资源简介

实验06 DNA片段的扩增及电泳鉴定
2022年新课标 课标解读
一、生命观念
通过实验探究DNA片段的扩增（PCR技术）及电泳鉴定方法，理解核酸的复制机制和理化性质，建立“核酸的结构与功能相适应、物质变化与能量供应相统一”的生命观念，认同PCR技术对核酸研究的重要意义。
二、科学思维
运用观察、对比、推理、归纳等科学方法，分析PCR扩增的原理（DNA半保留复制）、电泳鉴定的原理（核酸的带电性与分子量差异），解读实验现象与实验结果的关系，推理实验操作对扩增效果、电泳结果的影响，形成基于实验证据的逻辑推理能力和误差分析意识。
三、科学探究
通过设计和实施DNA片段的扩增及电泳鉴定实验，掌握PCR技术的基本操作、琼脂糖凝胶电泳的操作流程，提升实验设计、操作实施、现象描述与结果分析能力，理解实验设计的单一变量原则、对照原则。
四、社会责任
结合实验原理，联系PCR技术、电泳技术在医学、刑侦、生物技术、基因诊断等领域的应用价值，认识核酸技术对人类生产生活、科学研究的重要意义，树立“科学利用生物技术服务人类”的责任意识，培养严谨的科学态度。 1. 知识目标
基础概念：掌握PCR（多聚酶链式反应）、引物、Taq酶、琼脂糖凝胶、电泳、DNA分子量标准等核心术语，理解DNA半保留复制的过程和核酸的带电性特点。
关键原理：理解PCR扩增DNA片段的核心原理（模拟体内DNA复制，通过变性、复性、延伸三步循环实现DNA片段的大量扩增），掌握琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA片段的原理（DNA分子带负电，在电场中向正极移动，迁移速率与分子量大小、构象有关），明确实验中各试剂、仪器的作用及操作目的。
2. 能力目标
操作技能：规范进行PCR反应体系的配制、PCR仪的设置与操作，掌握琼脂糖凝胶的配制、电泳装置的组装、样品点样、电泳运行及结果观察等操作，能规范记录实验现象和实验数据。
数据分析：能分析PCR反应条件（温度、循环次数）、电泳参数（电压、时间）对实验结果的影响，解读电泳图谱，判断DNA片段的分子量大小和扩增效果，归纳实验结论。
3. 价值目标
科学素养：认同实验探究在核酸扩增与鉴定中的作用，培养严谨的科学实验态度、细致的观察能力和规范的实验操作习惯。
跨学科融合：关联化学（核酸的带电性、试剂的作用机理）、物理（电场作用、分子迁移）、生物工程（PCR技术的应用），理解DNA片段扩增及电泳鉴定的理化基础和实践意义。
重点先知：
1.实验核心是“PCR扩增DNA片段+电泳鉴定扩增效果”：PCR技术的核心是模拟体内DNA复制过程，通过变性、复性、延伸三步循环，实现目标DNA片段的大量扩增；电泳鉴定的核心是利用DNA的带电性和分子量差异，分离扩增后的DNA片段，判断扩增是否成功、片段大小是否符合预期，核心是抓住“PCR循环机制”和“电泳分离原理”。
2.操作关键是“控制条件、保证扩增与分离效果”：PCR实验需严格控制反应体系的组分（引物、Taq酶、dNTP、模板DNA等）和反应条件（变性温度、复性温度、延伸温度、循环次数）；电泳实验需控制琼脂糖凝胶浓度、电泳电压和时间，点样时动作规范，避免样品污染或漏样，确保电泳图谱清晰、可分析。
3.核心区分：PCR扩增的三步循环（变性：90~95℃，DNA双链解旋；复性：55~60℃，引物与模板结合；延伸：72℃，Taq酶催化DNA合成）；电泳中，DNA分子带负电，向正极移动，分子量越小，迁移速率越快，迁移距离越远；DNA分子量标准用于对比判断目标片段大小。
教材内容
（一）实验核心原理
1.PCR扩增DNA片段的原理：PCR（多聚酶链式反应）是一种在体外快速扩增特定DNA片段的技术，本质是模拟体内DNA半保留复制过程，通过人工控制温度，使DNA片段重复进行变性、复性、延伸三步循环，实现指数级扩增（每循环一次，DNA片段数量翻倍）。
① 变性：将反应体系加热至90~95℃，持续30秒左右，DNA双链间的氢键断裂，双链解旋形成单链DNA（模板链）；
② 复性：将反应体系冷却至55~60℃，持续30秒左右，两种引物（分别与DNA两条单链的3’端互补）与对应的模板链结合，为DNA合成提供起始位点；
③ 延伸：将反应体系升温至72℃，持续1~2分钟，Taq酶（耐高温DNA聚合酶，来自嗜热菌，可在72℃下稳定发挥作用）以dNTP（四种脱氧核苷三磷酸，DNA合成的原料）为原料，以引物为起始点，按照碱基互补配对原则，沿着模板链5’→3’方向延伸，合成新的DNA链，形成双链DNA。
重复上述三步循环30~35次，目标DNA片段可扩增至数百万甚至数十亿份，满足后续鉴定需求。
2.琼脂糖凝胶电泳鉴定的原理：电泳是利用带电粒子在电场中迁移速率的差异，实现物质分离的技术，本实验采用琼脂糖凝胶电泳分离和鉴定DNA片段，核心原理如下：
① DNA的带电性：DNA分子中磷酸基团带负电荷，在电场中会向正极（阳极）移动；
② 迁移速率的差异：DNA片段的迁移速率与自身分子量大小、构象有关，在相同电场条件下，分子量越小的DNA片段，迁移速率越快，迁移距离越远；分子量越大，迁移速率越慢，迁移距离越近；线性DNA片段的迁移速率遵循“分子量越小，迁移越快”的规律；
③ 显色与观察：DNA本身无色，需在琼脂糖凝胶中加入EB（溴化乙锭）或其他荧光染料，EB可插入DNA双链的碱基之间，在紫外线照射下发出橙红色荧光，通过观察荧光条带的位置、数量和亮度，判断DNA片段的分子量大小、扩增效果（是否有目标条带）和DNA含量（条带越亮，含量越高）。
（二）实验材料的选择与优势
实验核心材料包括模板DNA、PCR反应试剂、电泳相关材料，选择依据是“纯度高、适用性强、操作简便”，贴合高中实验室条件，具体如下：
1. 模板DNA：可选用基因组DNA、质粒DNA或PCR扩增后的中间产物，要求模板DNA纯度高（无蛋白质、RNA、核酸酶等杂质，避免影响PCR扩增），浓度适宜（一般为10~100ng/μL）；高中实验中常用质粒DNA作为模板，因其纯度易控制、目标片段明确，扩增效果稳定。
2. PCR反应试剂：选用商业化PCR试剂盒（含Taq酶、dNTP混合液、引物、缓冲液），无需单独配制各组分，操作简便、误差小，适合高中实验教学；引物需与目标DNA片段的两端互补，长度一般为18~25个碱基，确保特异性结合模板。
3. 电泳相关材料：琼脂糖（纯度高，用于配制凝胶，浓度根据目标DNA片段大小选择：片段越小，凝胶浓度越高）、EB染色液（或安全型荧光染料）、DNA分子量标准（Marker，含已知分子量的DNA片段，用于对比判断目标片段大小）、电泳缓冲液（如TAE缓冲液，维持电泳过程中的pH稳定，提供离子环境，保证电场稳定）。
注意：模板DNA需妥善保存（-20℃冷藏），避免反复冻融导致DNA降解；EB染色液具有致癌性，操作时需佩戴手套、护目镜，严格遵守安全规范；DNA分子量标准需按照说明书保存，避免失效。
（三）实验中关键试剂与器具的作用原理
1. PCR反应相关试剂：
模板DNA：PCR扩增的模板，提供目标DNA片段的原始序列，是扩增的基础；
Taq酶：耐高温DNA聚合酶，核心作用是催化DNA链的延伸，可在72℃下稳定发挥作用，且能耐受变性步骤的高温（90~95℃），避免高温失活；
引物：短单链DNA片段，与模板DNA两端的序列互补，可与模板结合，为Taq酶提供延伸起始位点，决定扩增的特异性（仅目标DNA片段可被扩增）；
dNTP混合液：含dATP、dTTP、dCTP、dGTP四种脱氧核苷三磷酸，是DNA合成的原料，为DNA链的延伸提供碱基；
PCR缓冲液：维持反应体系的pH稳定（一般为8.3~8.8），提供Mg （Taq酶的激活剂），保证Taq酶的活性和PCR反应的顺利进行。
2.电泳相关试剂：
琼脂糖：一种多糖，加热溶解后冷却凝固形成凝胶，凝胶内部有许多多孔通道，可作为DNA片段迁移的载体，通道大小与琼脂糖浓度相关（浓度越高，通道越小）；
电泳缓冲液（TAE缓冲液）：维持电泳过程中的pH稳定，避免DNA变性；提供离子，增强溶液导电性，保证电场强度稳定；
EB染色液（或安全型荧光染料）：与DNA结合后，在紫外线照射下发出荧光，便于观察DNA条带的位置和数量；
DNA分子量标准（Marker）：含已知分子量的DNA片段混合物，电泳后形成清晰的条带，作为对照，用于判断目标DNA片段的分子量大小。
3.关键器具：
-PCR仪：核心仪器，用于精确控制PCR反应的温度和时间，实现变性、复性、延伸三步循环的自动化运行；
电泳仪：提供稳定的电场，控制电泳电压和电流，驱动DNA片段在凝胶中迁移；
电泳槽：用于放置琼脂糖凝胶和电泳缓冲液，形成电泳回路；
移液器（移液枪）：用于精确吸取和转移试剂、模板DNA、PCR产物，确保反应体系组分的准确性；
紫外凝胶成像仪：用于照射电泳后的凝胶，观察并拍摄DNA荧光条带，分析实验结果；
其他器具：烧杯、玻璃棒、容量瓶、电子天平、微波炉（加热溶解琼脂糖）、离心管、离心机（可选，用于离心混匀反应体系）。
（四）实验设计的基本原则
1.对照原则：本实验需设置2组对照，① 空白对照（PCR反应体系中不加模板DNA，其他组分均加入），用于排除试剂污染（若空白对照出现DNA条带，说明试剂被污染）；② 阳性对照（PCR反应体系中加入已知的阳性模板DNA，可正常扩增出目标条带），用于验证PCR反应体系和操作的有效性；电泳时需加入DNA分子量标准，作为判断目标片段大小的对照。
