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第2章 细胞工程
第2节 动物细胞工程
一 动物细胞培养
动物细胞工程常用技术包括：动物细胞培养、动物细胞融合和动物细胞核移植等，其中以动物细胞培养为基础。
知识一 动物细胞培养
1．概念
从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。
2．培养条件
(1)营养
①成分：糖类、氨基酸、无机盐、维生素等。
②培养基类型
a．合成培养基：将细胞所需的营养物质(糖类、氨基酸、无机盐、维生素等)按种类和所需量严格配制而成的培养基。
b．天然成分：使用合成培养基时，通常需要加入血清等一些天然成分，原因是血清中含有尚未全部研究清楚的细胞所需的营养物质。
c．培养动物细胞一般使用液体培养基，也称为培养液。
(2)无菌、无毒的环境
①培养液和培养用具灭菌处理。
②无菌环境下操作。
③培养液定期更换的目的：清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。
(3)温度、pH和渗透压
①适宜的温度：哺乳动物多以(36.5±0.5) ℃为宜。
②适宜的pH：多数细胞生存的适宜pH为7.2～7.4。
③适宜的渗透压。
(4)气体环境
①组成：动物细胞培养所需气体主要有O2和CO2。
②不同气体的作用
O2：是细胞代谢所必需的。
CO2：维持培养液的pH。
③培养容器：通常采用培养皿或松盖培养瓶。
④培养仪器：含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱。
3．培养过程
(1)取动物组织
一般取材于动物胚胎或幼龄动物的组织、器官。因为这些细胞分化程度低，增殖能力强，容易培养。
(2)制成细胞悬液
①将细胞分散成单个细胞，原因从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此抑制了生长和增殖；另外能使细胞与培养液充分接触，更易进行物质交换。
②常用的方法包括：机械方法，酶解法（用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理）
③用培养液将细胞制成细胞悬液
(3)进行原代培养
①将细胞悬液放入培养皿或培养瓶内，置于适宜环境中培养。原代培养：通常指分瓶之前的细胞培养，即动物组织经处理后的初次培养称为原代培养。
②体外培养的动物细胞类型，包括悬浮在培养液中生长增殖的细胞；贴附于某些基质表面生长增殖的细胞。
(4)进行传代培养
①传代培养：将分瓶之后的细胞培养称为传代培养。
②原因：悬浮生长的细胞分裂受阻，是因为细胞密度过大、有害代谢物积累和营养物质缺乏等；贴壁生长的细胞还会因接触抑制而分裂受阻。
③方法：悬浮生长类的细胞直接用离心法收集；贴壁生长类的细胞需要重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集。之后，将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养。
[例1]一般来说，下列关于动物细胞培养需要满足的条件及相关叙述，正确的是(　　)
①无毒的环境　②无菌的环境　③合成培养基需加血清　④温度与动物体温相近　⑤需要O2，不需要CO2　⑥CO2能调节培养液pH
A.①②③④⑤⑥ B.①②③④
C.①③④⑤⑥ D.①②③④⑥
【答案】D
【详解】动物细胞培养需要无菌、无毒的环境，①②正确；用于动物细胞培养的合成培养基需加入糖类、氨基酸、无机盐、维生素等，还需加入血清等天然成分，③正确；动物细胞培养需要适宜的温度和pH，其中温度与动物体温相近，④正确；动物细胞培养需要一定的气体环境：95%的空气和5%的CO2，⑤错误；5%的CO2能调节培养液pH，⑥正确。
故选D。
[例2]实验小鼠皮肤细胞培养的基本过程如图所示。下列叙述错误的是(　　)
A.培养液中往往添加一定量抗生素，以防止培养过程被污染
B.乙过程对皮肤组织可用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理
C.丙过程属于原代培养，此过程的细胞能保持正常的二倍体核型
D.丁过程属于传代培养，此过程大多数细胞会发生突变，朝着癌细胞的方向发展
【答案】
【详解】A、抗生素具有抑制细菌的作用，为防止培养液被污染，可在培养液中加入一定量的抗生素，A正确；
B、乙过程表示将皮肤组织处理分散成单个皮肤细胞，该过程可用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，B正确；
C、丙过程表示原代培养，此过程中细胞遗传物质没有发生改变，具有正常的二倍体核型，C正确；
D、丁过程是传代培养，该过程中少部分细胞遗传物质发生了变化而能继续增殖，朝着癌细胞的方向发展，D错误。
故选D。
知识二 干细胞培养及其应用
1．来源
早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中。
2．类型
(1)胚胎干细胞(简称ES细胞)
①概念：存在于早期胚胎中，具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。
②局限：胚胎干细胞必须从胚胎中获取，这涉及伦理问题，因而限制了它在医学上的应用。
③成果：目前科学家已经分离了兔、牛、猴和人等的ES细胞，并证明了ES细胞可以在体外分化成心肌细胞、神经元和造血干细胞等细胞。
(2)成体干细胞
①概念：成体组织或器官内的干细胞。
②类型：骨髓中的造血干细胞、神经系统中的神经干细胞和睾丸中的精原干细胞等。
③特点：具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。
④作用：有着自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关。
(3)诱导多能干细胞
