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第1章 发酵工程
第2节 微生物的培养技术及应用
二 微生物的选择培养和计数
知识一 选择培养基
1.原理
人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
2.概念
在微生物学中，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
3.实例
（1）聚合酶链式反应(PCR)中用到的耐高温的DNA聚合酶，是从热泉中筛选出来的水生栖热菌中提取出来的，因为水生栖热菌能在70～80 ℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
（2）选择分解尿素的细菌的培养基，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。
知识二 微生物的选择培养(稀释涂布平板法)
1．方法
对土样进行充分稀释，然后再将菌液涂布到制备好的选择培养基上。
2．操作
(1)系列梯度稀释操作
将10 g土样加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1 mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
(2)涂布平板操作
(3)培养分离
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37 ℃的恒温培养箱中培养1～2 d。在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。
[例1]下图为从土壤中分离纯化尿素分解菌的过程。酚红指示剂在碱性环境中呈红色。下列有关叙述错误的是(　　)
A.①②③④培养基都应以尿素为唯一氮源
B.图中所用培养基灭菌常用的方法是高压蒸汽灭菌
C.④过程采用稀释涂布平板法进行接种，接种工具是涂布器
D.可用酚红指示剂鉴定，菌落周围是否出现红色圈
【答案】C
【解析】A、尿素分解菌可以产生脲酶将尿素分解，从而能利用尿素，但其他微生物不能，因此要分离纯化尿素分解菌，培养基都应以尿素为唯一氮源，A正确；
B、对培养基的灭菌常用高压蒸汽灭菌法，B正确；
C、据图可知，④过程采用的是平板划线法进行接种，接种工具是接种环，C错误；
D、尿素分解菌能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，使培养基碱性增强，pH升高，酚红指示剂会变红，因此可用酚红指示剂鉴定菌落周围是否出现红色圈，D正确。
[例2]研究人员利用无机盐、琼脂和石油配制培养基，欲培养出石油降解菌，以修复被石油污染的土壤。下列相关叙述中，错误的是(　　)
A.这种培养基是一种选择培养基
B.这种培养基的唯一碳源是石油
C.能在该培养基上生长的微生物可能是石油降解菌
D.石油降解菌在未被石油污染的土壤中含量较高
【答案】D
【解析】A和B、分离获得能降解石油的菌株的关键是用以石油作为唯一碳源的选择培养基进行培养，A、B正确；
C、由于该培养基以石油作为唯一碳源，能在该培养基上生长的微生物可能是石油降解菌，有些以空气中二氧化碳为碳源的微生物也能在该培养基上生存，C正确；
D、石油降解菌在被石油污染的土壤中含量较高，D错误。
知识三 微生物的数量测定
1.稀释涂布平板法
(1)统计依据
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
(2)操作
①选用一定稀释范围的样品液进行培养，一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。
②在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。
2.显微镜直接计数
利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。
[例1]下列是关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验操作的叙述，其中错误的是（ ）
A．利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是恰当的稀释度
B．若要判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置未接种的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照
C．在土壤中分解尿素的细菌的分离和计数实验中，应采用稀释涂布平板法
D．计数时应选择菌落数为30-300之间的平板，取平均值进行计数
【答案】B
【解析】
A、利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是恰当的稀释度，稀释倍数太低，菌落太多会长 在一起，稀释倍数太高，平板上菌落数目过少，都不易进行计数，A正确；
B、若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需设置接种了的没有选择作用的细菌通用的牛肉膏 蛋白胨培养基作对照，B错误；
C、在土壤中分解尿素的细菌的分离和计数实验中，应采用稀释涂布平板法，C正确；
D、计数时通常选择菌落数在 30-300之间的实验组平板进行计数 ，D正确。
[例2]自生固氮菌是土壤中能独立进行固氮的细菌。科研人员进行了土壤中自生固氮菌的分离和固氮能力测定的研究，部分实验流程如图。已知步骤④获得的3个平板的菌落数分别为90、95、100，对照组平板为0。下列相关叙述正确的是(　　)
A.步骤②振荡20 min的目的是扩大菌种数量，属于选择培养
B.步骤④→⑤使用接种环划线接种，使用前需要灼烧灭菌
C.1 g土壤中平均自生固氮菌数约为9.5×106个
D.所用培养基应加入碳源、氮源、无机盐、水和琼脂
【答案】C
【解析】
A、步骤②需充分振荡的主要目的是使土壤中的微生物充分释放到无菌水中，A错误；
B、由题图可知，步骤⑤平板中的菌落分布均匀，故步骤④→⑤所用的接种工具是涂布器，接种方法是稀释涂布平板法，B错误；
C、1 g土壤中平均自生固氮菌数约为(90＋95＋100)/3÷0.1×104＝9.5×106(个)，C正确；
D、本实验需要分离的自生固氮菌可以利用空气中的氮气作为氮源，故所用培养基中不能加入氮源，D错误。
知识四 探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1.原理
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
2.方法步骤
(1)实验中所用接种方法是稀释涂布平板法（填“平板划线法”或“稀释涂布平板法”)，选择上述方法的理由是稀释涂布平板法能用于微生物计数，而平板划线法不能用于微生物计数。