2.单一变量原则：探究某一因素（如PCR循环次数、复性温度、琼脂糖凝胶浓度）对实验结果的影响时，仅改变该因素，其他条件（试剂用量、反应时间、电泳电压等）需保持一致，确保实验结果的科学性；例如，探究循环次数对扩增效果的影响时，设置不同的循环次数（25次、30次、35次），其他条件相同，对比电泳条带的亮度。
3.平行重复原则：每组实验至少设置3个重复，相同条件下进行PCR扩增和电泳鉴定，避免单一样本的偶然性，提高实验结果的可靠性（如多次扩增同一模板，对比电泳条带的一致性）。
【实验目的】 1.理解PCR扩增DNA片段的核心原理（DNA半保留复制、三步循环机制）和琼脂糖凝胶电泳鉴定的原理（DNA带电性、分子量差异），深化对核酸复制和电泳技术的理解。 2.掌握PCR反应体系的配制、PCR仪的设置与操作，掌握琼脂糖凝胶的配制、电泳装置的组装、样品点样及结果观察等基本操作，提升实验操作和现象分析能力。 3.探究影响PCR扩增效果（如循环次数、复性温度）和电泳结果（如凝胶浓度、电压）的因素，能规范记录实验现象、分析实验结果并归纳实验结论。 4.联系PCR技术、电泳技术的实际应用，认识该技术在医学、刑侦、基因诊断等领域的价值，培养科学探究能力和严谨的实验素养。
【材料用具】 （一）实验材料
模板DNA（质粒DNA，纯度高、浓度适宜）、DNA分子量标准（Marker）、蒸馏水。 （二）实验器具
PCR仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪、移液器（10μL、100μL）、离心管（0.2mL、1.5mL）、离心机（可选）、烧杯、玻璃棒、容量瓶（100mL）、电子天平、微波炉、试管架、手套、护目镜、实验记录表。 （三）实验试剂
1. PCR试剂盒：含Taq酶、dNTP混合液（10mmol/L）、引物（上游引物、下游引物，10μmol/L）、PCR缓冲液（含Mg ）；
2. 电泳相关试剂：琼脂糖（分析纯）、TAE电泳缓冲液（50×浓缩液，使用时稀释为1×）、EB染色液（0.5μg/mL，或安全型荧光染料）；
3. 其他试剂：无菌蒸馏水（用于稀释试剂、配制凝胶）、loading buffer（上样缓冲液，含溴酚蓝，用于指示样品迁移位置）。 （四）辅助材料
实验操作手册、PCR循环参数示意图、电泳图谱示例、实验安全防护用品（手套、护目镜）、吸水纸。
【方法步骤】
1.实验准备与试剂处理（第1步） ① 试剂准备：将PCR试剂盒从-20℃冰箱取出，室温放置5~10分钟（避免反复冻融）；将50×TAE电泳缓冲液稀释为1×TAE缓冲液（如取20mL浓缩液，加980mL蒸馏水，摇匀备用）；准备好EB染色液（或安全型荧光染料）、loading buffer。 ② 器具准备：将PCR离心管、移液器吸头、电泳槽、凝胶托盘等器具清洗干净，晾干备用；检查PCR仪、电泳仪、紫外凝胶成像仪是否正常工作；将微波炉、电子天平调试至正常状态。 2. PCR反应体系的配制（第2步） ① 取1支0.2mL无菌PCR离心管，做好标记（如“实验组”“空白对照”“阳性对照”）； ② 按照试剂盒说明书，用移液器依次向离心管中加入各组分（按体积从小到大顺序加入，避免试剂污染），典型20μL反应体系如下： PCR缓冲液（10×）：2μL；dNTP混合液：0.4μL；上游引物：0.8μL；下游引物：0.8μL；Taq酶：0.2μL；模板DNA：1μL；无菌蒸馏水：14.8μL； ③ 加入所有组分后，轻轻弹击离心管底部，使试剂充分混匀；若有离心机，可离心10秒（转速5000r/min），使试剂集中在离心管底部，避免气泡产生； ④ 空白对照：配制与实验组相同的反应体系，但不加模板DNA，加入1μL无菌蒸馏水替代；阳性对照：加入已知的阳性模板DNA，其他组分与实验组一致。 3. PCR扩增（第3步） ① 将配制好的PCR离心管放入PCR仪的样品槽中，盖紧PCR仪盖子，设置PCR循环参数（高中实验常用参数）： 预变性：94℃，5分钟（使模板DNA完全解旋，为扩增做准备）； 循环（30~35次）：变性94℃，30秒；复性55℃，30秒；延伸72℃，1分钟；终延伸：72℃，10分钟（使所有DNA片段充分延伸，确保扩增完整性）； 保温：4℃，保存（防止PCR产物降解）； ② 设置完成后，启动PCR仪，开始扩增，扩增过程约1.5~2小时，期间观察PCR仪运行状态，避免异常。 4.琼脂糖凝胶的配制（第4步） ① 根据目标DNA片段大小，确定琼脂糖凝胶浓度（高中实验常用1.0%~1.5%，如目标片段为500~1000bp，选用1.2%琼脂糖）； ② 用电子天平称取适量琼脂糖，放入100mL烧杯中，加入50mL 1×TAE缓冲液，用玻璃棒搅拌均匀； ③ 将烧杯放入微波炉中，中高火加热1~2分钟，期间取出搅拌1次，直至琼脂糖完全溶解（溶液透明，无颗粒），避免加热过度导致溶液沸腾溢出； ④ 待琼脂糖溶液冷却至50~60℃（手感不烫手），加入适量EB染色液（50mL凝胶中加入2μL 0.5μg/mL EB染色液），轻轻搅拌均匀（避免产生气泡）； ⑤ 将凝胶托盘放入电泳槽中，安装好梳子（梳齿间距根据点样孔大小选择），将冷却后的琼脂糖溶液缓慢倒入托盘，避免产生气泡； ⑥ 静置20~30分钟，待琼脂糖凝胶完全凝固后，轻轻拔出梳子，形成点样孔；将凝固的凝胶连同托盘放入电泳槽中，加入1×TAE缓冲液，使缓冲液液面高于凝胶表面1~2mm。 5.电泳鉴定（第5步） ① 取PCR扩增产物、DNA分子量标准（Marker），分别加入loading buffer（如取5μL PCR产物，加入1μL loading buffer），轻轻混匀； ② 用移液器将混匀后的样品缓慢加入凝胶的点样孔中（点样时吸头垂直对准点样孔，避免吸头触碰凝胶，防止样品污染或点样孔破损）；每个点样孔加入5~8μL样品，DNA分子量标准单独加入一个点样孔； ③ 盖紧电泳槽盖子，连接电泳仪电源（注意正负极：DNA带负电，点样孔一端接负极，凝胶另一端接正极，避免接反导致DNA片段反向迁移）； ④ 设置电泳参数：电压为5~10V/cm（如凝胶长度为10cm，电压设置为50~100V），电泳时间为20~30分钟；启动电泳仪，开始电泳，期间观察溴酚蓝的迁移位置（溴酚蓝迁移至凝胶中部时，可停止电泳）。 6.结果观察与分析（第6步） ① 电泳结束后，关闭电泳仪电源，断开电源连接；将凝胶从电泳槽中取出，放入紫外凝胶成像仪中； ② 打开紫外灯（波长302nm），观察凝胶上的荧光条带，拍摄电泳图谱； ③ 对比DNA分子量标准的条带位置，判断PCR扩增产物（目标DNA片段）的分子量大小；观察实验组、空白对照、阳性对照的条带情况，分析扩增效果。 7. 实验结束与整理（第7步） ① 实验结束后，将PCR产物妥善保存（-20℃冷藏），用于后续实验或丢弃； ② 含EB染色液的凝胶、废液属于危险废物，需单独收集处理，不可直接丢弃或倒入下水道（EB具有致癌性）； ③ 将电泳槽、凝胶托盘、移液器等器具清洗干净，晾干后归位；关闭PCR仪、电泳仪、紫外凝胶成像仪等仪器，整理实验台； ④ 整理实验数据，绘制电泳图谱，描述实验现象，分析实验结果，归纳实验结论，填写实验记录表。 补充（操作注意拓展）： 1. 若PCR扩增产物无条带，可适当调整复性温度（降低1~2℃）或增加循环次数（5次左右），重新进行扩增； 2. 若电泳条带模糊，可适当提高琼脂糖凝胶浓度、降低电泳电压、缩短电泳时间，或增加PCR产物的上样量。
【实验结果】
1. PCR扩增结果： ① 正常情况： 阳性对照：电泳后出现清晰的荧光条带，条带位置与目标DNA片段的分子量一致，说明PCR反应体系和操作有效； 实验组：电泳后出现清晰的荧光条带，条带位置与阳性对照一致，且无明显杂带，说明目标DNA片段扩增成功，纯度较高；条带越亮，说明PCR产物含量越高（扩增效果越好）； 空白对照：电泳后无荧光条带，说明试剂未被污染，实验结果可靠。 ② 异常情况： 实验组无条带：说明PCR扩增失败，可能是模板DNA降解、引物失效、Taq酶失活、循环参数设置不当（如复性温度过高）； 实验组出现杂带：说明扩增特异性差，可能是引物设计不合理、复性温度过低、模板DNA纯度低（含杂质）； 空白对照出现条带：说明试剂被DNA污染，需更换试剂重新实验； 条带模糊、拖尾：说明PCR产物降解，或电泳操作不当（如凝胶浓度过低、电压过高、点样量过多）。 2. 电泳鉴定结果分析： ① 通过对比DNA分子量标准的条带位置，可准确判断目标DNA片段的分子量大小（如目标片段为800bp，若实验组条带与分子量标准中800bp的条带位置一致，说明扩增的片段符合预期）； ② 条带的亮度反映PCR产物的含量，亮度越高，产物含量越高，说明扩增效果越好；若条带暗淡，说明扩增产物含量低，可能是循环次数不足、模板DNA浓度过低； ③ 杂带的出现说明扩增过程中出现非特异性扩增，需优化实验条件（如调整复性温度、更换引物）。
【实验结论】 1. PCR技术可在体外快速扩增特定DNA片段：通过变性、复性、延伸三步循环，可实现目标DNA片段的指数级扩增，Taq酶的耐高温特性是PCR扩增顺利进行的关键，引物的特异性决定了扩增片段的特异性。 2.琼脂糖凝胶电泳可有效分离和鉴定DNA片段：DNA分子带负电，在电场中向正极移动，迁移速率与分子量大小相关，可通过电泳图谱判断DNA片段的分子量大小、扩增效果和纯度。 3. 实验条件（PCR循环参数、凝胶浓度、电泳电压等）会影响实验结果：适宜的复性温度、足够的循环次数可提高PCR扩增效果；适宜的琼脂糖凝胶浓度和电泳电压可获得清晰的电泳条带，便于结果分析。 4.空白对照和阳性对照的设置可确保实验结果的可靠性：空白对照排除试剂污染，阳性对照验证实验体系的有效性，两者结合可准确判断PCR扩增是否成功。 5. PCR技术和电泳技术是核酸研究的重要手段，可用于DNA片段的扩增、鉴定，为后续基因克隆、基因诊断、刑侦鉴定等提供基础。