①概念：通过体外诱导成纤维细胞等，获得类似胚胎干细胞的一种细胞，被称为诱导多能干细胞(简称iPS细胞)。
②应用：治疗小鼠的镰状细胞贫血；用iPS细胞治疗阿尔茨海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展。
③优点：诱导过程无须破坏胚胎；iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。
④制备方法：借助载体将特定基因导入细胞中，直接将特定蛋白导入细胞中或者用小分子化合物等来诱导形成iPS细胞。
⑤来源：成纤维细胞、已分化的T细胞、B细胞等。
[例1]下列关于人体造血干细胞的叙述，错误的是(　　)
A.造血干细胞比胚胎干细胞的分化程度更高
B.造血干细胞属于成体干细胞，但不具有组织特异性
C.造血干细胞可不断增殖和分化，适当捐献造血干细胞不影响人体健康
D.造血干细胞移植是治疗白血病的有效手段
【答案】B
【详解】A、造血干细胞可以分化成红细胞、白细胞和血小板，胚胎干细胞可以分化为任何一种组织细胞，所以造血干细胞的分化程度更高，A正确；
B、成体干细胞是成体组织或器官内的干细胞，具有组织特异性，只能分化为特定的细胞或组织，B错误；
C、骨髓中的造血干细胞可不断增殖和分化，不断产生红细胞、白细胞和血小板，从而补充到血液中去，所以适当捐献造血干细胞不影响人体健康，C正确；
D、造血干细胞移植可以取代白血病患者病变的造血干细胞，是治疗白血病的有效手段，D正确。
故选B。
[例2]如图为诱导多能干细胞(iPS细胞)用于治疗糖尿病的示意图，下列相关叙述错误的是(　　)
A.干细胞存在于多种组织和器官中，包括胚胎干细胞和成体干细胞等
B.诱导iPS细胞分化的实质是动物细胞核具有发育的全能性
C.除图中的成纤维细胞，已分化的T细胞和B细胞等均能被诱导为iPS细胞
D.将分化得到的胰岛细胞移植回病人体内治疗，理论上可避免免疫排斥反应
【答案】B
【详解】A、在一定条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞，干细胞存在于多种组织和器官中，包括胚胎干细胞和成体干细胞等，A正确；
诱导iPS细胞分化的实质是基因选择性表达的结果，B错误；
iPS细胞最初是由成纤维细胞转化而来的，后来发现已分化的T细胞和B细胞等均能被诱导为iPS细胞，C正确；
用患者自己的体细胞通过体外诱导成胰岛细胞，并将胰岛细胞移植回病人体内，由于移植的细胞是由病人自身细胞经诱导分化得到的，理论上可以避免免疫排斥反应，D正确。　　　
故选B。
难点知识一 动物细胞培养的过程
1．动物细胞培养过程
2．动物细胞培养过程中酶的处理
(1)用酶“两次”处理的目的：第一次使用的目的是使组织细胞分散开；第二次使用的目的是使细胞从瓶壁上脱离下来，便于分散后继续培养。
(2)使细胞分散开的原因：一是能保证细胞所需要的营养供应；二是能保证细胞内有害代谢物的及时排出。
(3)不能用胃蛋白酶处理：由于大多数动物细胞培养的适宜pH为7.2～7.4，而胃蛋白酶发挥作用的最适pH为2.0左右，因此不能用胃蛋白酶使细胞分散开。
3．有关动物细胞培养知识点可归纳为4个“2”
(1)培养材料为“2”：即动物胚胎、幼龄动物的组织和器官。
(2)培养过程为“2”：即原代培养、传代培养。
(3)胰蛋白酶使用“2”次：即原代培养和传代培养中均使用，目的是使细胞分散开。
(4)细胞生长特点有“2”个：即贴壁生长和接触抑制。
4．动物细胞培养和植物组织培养的比较
项目 植物组织培养 动物细胞培养
不同点 理论 基础 植物细胞的全能性 细胞增殖
前处理 无菌、离体 无菌；用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理
取材 植物较幼嫩的部位或花药等 动物胚胎、幼龄动物的器官或组织
培养基性质 固体 液体
培养基成分 水、矿质元素、蔗糖、维生素、植物激素等 糖类、氨基酸、无机盐、维生素等
结果 最终产生新个体，体现了细胞的全能性 产生大量细胞，不形成新个体
相同点 ①都需人工条件下的无菌操作；②都需要适宜的温度、pH等条件；③都进行有丝分裂，都不涉及减数分裂
讨论1：如何区分原代培养和传代培养？必须进行传代培养的原因是什么？
通常将分瓶之前的细胞培养，即动物组织经处理后的初次培养称为原代培养，将分瓶后的细胞培养称为传代培养。悬浮培养的细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻，贴壁细胞在生长增殖时，除受上述因素的影响外，还会发生接触抑制现象，因此必须进行传代培养。
讨论2：动物细胞培养和植物组织培养一样可以获得完整个体吗？
动物细胞培养时细胞只进行生长和增殖，不能得到完整个体，但是植物组织培养可以获得完整个体。
巩固训练1
1．下图表示动物细胞培养的过程，下列有关叙述正确的是(　　)
A.乙中进行动物细胞培养时应通入适量的CO2以调节pH
B.宜用胃蛋白酶将甲中的动物组织分散为单个的细胞
C.甲中用于培养的动物细胞宜取自成年动物
D.丙中细胞大量繁殖后，细胞之间相互接触能促进细胞的分裂　
【答案】A
【详解】A、动物细胞培养过程中，需要通入一定量的CO2以维持培养液的pH，A正确；
B、将甲中的动物组织分散为单个的细胞应该用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，不能用胃蛋白酶，B错误；
C、甲中用于培养的动物细胞宜取自动物胚胎或幼龄动物的器官或组织等，C错误；
D、丙中细胞大量繁殖后，细胞之间相互接触会抑制细胞的分裂，D错误。
故选A。
巩固训练2
下图为科学家在实验室中培养“人造牛肉”的简要过程。相关叙述正确的是（ ）
A．用胃蛋白酶处理牛肌肉组织，获得分裂能力强的肌肉干细胞
B．生物反应器中应充以95%空气加5%CO2的混合气体，CO2的作用是刺激细胞呼吸
C．培养液中的支架提供了更多的细胞吸附面积，有利于细胞贴壁生长
D．“人造牛肉”的培养有利于牛肉的工厂化生产，但环境污染严重
【答案】C
【详解】A、胰蛋白酶处理动物组织，可以使组织分散成单个细胞，利于动物细胞培养，A错误；