(2)实验中能以菌落数表示活菌数的原因是当样品的稀释度足够高时，培养基上的一个单菌落来源于一个活菌。该实验所用计数方法的统计结果比实际值小(填“大”或“小”)。若用显微镜进行直接计数，统计结果比实际值大(填“大”或“小”)。
[例1]下列是某同学分离产脲酶菌的实验设计，不合理的是(　　)
A.选择农田或公园土壤作为样品分离目的菌株
B.在选择培养基中需添加尿素作为唯一氮源
C.适当稀释样品是为了在平板上形成单菌落
D.可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌株
【答案】D
【解析】
A、农田或公园土壤中含有较多的含脲酶的微生物，A正确；
B、为了筛选可分解尿素的细菌，配制的培养基应选择尿素作为唯一氮源，产脲酶的微生物在该培养基上能生长，B正确；
C、当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，C正确；
D、在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红，因此在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，能对分离的菌种做进一步鉴定，D错误。
[例2]某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验，包括制备培养基、灭菌、接种培养、菌落观察与计数。下列与此实验相关问题的叙述中错误的是（ ）
A．实验用过的带菌培养基经过加热后才能倒掉
B．利用稀释涂布平板法对细菌进行分离纯化并计数
C．观察细菌培养的实验时，最好是在另一块平板上接种无菌水作为对照实验
D．培养基中含有的淀粉、蛋白胨可以分别为细菌培养提供碳源和氮源
【答案】A
【解析】
A、实验用过的带菌培养需要经过高压蒸汽灭菌后才能倒掉，以免污染环境和感染操作者，A错误；
B、可利用稀释涂布平板划线法对细菌进行分离纯化并计数，B正确；
C、观察细菌培养的实验时，最好是在另一块平板上接种无菌水作为对照实验，以检测培养基配制是否合格，C正确；
D、培养基中含有的淀粉可以为细菌培养提供碳源，蛋白胨可以为细菌培养提供氮源，D正确。
难点知识一 微生物的筛选
微生物的筛选方法
单菌落挑取法 利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体平板培养基表面，直接根据微生物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物
选择 培养法 利用选择培养基对微生物进行选择培养，直接获得目的微生物
鉴定 培养法 利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现易于区分的特征，然后筛选目的微生物
选择培养基
（1）常见类型
类型 条件 分离得到的菌种
改变培养条件 70～80 ℃的高温 水生栖热菌
添加某种化学物质 加入青霉素 酵母菌、霉菌等真菌
高浓度食盐 金黄色葡萄球菌
特殊碳源、氮源 石油是唯一碳源 能消除石油污染的微生物
营养缺陷 不加碳源 自养型微生物
不加氮源 固氮菌
与鉴别培养基的区别
选择培养基 鉴别培养基
特殊成分 控制某一条件(如唯一氮源)或加入某种物质(如青霉素) 加入某种指示剂或化学药品
目的 抑制其他微生物生长，促进目的微生物的生长 与微生物的代谢产物或培养基中的成分发生特定反应
用途 培养、分离出特定微生物 鉴别不同的微生物
举例 培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌生长；用以尿素为唯一氮源的培养基来培养尿素分解菌 可用伊红—美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈深紫色，并带有金属光泽)
巩固训练1
耐高温淀粉酶在大规模工业生产中有很大的实用性。嗜热菌可以在高温环境中生存，其产生的淀粉酶最适温度较高。筛选能产生耐高温淀粉酶的嗜热菌过程如图1所示，其中Ⅰ号培养基用碘液处理的结果如图2所示。下列叙述正确的是(　　)
图1
图2
A.图2中周围不显蓝色的菌落含有所需菌种
B.倒平板后对培养皿进行高压蒸汽灭菌
C.淀粉是图2所示固体培养基的唯一碳源
D.甲、乙试管中均为选择培养基
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【答案】A
【详解】
A、图2中周围不显蓝色的菌落，说明其周围的淀粉被产生的淀粉酶水解，不能与碘液呈现蓝色；
B、倒平板前培养皿和培养基都已灭菌处理，因此倒平板后不需要对培养皿再进行高压蒸汽灭菌，B错误；
C、据图2可知，培养基上出现周围显蓝色的菌落和周围不显蓝色的菌落，因此淀粉可能不是图2所示固体培养基的唯一碳源，C错误；
D、图1中①过程是梯度稀释，②过程是用稀释涂布平板法进行接种，因此甲、乙试管主要是对嗜热菌样品进行稀释，不具备选择作用，不属于选择培养基，D错误。
巩固训练2
进行垃圾分类收集可以减少垃圾处理时间，降低处理成本。科研小组欲分离及培养若干种微生物用于对湿垃圾（包括剩菜剩饭、骨头、菜根菜叶、果皮等食品类废物）的处理。下列有关叙述正确的是（ ）
A．在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行灭菌处理；对培养基和操作者的双手进行灭菌
B．培养过程需要向培养基通入无菌空气并进行搅拌，目的是使菌体充分接触营养物质和溶解氧，促进细菌生长繁殖
C．科研小组若从生活垃圾中分离分解尿素的微生物，可在培养基中加入酚红指示剂；如果有尿素分解菌存在，则培养基中该菌落的周围会出现黑色
D．卫生纸类垃圾可采用焚烧的方式处理，有效减少对环境的污染。
【答案】B
【详解】
A、在微生物培养操作过程中，对操作者的双手应进行酒精消毒，A错误；
B、培养过程向培养基通入无菌空气并进行搅拌，可使菌体充分接触营养物质和溶解氧，促进细菌生长繁殖，B正确；
C、从生活垃圾中分离分解尿素的微生物，在培养基中加入酚红指示剂；如果有尿素分解菌存在，则培养基中该菌落的周围会出现红色，C错误；
D、卫生纸类垃圾采用焚烧的方式处理，其中塑料类物质燃烧会增加大气污染物，D错误。
难点知识二、微生物的数量测定
稀释涂布平板法
(1)主要操作环节：系列梯度稀释和涂布平板。
(2)系列梯度稀释和涂布平板后培养结果如图所示：
(3)计算公式：
每克样品中的菌株数＝
×稀释倍数
(4)计数结果：由于当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，计算结果比实际值偏小。
显微镜直接计数
(1)原理：此法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定体积的样品中微生物的数量。
(2)方法：显微镜下观察，细菌计数板或血细胞计数板计数。
(3)计算公式：
每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10 000×稀释倍数。
(4)缺点：统计的结果一般是活细菌和死细菌的总和，计算结果比实际值偏大。
