞后复制产生的子代 DNA 大多为突变型
1．（24-25高二下·广东·阶段练习）科研人员通过切割pET-SEA质粒上SEA基因和终止子之间的部分序列，将猪流行性腹泻病毒的S基因插入，以构建pET-SEA-S重组质粒，并在大肠杆菌中高效表达SEA-S融合蛋白。目的基因导入受体细胞后，可用PCR技术筛选出成功导入pET-SEA-S融合表达质粒的细菌。下列各项所列引物用来进行筛选最合适的是（　　）
A．引物1和引物4 B．引物3和引物4
C．引物1和引物5 D．引物2和引物5
2．（24-25高二下·重庆·期中）工业化生产紫杉醇的过程如图所示，工作人员对红豆杉愈伤组织进行液体悬浮培养分离出单细胞，再用培养液培养获得大量红豆杉细胞.已知红豆杉愈伤组织在没有诱导因子的条件下几乎不合成紫杉醇。下列叙述错误的是（ ）
A．可通过向培养液中添加生长素和细胞分裂素来促进外植体愈伤化
B．图示生产过程中可选取红豆杉植株的幼嫩部位作为外植体
C．紫杉醇属于红豆杉细胞生长，发育所必需的营养物质
D．外植体的使用及整个培养过程中需要保证严格的无菌环境
3．（24-25高三上·山东日照·期末）为制备荧光标记的DNA探针，研究人员向①~④号反应管中分别添加了DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种dNTP（dATP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dCTP）以及适量单链DNA（如下）。实验中提供的温度条件不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区（遵循碱基互补配对原则）。实验结束后，能达到实验目的的是（　　）
反应管①：5'—ACCGGTGCATGCA—3'
反应管②：5'—AAGCATCGCGATG—3'
反应管③：5'-TGGACTACCGAAC—3；5'—GGTAGTCCACCGA—3'
反应管④：5'—GAGATAGAATAGC—3'；5'—CAGGGCTATTCTA—3'
A．①② B．①③ C．②④ D．③④
4．（24-25高三下·甘肃平凉·阶段练习）如图表示基因工程中两种工具酶的作用。下列叙述正确的是（ ）
A．a表示限制酶，不同限制酶识别序列不同，产生的末端也不同
B．b表示DNA连接酶，其与DNA聚合酶催化的底物完全相同
C．a的识别序列越长，该序列在DNA中出现的概率就越小
D．欲将图示中的切口“缝合”起来，必须使用E.coliDNA连接酶
5．（2025·吉林松原·模拟预测）DNA的粗提取、PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中的重要程序，下列叙述正确的是（　　）
A．DNA不溶于NaCl溶液，但可以溶于酒精
B．PCR扩增过程中，缓冲液中需要加入Ca2+以激活DNA聚合酶
C．电泳过程中，DNA相对分子质量越小，移动的速度越快
D．对PCR扩增得到的DNA进行电泳后，加入核酸染料在紫外灯下进行观察
6．（2025·广西柳州·二模）科学家常利用λ-Red同源重组酶系统进行基因敲除。图为科学家运用A-Red同源重组酶系统到大肠杆菌（E．coli）内进行靶基因敲除的过程，其中重组质粒pKD46在30℃时正常复制，而37℃时自动丢失。下列说法正确的是（　　）
A．HA1和HA2分别添加在两种引物的5'和3'端
B．过程I和Ⅱ的培养温度分别是30℃、37℃
C．靶基因敲除过程，只发生磷酸二酯键的断裂及合成
D．若过程I是使用含青霉素的培养基成功筛选出含质粒pKD46的大肠杆菌，则说明该大肠杆菌自身含有青霉素抗性基因
7．（2025高三·河北·专题练习）基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是在体外构建重组DNA，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品的遗传技术。这一过程需要用到多种操作工具。下列有关基因工程工具的叙述中，错误的是（ ）
A．T4 DNA连接酶和E．coli DNA连接酶都能连接具有互补黏性末端的DNA片段
B．基因工程中被用作载体的质粒常有特殊的标记基因
C．携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，未整合到受体DNA上的也能复制
D．DNA连接酶作用于核糖核苷酸间的磷酸二酯键，其作用与DNA聚合酶相同
二、多选题
8．（24-25高二下·河北衡水·阶段练习）水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。研究人员发现，用赖氨酸替换水蛭素第47位的天冬酰胺可以提高它的抗凝血活性。下列关于这项替换研究工作的叙述，错误的是（　　）
A．可行的直接操作对象是水蛭素基因
B．该过程与中心法则的信息流动方向一致，即DNA→mRNA→蛋白质
C．该蛋白质工程进行中难度最大的操作是改造水蛭素基因
D．改造的水蛭素基因导入微生物后可利用发酵工程生产水蛭素