【注意事项】 1. 试剂使用规范（核心注意事项）： ① PCR试剂需妥善保存（-20℃冷藏），避免反复冻融，使用前室温放置5~10分钟，防止试剂失效；引物、Taq酶需分装保存，避免污染； ② EB染色液具有致癌性，操作时必须佩戴手套、护目镜，避免接触皮肤和黏膜；染色后的凝胶和废液需单独收集处理，不可随意丢弃；若使用安全型荧光染料，也需规范操作，避免污染； ③ 移液器吸头需一次性使用，避免交叉污染（如配制PCR体系的吸头，不可用于吸取不同试剂或样品）；PCR离心管需无菌，避免污染导致扩增失败。 2.PCR操作规范： ① 配制PCR反应体系时，需按体积从小到大的顺序加入试剂，先加蒸馏水，再加缓冲液、dNTP、引物，最后加Taq酶和模板DNA，避免Taq酶提前接触高温或其他试剂而失活； ② 加入试剂后，需充分混匀，避免气泡产生；若有离心机，离心10秒使试剂集中在管底，确保反应充分； ③ PCR仪参数设置需准确，尤其是变性、复性、延伸的温度和时间，以及循环次数，参数偏差会导致扩增失败或效果不佳；放入PCR管时，确保盖子盖紧，避免漏气影响温度控制。 3.电泳操作规范： ① 配制琼脂糖凝胶时，加热时间不宜过长，避免溶液沸腾溢出；冷却至50~60℃后再加入染色液，避免高温破坏染色剂； ② 凝胶凝固后，拔出梳子时动作要轻柔，避免损坏点样孔；放入电泳槽时，确保凝胶与电极连接正确（点样孔接负极），避免DNA反向迁移； ③ 点样时，吸头垂直对准点样孔，缓慢加入样品，避免吸头触碰凝胶或点样孔边缘，防止样品污染、漏样或点样孔破损；上样量不宜过多（5~8μL），避免条带模糊。 4.结果观察规范： ① 紫外凝胶成像仪使用时，需关闭门窗，避免紫外线照射皮肤和眼睛；观察时间不宜过长，拍摄后及时关闭紫外灯； ② 分析电泳图谱时，需以DNA分子量标准为对照，准确判断目标片段的分子量大小；区分目标条带和杂带，分析扩增效果。 5.实验安全与环保规范： ① 实验过程中佩戴手套、护目镜，避免接触EB染色液、PCR试剂等有害物质；若不慎接触EB，立即用大量清水冲洗； ② 含EB的凝胶、废液、一次性吸头、离心管等危险废物，需放入专用回收容器，统一处理，不可直接倒入下水道或丢弃； ③ 实验结束后，彻底清洗实验器具，避免试剂残留；关闭所有仪器电源，整理实验台，保持环境整洁。 6. 实验操作误区： ① 误认为“循环次数越多，扩增效果越好”：循环次数过多（超过35次）会导致非特异性扩增增加，出现杂带，且Taq酶活性下降，反而影响扩增效果； ② 忽略引物的特异性：引物设计不合理（如引物长度过短、序列不特异）会导致非特异性扩增，出现杂带； ③ 电泳时正负极接反：导致DNA片段反向迁移，无法观察到条带； ④ 配制PCR体系时，先加Taq酶：Taq酶在常温下也有一定活性，提前加入会导致引物与模板非特异性结合，影响扩增效果。
【实验讨论】 1. 实验方法的局限性与改进： 本实验中PCR扩增的特异性可能不足，如何提高PCR扩增的特异性？（提示：优化复性温度，适当提高复性温度可减少非特异性结合；优化引物设计，增加引物长度、提高引物与模板的特异性结合；提高模板DNA纯度，去除杂质）； 电泳条带模糊、拖尾，如何改进？（提示：提高琼脂糖凝胶浓度、降低电泳电压、缩短电泳时间；减少上样量；确保PCR产物未降解）。 2.误差原因的深度分析： 除了试剂失效、操作不当，还有哪些因素会导致PCR扩增失败或电泳结果异常？（提示：模板DNA浓度过低或降解、引物浓度过高或过低、Taq酶用量不足、电泳缓冲液浓度不当、凝胶凝固不充分），如何针对性改进？（提示：选用纯度高、浓度适宜的模板DNA；按说明书控制试剂用量；确保电泳缓冲液浓度为1×；待凝胶完全凝固后再进行电泳）。 3. 实验原理的拓展应用： 临床中，如何利用PCR技术进行遗传病诊断和新冠病毒检测？（提示：提取患者细胞DNA或病毒RNA，通过PCR扩增特定基因或病毒片段，若扩增出目标条带，说明存在相关基因异常或病毒感染）； 刑侦领域中，PCR技术和电泳技术的作用是什么？（提示：提取现场微量DNA，通过PCR扩增放大，再通过电泳鉴定，与嫌疑人DNA图谱对比，为案件侦破提供证据）； PCR技术和电泳技术还可应用于哪些领域？（提示：基因克隆、物种鉴定、亲子鉴定、转基因生物检测等）。
1.核心原理与操作要点汇总：
① 核心机制：PCR扩增（变性90~95℃解旋→复性55~60℃引物结合→延伸72℃Taq酶催化）→ 电泳鉴定（DNA带负电→电场中向正极迁移→分子量越小迁移越快）；
② 实验流程：PCR反应体系配制→PCR扩增（预变性→循环→终延伸）→琼脂糖凝胶配制→点样→电泳→紫外观察→结果分析；
③ 核心区分：PCR三步循环的温度和作用、DNA电泳的正负极判断、目标条带与杂带的区分、空白对照与阳性对照的作用；
④ 关键原则：单一变量（如循环次数、复性温度）、对照（空白对照+阳性对照+Marker对照）、平行重复（每组3个重复）；
⑤ 操作关键：PCR试剂低温保存、体系配制无交叉污染、电泳正负极正确、EB染色规范。
【典例01】下列关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，错误的是（　　）
A．PCR扩增的核心原理是模拟体内DNA半保留复制，通过三步循环实现指数级扩增
B．Taq酶具有耐高温特性，可在PCR变性步骤（90~95℃）中保持活性
C．DNA分子带负电，电泳时向负极移动，分子量越小，迁移距离越远
D．PCR反应体系中，引物的作用是与模板DNA结合，提供延伸起始位点
【答案】C
【详解】A、PCR扩增模拟体内DNA半保留复制，通过变性、复性、延伸三步循环实现DNA片段指数级扩增，A正确；B、Taq酶来自嗜热菌，耐高温，可耐受变性步骤的高温，在72℃下催化DNA延伸，B正确；C、DNA分子带负电，电泳时向正极移动，分子量越小，迁移速率越快，迁移距离越远，C错误；D、引物与模板DNA两端互补结合，为Taq酶提供延伸起始位点，决定扩增特异性，D正确。故选C。
2.实验误差与异常分析：
误差原因1：PCR无条带→ 模板降解、引物失效、Taq酶失活、复性温度过高、循环次数不足；
误差原因2：电泳无条带→ 正负极接反、样品未点入孔中、凝胶浓度过高、电泳时间过短；
误差原因3：出现杂带→ 复性温度过低、引物特异性差、模板纯度低、循环次数过多；
误差原因4：条带模糊→ 凝胶浓度过低、电压过高、上样量过多、PCR产物降解；
误差原因5：空白对照有条带→ 试剂被DNA污染。
【典例02】进行“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验时，PCR扩增后电泳未观察到目标条带，最可能的原因是（　　）
A．PCR循环次数设置为30次，符合实验要求
B．复性温度设置为58℃，与引物特异性匹配
C．模板DNA被核酸酶降解，无法作为扩增模板
D．电泳时，点样孔接负极，凝胶另一端接正极
【答案】C
【详解】A、30次循环符合高中实验要求，不会导致无条带，A错误；B、复性温度58℃适宜，与引物匹配可保证特异性结合，不会导致无条带，B错误；C、模板DNA降解，无法作为扩增模板，会导致PCR扩增失败，电泳无条带，C正确；D、点样孔接负极、另一端接正极，符合电泳要求，不会导致无条带，D错误。故选C。
模拟题感知练
1.某实验利用PCR技术获取目的基因,实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外,还有2条非特异性条带(引物和模板不完全配对)。为了减少非特异性条带的产生,以下措施中有效的是(　　)
A.增加模板DNA的量
B.延长热变性的时间
C.延长延伸的时间
D.提高复性的温度
答案　D
解析　增加模板DNA的量可以提高反应速度,但不能有效减少非特异性条带的产生,A错误;延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性和延伸过程,但对于延伸中的配对影响不大,故不能有效减少产生非特异性条带,B、C错误;非特异性条带增加的原因可能是复性温度过低而造成引物与模板的错配,故可通过提高复性的温度来减少非特异性条带的产生,D正确。
2.(多选)为优化目的基因(700 bp)的PCR条件,研究者设计不同的复性温度进行实验,产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图所示。据图分析,下列有关说法正确的是(　　)
A.阴性对照组可用无菌蒸馏水代替模板,其他成分相同
B.电泳条带的宽度、亮度与扩增产物大小呈正相关
C.复性温度的高低会影响PCR扩增产物的纯度
D.58 ℃是本实验中扩增该基因的最佳复性温度
答案　ACD
解析　实验设计应遵循对照原则与单一变量原则,故阴性对照组可用无菌蒸馏水代替模板,其他成分相同,A正确;PCR技术中,反应最终的电泳条带的宽度、亮度与PCR起始状态的模板DNA(或者模板)含量呈正相关,B错误;据图可知,58 ℃条件下条带宽度最大,故该温度是本实验中扩增该基因的最佳复性温度,D正确。