巩固训练3
营养缺陷型菌株就是在人工诱变或自发突变后，微生物细胞代谢调节机制中的某些酶被破坏，使代谢过程中的某些合成反应不能进行的菌株。这种菌株能积累正常菌株不能积累的某些代谢中间产物，为工业生产提供大量的原料产物。以下是实验人员利用影印法初检氨基酸缺陷型菌株的过程。下列说法正确的是（ ）
A．过程①的接种方法为稀释涂布平板法，过程②两种培养基的成分相同
B．进行过程②培养时必须先将丝绒布转印至基本培养基上顺序不能颠倒
C．统计菌落种类和数量时要每隔24h观察统计一次，直到各类菌落数目稳定，以防止培养时间不足导致菌落数目偏大
D．营养缺陷型菌株细胞代谢调节机制中的某些酶被破坏，可能与核孔复合体的蛋白质空间结构发生改变有关
【答案】B
【详解】
A、过程①得到的菌落均匀分布，接种方法为稀释涂布平板法，过程②两种培养基的成分不同，基本培养基中缺乏某种氨基酸，A错误；
B、进行过程②培养时先将丝绒布转印至完全培养基上，可能会携带某种氨基酸进入基本培养基，因此顺序不能颠倒，B正确；
C、统计菌落种类和数量时要每隔24h观察统计一次，直到各类菌落数目稳定，以防止培养时间不足导致菌落数目偏小，C错误；
D、若该菌株为原核细胞，则不存在核孔复合体，营养缺陷型菌株细胞代谢调节机制中的某些酶被破坏，应是控制该酶合成的基因发生突变，D错误。
巩固训练4
日前微信传言手机屏幕细菌比马桶按钮上的多。两个兴趣小组分别展开如下图的实验过程。下列分析错误的是（ ）
A．通过观察菌落的形态、大小，可知手机屏幕和马桶按钮上都存在多种微生物
B．以上两组实验接种方法相同，且都需要用到酒精灯、涂布器等
C．该实验对照组可以设置为取相同培养基接种等量无菌水进行培养
D．两组实验操作结果截然不同，说明期中有一组实验的操作出现失误
【答案】D
【详解】
A、不同的菌落形态、大小不同，图示两个报道中的手机屏幕和马桶按钮的实验结果都有多种形态的菌落，即存在多种微生物，A正确；
B、根据图示中菌落分布情况分析，该实验的接种方法为稀释涂布平板法，该方法用到的工具有酒精灯、移液管、涂布器等，B正确；
C、该实验的对照组应设置为取相同培养基接种等量无菌水进行培养，C正确；
D、两报道实验操作结果截然不同，应是随机手机屏幕的取样和马桶的取样都不相同引起的，D错误。
一、选择题
1．我国规定1L自来水中大肠杆菌数不得超过3个。某兴趣小组利用滤膜法（如下图）对校内自来水中大肠杆菌数量进行检测。有关叙述不正确的是（ ）
A．取样水龙头应用火焰灼烧，打开水龙头一段时间后再取样
B．滤膜的孔径应小于大肠杆菌，过滤水样应足量
C．伊红美蓝培养基属于选择培养基，培养基中含有琼脂
D．进行细菌培养的同时需进行未接种培养基的培养
【答案】C
【解析】
A、为避免杂菌污染，取样水龙头应用火焰灼烧，打开水龙头一段时间后再取样，是为了防止温度过高杀死目的菌，A正确；
B、用滤膜过滤待测水样，滤膜的孔径应小于大肠杆菌，这样水样中的细菌才会留在滤膜上，B正确；
C、伊红美蓝培养基属于鉴别培养基，且该培养基属于固体培养基，培养基中含有琼脂，C错误；
D、进行细菌培养的同时需进行未接种培养基的培养，起对照作用，D正确。
2．某在进行微生物数量测定时，下列情况会造成结果偏多的是（　　）
A．经过静置后，取培养液的上层进行直接计数
B．进行梯度稀释时，每支试管加入了过多的无菌水
C．利用显微镜直接计数时，滴加菌液后再盖盖玻片
D．平板上有不少菌落是两个细菌长成的菌落连在一起形成的
【答案】C
【解析】
A、对微生物计数时，培养液经过静置后，需要先摇匀，若未摇匀，由于微生物生物沉淀培养液的上层微生物数量少，进行直接计数会使计数值偏小，A错误；
B、进行梯度稀释时，若每支试管加入了过多的无菌水，会使菌液稀释超过需要稀释的倍数而是结果偏低，B错误；
C、利用显微镜直接计数时，如果先滴加菌液再加盖玻片，容易使盖玻片由于液滴的表面张力作用而不能严密的盖到计数板表面上，使计数室内的体积增大,计数结果将偏高，C正确；
D、平板上有不少菌落是两个细菌长成的菌落连在一起形成按一个菌落计数，会使数值偏小，D错误。
3．土壤中的溶磷菌能够把难溶态的磷转化为可被植物直接利用的可溶性磷，从土壤中筛选出溶磷能力强的溶磷菌制成菌肥，有利于植物对磷元素的吸收。下列有关操作和分析错误的是（ ）
A．土壤取样、称取土壤、稀释样品都在酒精灯的火焰旁进行
B．需要用含难溶态磷的固体培养基进行目的菌株的分离
C．推测难溶态磷的分解可能与溶磷菌分泌的代谢产物有关
D．实验组与对照组可溶性磷含量差值最大的菌株适合制成菌肥
【答案】A
【解析】
A、土壤是土壤微生物的培养基，土壤取样时不需要在酒精灯火焰旁操作，A错误；
B、分离菌株需用固态的选择培养基，土壤中的溶磷菌能够把难溶态的磷转化为可被植物直接利用的可溶性磷，而其他微生物不能在此环境中生长，所以要用含难溶态磷的固体培养基进行目的菌株的分离，B正确；
C、土壤中的溶磷菌能够把难溶态的磷转化为可被植物直接利用的可溶性磷，说明难溶态磷的分解可能与溶磷菌分泌的代谢产物有关，C正确；
D、实验组与对照组可溶性磷含量差值最大的菌株说明其把难溶态的磷转化为可被植物直接利用的可溶性磷的能力较强，适合制成菌肥，D正确。
4．下图为“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验中样品稀释示意图。据图分析下列叙述正确的是(　　)
A.3号试管的菌落稀释倍数为103倍
B.5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×109
C.5号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数恰好为4号试管的10倍
D.该方法和平板划线法都可对微生物进行准确计数
【答案】B
【解析】
A、2号试管中的菌落稀释倍数为103倍，3号试管的菌落稀释倍数为104倍，A错误；
B、5号试管进行稀释涂布平板法计数的结果表明每克土壤中的菌株数为(168＋175＋167)÷3÷0.1×106＝1.7×109(个)，B正确；
C、4号试管中如果稀释倍数适当，平板培养得到的菌落平均数可能是5号试管的10倍，C错误；
D、稀释涂布平板法得到的菌落可能存在两个或多个细胞连在一起的情况，此时平板上观察到的只是一个菌落，故该实验方法统计得到的结果比实际活菌数目少，且平板划线法不能对微生物进行计数，D错误。
5．下列有关稀释涂布平板法计数和显微镜直接计数法计数的叙述，错误的是(　　)
A.利用血细胞计数板计数属于显微镜直接计数法，其缺点是不能区分死菌与活菌
B.两种计数方法，其统计值与实际值相比，均有差异，但差异原因不同
C.两种计数方法均能在计数的同时观察到所研究微生物的形态特征
D.当菌落数目稳定时，一般选取菌落数在30～300的且差异不大的平板进行计数
【答案】C
【解析】
用稀释涂布平板法计数时，当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，故而统计值比实际值小，显微镜直接计数法计数时不能区分死菌和活菌，故统计的微生物数量往往大于实际的活菌数，因此两种计数方法的统计值与实际值相比，均有差异，但差异原因不同，A、B正确；稀释涂布平板法观察到的是菌落的形态特征，而不是微生物的形态特征，显微镜直接计数法观察到的是微生物的形态特征，C错误。