B、生物反应器中应充以95%空气加5%CO2的混合气体，CO2的作用是维持pH，B错误；
C、动物细胞培养过程中悬液中的细胞会很快贴附在瓶壁上，所以细胞贴附瓶壁的培养瓶或培养皿的内表面光滑，无毒，易于贴附，如果想得到大量的产物，可以增大细胞吸附面积，有利于细胞贴壁生长，C正确；
D、理论上来说，仅来自1只动物的干细胞，可制成的肉品数量，比宰杀1头牛还多100万倍，可有利于牛肉的工厂化生产，同时也可减少对土地、饮用水和饲料的需求，且温室气体等其他环境污染物也会减少，D错误。
故选C。
难点知识二 干细胞培养及其应用
1.种类及存在部位
2.iPS细胞的培养和应用
讨论1：诱导多能干细胞用于治疗人类的某些顽症的原理是什么？
诱导多能干细胞可以被诱导分化形成新的组织细胞，经移植可使坏死或退化部位得以修复并恢复正常功能。
讨论2：诱导多能干细胞为什么可以解决供体器官不足和器官移植后免疫排斥的问题？
通过干细胞体外诱导分化，可以培育出人造器官，从而解决供体器官不足的问题。又由于人造器官是由病人自身细胞经诱导分化形成的，所以理论上可以避免免疫排斥反应。
巩固训练3
造血干细胞是机体所有血细胞和免疫细胞的起源，是具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞。下列叙述错误的是（ ）
A．来自骨髓的造血干细胞可分化成淋巴细胞和吞噬细胞
B．造血干细胞具有多向分化潜能，体现了细胞全能性
C．自体造血干细胞移植可用于治疗系统性红斑狼疮
D．若人体内出现造血干细胞缺陷，会引起免疫缺陷病
【答案】B
【详解】A、吞噬细胞、B细胞和T细胞均由造血干细胞分裂分化而来，A正确；
B、造血干细胞分化为血细胞和免疫细胞，没有形成完整个体，不能体现细胞全能性，B错误；
C、系统性红斑狼疮属于自身免疫病，可对系统性红斑狼疮患者进行自体造血干细胞移植，C正确；
D、淋巴细胞等来源于造血干细胞，若人体内出现造血干细胞缺陷，会引起免疫缺陷病，D正确。
故选B。
巩固训练4
如图是科学家制备iPS细胞的一种方法，可用于治疗镰状细胞贫血。下列叙述错误的是 （ ）
A．过程①可以取成纤维细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞等
B．过程②需要加入适当的诱导分化的因子
C．过程③包含细胞分化，遗传物质发生改变
D．将 iPS 技术制备的专用干细胞移植回患者后，不发生免疫排斥
【答案】C
【详解】A、过程①表示从患者体内取出具有增殖分化能力的体细胞，可以是成纤维细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞等，A正确；
B、过程②表示成纤维细胞失去特定的形态，形成iPS细胞，类似于植物组织培养的脱分化过程，B正确；
C、过程②表示iPS细胞增殖分化产生了多种类型的细胞，该过程包含了细胞分化，细胞分化的实质是基因的选择性表达，因此遗传物质没有发生改变，C错误；
D、iPS技术使用患者自己的体细胞通过体外诱导成iPS细胞，所以将iPS细胞增殖分化出的不同细胞移植回病人体内，理论上可以避免免疫排斥反应，D正确。
故选C。
一、选择题
1．下图为肾脏上皮细胞培养过程示意图，下列有关叙述错误的是（ ）
A．甲→乙过程需要用胰蛋白酶处理
B．丙过程指细胞在添加血清的合成培养基中原代培养
C．丙过程培养的细胞与体内细胞的生长特性相近
D．丁过程为传代培养，细胞都能进行无限增殖
【答案】D
【详解】A、甲 → 乙过程需要用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理获得单细胞悬液然后进行细胞培养，A正确；
B、由分析可知，丙过程指细胞在添加血清的合成培养基中原代培养的过程，B正确；
C、丙过程为原代培养，会出现细胞贴壁生长和接触抑制现象，与体内细胞的生长特性相近，C正确；
D、丁过程为传代培养，细胞传至 10~50 代会逐渐缓慢，直到完全停止，当继续传代培养时少部分细胞会获得不死性，这些细胞已经发生了突变，D错误。
故选D。
2．下列有关动物细胞培养及细胞工程的叙述，正确的是（ ）
A．动物组织培养过程中不会出现细胞的分化
B．动物成熟体细胞的细胞核仍然具有脱分化和使其后代细胞再分化实现全能性的能力
C．培养骨髓瘤细胞时要定期使细胞从培养瓶壁上脱离，以解除接触抑制
D．细胞传代培养过程中，一定要用到胰蛋白酶处理
【答案】B
【详解】A、动物组织培养过程中会出现细胞的分化，A错误；
B、动物成熟体细胞的细胞核仍然具有脱分化和使其后代细胞再分化实现全能性的能力，B正确；
C、骨髓瘤细胞失去了接触抑制，C错误；
D、动物细胞传代培养过程中，接触抑制类的细胞需要用胰蛋白酶处理脱落，但是悬浮培养的细胞不需要用到胰蛋白酶，D错误。
故选B。
3．如图是动物细胞培养过程中可能出现的接触抑制现象，对此下列有关叙述错误的是（ ）
A．正常动物细胞培养过程中均会出现接触抑制现象
B．癌细胞无接触抑制因而培养时可形成多层细胞
C．出现接触抑制时细胞将停止分裂活动
D．出现接触抑制后需利用胰蛋白酶消化后才可进行传代培养
【答案】A
【详解】A、接触抑制是体外细胞培养时贴附型细胞生长的特性，故正常动物细胞培养过程中不都会出现接触抑制现象，A错误；
B、癌细胞培养过程中不会出现接触抑制现象，因而癌细胞培养时可形成多层细胞，B正确；
C、出现接触抑制时细胞将停止分裂活动，C正确；
D、出现接触抑制后需利用胰蛋白酶消化后是贴壁生长的细胞变为单个游离细胞才可进行传代培养，D正确。
故选A。
4．“细胞培养肉”是依据肉类自然生长规律，利用体外培养技术调控“种子细胞”的增殖分化过程而生产的可食用肉类，其结构、营养价值接近“真肉”。下列叙述错误的是（ ）
A．成体干细胞可作为“种子细胞”
B．生产过程需要定期更换培养液
C．接触抑制现象有利于生产“细胞培养肉”
D．应用“细胞培养肉”或能降低生态足迹
【答案】C
【详解】A、“细胞培养肉”的生产依赖于动物细胞的分裂分化，因此“种子细胞”必须具有较强的分裂、分化能力，成体干细胞分裂能力强，分化程度低，符合要求，可作为“种子细胞”，A正确；