3.(多选)关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验,下列相关叙述正确的是(　　)
A.PCR仪实质上就是一台能自动调控温度的仪器,但在使用时需根据扩增的DNA片段以及引物的情况人工设定合适的温度
B.PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶,该酶主要在延伸过程中起作用
C.为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水和微量移液器等在使用前都必须进行高压蒸汽灭菌处理
D.电泳时,电泳缓冲液不能没过凝胶,以免凝胶加样孔中的电泳样液流出
答案　AB
解析　为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前都必须进行高压蒸汽灭菌处理,微量移液器不需要高压蒸汽灭菌,C错误;电泳时,电泳缓冲液没过凝胶1 mm为宜,D错误。
4.用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时,得到以下电泳图谱,其中1号为DNA标准样液(Marker),10号为蒸馏水,PCR时加入的模板DNA如图所示。据此作出的分析,不合理的是(　　)
A.PCR产物的分子大小在250~500 bp之间
B.3号样品为不含目的基因的载体DNA
C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D.10号确定反应体系等对结果没有干扰
答案　B
解析　PCR过程中,可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段,4~9号是转基因植株,理论上应包含目的基因,结合2号野生型和10号蒸馏水组的结果,推测包含目的基因的片段大小应为250~500 bp,A正确;3号PCR结果包含250~500 bp片段,应包含目的基因,B错误;9号PCR结果不包含250~500 bp片段,所以不是所需转基因植株,C正确;10号放入蒸馏水,可排除反应体系等对结果的干扰,D正确。
5.关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”(实验 Ⅰ)和“DNA的粗提取与鉴定”(实验Ⅱ)的实验操作,下列相关叙述正确的是(　　)
A.实验Ⅰ中,PCR实验所需的移液器、枪头、蒸馏水等必须进行高压蒸汽灭菌处理
B.实验Ⅰ中,将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳,加样前应先接通电源
C.实验Ⅱ中,取洋葱研磨液的上清液,加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNA
D.实验Ⅱ中,将白色丝状物直接加入到二苯胺试剂中并进行沸水浴,用于鉴定DNA
答案　C
解析　为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前都必须进行高压蒸汽灭菌处理,移液器不需要进行高压蒸汽灭菌处理,A错误;PCR产物进行凝胶电泳,应先加样后接通电源,B错误;DNA不溶于酒精,细胞中的某些蛋白质可溶于酒精,因此离心后取上清液加入等体积的冷酒精进行DNA的粗提取,C正确;鉴定DNA时,应先将白色丝状物溶解在2 mol/L的NaCl溶液中,再加入二苯胺试剂并进行沸水浴,D错误。
6.染色质是由一定长度的核小体为基本单位构成的。将大鼠肝细胞中分离出的染色质用非特异性核酸酶水解后去除染色质蛋白,对得到的DNA片段进行凝胶电泳,结果如图所示。若先将染色质中的蛋白质去掉,后用同样的非特异性核酸酶处理,则得到长度随机的DNA片段。据此分析,下列有关叙述错误的是(　　)
A.凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来
B.染色质中的蛋白质可能对DNA具有保护作用
C.构成核小体的基本单位是脱氧核糖核苷酸和氨基酸
D.当DNA分子处于不同构象时,其在琼脂糖凝胶中的移动速率是一样的
答案　D
解析　染色质用核酸酶处理后,得到的是部分水解的染色质,但若先将染色质中的蛋白质去掉后,用同样的核酸酶处理,则得到长度随机的DNA片段,说明染色质中的蛋白质可能对DNA具有保护作用,B正确;染色质是由一定长度的核小体为基本单位构成的,核小体的组成成分是蛋白质和DNA,其基本单位是氨基酸和脱氧核苷酸,C正确;在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关,故当DNA分子处于不同构象时,其在琼脂糖凝胶中的移动速率可能不一样,D错误。
7.科研人员利用农杆菌转化法将水稻的耐低磷基因OsPTF转移到大豆植株中,获得转基因大豆。如图为重组Ti质粒上T-DNA的序列结构示意图。下列相关叙述错误的是(　　)
A.通过PCR扩增获得大量OsPTF基因时需要了解该基因的全部序列
B.RNA聚合酶识别到终止子后,会使转录过程停止
C.可通过含除草剂的选择培养基筛选含有目的基因的大豆愈伤组织
D.用图中所示两种限制酶切割重组Ti质粒后,至少得到两条不同长度的片段
答案　A
解析　通过PCR扩增目的基因时,不需要知道目的基因全部的碱基序列,只需要知道目的基因的部分碱基序列,以便合成引物,A错误;Ti质粒为环状DNA分子,若重组质粒上只含有图中所示的两个限制酶的识别位点,那么用这两种限制酶切割该质粒后,可以得到两条不同长度的片段,若重组质粒上其他位置还有这两种限制酶的识别位点,则可以得到不止两种不同长度的DNA片段,D正确。
8.(多选)下列关于将目的基因导入受体细胞的叙述,正确的是(　　)
A.用一定浓度的CaCl2溶液处理大肠杆菌,以改变大肠杆菌细胞的生理状态
B.将目的基因转入微生物细胞常用显微注射技术
C.对于动物来说,受体细胞一般是受精卵
D.通过基因工程大量获得胰岛素时,受体细胞选择酵母菌比大肠杆菌更有优势
答案　ACD
解析　将目的基因转入动物细胞常用显微注射技术,将目的基因转入微生物细胞常用Ca2+处理,B错误。
9.氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　)
A.若用Hind Ⅲ酶切,目的基因转录的产物可能不同
B.若用Pvu Ⅰ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因
C.若用Sph Ⅰ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D.若用Sph Ⅰ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
答案　D
解析　若用Hind Ⅲ酶切,目的基因可能正向插入,也可能反向插入,转录的产物可能不同,A正确;若用Pvu Ⅰ酶切,重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR),因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因,B正确;DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段,重组质粒的大小与质粒不同,能够鉴定重组质粒构建成功与否,C正确;Sph Ⅰ的酶切位点位于四环素抗性基因中,若用Sph Ⅰ酶切,会破坏四环素抗性基因,重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR),因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落,在含Tet的培养基中不能形成菌落,D错误。
10.如图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图,载体质粒P0具有四环素抗性基因(TetR)和氨苄青霉素抗性基因(AmpR)。请回答下列问题:
(1)EcoR Ⅴ酶切位点为,EcoR Ⅴ酶切出来的线性载体P1为　　　　末端。
(2)用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段,其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理,在两端各添加了一个碱基为　　　　的脱氧核苷酸,形成P2;P2和目的基因片段在　　　　酶作用下,形成重组质粒P3。
(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落,采用含有不同抗生素的平板进行筛选,得到A、B、C三类菌落,其生长情况如表(“+”代表生长,“-”代表不生长)。根据表中结果判断,应选择的菌落是　　　　(填表中字母)类,另外两类菌落质粒导入情况分别是　　　　、　　　　。
　　　　　 菌落类型 平板类型
A B C
无抗生素 + + +
氨苄青霉素 + + -
四环素 + - -
氨苄青霉素+四环素 + - -
(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒,拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置,PCR鉴定时应选择的一对引物是　　　　。某学生尝试用图中另外一对引物,结果从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段,原因是