6．油烟污染由多种有害物质组成，不易降解。某同学从长期受到油烟污染的环境中分离出油烟降解菌，其筛选分离过程如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A.图中①～③的过程为梯度稀释
B.在培养基中加入油烟污染物，其作用是为微生物提供碳源和能源
C.④使用的是固体培养基，需加入琼脂作为微生物生长繁殖的营养物质
D.过程④可采用稀释涂布平板法或平板划线法分离菌种并进行计数
【答案】B
【解析】
A、图中①～③的过程中加入油烟污染物作为唯一碳源，能够初步筛选出能分解油烟的微生物，故该过程称为选择培养，A错误；
C、配制固体培养基时加入琼脂，其作用是作为凝固剂，而不是为微生物生长提供营养物质，C错误；
D、分离菌种常用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法，但对活菌进行计数时常用稀释涂布平板法而不能用平板划线法，D错误。
7．下列关于土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验的叙述，正确的是(　　)
A.培养基应以尿素为唯一氮源，该细菌与硝化细菌所利用的碳源是相同的
B.取样时应选择农田、菜地的表层土
C.对10 mL土样稀释106倍后，取0.1 mL该溶液进行重复的涂布实验，测得的菌落数分别为18、234、276，则该10 mL土样中分解尿素的细菌数为2.55×108个
D.鉴定分解尿素的细菌，利用了尿素可被分解产生氨，从而使pH升高的原理
【答案】D
【解析】
A、分离分解尿素的细菌时应该用以尿素为唯一氮源的培养基，尿素分解菌为异养生物，而硝化细菌为自养生物，因此它们所利用的碳源是不同的，前者利用的是有机碳源，后者利用的是无机碳源，A错误；
B、绝大多数细菌分布在距地表3～8 cm的土壤层，所以土壤取样时应铲去表层土，B错误；
C、对10 mL土样稀释106倍后，取0.1 mL该溶液进行重复的涂布实验，测得的菌落数分别为18、234、276，为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数，则该10 mL土样中分解尿素的细菌数为(234＋276)÷2×106÷0.1×10＝2.55×1010(个)，C错误；
D、鉴定分解尿素的细菌的原理是该种细菌能产生脲酶，脲酶能将尿素分解产生氨，从而使pH升高，使酚红指示剂变红，D正确。
8．聚羟基脂肪酸酯(PHA)是由某些嗜盐细菌合成的一种胞内聚酯，具有类似于合成塑料的物化特性及合成塑料所不具备的生物可降解性，可用于制造无污染的“绿色塑料”。科学家从某咸水湖中寻找生产PHA菌种的流程如下。下列说法正确的是(　　)
A.步骤①取湖水接种到含合成塑料的选择培养基上进行筛选
B.步骤②若用稀释涂布平板法接种，需用涂布器蘸取少量湖水均匀地涂布在培养基的表面
C.步骤③应将培养基置于37 ℃恒温下培养，长出的菌落均能够合成PHA
D.步骤④挑取单菌落时，应挑取多个菌落并分别测定PHA含量
【答案】D
【解析】
A、结合题干“聚羟基脂肪酸酯(PHA)是由某些嗜盐细菌合成的一种胞内聚酯”可知，步骤①取湖水接种到含盐量较高的选择培养基上进行筛选，A错误；
B、若步骤②用稀释涂布平板法接种，需要先将菌液滴在培养基上，再用涂布器涂布均匀，B错误；
C、步骤③应将培养基置于37 ℃恒温下培养，长出的菌落不一定都能够合成PHA，需要进一步测定，C错误；
D、为获得高产PHA的菌种，步骤④挑取单菌落时，应挑取多个菌落并分别测定PHA含量，以确定高产PHA菌株，D正确。
9．化工厂的污水池中含有一种有害的难以降解的有机化合物 A，研究人员用化合物 A、磷酸盐、镁盐以及一些微量元素配制的培养基，成功筛选到能高效降解化合物 A 的细菌（目的菌），实验的主要步骤如图所示。下列有关叙述错误的是（ ）
A．该培养基中化合物 A 可能既作碳源又作氮源
B．实验培养过程中进行振荡培养，可使目的菌和培养液充分接触
C．实验操作过程中，获得纯净“目的菌”的关键是防止外来杂菌污染
D．将固体培养基得到的目的菌重复多次上述实验的目的是获得大量菌种
【答案】D
【解析】
A、磷酸盐、镁盐以及一些微量元素中不含有N元素，推测该培养基中有机化合物A可能既作碳源又作氮源，A正确；
B、实验培养过程中进行振荡培养可以增加培养液中的溶氧量，满足微生物对氧气的需求，同时可使目的菌和培养液充分接触，B正确；
C、筛选微生物的过程中应注意防止外来杂菌污染，C正确；
D、在以化合物A为唯一碳源的培养基中只有能降解化合物A的微生物才能生长繁殖，不能利用化合物A的微生物因缺乏碳源和氮源，无法生长繁殖，将固体培养基得到的目的菌重复多次上述实验的目的是对菌种“纯化”，D错误。
10．青霉素一般只对革兰氏阳性菌有作用，利用滤纸条法可测定青霉素的抑菌情况，方法如下图。下列分析错误的是（ ）
A．青霉素是由青霉菌产生的代谢产物，可分泌到培养基中
B．滤纸条周围已被抑制的区域不会再出现菌落
C．青霉素对大肠杆菌几乎不起作用，推测大肠杆菌可能不属于革兰氏阳性菌
D．相对于枯草芽孢杆菌，青霉素对金黄色葡萄球菌的抑制作用更明显
【答案】B
【解析】
A、青霉菌产生的青霉素是一种抗生素，可分泌到培养基中，对细菌具有抑制作用，A正确；
B、滤纸条周围已被抑制的区域可能会出现新的菌落，如可以利用试验菌代谢产物的一些菌类可能繁殖，B错误；
C、青霉素是青霉菌在代谢过程中产生的能够抑制细菌生长的广谱抗生素，尤其是对革兰氏阳性菌生长抑制明显，青霉素对大肠杆菌几乎不起作用，故推测大肠杆菌可能不属于革兰氏阳性菌，C正确；
D、据图可知，相对于枯草芽孢杆菌，大肠杆菌的菌落更多，而金黄色葡萄球菌的菌落更少，故推测青霉素对金黄色葡萄球菌的抑制作用更明显，D正确。
二、非选择题
11.多菌灵是一种广谱性有机杀菌剂，对多种由真菌引起的病害有防治效果，在我国的使用范围广泛，但其残留能引起肝病和染色体变异。某科研小组从长期受多菌灵污染的土壤中取样，进行了多菌灵降解菌的分离，分离过程如下：
→→→→
请回答下列有关问题。
(1)“第二步”所用的培养基是以多菌灵为唯一碳源的选择培养基，选择培养基的作用是____________________；“第二步”的目的是_____________________________________________________________________。
(2)与“第二步”所用培养基相比，培养基A中还需要加入的成分是________________。涂布平板过程中无菌操作的措施有哪些？________________
______________________________________________________________。
(3)对涂布的平板进行培养时，将接种的培养基和一个未接种的培养基都放入恒温箱中培养，这样操作的目的是__________________________________________。