B、体外培养动物细胞时，需要定期更换培养液，以补充营养物质和清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害，B正确；
C、接触抑制现象是指细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖，“细胞培养肉”的结构接近“真肉”，说明由多层细胞构成，接触抑制现象不利于这一结构的形成，不利于“细胞培养肉”的生产，C错误；
D、与传统养殖业相比，“细胞培养肉”的生产不涉及动物的饲养，不浪费土地资源，可能降低生态足迹，D正确。
故选C。
5．下图为动物细胞培养过程中细胞数量的指数变化示意图。下列表述错误的是（　　）
A．原代培养过程中，细胞可能会发生基因突变
B．动物细胞培养所需气体为氧气
C．动物细胞传代培养时通常需要用胰蛋白酶处理
D．无限细胞系适于作为生产甲流疫苗的宿主细胞
【答案】B
【详解】A、基因突变具有随机性和普遍性，所以原代培养过程中，细胞可能会发生基因突变，A正确；
B、动物细胞培养所需要的气体环境是95%的空气和5%CO2的混合气体，不是氧气，B错误；
C、动物细胞有贴壁生长和接触抑制现象，所以传代培养时需加入胰蛋白酶分散成单个细胞，C正确；
D、无限细胞系能够无限增殖，适于作为生产甲流疫苗的宿主细胞，D正确。
故选B。
6．科学家利用多人的干细胞培育出了“三维大脑模型”。研究人员将来自人类供体的干细胞浸泡在一种特殊配制的混合溶液中，以促进干细胞转化为特定的细胞类型，且培养条件也促使细胞聚集成复杂的3D形状，通过精细的调控和优化，成功将干细胞培育成具有类似大脑结构和功能的组织。下列相关叙述错误的是（ ）
A．三维大脑模型的形成是基因选择性表达的结果
B．混合溶液中含有诱导干细胞分化的物质
C．各类脑组织细胞内DNA和RNA序列均相同
D．该模型可为研究人类大脑的发育机制提供支持
【答案】C
【详解】A、干细胞是一类分化程度较低的细胞，干细胞培育成具有类似大脑结构和功能的组织的根本原因是基因选择性表达，A正确；
B、干细胞能分化成脑细胞，说明培养液中含有定向诱导分化的物质，B正确；
C、 各类脑组织细胞内DNA和RNA序列具有以下特点 ：DNA相同 ：同一生物体不同组织细胞中的DNA是相同的，因为它们都来源于同一个受精卵的有丝分裂。这意味着所有细胞都继承了相同的遗传信息 。RNA不同 ：尽管不同组织细胞的DNA是相同的，但由于基因的选择性表达，不同细胞中的RNA种类和数量会有所不同。基因的选择性表达导致不同细胞中转录出的RNA种类和数量不同，从而使得细胞具有不同的功能和特性 ，C错误；
D、科学家利用这种干细胞技术获得大脑模型后，可加深对脑科学的研究，例如，探索大脑的发育机制，预测人脑对新药物和新疗法的反应等等，D正确。
故选C。
7．我国科学家利用重编程技术成功建立了大熊猫成纤维细胞来源的诱导多能干细胞系（iPSCs），这些大熊猫iPSCs不仅能在体外培养条件下稳定增殖传代，还能在体内和体外分化条件下，分化为特定的功能性细胞。下列相关叙述错误的是（ ）
A．iPSCs体外增殖传代的过程是通过有丝分裂实现的
B．iPSCs体外分化的过程与细胞内基因表达的调控有关
C．多能干细胞的细胞核和成纤维细胞的细胞核均具有全能性
D．利用iPSCs分化成的特定组织可治疗大熊猫的各种疾病
【答案】D
【详解】A、诱导多能干细胞的增殖方式为有丝分裂，A正确；
B、iPSCs体外分化的实质是基因的选择性表达，而基因选择性表达与基因表达的调控有关，B正确；
C、多能干细胞和成纤维细胞都属于动物细胞，其细胞核都具有全能性，C正确；
D、利用iPSCs分化成的特定组织，只能治疗某些特定疾病，并不能治疗各种疾病，D错误。
故选D。
8．下列有关植物组织培养和动物细胞培养的比较，正确的是(　　)
植物组织培养 动物细胞培养
原理 植物细胞的全能性 细胞增殖
培养前的处理 离体 将组织细胞分散开
特有成分 植物激素 血清
特殊环境条件 再分化需光 气体环境
主要过程 脱分化、再分化 原代培养、传代培养
A.后者没有体现细胞的全能性，是因为细胞核中没有本物种全套的遗传物质
B.将动物组织细胞分散开时只能使用胶原蛋白酶或胰蛋白酶
C.两者的培养过程都只涉及有丝分裂，不进行减数分裂
D.植物组织培养时也有将组织细胞分散开的操作
【答案】C
【详解】A、动物细胞培养的原理是细胞增殖，该过程没有体现细胞的全能性，但动物细胞核中有本物种全套的遗传物质，A错误；
B、将动物组织细胞分散开，除使用胶原蛋白酶或胰蛋白酶外，还可使用机械的方法，B错误；
C、植物组织培养和动物细胞培养的原理分别是植物细胞的全能性和细胞增殖，这两个过程都只涉及有丝分裂，细胞不进行减数分裂，C正确；
D、植物组织培养时没有将组织细胞分散开的操作，D错误。
故选C。
9．人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)广泛应用于神经系统、心血管系统和骨骼肌、皮肤创面的再生和修复。科研人员采用不同浓度血清培养hUCMSCs，48 h后收集各组上清液，用以培养角膜上皮细胞(HCECs)，过程及结果如表。下列相关叙述错误的是(　　)
实验步骤 A组 B组 C组 D组
配制不同浓度的血清 1% 3% 5% 10%
培养hUCMSCs细胞48 h后，取上清液 进行 进行 进行 进行
用上清液培养HCECs 进行 进行 进行 进行
24 h后测吸光度(数值越大代表活细胞数目越多) 0.67 0.68 0.52 0.48
A.本实验目的是探究培养HCECs的最适血清浓度
B.用胰蛋白酶处理使HCECs分散以检测吸光度
C.血清浓度较低时有利于获得更多的HCECs
D.hUCMSCs可能产生某种物质调控HCECs增殖
【答案】A
【详解】A、根据题意可知，用于培养HCECs的不是血清，而是用不同浓度血清培养hUCMSCs细胞48 h后得到的上清液，A错误；
B、为检测HCECs吸光度，可利用胰蛋白酶处理使HCECs分散成单个细胞，B正确；