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
答案　(1)平　(2)胸腺嘧啶(T)　DNA连接 (3)B　A类菌落含有P0　C类菌落未导入质粒　(4)乙、丙　目的基因反向连接
解析　(1)从题干及图中可以看出,EcoR Ⅴ酶切出来的载体质粒为平末端。(2)从图中可以看出,目的基因的两端各有一个游离的腺嘌呤脱氧核苷酸,由于载体P1为平末端,所以载体P1的两端应该各添加一个胸腺嘧啶脱氧核苷酸,这样在DNA连接酶的作用下才能把目的基因和载体P1连接起来。(3)由题意可知,构建重组质粒时四环素抗性基因被破坏,所以导入目的基因的菌落只能在没有抗生素或含有氨苄青霉素的培养基中存活,应该选B类菌落。A类菌落能在表中条件下存活,说明导入的是P0质粒。C类菌落只能在无抗生素的培养基中存活,说明C类菌落没有导入质粒。(4)据图分析,目的基因的外侧链只能用丙作引物,内侧链可用甲、乙作引物,如果用甲、丙作引物,则无论目的基因是否插入正确,都能通过PCR扩增大量目的基因,如果用乙、丙作为引物,当目的基因插入不正确(反向插入)时,则乙、丙两引物都结合在外侧,PCR不能正常进行,因此选用乙、丙作为引物可以进行PCR鉴定。若扩增出的DNA片段为400 bp,则正好是目的基因反向连接后,外侧链用乙作引物,内侧链用甲作引物扩增出的片段。
11.将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒(辅助T-DNA转移)和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒,共同转入农杆菌,可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同,为提高翻译效率,增强棉花抗病虫害能力,进行如下操作。回答下列问题。
注:F1-F3,R1-R3表示引物;T-DNA-LB表示左边界;T-DNA-RB表示右边界;Ori表示复制原点;KanR表示卡那霉素抗性基因;HygBR表示潮霉素B抗性基因。
(1)从苏云金杆菌提取DNA时,需加入蛋白酶,其作用是
　　　　　　　　　　　　　　　　　。
提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精,其目的是　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)本操作中获取目的基因的方法是　　　　和　　　　。
(3)穿梭质粒中p35s为启动子,其作用是　　　　　　　　　　　　,驱动目的基因转录;插入两个p35s启动子,其目的可能是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置,用　　　　基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。
(5)为检测棉花植株是否导入目的基因,提取棉花植株染色体DNA作模板,进行PCR,应选用的引物是　　　　和　　　　。
答案　(1)水解蛋白质　析出DNA　(2)PCR技术扩增　人工合成　(3)RNA聚合酶识别并结合的部位　提高目的基因的转录效率　(4)HygBR
(5)F3　R2
解析　(1)从苏云金杆菌提取DNA时,需加入蛋白酶,其作用是水解蛋白质,使得DNA与蛋白质分离。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精,其目的是溶解蛋白质等物质,析出不溶于酒精的DNA。(2)本操作中获取目的基因的方法是人工合成和PCR技术扩增。(3)穿梭质粒中p35s为启动子,其作用是RNA聚合酶识别并结合的部位,驱动目的基因转录;插入两个p35s启动子,其目的可能是提高目的基因的转录效率。(4)结合基因表达载体的示意图,根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置,用HygBR基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。(5)为检测棉花植株是否导入目的基因,提取棉花植株染色体DNA作模板,进行PCR,应选用的引物是F3和R2。
12.大豆是重要的粮油作物,提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现,基因S在大豆品种DN(种子较大)中的表达量高于品种TL(种子较小),然后克隆了该基因(两品种中基因S序列无差异)及其上游的启动子序列,并开展相关研究。
注:箭头表示酶的切割位置。
(1)基因S启动子的基本组成单位是　　　　。
(2)通过基因工程方法,将DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题图所示信息(不考虑未标明序列)判断构建重组表达载体时,为保证目标序列的完整性,不宜使用的限制酶是　　　　;此外,不宜同时选用酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ,原因是　　　　　　　　　。
(3)为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上,可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时,对照样品除指示分子大小的标准参照物外,还应有　　　　　　　　　　。经验证的重组表达载体需转入农杆菌,检测转入是否成功的技术是　　　　。
(4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ-1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T+基因S”序列成功导入YZ,所得再生植株YZ-2的种子也变大,但小于YZ-1。综合分析,大豆品种DN较TL种子大的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
答案　(1)脱氧核糖核苷酸(脱氧核苷酸)
(2)EcoR Ⅰ　酶切后形成的片段黏性末端相同,易自身环化;不能保证目标片段与载体定向连接(或反向连接)　(3)酶切后的空载体片段、“启动子D+基因S”片段　PCR　(4)品种DN的基因S上游启动子效应比TL强,使得基因S表达量更高,种子更大
解析　(1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,用于启动基因的转录,是一段有特殊结构序列的DNA片段,其基本组成单位是脱氧核糖核苷酸。(2)根据图示信息可知,“启动子D+基因S”的DNA序列上存在EcoR Ⅰ的识别序列,若使用限制酶EcoR Ⅰ,会使目的基因序列被破坏;根据图中限制酶的识别序列可知,限制酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ切割产生的黏性末端相同,若用这两种限制酶切割,形成的DNA片段在构建基因表达载体时,容易出现自身环化,以及无法保证目的基因片段与载体片段定向连接,影响目的基因在受体细胞中的表达。(3)DNA电泳可以分离不同大小的DNA片段,用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动子D+基因S”片段,还有酶切后的空载体片段,因此电泳时,对照样品除指示分子大小的标准参照物外,还应有酶切后的空载体片段和“启动子D+基因S”片段;在分子水平上检测目的基因是否转入成功可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA。(4)根据题目(4)信息可知,再生植株YZ-1导入的目的基因为取自品种DN的“启动子D+基因S”序列,再生植株YZ-2导入的目的基因为取自品种TL的“启动子T+基因S”序列,结合题干信息“两品种中基因S序列无差异”可推测:品种DN的基因S上游的启动子D的效应强于品种TL的启动子T,启动子D使基因S表达量更高,因而种子更大。
13.源于细菌的纤维素酶是一种复合酶,能降解纤维素。为了提高纤维素酶的降解效率,某课题组通过筛选高产纤维素酶菌株,克隆表达降解纤维素的三种酶(如图),研究了三种酶混合的协同降解作用,以提高生物质资源的利用效率。回答下列问题。
(1)过程①②采用以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基筛选菌株X,能起到筛选作用的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
高产纤维素酶菌株筛选时,刚果红培养基上的菌落周围透明圈大小反映了
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)过程④扩增不同目的基因片段需要的关键酶是　　　　。
(3)过程⑤在基因工程中称为　　　　,该过程需要的主要酶有　　　　。