(4)稀释涂布平板法除可以用于微生物的分离外，也常用来____________，涂布液被培养基吸收后需要将平板____________，放入恒温培养箱内培养。
【答案】
(1)允许特定种类的微生物生长，抑制或阻止其他种类微生物生长　筛选多菌灵降解菌并提高多菌灵降解菌的浓度　
(2)琼脂　将蘸有酒精的涂布器在火焰上灼烧，涂布过程在酒精灯火焰附近进行　(3)作为对照，检测培养基是否灭菌彻底(或是否被污染)　
(4)统计样品中活菌的数目　倒置
【解析】
（1）选择培养基的作用是允许特定种类的微生物生长，抑制或阻止其他种类微生物生长；“第二步”所用的培养基是以多菌灵为唯一碳源的选择培养基，只有能够分解多菌灵的微生物才能在其上生长，所以该步骤目的是筛选多菌灵降解菌并提高多菌灵降解菌的浓度。
（2）培养基A上可获得菌落，应为固体培养基，所以与“第二步”所用培养基相比，培养基A中还需要加入琼脂。涂布平板过程中，将蘸有酒精的涂布器在火焰上灼烧，涂布过程在酒精灯火焰附近进行，目的都是防止杂菌污染。
（3）对涂布的平板进行培养时，将接种的培养基和一个未接种的培养基都放入恒温箱中培养，目的是作为对照，检测培养基是否灭菌彻底(或是否被污染)。
（4）稀释涂布平板法也常用来统计样品中活菌的数目，因为当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。涂布液被培养基吸收后需要将平板倒置，放入恒温培养箱内培养。
12．尿素是一种重要的氮肥，但是不能被农作物直接吸收，只有敲土壤中的细菌分解成氨后才能被植物利用。某实验小组要完成课题“从土壤中外离出能分解尿素的细菌”，问答下列问题：
（1）在该实验中，配制培养基需要以__________为唯一氮源。该培养基中_______（填“需要”或“不需要”）添加葡萄糖，原因是______________。若要验证该培养基具有选择作用，需要设置___________________作为对照，当_________时，即可说明该培养基具有选择作用。
（2）在接种前需要对样品进行稀释处理，以保证获得菌落数在__________范围、适于计数的平板。测定土壤中细菌的数量。一般选用104，105，106倍的稀释液进行平板培养，若测定放线菌数量，则需要采用与此不一样的稀释倍数，原因是____________________。
（3）在进行实验时，甲同学从对应106倍稀释的培养基中筛选出大约200个菌落，但是其他同学在同样稀释度下只筛选出大约90个菌落，若甲同学的结果有问题，则可能的原因是：_____________。
【答案】
（1）尿素 需要 尿素分解菌为异养生物，需要葡萄糖为其提供碳源 在相同稀释度下接种等量的相同样品的牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落明显多于该培养基上的菌落
（2）30~300 土壤中各类微生物的数量是不同的
（3）培养基被杂菌污染或培养基中混入了其他含氮物质或土壤样品不同
【解析】
（1）在该实验中，配制培养基需要以尿素为唯一氮源，该培养基中需要添加葡萄糖为分解尿素的细菌提供碳源，原因是尿素分解菌为异养微生物，不能利用无机碳源，只能利用现成的有机碳源；若要验证该培养基具有选择作用，需要设置基础培养基作为对照，即接种相同样品的牛肉膏蛋白胨培养基，在相同条件下培养，当牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落明显多于该培养基上的菌落时，即可说明该培养基具有选择作用。
（2）在接种前需要对样品进行稀释处理，以保证获得菌落欻在30~300范围、适于计数的平板；测定土壤中细菌的数量，一般选用l04、105、106倍的稀释液进行平板培养，若测定放线菌数量，则需要采用与此不一样的稀释倍数，原因是土壤中各类微生物的数量是不同的，所以分离不同的微生物需要采用不同的稀释倍数。
（3）在进行实验时，甲同学从对应106倍稀释的培养基中筛选出大约200个菌落，但是其他同学在同样稀释度下只筛选出大约90个菌落，若甲同学的结果有问题，则可能的原因是培养基被杂菌污染或培养基中混入了其他含氨物质，使得培养基上不止尿素分解菌这一种微生物。
13．物质W是一种含氮有机物，会污染土壤。W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。某研究小组欲从土壤中筛选出能降解W的细菌（目标菌）。回答下列问题。
（1）要从土壤中分离目标菌，所用选择培养基中的氮源应该是_________。
（2）某同学取10g土壤样品加90mL无菌水制成稀释液，在对应稀释倍数为105的溶液中取0.1mL接种到3个正常的细菌培养基平板上，该过程需要使用的接种工具是______________，培养一段时间后，统计出平板上的细菌菌落数分别为156、178和191，则每克土壤样品中的细菌数量约为_______个，统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，原因是________________________。
（3）在从土壤中分离目标菌的过程中，发现培养基上甲、乙两种细菌都能生长并形成菌落（如图所示）。如果要得到目标菌，应该选择________菌落进一步纯化，选择的依据是___________。
（4）土壤中的某些微生物可以利用空气中的氮气作为氮源。若要设计实验进一步确定甲、乙菌能否利用空气中的氮气作为氮源，请简要写出实验思路、预期结果和结论，即______________。
（5）该小组将人工合成的一段DNA转入大肠杆菌，使大肠杆菌产生能降解W的酶（酶E）。为了比较酶E与天然酶降解W能力的差异，该小组拟进行如下实验，请完善相关内容。
①在含有一定浓度W的固体培养基上，A处滴加酶E的缓冲液，B处滴加含有相同浓度天然酶的缓冲液，C处滴加_________，三处滴加量相同。
②一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，说明___________；若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明___________。
【答案】
（1）W
（2）涂布器 1.75×108 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
（3）乙 乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W
（4）将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源
（5）①缓冲液 ②缓冲液不能降解W 酶E与天然酶降解W的能力相近
【解析】
（1）该研究小组的目标菌是能够降解物质W的细菌，要从土壤中分离目标菌，所用选择培养基应以W为唯一氮源。
（2）根据题意可知，该同学使用的是稀释涂布平板法进行的接种，因此接种工具为涂布器，培养一段时间后，统计出平板上的细菌菌落数分别为156、178和191，则每克土壤样品中的细菌数量约为：（156+178+191）÷3×105÷0.1=1.75×108个。稀释涂布平板法是根据菌落数量进行计数的，如果当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，因此导致统计的菌落数往往比活菌实际数目低。