C、由表格数据可知，血清浓度较低时活细胞数目较多，即有利于获得更多的HCECs，C正确；
利用不同浓度的血清培养hUCMSCs得到的上清液来培养HCECs，其培养后活细胞数目不同，D、原因可能是hUCMSCs在培养过程中产生某种物质调控HCECs增殖，D正确。
故选A。
10．为了初步检测药物X和Y的抗癌活性，在细胞培养板的每个孔中加入相同数量的肝癌细胞，使其贴壁生长，实验组加入等体积相同浓度的溶于二甲基亚砜(溶剂)的药物X或Y，培养过程及结果如图所示。下列有关叙述错误的是(　　)
A.细胞培养液中通常需要加入血清
B.可用胰蛋白酶处理使肝癌细胞脱落下来并进行计数
C.对照组中应加入等体积的无菌蒸馏水
D.根据实验结果，可以初步判断药物X的抗癌效果较好
【答案】
【详解】A、依题意，该实验目的是检测药物X和Y的抗癌活性，自变量是药物X或Y，因变量是肝癌细胞数量。动物细胞培养时，除了需要加入营养物质糖类、氨基酸、无机盐、维生素等，还需要加入血清等一些天然成分，A正确；
B、对于已经贴壁生长的动物细胞，可用胰蛋白酶处理使肝癌细胞分散并脱落下来，有利于计数，B正确；
C、实验设计应遵循单一变量原则，对照组中不能加入等体积的无菌蒸馏水，应加入等体积的二甲基亚砜(溶剂)，C错误；
D、由实验结果可知，添加药物X的组别肝癌细胞数目最少，可以初步判断药物X的抗癌效果较好，D正确。
故选C。
二、非选择题
11．下图是有关细胞部分生命历程，请据图回答：
(1)①过程所形成的子代细胞形态、功能各不相同，这个过程叫作________，其根本原因是______________________________________________________________。
(2)D→E→F过程所使用的技术是________，其理论基础是_______________。
(3)②为癌细胞的无限增殖过程，研究发现，木瓜叶提取物能杀死癌细胞。某实验小组想通过癌细胞的培养来加以证明，请完成相应步骤：
第一步：将小块癌变组织剪碎，用________处理，使组织分散成单个细胞，用动物细胞培养液制成癌细胞悬浮液。
第二步：取两个规格相同的培养瓶，编号甲和乙，分别装入等量的癌细胞悬浮液，甲中加入________________________________，乙中加入________________。
第三步：将上述两个培养瓶放在37 ℃、含95%空气和5%________的培养箱中培养一段时间。
第四步：一段时间后，若发现________培养瓶中的癌细胞生长速度缓慢，死亡率升高，说明木瓜叶提取物具有抗癌作用。
【答案】
(1)细胞分化　基因的选择性表达
(2)植物组织培养　植物细胞具有全能性
(3)胰蛋白酶(或胶原蛋白酶)　适量木瓜叶提取物溶液　等量的生理盐水　CO2　甲
【详解】
(1)由题图可知，①过程是细胞分化，其根本原因(实质)是基因的选择性表达。(2)图中D→E→F表示植物组织培养过程，其原理是植物细胞具有全能性。
(3)本实验的目的是通过癌细胞的培养证明木瓜叶提取物能杀死癌细胞。癌细胞培养之前需要将小块癌变组织剪碎，用胰蛋白酶或胶原蛋白酶等处理，使组织分散成单个细胞，用动物细胞培养液制成癌细胞悬浮液。实验设计要遵循对照原则和单一变量原则，该实验的自变量为是否加入木瓜叶提取物，因此甲(实验组)需要加入适量木瓜叶提取物溶液，乙(对照组)加入等量的生理盐水。将上述两个培养瓶放在37 ℃、含95%空气和5%CO2的培养箱中培养。一段时间后，若发现甲培养瓶中的癌细胞生长速度缓慢，死亡率升高，说明木瓜叶提取物具有抗癌作用。
12．上海某医院病理室为确诊一患者的肿瘤是良性还是恶性，切取了一小块肿瘤组织进行培养。请回答下列问题：
(1)培养之前，肿瘤组织必须先用胰蛋白酶或_____等处理成单个细胞。
(2)由于人们对动物细胞所需营养物质尚未完全搞清楚，培养时需要在配制的合成培养基的基础上加入_____等天然成分。动物细胞培养应在含5%CO2的恒温培养箱中进行，CO2的作用是_____。
(3)与正常细胞相比，在显微镜下可见明显增多的细胞器是_____（答出两项即可）。
(4)在肿瘤组织培养了60代后，发现有恶性肿瘤细胞存在，那么能否判断该肿瘤组织就是恶性肿瘤？_____。说明理由：_____。
(5)动物细胞培养有许多用途。请列举两种：_____、_____。
【答案】
(1)胶原蛋白酶
(2) 血清 维持培养液的pH
(3)线粒体、核糖体
(4)不能 因为传代培养超过10~50代后，部分细胞会在细胞培养时程中获得不死性而发生癌变
(5)大规模生产生物制品（如单克隆抗体、疫苗等） 判断某种细胞的毒性
【详解】
1）培养之前，由于细胞彼此连在一起，肿瘤组织必须先用胰蛋白酶或胶原蛋白酶等处理成单个细胞。
（2）动物细胞培养所需的营养物质与体内基本相同，即水、无机盐、氨基酸、维生素、糖类、生长因子等。由于人们对动物细胞所需营养物质尚未完全搞清楚，培养时需要在配制的合成培养基的基础上加入血清等天然成分。动物细胞培养需要气体环境：95%空气+5%CO2，O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH，故动物细胞培养应在含5%CO2的恒温培养箱中进行。
（3）与正常细胞相比，肿瘤细胞由于进行细胞分裂合成大量的蛋白质需要能量，故在显微镜下观察可看见明显增多的细胞器有核糖体和线粒体。
（4）在肿瘤组织培养了60代后，发现有恶性肿瘤细胞的存在，也不能判断该肿瘤组织就是恶性肿瘤，因为传代培养超过10~50代后，部分细胞会在培养过程中获得不死性而发生癌变。
（5）动物细胞培养有许多用途。许多重要的生物制品，如病毒疫苗、单克隆抗体等，都可以借助动物细胞培养技术来大规模生产；动物细胞培养可用于判断某种细胞的毒性等。
13．科学家把4个与胚胎发育相关的特异性基因导入成年小鼠细胞，培养出了诱导多能干细胞，称为iPS细胞，再将iPS细胞转入小鼠乙体内培养，结果如下图所示。请回答下列问题：
(1)在形态上，胚胎干细胞具有的特点是____________________________；在功能上，具有______________。