(4)过程⑥大肠杆菌作为受体细胞的优点有　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
该过程用Ca2+处理细胞,使其处于一种　　　　　　　　　　　　　　的生理状态。
(5)课题组用三种酶及酶混合物对不同生物质原料进行降解处理,结果如下表。表中协同系数存在差异的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出两点)。
生物质 原料 降解率/% 协同系数
酶A 酶B 酶C 混1 混2 混1 混2
小麦秸秆 7.08 6.03 8.19 8.61 26.98 74.33 114.64
玉米秸秆 2.62 1.48 3.76 3.92 9.88 24.98 77.02
玉米芯 0.62 0.48 0.86 0.98 6.79 1.82 11.34
注:混1和混2表示三种酶的混合物。
答案　(1)只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖　菌落产生的纤维素酶的活性和量
(2)耐高温的DNA聚合酶
(3)基因表达载体的构建　限制酶和DNA连接酶
(4)繁殖快、结构简单、遗传物质少、容易培养等　易于吸收周围环境中DNA分子
(5)纤维素的结构与组分不同(生物质原料不同)、三种酶混合物比例不同
解析　(1)选择培养基是指允许特定种类的微生物生长,同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。在以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的选择培养基中,只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长、繁殖。刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物,使得含有纤维素的培养基呈现红色。当纤维素被纤维素酶分解时,刚果红与纤维素的复合物无法形成,培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这个透明圈的大小直接反映了高产纤维素酶菌株分解纤维素的能力。透明圈越大,说明高产纤维素酶菌株分解纤维素的能力越强,即该菌产生的纤维素酶的活性强、量多。(2)扩增目的基因片段在PCR仪中进行,因此需要耐高温的DNA聚合酶。(3)根据图示中酶基因与质粒载体经过过程⑤构成重组质粒,推导出过程⑤为基因表达载体的构建,该过程需要限制酶和DNA连接酶。(4)大肠杆菌作为受体细胞的优点有繁殖快、结构简单、遗传物质少、容易培养等。过程⑥用Ca2+ 处理细胞,使其处于一种易于吸收周围环境中DNA分子的生理状态。(5)混1和混2都是三种酶混合物,但是针对同一种材料的降解效果和协同效果不同,整体上混2效果好于混1,说明不同混合比例影响协同效果。同一混合方式,如混2对小麦秸秆效果好于玉米秸秆,后者好于玉米芯,混1也是一样,说明不同细胞壁组成成分即生物质原料不同,降解效果不同。
14.新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病,我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN,使其在水稻胚乳特异表达,制备获得r2HN疫苗,并对其免疫效果进行了检测。
回答下列问题:
(1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子,若使r2HN仅在水稻胚乳表达,GtP应为　　　　　　启动子。Nos为终止子,其作用为　　　　　　　　　　　　。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此,可选择限制酶　　　　和　　　　对r2HN基因与载体进行酶切,用于表达载体的构建。
(2)利用　　　　方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况,可通过PCR技术检测　　　　　　　　　　,通过　　　　技术检测是否翻译出r2HN蛋白。
(3)获得转基因植株后,通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后,r2HN纯合体植株的占比为　　　　。选择纯合体进行后续研究的原因是
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(4)制备r2HN疫苗后,为研究其免疫效果,对实验组鸡进行接种,对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的CD8+T细胞(细胞毒性T细胞)水平,结果如图2所示。据此分析,获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的　　　　免疫和　　　　免疫。
(5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出两点即可)。
答案　(1)在胚乳中特异性表达的基因　终止转录　HindⅢ　EcoRⅠ
(2)农杆菌转化　r2HN mRNA　抗原—抗体杂交
(3)1/4　纯合体自交后代不发生性状分离
(4)体液　细胞
(5)成本低;转基因水稻易获得
解析　(1)若使r2HN仅在水稻胚乳中表达,则GtP应为在胚乳中特异性表达的基因启动子。终止子是基因下游的一端有特殊序列结构的DNA片段,使转录在所需要的地方停下来。r2HN应插入启动子GtP和终止子Nos之间,由于GtP中有限制酶KpnⅠ的识别序列,而SacⅠ的一个识别序列位于终止子之后,因此不能选择这两种限制酶切割,应选择HindⅢ和EcoRⅠ对r2HN和载体进行酶切。(2)通常采用农杆菌转化法将目的基因导入水稻的愈伤组织。检测r2HN是否表达,可以采用PCR技术检测该基因是否转录出mRNA,通过抗原—抗体杂交技术检测是否翻译出相关蛋白质。(3)设r2HN为基因N,则单一位点插入目的基因的植株的基因型为Nn,其自交后代的基因型及比例为NN∶Nn∶nn=1∶2∶1,r2HN纯合体植株的比例为1/4。纯合体自交后代不会发生性状分离,因此选择纯合体进行后续研究。(4)抗体参与体液免疫,CD8+T细胞为细胞毒性T细胞,参与细胞免疫。分析题图,实验组的抗体水平及CD8+T细胞水平的相对值都高于对照组,说明获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的体液免疫和细胞免疫。(5)水稻属于常见的农作物,易于种植,其作为生物反应器容易获得疫苗;水稻的产量高,作为生物反应器容易从胚乳中获得大量疫苗。
15.某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中,构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段;再经限制酶切割获得含N基因的片段甲,片段甲两端分别为M1与M2;利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组,得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ~Ⅳ)、引物(P1~P4)的结合位置、片段甲替换区如下图所示,→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。
(1)限制酶切割的化学键是　　　　。为保证N基因能在菌株B2中表达,在构建片段甲时,应将M1与M2片段分别插入质粒的 Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间,原因是　　　　　　　　　　。
(2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C和　　　　　　　　　　。
(3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组,所用的模板是　　　　;若用该模板与引物P3和P4进行PCR,实验结果是
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(4)与秸秆焚烧相比,利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出2点即可)。
答案　(1)磷酸二酯键　保证N基因启动子、N基因、N基因终止子的完整性,确保N基因能够顺利表达　(2)C—G、U—A、A—T　(3)N基因的两条链　不能扩增出目的基因　(4)无空气污染;更安全,无火灾隐患;分解效率更高,增加土壤养分等
解析　(1)限制酶作用于DNA的磷酸二酯键。由题述可知,该过程是将重组质粒特定位点,接入M1、M2,再利用限制酶切出新的片段甲替换区(M1+启动子+N基因+终止子+M2),再接入B1基因组中,得到B2,因此在M1和M2之间,需要保证N基因完整性,同时需要保证N基因能够正常表达,因此需要把M1接入启动子之前,M2接入终止子之后。(2)根据所给信息,向导RNA需要与对应DNA进行结合,结合期间,RNA的碱基会和DNA的碱基进行互补配对,根据碱基互补配对原则配对方式包括G—C、C—G、U—A、A—T。(3)据图可知,引物P1和P2结合在N基因两端,以N基因为模板经PCR扩增N基因,用以检测片段甲是否成功插入了细菌B1基因组。用该模板与引物P3和P4进行PCR,因为P3不能与N基因模板链结合,故实验结果是不能扩增出目的基因。(4)秸秆焚烧严重污染环境,且有很大的火灾隐患,与此同时,焚烧对于有机物中的能量是极大的浪费,可以从上述角度进行论述。例如:无空气污染;更安全,无火灾隐患;分解效率更高,增加土壤养分等。