（3）研究小组的目标菌，是能够降解物质W的细菌，培养基中乙菌落的周围出现透明圈，说明形成乙菌落的菌能够降解物质W，故要得到目标菌，应该选择乙菌落进一步纯化。
（4）若目标菌能够利用空气中的氮气作为氮源，故选用的选择培养基不添加氮源，能够在无氮源的培养基上生存的细菌便是目标菌，故实验思路、预期结果和结论为：将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源。
（5）①C处作为空白对照，要排除作为溶剂的缓冲液对实验可能造成的影响，故需要在C处滴加缓冲液，且三处滴加量相同。②培养基中的透明圈直径大小表示物质W被降解的程度，若C处不出现透明圈，则说明缓冲液不能降解物质W；若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明物质W被降解的程度相近，即酶E与天然酶降解物质W的能力相近。第1章 发酵工程
第2节 微生物的培养技术及应用
二 微生物的选择培养和计数
知识一 选择培养基
1.原理
人为提供有利于 生长的条件(包括 等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
2.概念
在微生物学中，允许 的微生物生长，同时 其他种类微生物生长的培养基。
3.实例
（1）聚合酶链式反应(PCR)中用到的 ，是从热泉中筛选出来的水生栖热菌中提取出来的，因为水生栖热菌能在 的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
（2）选择分解尿素的细菌的培养基，以 作为唯一氮源，只有能合成 的微生物才能分解尿素。
知识二 微生物的选择培养(稀释涂布平板法)
1．方法
对土样进行充分 ，然后再将菌液涂布到制备好的 上。
2．操作
(1) 操作
将10 g土样加入盛有 无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1 mL上清液加入盛有 无菌水的试管中，依次等比稀释。
(2) 操作
(3)培养分离
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板 ，放入30～37 ℃的恒温培养箱中培养1～2 d。在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的 。
[例1]下图为从土壤中分离纯化尿素分解菌的过程。酚红指示剂在碱性环境中呈红色。下列有关叙述错误的是(　　)
A.①②③④培养基都应以尿素为唯一氮源
B.图中所用培养基灭菌常用的方法是高压蒸汽灭菌
C.④过程采用稀释涂布平板法进行接种，接种工具是涂布器
D.可用酚红指示剂鉴定，菌落周围是否出现红色圈
[例2]研究人员利用无机盐、琼脂和石油配制培养基，欲培养出石油降解菌，以修复被石油污染的土壤。下列相关叙述中，错误的是(　　)
A.这种培养基是一种选择培养基
B.这种培养基的唯一碳源是石油
C.能在该培养基上生长的微生物可能是石油降解菌
D.石油降解菌在未被石油污染的土壤中含量较高
知识三 微生物的数量测定
1.稀释涂布平板法
(1)统计依据
当样品的 足够高时，培养基表面生长的一个 ，来源于样品稀释液中的一个 。通过统计平板上的 ，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
(2)操作
①选用一定稀释范围的样品液进行培养，一般选择菌落数为 的平板进行计数。
②在同一稀释度下，应至少对 个平板进行重复计数，然后求出 。
2.显微镜直接计数
利用特定的 或 ，在显微镜下观察、 ，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。
[例1]下列是关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验操作的叙述，其中错误的是（ ）
A．利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是恰当的稀释度
B．若要判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置未接种的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照
C．在土壤中分解尿素的细菌的分离和计数实验中，应采用稀释涂布平板法
D．计数时应选择菌落数为30-300之间的平板，取平均值进行计数
[例2]自生固氮菌是土壤中能独立进行固氮的细菌。科研人员进行了土壤中自生固氮菌的分离和固氮能力测定的研究，部分实验流程如图。已知步骤④获得的3个平板的菌落数分别为90、95、100，对照组平板为0。下列相关叙述正确的是(　　)
A.步骤②振荡20 min的目的是扩大菌种数量，属于选择培养
B.步骤④→⑤使用接种环划线接种，使用前需要灼烧灭菌
C.1 g土壤中平均自生固氮菌数约为9.5×106个
D.所用培养基应加入碳源、氮源、无机盐、水和琼脂
知识四 探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1.原理
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成 的微生物才能分解尿素。利用以 的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
2.方法步骤
(1)实验中所用接种方法是 （填“平板划线法”或“稀释涂布平板法”)，选择上述方法的理由是 。
(2)实验中能以菌落数表示活菌数的原因是 。该实验所用计数方法的统计结果比实际值 (填“大”或“小”)。若用显微镜进行直接计数，统计结果比实际值 (填“大”或“小”)。
[例1]下列是某同学分离产脲酶菌的实验设计，不合理的是(　　)
A.选择农田或公园土壤作为样品分离目的菌株
B.在选择培养基中需添加尿素作为唯一氮源
C.适当稀释样品是为了在平板上形成单菌落
D.可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌株
[例2]某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验，包括制备培养基、灭菌、接种培养、菌落观察与计数。下列与此实验相关问题的叙述中错误的是（ ）
A．实验用过的带菌培养基经过加热后才能倒掉
B．利用稀释涂布平板法对细菌进行分离纯化并计数
C．观察细菌培养的实验时，最好是在另一块平板上接种无菌水作为对照实验
D．培养基中含有的淀粉、蛋白胨可以分别为细菌培养提供碳源和氮源
难点知识一 微生物的筛选
微生物的筛选方法