(2)克隆培养iPS细胞时，为了防止杂菌感染，需在培养液中加入一定量的________。在iPS细胞诱导培养的过程中会出现大量不具备干细胞功能的细胞，若用维生素C处理，能显著提高iPS细胞的诱导成功率，原因可能是维生素C可诱导某些基因________。
(3)研究人员将iPS细胞团注入缺乏T细胞的小鼠体内，细胞团能继续生长。由此可推测，图1中iPS细胞团逐渐退化的原因是___________________________________________。
【答案】
(1)体积小，细胞核大，核仁明显 发育的全能性
(2)抗生素 重新表达
(3)小鼠乙发生免疫反应
【详解】
(1)在形态上，胚胎干细胞具有的特点是：胚胎干细胞体积小、细胞核大、核仁明显；在功能上，具有发育的全能性。
(2)克隆培养iPS细胞时，为防止杂菌污染，需要加入一定量的抗生素，在iPS细胞诱导培养的过程中会出现大量不具备干细胞功能的细胞，若用维生素C处理，能显著提高iPS细胞的诱导成功率，原因是维生素C可诱导某些基因重新表达。
(3)将iPS细胞团注射入缺乏T细胞的小鼠体内，细胞团能继续生长，由此可推测图中iPS细胞团逐渐退化的原因是小鼠乙（受体）发生免疫反应，使得iPS细胞团失去生命力。
2 / 2第2章 细胞工程
第2节 动物细胞工程
一 动物细胞培养
动物细胞工程常用技术包括： 、 和 等，其中以 为基础。
知识一 动物细胞培养
1．概念
从动物体中取出相关的组织，将它分散成 ，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞 和 的技术。
2．培养条件
(1)营养
①成分： 、 、无机盐、维生素等。
②培养基类型
合成培养基：将细胞所需的 (糖类、氨基酸、无机盐、维生素等)按 和
严格配制而成的培养基。
天然成分：使用合成培养基时，通常需要加入 等一些天然成分，原因是
。
c．培养动物细胞一般使用 ，也称为 。
(2)无菌、无毒的环境
①培养液和培养用具 处理。
② 环境下操作。
③培养液 的目的： ，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。
(3)温度、pH和渗透压
①适宜的温度：哺乳动物多以( ) ℃为宜。
②适宜的pH：多数细胞生存的适宜pH为 。
③适宜的渗透压。
(4)气体环境
①组成：动物细胞培养所需气体主要有 和 。
②不同气体的作用
O2： 。
CO2： 。
③培养容器：通常采用 或 。
④培养仪器：含有 和 的混合气体的CO2培养箱。
3．培养过程
(1)取动物组织
一般取材于 或 的组织、器官。因为这些细胞分化程度 ，增殖能力 ，容易培养。
(2)制成细胞悬液
①将细胞分散成 ，原因从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此
了生长和增殖；另外能使细胞与培养液 ，更易进行物质交换。
②常用的方法包括： ， （用 、胶原蛋白酶等处理）
③用培养液将细胞制成细胞悬液
(3)进行原代培养
①将细胞悬液放入培养皿或培养瓶内，置于适宜环境中培养。原代培养：通常指分瓶 的细胞培养，即动物组织经处理后的 称为原代培养。
②体外培养的动物细胞类型，包括 在培养液中生长增殖的细胞； 于某些基质表面生长增殖的细胞。
(4)进行传代培养
①传代培养：将分瓶 的细胞培养称为传代培养。
②原因：悬浮生长的细胞分裂受阻，是因为细胞 、 和
等；贴壁生长的细胞还会因 而分裂受阻。
③方法：悬浮生长类的细胞直接用 收集；贴壁生长类的细胞需要重新用
等处理，使之分散成 ，然后再用 收集。之后，将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养。
[例1]一般来说，下列关于动物细胞培养需要满足的条件及相关叙述，正确的是(　　)
①无毒的环境　②无菌的环境　③合成培养基需加血清　④温度与动物体温相近　⑤需要O2，不需要CO2　⑥CO2能调节培养液pH
A.①②③④⑤⑥ B.①②③④
C.①③④⑤⑥ D.①②③④⑥
[例2]实验小鼠皮肤细胞培养的基本过程如图所示。下列叙述错误的是(　　)
A.培养液中往往添加一定量抗生素，以防止培养过程被污染
B.乙过程对皮肤组织可用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理
C.丙过程属于原代培养，此过程的细胞能保持正常的二倍体核型
D.丁过程属于传代培养，此过程大多数细胞会发生突变，朝着癌细胞的方向发展
知识二 干细胞培养及其应用
1．来源
、骨髓和脐带血等多种组织和器官中。
2．类型
(1)胚胎干细胞(简称ES细胞)
①概念：存在于 中，具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的 甚至个体的潜能。
②局限：胚胎干细胞必须从 中获取，这涉及伦理问题，因而限制了它在医学上的应用。
③成果：目前科学家已经分离了兔、牛、猴和人等的ES细胞，并证明了ES细胞可以在体外分化成心肌细胞、神经元和造血干细胞等细胞。
(2)成体干细胞
①概念： 组织或器官内的干细胞。
②类型：骨髓中的 、神经系统中的 和睾丸中的 等。
③特点：具有 ，只能分化成 的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。
④作用：有着自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、器官的 、 和
等密切相关。
(3)诱导多能干细胞
①概念：通过体外诱导 细胞等，获得类似胚胎干细胞的一种细胞，被称为诱导多能干细胞(简称iPS细胞)。
②应用：治疗小鼠的镰状细胞贫血；用iPS细胞治疗阿尔茨海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展。
③优点：诱导过程无须破坏胚胎；iPS细胞可以来源于病人 的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免 反应。