9．（24-25高二下·全国·课后作业）植物体细胞杂交过程中细胞融合的方式有对称融合和非对称融合。对称融合是将两个物种的两个完整的原生质体融合在一起，由于两个物种的全套基因组合在一起，有用基因和不利基因共处于一个杂种植株中，往往需要多次回交才能去除杂种植株中的不利基因。非对称融合是将一个物种的部分染色体和细胞质与另一个物种的一个完整原生质体融合在一起，可以较好地减少不利基因的重组，所得杂种植株只需较少次数的回交就可以达到改良作物的目的。下列相关叙述正确的是（　　）
A．植物体细胞杂交可以克服有性杂交的不亲和性，打破物种之间的生殖隔离
B．对称融合方式中，两个植物细胞完成融合的标志是两个细胞核融合形成一个细胞核
C．在非对称融合过程中，可以利用物理射线、化学试剂等方式去除部分染色体
D．在进行植物体细胞杂交之前，必须先利用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁
三、解答题
10．（24-25高二下·福建福州·期末）水蛭是我国传统中药材，主要药理成分水蛭素（由65个氨基酸组成的单链多肽）为水蛭蛋白中的重要成分，具有良好的抗凝血作用。研究人员拟通过蛋白质工程改造水蛭素，提高其抗凝血活性。请回答下列问题：
(1)蛋白质工程基本思路如下图所示，物质a是 ，物质b是 。
(2)若通过乳腺生物反应器生产水蛭素，简要实验思路为：将改造后的水蛭素基因与 的启动子重组在一起，构建好的表达载体通过 导入哺乳动物的 。
(3)与该方法相比，诱变育种的缺点是（写出两点） 。
(4)除乳腺生物反应器外，也可利用大肠杆菌为受体生产水蛭素，其中用 生产的水蛭素活性更高，原因是 。
(5)为检测受体细胞中的水蛭素基因是否翻译，可用 通过 技术进行检测。
11．（23-24高一下·甘肃天水·阶段练习）“克隆猴”是中国科学家率先建立起可有效模拟人类疾病的动物模型，实现了我国在非人灵长类研究领域由国际“并跑”到“领跑”的转变。回答下列问题：
(1)相对于植物组织培养而言，动物尤其是高等动物的克隆比较困难的原因是 。克隆过程中一般利用未受精的去核卵细胞作为受体细胞，原因是 。
(2)克隆猴培养过程中需要用 酶处理使细胞从瓶壁上分离下来。
(3)克隆猴除了利用到动物细胞工程的相关生物技术手段外，还必须用到 。
(4)如果培育大量的转基因克隆猴，可采用 技术将药用蛋白基因导入到受精卵中，并采用 技术检测受体细胞中的染色体DNA上是否插入了目的基因。
12．（23-24高三上·浙江·阶段练习）人血清白蛋白（HSA）在临床上的需求量大，由于其来源有限和有生物污染的风险，重组人血清白蛋白（rHSA），成为其重要的替代品。回答下列（一）（二）小题：
（一）途径一：基因工程结合发酵工程构建人血清白蛋白工程菌：
科研人员将HSA基因转入酵母菌细胞，获得了重组人血清白蛋白。图为酵母菌基因改造以及工业化发酵生产rHSA的过程示意图，其中I、II、III、IV是四种不同的限制酶，具各自识别的酶切位点如表所示。

限制酶 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ
识别序列及切割位点
(1)随着测序技术的发展，为获取人血清白蛋白基因，可通过检索 获取其编码序列，用化学合成法制备得到。将HSA基因插入质粒中时，最好选择限制酶 进行共同切割。将受体酵母菌置于含有 的培养基中进行筛选培养，以获得能表达HSA的细胞。
(2)采用PCR等技术可检测目的基因是否插入酵母菌染色体中，得到的PCR产物一般通过 来鉴定，DNA分子的迁移速率与 有关（答出2点即可）。
(3)工业化发酵生产rHSA的过程一般包括菌种的选育，扩大培养、 接种、发酵、产品的分离、提纯等方面，将rHSA工程菌接种至发酵罐内进行扩增，培养过程中可定期取样并使用细菌计数板对 （填“菌体”或“菌落”）进行直接计数，以评估增殖情况。发酵结束后，采用 （答出2点即可）等方法获得所需的发酵产品。
（二）途径二：基因工程结合细胞工程构建人血清白蛋白乳腺反应器
I.采集良种供体牛的卵母细胞和精液，通过体外受精，形成奶牛受精卵；
II.构建基因的表达载体，并将其导入奶牛受精卵，形成转基因细胞；
III.电脉冲刺激转基因细胞促使其形成早期胚胎；
IV.将胚胎移植到受体母牛的子宫中，最终发育成转基因小牛。
(4)实验步骤I中，在体外受精前，需要对奶牛的精子进行 处理。
(5)实验步骤II中，将人的血清白蛋白基因导入奶牛受精卵最为有效的方法是 。
(6)实验步骤III中进行动物早期胚胎的体外培养时，培养液中通常要加入 等天然成分，培养条件要求无毒、无菌的环境，具体措施有 （答出两点即可）。当胚胎发育至囊胚阶段，取其 做DNA分析来进行性别鉴定，筛选出发育状态良好的雄性胚胎进行移植。
(7)实验步骤IV进行胚胎移植，其实质是 。为实现这一工序，需用相应激素对受体进行 处理。
(8)有人提议将乳腺反应器改成膀胱反应器，请分析利用膀胱反应器比乳腺反应器产量高的原因 （答出两点即可）。
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