单菌落挑取法 利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体平板培养基表面，直接根据微生物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物
选择 培养法 利用选择培养基对微生物进行选择培养，直接获得目的微生物
鉴定 培养法 利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现易于区分的特征，然后筛选目的微生物
选择培养基
（1）常见类型
类型 条件 分离得到的菌种
改变培养条件 70～80 ℃的高温 水生栖热菌
添加某种化学物质 加入青霉素 酵母菌、霉菌等真菌
高浓度食盐 金黄色葡萄球菌
特殊碳源、氮源 石油是唯一碳源 能消除石油污染的微生物
营养缺陷 不加碳源 自养型微生物
不加氮源 固氮菌
与鉴别培养基的区别
选择培养基 鉴别培养基
特殊成分 控制某一条件(如唯一氮源)或加入某种物质(如青霉素) 加入某种指示剂或化学药品
目的 抑制其他微生物生长，促进目的微生物的生长 与微生物的代谢产物或培养基中的成分发生特定反应
用途 培养、分离出特定微生物 鉴别不同的微生物
举例 培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌生长；用以尿素为唯一氮源的培养基来培养尿素分解菌 可用伊红—美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈深紫色，并带有金属光泽)
巩固训练1
耐高温淀粉酶在大规模工业生产中有很大的实用性。嗜热菌可以在高温环境中生存，其产生的淀粉酶最适温度较高。筛选能产生耐高温淀粉酶的嗜热菌过程如图1所示，其中Ⅰ号培养基用碘液处理的结果如图2所示。下列叙述正确的是(　　)
图1
图2
A.图2中周围不显蓝色的菌落含有所需菌种
B.倒平板后对培养皿进行高压蒸汽灭菌
C.淀粉是图2所示固体培养基的唯一碳源
D.甲、乙试管中均为选择培养基试卷第1页，共3页
2 / 2
巩固训练2
进行垃圾分类收集可以减少垃圾处理时间，降低处理成本。科研小组欲分离及培养若干种微生物用于对湿垃圾（包括剩菜剩饭、骨头、菜根菜叶、果皮等食品类废物）的处理。下列有关叙述正确的是（ ）
A．在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行灭菌处理；对培养基和操作者的双手进行灭菌
B．培养过程需要向培养基通入无菌空气并进行搅拌，目的是使菌体充分接触营养物质和溶解氧，促进细菌生长繁殖
C．科研小组若从生活垃圾中分离分解尿素的微生物，可在培养基中加入酚红指示剂；如果有尿素分解菌存在，则培养基中该菌落的周围会出现黑色
D．卫生纸类垃圾可采用焚烧的方式处理，有效减少对环境的污染。
难点知识二、微生物的数量测定
稀释涂布平板法
(1)主要操作环节：系列梯度稀释和涂布平板。
(2)系列梯度稀释和涂布平板后培养结果如图所示：
(3)计算公式：
每克样品中的菌株数＝
×稀释倍数
(4)计数结果：由于当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，计算结果比实际值偏小。
显微镜直接计数
(1)原理：此法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定体积的样品中微生物的数量。
(2)方法：显微镜下观察，细菌计数板或血细胞计数板计数。
(3)计算公式：
每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10 000×稀释倍数。
(4)缺点：统计的结果一般是活细菌和死细菌的总和，计算结果比实际值偏大。
巩固训练3
营养缺陷型菌株就是在人工诱变或自发突变后，微生物细胞代谢调节机制中的某些酶被破坏，使代谢过程中的某些合成反应不能进行的菌株。这种菌株能积累正常菌株不能积累的某些代谢中间产物，为工业生产提供大量的原料产物。以下是实验人员利用影印法初检氨基酸缺陷型菌株的过程。下列说法正确的是（ ）
A．过程①的接种方法为稀释涂布平板法，过程②两种培养基的成分相同
B．进行过程②培养时必须先将丝绒布转印至基本培养基上顺序不能颠倒
C．统计菌落种类和数量时要每隔24h观察统计一次，直到各类菌落数目稳定，以防止培养时间不足导致菌落数目偏大
D．营养缺陷型菌株细胞代谢调节机制中的某些酶被破坏，可能与核孔复合体的蛋白质空间结构发生改变有关
巩固训练4
日前微信传言手机屏幕细菌比马桶按钮上的多。两个兴趣小组分别展开如下图的实验过程。下列分析错误的是（ ）
A．通过观察菌落的形态、大小，可知手机屏幕和马桶按钮上都存在多种微生物
B．以上两组实验接种方法相同，且都需要用到酒精灯、涂布器等
C．该实验对照组可以设置为取相同培养基接种等量无菌水进行培养
D．两组实验操作结果截然不同，说明期中有一组实验的操作出现失误
一、选择题
1．我国规定1L自来水中大肠杆菌数不得超过3个。某兴趣小组利用滤膜法（如下图）对校内自来水中大肠杆菌数量进行检测。有关叙述不正确的是（ ）
A．取样水龙头应用火焰灼烧，打开水龙头一段时间后再取样
B．滤膜的孔径应小于大肠杆菌，过滤水样应足量
C．伊红美蓝培养基属于选择培养基，培养基中含有琼脂
D．进行细菌培养的同时需进行未接种培养基的培养
2．某在进行微生物数量测定时，下列情况会造成结果偏多的是（　　）
A．经过静置后，取培养液的上层进行直接计数
B．进行梯度稀释时，每支试管加入了过多的无菌水
C．利用显微镜直接计数时，滴加菌液后再盖盖玻片
D．平板上有不少菌落是两个细菌长成的菌落连在一起形成的
3．土壤中的溶磷菌能够把难溶态的磷转化为可被植物直接利用的可溶性磷，从土壤中筛选出溶磷能力强的溶磷菌制成菌肥，有利于植物对磷元素的吸收。下列有关操作和分析错误的是（ ）
A．土壤取样、称取土壤、稀释样品都在酒精灯的火焰旁进行
B．需要用含难溶态磷的固体培养基进行目的菌株的分离
C．推测难溶态磷的分解可能与溶磷菌分泌的代谢产物有关
D．实验组与对照组可溶性磷含量差值最大的菌株适合制成菌肥
4．下图为“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验中样品稀释示意图。据图分析下列叙述正确的是(　　)
A.3号试管的菌落稀释倍数为103倍
B.5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×109
C.5号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数恰好为4号试管的10倍
D.该方法和平板划线法都可对微生物进行准确计数
5．下列有关稀释涂布平板法计数和显微镜直接计数法计数的叙述，错误的是(　　)
A.利用血细胞计数板计数属于显微镜直接计数法，其缺点是不能区分死菌与活菌
B.两种计数方法，其统计值与实际值相比，均有差异，但差异原因不同
C.两种计数方法均能在计数的同时观察到所研究微生物的形态特征
D.当菌落数目稳定时，一般选取菌落数在30～300的且差异不大的平板进行计数