④制备方法：借助 将特定 导入细胞中，直接将特定 导入细胞中或者用 等来诱导形成iPS细胞。
⑤来源：成纤维细胞、已分化的 、 等。
[例1]下列关于人体造血干细胞的叙述，错误的是(　　)
A.造血干细胞比胚胎干细胞的分化程度更高
B.造血干细胞属于成体干细胞，但不具有组织特异性
C.造血干细胞可不断增殖和分化，适当捐献造血干细胞不影响人体健康
D.造血干细胞移植是治疗白血病的有效手段
[例2]如图为诱导多能干细胞(iPS细胞)用于治疗糖尿病的示意图，下列相关叙述错误的是(　　)
A.干细胞存在于多种组织和器官中，包括胚胎干细胞和成体干细胞等
B.诱导iPS细胞分化的实质是动物细胞核具有发育的全能性
C.除图中的成纤维细胞，已分化的T细胞和B细胞等均能被诱导为iPS细胞
D.将分化得到的胰岛细胞移植回病人体内治疗，理论上可避免免疫排斥反应
难点知识一 动物细胞培养的过程
1．动物细胞培养过程
2．动物细胞培养过程中酶的处理
(1)用酶“两次”处理的目的：第一次使用的目的是使组织细胞分散开；第二次使用的目的是使细胞从瓶壁上脱离下来，便于分散后继续培养。
(2)使细胞分散开的原因：一是能保证细胞所需要的营养供应；二是能保证细胞内有害代谢物的及时排出。
(3)不能用胃蛋白酶处理：由于大多数动物细胞培养的适宜pH为7.2～7.4，而胃蛋白酶发挥作用的最适pH为2.0左右，因此不能用胃蛋白酶使细胞分散开。
3．有关动物细胞培养知识点可归纳为4个“2”
(1)培养材料为“2”：即动物胚胎、幼龄动物的组织和器官。
(2)培养过程为“2”：即原代培养、传代培养。
(3)胰蛋白酶使用“2”次：即原代培养和传代培养中均使用，目的是使细胞分散开。
(4)细胞生长特点有“2”个：即贴壁生长和接触抑制。
4．动物细胞培养和植物组织培养的比较
项目 植物组织培养 动物细胞培养
不同点 理论 基础 植物细胞的全能性 细胞增殖
前处理 无菌、离体 无菌；用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理
取材 植物较幼嫩的部位或花药等 动物胚胎、幼龄动物的器官或组织
培养基性质 固体 液体
培养基成分 水、矿质元素、蔗糖、维生素、植物激素等 糖类、氨基酸、无机盐、维生素等
结果 最终产生新个体，体现了细胞的全能性 产生大量细胞，不形成新个体
相同点 ①都需人工条件下的无菌操作；②都需要适宜的温度、pH等条件；③都进行有丝分裂，都不涉及减数分裂
讨论1：如何区分原代培养和传代培养？必须进行传代培养的原因是什么？
讨论2：动物细胞培养和植物组织培养一样可以获得完整个体吗？
巩固训练1
1．下图表示动物细胞培养的过程，下列有关叙述正确的是(　　)
A.乙中进行动物细胞培养时应通入适量的CO2以调节pH
B.宜用胃蛋白酶将甲中的动物组织分散为单个的细胞
C.甲中用于培养的动物细胞宜取自成年动物
D.丙中细胞大量繁殖后，细胞之间相互接触能促进细胞的分裂　
巩固训练2
下图为科学家在实验室中培养“人造牛肉”的简要过程。相关叙述正确的是（ ）
A．用胃蛋白酶处理牛肌肉组织，获得分裂能力强的肌肉干细胞
B．生物反应器中应充以95%空气加5%CO2的混合气体，CO2的作用是刺激细胞呼吸
C．培养液中的支架提供了更多的细胞吸附面积，有利于细胞贴壁生长
D．“人造牛肉”的培养有利于牛肉的工厂化生产，但环境污染严重
难点知识二 干细胞培养及其应用
1.种类及存在部位
2.iPS细胞的培养和应用
讨论1：诱导多能干细胞用于治疗人类的某些顽症的原理是什么？
讨论2：诱导多能干细胞为什么可以解决供体器官不足和器官移植后免疫排斥的问题？
巩固训练3
造血干细胞是机体所有血细胞和免疫细胞的起源，是具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞。下列叙述错误的是（ ）
A．来自骨髓的造血干细胞可分化成淋巴细胞和吞噬细胞
B．造血干细胞具有多向分化潜能，体现了细胞全能性
C．自体造血干细胞移植可用于治疗系统性红斑狼疮
D．若人体内出现造血干细胞缺陷，会引起免疫缺陷病
巩固训练4
如图是科学家制备iPS细胞的一种方法，可用于治疗镰状细胞贫血。下列叙述错误的是 （ ）
A．过程①可以取成纤维细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞等
B．过程②需要加入适当的诱导分化的因子
C．过程③包含细胞分化，遗传物质发生改变
D．将 iPS 技术制备的专用干细胞移植回患者后，不发生免疫排斥
一、选择题
1．下图为肾脏上皮细胞培养过程示意图，下列有关叙述错误的是（ ）
A．甲→乙过程需要用胰蛋白酶处理
B．丙过程指细胞在添加血清的合成培养基中原代培养
C．丙过程培养的细胞与体内细胞的生长特性相近
D．丁过程为传代培养，细胞都能进行无限增殖
2．下列有关动物细胞培养及细胞工程的叙述，正确的是（ ）
A．动物组织培养过程中不会出现细胞的分化
B．动物成熟体细胞的细胞核仍然具有脱分化和使其后代细胞再分化实现全能性的能力
C．培养骨髓瘤细胞时要定期使细胞从培养瓶壁上脱离，以解除接触抑制
D．细胞传代培养过程中，一定要用到胰蛋白酶处理
3．如图是动物细胞培养过程中可能出现的接触抑制现象，对此下列有关叙述错误的是（ ）
A．正常动物细胞培养过程中均会出现接触抑制现象
B．癌细胞无接触抑制因而培养时可形成多层细胞
C．出现接触抑制时细胞将停止分裂活动
D．出现接触抑制后需利用胰蛋白酶消化后才可进行传代培养
4．“细胞培养肉”是依据肉类自然生长规律，利用体外培养技术调控“种子细胞”的增殖分化过程而生产的可食用肉类，其结构、营养价值接近“真肉”。下列叙述错误的是（ ）
A．成体干细胞可作为“种子细胞”
B．生产过程需要定期更换培养液
C．接触抑制现象有利于生产“细胞培养肉”
D．应用“细胞培养肉”或能降低生态足迹
5．下图为动物细胞培养过程中细胞数量的指数变化示意图。下列表述错误的是（　　）
A．原代培养过程中，细胞可能会发生基因突变
B．动物细胞培养所需气体为氧气
C．动物细胞传代培养时通常需要用胰蛋白酶处理