2 / 2实验06 DNA片段的扩增及电泳鉴定
2022年新课标 课标解读
一、生命观念
通过实验探究DNA片段的扩增（PCR技术）及电泳鉴定方法，理解核酸的复制机制和理化性质，建立“核酸的结构与功能相适应、物质变化与能量供应相统一”的生命观念，认同PCR技术对核酸研究的重要意义。
二、科学思维
运用观察、对比、推理、归纳等科学方法，分析PCR扩增的原理（DNA半保留复制）、电泳鉴定的原理（核酸的带电性与分子量差异），解读实验现象与实验结果的关系，推理实验操作对扩增效果、电泳结果的影响，形成基于实验证据的逻辑推理能力和误差分析意识。
三、科学探究
通过设计和实施DNA片段的扩增及电泳鉴定实验，掌握PCR技术的基本操作、琼脂糖凝胶电泳的操作流程，提升实验设计、操作实施、现象描述与结果分析能力，理解实验设计的单一变量原则、对照原则。
四、社会责任
结合实验原理，联系PCR技术、电泳技术在医学、刑侦、生物技术、基因诊断等领域的应用价值，认识核酸技术对人类生产生活、科学研究的重要意义，树立“科学利用生物技术服务人类”的责任意识，培养严谨的科学态度。 1. 知识目标
基础概念：掌握PCR（多聚酶链式反应）、引物、Taq酶、琼脂糖凝胶、电泳、DNA分子量标准等核心术语，理解DNA半保留复制的过程和核酸的带电性特点。
关键原理：理解PCR扩增DNA片段的核心原理（模拟体内DNA复制，通过变性、复性、延伸三步循环实现DNA片段的大量扩增），掌握琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA片段的原理（DNA分子带负电，在电场中向正极移动，迁移速率与分子量大小、构象有关），明确实验中各试剂、仪器的作用及操作目的。
2. 能力目标
操作技能：规范进行PCR反应体系的配制、PCR仪的设置与操作，掌握琼脂糖凝胶的配制、电泳装置的组装、样品点样、电泳运行及结果观察等操作，能规范记录实验现象和实验数据。
数据分析：能分析PCR反应条件（温度、循环次数）、电泳参数（电压、时间）对实验结果的影响，解读电泳图谱，判断DNA片段的分子量大小和扩增效果，归纳实验结论。
3. 价值目标
科学素养：认同实验探究在核酸扩增与鉴定中的作用，培养严谨的科学实验态度、细致的观察能力和规范的实验操作习惯。
跨学科融合：关联化学（核酸的带电性、试剂的作用机理）、物理（电场作用、分子迁移）、生物工程（PCR技术的应用），理解DNA片段扩增及电泳鉴定的理化基础和实践意义。
重点先知：
1.实验核心是“PCR扩增DNA片段+电泳鉴定扩增效果”：PCR技术的核心是模拟体内DNA复制过程，通过变性、复性、延伸三步循环，实现目标DNA片段的大量扩增；电泳鉴定的核心是利用DNA的带电性和分子量差异，分离扩增后的DNA片段，判断扩增是否成功、片段大小是否符合预期，核心是抓住“PCR循环机制”和“电泳分离原理”。
2.操作关键是“控制条件、保证扩增与分离效果”：PCR实验需严格控制反应体系的组分（引物、Taq酶、dNTP、模板DNA等）和反应条件（变性温度、复性温度、延伸温度、循环次数）；电泳实验需控制琼脂糖凝胶浓度、电泳电压和时间，点样时动作规范，避免样品污染或漏样，确保电泳图谱清晰、可分析。
3.核心区分：PCR扩增的三步循环（变性：90~95℃，DNA双链解旋；复性：55~60℃，引物与模板结合；延伸：72℃，Taq酶催化DNA合成）；电泳中，DNA分子带负电，向正极移动，分子量越小，迁移速率越快，迁移距离越远；DNA分子量标准用于对比判断目标片段大小。
教材内容
（一）实验核心原理
1.PCR扩增DNA片段的原理：PCR（多聚酶链式反应）是一种在体外快速扩增特定DNA片段的技术，本质是模拟体内DNA半保留复制过程，通过人工控制温度，使DNA片段重复进行变性、复性、延伸三步循环，实现指数级扩增（每循环一次，DNA片段数量翻倍）。
① 变性：将反应体系加热至90~95℃，持续30秒左右，DNA双链间的氢键断裂，双链解旋形成单链DNA（模板链）；
② 复性：将反应体系冷却至55~60℃，持续30秒左右，两种引物（分别与DNA两条单链的3’端互补）与对应的模板链结合，为DNA合成提供起始位点；
③ 延伸：将反应体系升温至72℃，持续1~2分钟，Taq酶（耐高温DNA聚合酶，来自嗜热菌，可在72℃下稳定发挥作用）以dNTP（四种脱氧核苷三磷酸，DNA合成的原料）为原料，以引物为起始点，按照碱基互补配对原则，沿着模板链5’→3’方向延伸，合成新的DNA链，形成双链DNA。
重复上述三步循环30~35次，目标DNA片段可扩增至数百万甚至数十亿份，满足后续鉴定需求。
2.琼脂糖凝胶电泳鉴定的原理：电泳是利用带电粒子在电场中迁移速率的差异，实现物质分离的技术，本实验采用琼脂糖凝胶电泳分离和鉴定DNA片段，核心原理如下：
① DNA的带电性：DNA分子中磷酸基团带负电荷，在电场中会向正极（阳极）移动；
② 迁移速率的差异：DNA片段的迁移速率与自身分子量大小、构象有关，在相同电场条件下，分子量越小的DNA片段，迁移速率越快，迁移距离越远；分子量越大，迁移速率越慢，迁移距离越近；线性DNA片段的迁移速率遵循“分子量越小，迁移越快”的规律；
③ 显色与观察：DNA本身无色，需在琼脂糖凝胶中加入EB（溴化乙锭）或其他荧光染料，EB可插入DNA双链的碱基之间，在紫外线照射下发出橙红色荧光，通过观察荧光条带的位置、数量和亮度，判断DNA片段的分子量大小、扩增效果（是否有目标条带）和DNA含量（条带越亮，含量越高）。
（二）实验材料的选择与优势
实验核心材料包括模板DNA、PCR反应试剂、电泳相关材料，选择依据是“纯度高、适用性强、操作简便”，贴合高中实验室条件，具体如下：
1. 模板DNA：可选用基因组DNA、质粒DNA或PCR扩增后的中间产物，要求模板DNA纯度高（无蛋白质、RNA、核酸酶等杂质，避免影响PCR扩增），浓度适宜（一般为10~100ng/μL）；高中实验中常用质粒DNA作为模板，因其纯度易控制、目标片段明确，扩增效果稳定。
2. PCR反应试剂：选用商业化PCR试剂盒（含Taq酶、dNTP混合液、引物、缓冲液），无需单独配制各组分，操作简便、误差小，适合高中实验教学；引物需与目标DNA片段的两端互补，长度一般为18~25个碱基，确保特异性结合模板。
3. 电泳相关材料：琼脂糖（纯度高，用于配制凝胶，浓度根据目标DNA片段大小选择：片段越小，凝胶浓度越高）、EB染色液（或安全型荧光染料）、DNA分子量标准（Marker，含已知分子量的DNA片段，用于对比判断目标片段大小）、电泳缓冲液（如TAE缓冲液，维持电泳过程中的pH稳定，提供离子环境，保证电场稳定）。
注意：模板DNA需妥善保存（-20℃冷藏），避免反复冻融导致DNA降解；EB染色液具有致癌性，操作时需佩戴手套、护目镜，严格遵守安全规范；DNA分子量标准需按照说明书保存，避免失效。
（三）实验中关键试剂与器具的作用原理
1. PCR反应相关试剂：
模板DNA：PCR扩增的模板，提供目标DNA片段的原始序列，是扩增的基础；
Taq酶：耐高温DNA聚合酶，核心作用是催化DNA链的延伸，可在72℃下稳定发挥作用，且能耐受变性步骤的高温（90~95℃），避免高温失活；
引物：短单链DNA片段，与模板DNA两端的序列互补，可与模板结合，为Taq酶提供延伸起始位点，决定扩增的特异性（仅目标DNA片段可被扩增）；
dNTP混合液：含dATP、dTTP、dCTP、dGTP四种脱氧核苷三磷酸，是DNA合成的原料，为DNA链的延伸提供碱基；
PCR缓冲液：维持反应体系的pH稳定（一般为8.3~8.8），提供Mg （Taq酶的激活剂），保证Taq酶的活性和PCR反应的顺利进行。
2.电泳相关试剂：
琼脂糖：一种多糖，加热溶解后冷却凝固形成凝胶，凝胶内部有许多多孔通道，可作为DNA片段迁移的载体，通道大小与琼脂糖浓度相关（浓度越高，通道越小）；
电泳缓冲液（TAE缓冲液）：维持电泳过程中的pH稳定，避免DNA变性；提供离子，增强溶液导电性，保证电场强度稳定；
EB染色液（或安全型荧光染料）：与DNA结合后，在紫外线照射下发出荧光，便于观察DNA条带的位置和数量；
DNA分子量标准（Marker）：含已知分子量的DNA片段混合物，电泳后形成清晰的条带，作为对照，用于判断目标DNA片段的分子量大小。
3.关键器具：
-PCR仪：核心仪器，用于精确控制PCR反应的温度和时间，实现变性、复性、延伸三步循环的自动化运行；
电泳仪：提供稳定的电场，控制电泳电压和电流，驱动DNA片段在凝胶中迁移；
电泳槽：用于放置琼脂糖凝胶和电泳缓冲液，形成电泳回路；
移液器（移液枪）：用于精确吸取和转移试剂、模板DNA、PCR产物，确保反应体系组分的准确性；
紫外凝胶成像仪：用于照射电泳后的凝胶，观察并拍摄DNA荧光条带，分析实验结果；
其他器具：烧杯、玻璃棒、容量瓶、电子天平、微波炉（加热溶解琼脂糖）、离心管、离心机（可选，用于离心混匀反应体系）。