6．油烟污染由多种有害物质组成，不易降解。某同学从长期受到油烟污染的环境中分离出油烟降解菌，其筛选分离过程如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A.图中①～③的过程为梯度稀释
B.在培养基中加入油烟污染物，其作用是为微生物提供碳源和能源
C.④使用的是固体培养基，需加入琼脂作为微生物生长繁殖的营养物质
D.过程④可采用稀释涂布平板法或平板划线法分离菌种并进行计数
7．下列关于土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验的叙述，正确的是(　　)
A.培养基应以尿素为唯一氮源，该细菌与硝化细菌所利用的碳源是相同的
B.取样时应选择农田、菜地的表层土
C.对10 mL土样稀释106倍后，取0.1 mL该溶液进行重复的涂布实验，测得的菌落数分别为18、234、276，则该10 mL土样中分解尿素的细菌数为2.55×108个
D.鉴定分解尿素的细菌，利用了尿素可被分解产生氨，从而使pH升高的原理
8．聚羟基脂肪酸酯(PHA)是由某些嗜盐细菌合成的一种胞内聚酯，具有类似于合成塑料的物化特性及合成塑料所不具备的生物可降解性，可用于制造无污染的“绿色塑料”。科学家从某咸水湖中寻找生产PHA菌种的流程如下。下列说法正确的是(　　)
A.步骤①取湖水接种到含合成塑料的选择培养基上进行筛选
B.步骤②若用稀释涂布平板法接种，需用涂布器蘸取少量湖水均匀地涂布在培养基的表面
C.步骤③应将培养基置于37 ℃恒温下培养，长出的菌落均能够合成PHA
D.步骤④挑取单菌落时，应挑取多个菌落并分别测定PHA含量
9．化工厂的污水池中含有一种有害的难以降解的有机化合物 A，研究人员用化合物 A、磷酸盐、镁盐以及一些微量元素配制的培养基，成功筛选到能高效降解化合物 A 的细菌（目的菌），实验的主要步骤如图所示。下列有关叙述错误的是（ ）
A．该培养基中化合物 A 可能既作碳源又作氮源
B．实验培养过程中进行振荡培养，可使目的菌和培养液充分接触
C．实验操作过程中，获得纯净“目的菌”的关键是防止外来杂菌污染
D．将固体培养基得到的目的菌重复多次上述实验的目的是获得大量菌种
10．青霉素一般只对革兰氏阳性菌有作用，利用滤纸条法可测定青霉素的抑菌情况，方法如下图。下列分析错误的是（ ）
A．青霉素是由青霉菌产生的代谢产物，可分泌到培养基中
B．滤纸条周围已被抑制的区域不会再出现菌落
C．青霉素对大肠杆菌几乎不起作用，推测大肠杆菌可能不属于革兰氏阳性菌
D．相对于枯草芽孢杆菌，青霉素对金黄色葡萄球菌的抑制作用更明显
二、非选择题
11.多菌灵是一种广谱性有机杀菌剂，对多种由真菌引起的病害有防治效果，在我国的使用范围广泛，但其残留能引起肝病和染色体变异。某科研小组从长期受多菌灵污染的土壤中取样，进行了多菌灵降解菌的分离，分离过程如下：
→→→→
请回答下列有关问题。
(1)“第二步”所用的培养基是以多菌灵为唯一碳源的选择培养基，选择培养基的作用是____________________；“第二步”的目的是_____________________________________________________________________。
(2)与“第二步”所用培养基相比，培养基A中还需要加入的成分是________________。涂布平板过程中无菌操作的措施有哪些？________________
______________________________________________________________。
(3)对涂布的平板进行培养时，将接种的培养基和一个未接种的培养基都放入恒温箱中培养，这样操作的目的是__________________________________________。
(4)稀释涂布平板法除可以用于微生物的分离外，也常用来____________，涂布液被培养基吸收后需要将平板____________，放入恒温培养箱内培养。
12．尿素是一种重要的氮肥，但是不能被农作物直接吸收，只有敲土壤中的细菌分解成氨后才能被植物利用。某实验小组要完成课题“从土壤中外离出能分解尿素的细菌”，问答下列问题：
（1）在该实验中，配制培养基需要以__________为唯一氮源。该培养基中_______（填“需要”或“不需要”）添加葡萄糖，原因是______________。若要验证该培养基具有选择作用，需要设置___________________作为对照，当_________时，即可说明该培养基具有选择作用。
（2）在接种前需要对样品进行稀释处理，以保证获得菌落数在__________范围、适于计数的平板。测定土壤中细菌的数量。一般选用104，105，106倍的稀释液进行平板培养，若测定放线菌数量，则需要采用与此不一样的稀释倍数，原因是____________________。
（3）在进行实验时，甲同学从对应106倍稀释的培养基中筛选出大约200个菌落，但是其他同学在同样稀释度下只筛选出大约90个菌落，若甲同学的结果有问题，则可能的原因是：_____________。
13．物质W是一种含氮有机物，会污染土壤。W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。某研究小组欲从土壤中筛选出能降解W的细菌（目标菌）。回答下列问题。
（1）要从土壤中分离目标菌，所用选择培养基中的氮源应该是_________。
（2）某同学取10g土壤样品加90mL无菌水制成稀释液，在对应稀释倍数为105的溶液中取0.1mL接种到3个正常的细菌培养基平板上，该过程需要使用的接种工具是______________，培养一段时间后，统计出平板上的细菌菌落数分别为156、178和191，则每克土壤样品中的细菌数量约为_______个，统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，原因是________________________。
（3）在从土壤中分离目标菌的过程中，发现培养基上甲、乙两种细菌都能生长并形成菌落（如图所示）。如果要得到目标菌，应该选择________菌落进一步纯化，选择的依据是___________。
（4）土壤中的某些微生物可以利用空气中的氮气作为氮源。若要设计实验进一步确定甲、乙菌能否利用空气中的氮气作为氮源，请简要写出实验思路、预期结果和结论，即______________。
（5）该小组将人工合成的一段DNA转入大肠杆菌，使大肠杆菌产生能降解W的酶（酶E）。为了比较酶E与天然酶降解W能力的差异，该小组拟进行如下实验，请完善相关内容。
①在含有一定浓度W的固体培养基上，A处滴加酶E的缓冲液，B处滴加含有相同浓度天然酶的缓冲液，C处滴加_________，三处滴加量相同。
②一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，说明___________；若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明___________。

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