D．无限细胞系适于作为生产甲流疫苗的宿主细胞
6．科学家利用多人的干细胞培育出了“三维大脑模型”。研究人员将来自人类供体的干细胞浸泡在一种特殊配制的混合溶液中，以促进干细胞转化为特定的细胞类型，且培养条件也促使细胞聚集成复杂的3D形状，通过精细的调控和优化，成功将干细胞培育成具有类似大脑结构和功能的组织。下列相关叙述错误的是（ ）
A．三维大脑模型的形成是基因选择性表达的结果
B．混合溶液中含有诱导干细胞分化的物质
C．各类脑组织细胞内DNA和RNA序列均相同
D．该模型可为研究人类大脑的发育机制提供支持
7．我国科学家利用重编程技术成功建立了大熊猫成纤维细胞来源的诱导多能干细胞系（iPSCs），这些大熊猫iPSCs不仅能在体外培养条件下稳定增殖传代，还能在体内和体外分化条件下，分化为特定的功能性细胞。下列相关叙述错误的是（ ）
A．iPSCs体外增殖传代的过程是通过有丝分裂实现的
B．iPSCs体外分化的过程与细胞内基因表达的调控有关
C．多能干细胞的细胞核和成纤维细胞的细胞核均具有全能性
D．利用iPSCs分化成的特定组织可治疗大熊猫的各种疾病
8．下列有关植物组织培养和动物细胞培养的比较，正确的是(　　)
植物组织培养 动物细胞培养
原理 植物细胞的全能性 细胞增殖
培养前的处理 离体 将组织细胞分散开
特有成分 植物激素 血清
特殊环境条件 再分化需光 气体环境
主要过程 脱分化、再分化 原代培养、传代培养
A.后者没有体现细胞的全能性，是因为细胞核中没有本物种全套的遗传物质
B.将动物组织细胞分散开时只能使用胶原蛋白酶或胰蛋白酶
C.两者的培养过程都只涉及有丝分裂，不进行减数分裂
D.植物组织培养时也有将组织细胞分散开的操作
9．人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)广泛应用于神经系统、心血管系统和骨骼肌、皮肤创面的再生和修复。科研人员采用不同浓度血清培养hUCMSCs，48 h后收集各组上清液，用以培养角膜上皮细胞(HCECs)，过程及结果如表。下列相关叙述错误的是(　　)
实验步骤 A组 B组 C组 D组
配制不同浓度的血清 1% 3% 5% 10%
培养hUCMSCs细胞48 h后，取上清液 进行 进行 进行 进行
用上清液培养HCECs 进行 进行 进行 进行
24 h后测吸光度(数值越大代表活细胞数目越多) 0.67 0.68 0.52 0.48
A.本实验目的是探究培养HCECs的最适血清浓度
B.用胰蛋白酶处理使HCECs分散以检测吸光度
C.血清浓度较低时有利于获得更多的HCECs
D.hUCMSCs可能产生某种物质调控HCECs增殖
10．为了初步检测药物X和Y的抗癌活性，在细胞培养板的每个孔中加入相同数量的肝癌细胞，使其贴壁生长，实验组加入等体积相同浓度的溶于二甲基亚砜(溶剂)的药物X或Y，培养过程及结果如图所示。下列有关叙述错误的是(　　)
A.细胞培养液中通常需要加入血清
B.可用胰蛋白酶处理使肝癌细胞脱落下来并进行计数
C.对照组中应加入等体积的无菌蒸馏水
D.根据实验结果，可以初步判断药物X的抗癌效果较好
二、非选择题
11．下图是有关细胞部分生命历程，请据图回答：
(1)①过程所形成的子代细胞形态、功能各不相同，这个过程叫作________，其根本原因是______________________________________________________________。
(2)D→E→F过程所使用的技术是________，其理论基础是_______________。
(3)②为癌细胞的无限增殖过程，研究发现，木瓜叶提取物能杀死癌细胞。某实验小组想通过癌细胞的培养来加以证明，请完成相应步骤：
第一步：将小块癌变组织剪碎，用________处理，使组织分散成单个细胞，用动物细胞培养液制成癌细胞悬浮液。
第二步：取两个规格相同的培养瓶，编号甲和乙，分别装入等量的癌细胞悬浮液，甲中加入________________________________，乙中加入________________。
第三步：将上述两个培养瓶放在37 ℃、含95%空气和5%________的培养箱中培养一段时间。
第四步：一段时间后，若发现________培养瓶中的癌细胞生长速度缓慢，死亡率升高，说明木瓜叶提取物具有抗癌作用。
12．上海某医院病理室为确诊一患者的肿瘤是良性还是恶性，切取了一小块肿瘤组织进行培养。请回答下列问题：
(1)培养之前，肿瘤组织必须先用胰蛋白酶或_____等处理成单个细胞。
(2)由于人们对动物细胞所需营养物质尚未完全搞清楚，培养时需要在配制的合成培养基的基础上加入_____等天然成分。动物细胞培养应在含5%CO2的恒温培养箱中进行，CO2的作用是_____。
(3)与正常细胞相比，在显微镜下可见明显增多的细胞器是_____（答出两项即可）。
(4)在肿瘤组织培养了60代后，发现有恶性肿瘤细胞存在，那么能否判断该肿瘤组织就是恶性肿瘤？_____。说明理由：_____。
(5)动物细胞培养有许多用途。请列举两种：_____、_____。
13．科学家把4个与胚胎发育相关的特异性基因导入成年小鼠细胞，培养出了诱导多能干细胞，称为iPS细胞，再将iPS细胞转入小鼠乙体内培养，结果如下图所示。请回答下列问题：
(1)在形态上，胚胎干细胞具有的特点是____________________________；在功能上，具有______________。
(2)克隆培养iPS细胞时，为了防止杂菌感染，需在培养液中加入一定量的________。在iPS细胞诱导培养的过程中会出现大量不具备干细胞功能的细胞，若用维生素C处理，能显著提高iPS细胞的诱导成功率，原因可能是维生素C可诱导某些基因________。
(3)研究人员将iPS细胞团注入缺乏T细胞的小鼠体内，细胞团能继续生长。由此可推测，图1中iPS细胞团逐渐退化的原因是___________________________________________。
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