（四）实验设计的基本原则
1.对照原则：本实验需设置2组对照，① 空白对照（PCR反应体系中不加模板DNA，其他组分均加入），用于排除试剂污染（若空白对照出现DNA条带，说明试剂被污染）；② 阳性对照（PCR反应体系中加入已知的阳性模板DNA，可正常扩增出目标条带），用于验证PCR反应体系和操作的有效性；电泳时需加入DNA分子量标准，作为判断目标片段大小的对照。
2.单一变量原则：探究某一因素（如PCR循环次数、复性温度、琼脂糖凝胶浓度）对实验结果的影响时，仅改变该因素，其他条件（试剂用量、反应时间、电泳电压等）需保持一致，确保实验结果的科学性；例如，探究循环次数对扩增效果的影响时，设置不同的循环次数（25次、30次、35次），其他条件相同，对比电泳条带的亮度。
3.平行重复原则：每组实验至少设置3个重复，相同条件下进行PCR扩增和电泳鉴定，避免单一样本的偶然性，提高实验结果的可靠性（如多次扩增同一模板，对比电泳条带的一致性）。
【实验目的】 1.理解PCR扩增DNA片段的核心原理（DNA半保留复制、三步循环机制）和琼脂糖凝胶电泳鉴定的原理（DNA带电性、分子量差异），深化对核酸复制和电泳技术的理解。 2.掌握PCR反应体系的配制、PCR仪的设置与操作，掌握琼脂糖凝胶的配制、电泳装置的组装、样品点样及结果观察等基本操作，提升实验操作和现象分析能力。 3.探究影响PCR扩增效果（如循环次数、复性温度）和电泳结果（如凝胶浓度、电压）的因素，能规范记录实验现象、分析实验结果并归纳实验结论。 4.联系PCR技术、电泳技术的实际应用，认识该技术在医学、刑侦、基因诊断等领域的价值，培养科学探究能力和严谨的实验素养。
【材料用具】 （一）实验材料
模板DNA（质粒DNA，纯度高、浓度适宜）、DNA分子量标准（Marker）、蒸馏水。 （二）实验器具
PCR仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪、移液器（10μL、100μL）、离心管（0.2mL、1.5mL）、离心机（可选）、烧杯、玻璃棒、容量瓶（100mL）、电子天平、微波炉、试管架、手套、护目镜、实验记录表。 （三）实验试剂
1. PCR试剂盒：含Taq酶、dNTP混合液（10mmol/L）、引物（上游引物、下游引物，10μmol/L）、PCR缓冲液（含Mg ）；
2. 电泳相关试剂：琼脂糖（分析纯）、TAE电泳缓冲液（50×浓缩液，使用时稀释为1×）、EB染色液（0.5μg/mL，或安全型荧光染料）；
3. 其他试剂：无菌蒸馏水（用于稀释试剂、配制凝胶）、loading buffer（上样缓冲液，含溴酚蓝，用于指示样品迁移位置）。 （四）辅助材料
实验操作手册、PCR循环参数示意图、电泳图谱示例、实验安全防护用品（手套、护目镜）、吸水纸。
【方法步骤】
1.实验准备与试剂处理（第1步） ① 试剂准备：将PCR试剂盒从-20℃冰箱取出，室温放置5~10分钟（避免反复冻融）；将50×TAE电泳缓冲液稀释为1×TAE缓冲液（如取20mL浓缩液，加980mL蒸馏水，摇匀备用）；准备好EB染色液（或安全型荧光染料）、loading buffer。 ② 器具准备：将PCR离心管、移液器吸头、电泳槽、凝胶托盘等器具清洗干净，晾干备用；检查PCR仪、电泳仪、紫外凝胶成像仪是否正常工作；将微波炉、电子天平调试至正常状态。 2. PCR反应体系的配制（第2步） ① 取1支0.2mL无菌PCR离心管，做好标记（如“实验组”“空白对照”“阳性对照”）； ② 按照试剂盒说明书，用移液器依次向离心管中加入各组分（按体积从小到大顺序加入，避免试剂污染），典型20μL反应体系如下： PCR缓冲液（10×）：2μL；dNTP混合液：0.4μL；上游引物：0.8μL；下游引物：0.8μL；Taq酶：0.2μL；模板DNA：1μL；无菌蒸馏水：14.8μL； ③ 加入所有组分后，轻轻弹击离心管底部，使试剂充分混匀；若有离心机，可离心10秒（转速5000r/min），使试剂集中在离心管底部，避免气泡产生； ④ 空白对照：配制与实验组相同的反应体系，但不加模板DNA，加入1μL无菌蒸馏水替代；阳性对照：加入已知的阳性模板DNA，其他组分与实验组一致。 3. PCR扩增（第3步） ① 将配制好的PCR离心管放入PCR仪的样品槽中，盖紧PCR仪盖子，设置PCR循环参数（高中实验常用参数）： 预变性：94℃，5分钟（使模板DNA完全解旋，为扩增做准备）； 循环（30~35次）：变性94℃，30秒；复性55℃，30秒；延伸72℃，1分钟；终延伸：72℃，10分钟（使所有DNA片段充分延伸，确保扩增完整性）； 保温：4℃，保存（防止PCR产物降解）； ② 设置完成后，启动PCR仪，开始扩增，扩增过程约1.5~2小时，期间观察PCR仪运行状态，避免异常。 4.琼脂糖凝胶的配制（第4步） ① 根据目标DNA片段大小，确定琼脂糖凝胶浓度（高中实验常用1.0%~1.5%，如目标片段为500~1000bp，选用1.2%琼脂糖）； ② 用电子天平称取适量琼脂糖，放入100mL烧杯中，加入50mL 1×TAE缓冲液，用玻璃棒搅拌均匀； ③ 将烧杯放入微波炉中，中高火加热1~2分钟，期间取出搅拌1次，直至琼脂糖完全溶解（溶液透明，无颗粒），避免加热过度导致溶液沸腾溢出； ④ 待琼脂糖溶液冷却至50~60℃（手感不烫手），加入适量EB染色液（50mL凝胶中加入2μL 0.5μg/mL EB染色液），轻轻搅拌均匀（避免产生气泡）； ⑤ 将凝胶托盘放入电泳槽中，安装好梳子（梳齿间距根据点样孔大小选择），将冷却后的琼脂糖溶液缓慢倒入托盘，避免产生气泡； ⑥ 静置20~30分钟，待琼脂糖凝胶完全凝固后，轻轻拔出梳子，形成点样孔；将凝固的凝胶连同托盘放入电泳槽中，加入1×TAE缓冲液，使缓冲液液面高于凝胶表面1~2mm。 5.电泳鉴定（第5步） ① 取PCR扩增产物、DNA分子量标准（Marker），分别加入loading buffer（如取5μL PCR产物，加入1μL loading buffer），轻轻混匀； ② 用移液器将混匀后的样品缓慢加入凝胶的点样孔中（点样时吸头垂直对准点样孔，避免吸头触碰凝胶，防止样品污染或点样孔破损）；每个点样孔加入5~8μL样品，DNA分子量标准单独加入一个点样孔； ③ 盖紧电泳槽盖子，连接电泳仪电源（注意正负极：DNA带负电，点样孔一端接负极，凝胶另一端接正极，避免接反导致DNA片段反向迁移）； ④ 设置电泳参数：电压为5~10V/cm（如凝胶长度为10cm，电压设置为50~100V），电泳时间为20~30分钟；启动电泳仪，开始电泳，期间观察溴酚蓝的迁移位置（溴酚蓝迁移至凝胶中部时，可停止电泳）。 6.结果观察与分析（第6步） ① 电泳结束后，关闭电泳仪电源，断开电源连接；将凝胶从电泳槽中取出，放入紫外凝胶成像仪中； ② 打开紫外灯（波长302nm），观察凝胶上的荧光条带，拍摄电泳图谱； ③ 对比DNA分子量标准的条带位置，判断PCR扩增产物（目标DNA片段）的分子量大小；观察实验组、空白对照、阳性对照的条带情况，分析扩增效果。 7. 实验结束与整理（第7步） ① 实验结束后，将PCR产物妥善保存（-20℃冷藏），用于后续实验或丢弃； ② 含EB染色液的凝胶、废液属于危险废物，需单独收集处理，不可直接丢弃或倒入下水道（EB具有致癌性）； ③ 将电泳槽、凝胶托盘、移液器等器具清洗干净，晾干后归位；关闭PCR仪、电泳仪、紫外凝胶成像仪等仪器，整理实验台； ④ 整理实验数据，绘制电泳图谱，描述实验现象，分析实验结果，归纳实验结论，填写实验记录表。 补充（操作注意拓展）： 1. 若PCR扩增产物无条带，可适当调整复性温度（降低1~2℃）或增加循环次数（5次左右），重新进行扩增； 2. 若电泳条带模糊，可适当提高琼脂糖凝胶浓度、降低电泳电压、缩短电泳时间，或增加PCR产物的上样量。
【实验结果】
1. PCR扩增结果： ① 正常情况： 阳性对照：电泳后出现清晰的荧光条带，条带位置与目标DNA片段的分子量一致，说明PCR反应体系和操作有效； 实验组：电泳后出现清晰的荧光条带，条带位置与阳性对照一致，且无明显杂带，说明目标DNA片段扩增成功，纯度较高；条带越亮，说明PCR产物含量越高（扩增效果越好）； 空白对照：电泳后无荧光条带，说明试剂未被污染，实验结果可靠。 ② 异常情况： 实验组无条带：说明PCR扩增失败，可能是模板DNA降解、引物失效、Taq酶失活、循环参数设置不当（如复性温度过高）； 实验组出现杂带：说明扩增特异性差，可能是引物设计不合理、复性温度过低、模板DNA纯度低（含杂质）； 空白对照出现条带：说明试剂被DNA污染，需更换试剂重新实验； 条带模糊、拖尾：说明PCR产物降解，或电泳操作不当（如凝胶浓度过低、电压过高、点样量过多）。 2. 电泳鉴定结果分析： ① 通过对比DNA分子量标准的条带位置，可准确判断目标DNA片段的分子量大小（如目标片段为800bp，若实验组条带与分子量标准中800bp的条带位置一致，说明扩增的片段符合预期）； ② 条带的亮度反映PCR产物的含量，亮度越高，产物含量越高，说明扩增效果越好；若条带暗淡，说明扩增产物含量低，可能是循环次数不足、模板DNA浓度过低； ③ 杂带的出现说明扩增过程中出现非特异性扩增，需优化实验条件（如调整复性温度、更换引物）。
【实验结论】 1. PCR技术可在体外快速扩增特定DNA片段：通过变性、复性、延伸三步循环，可实现目标DNA片段的指数级扩增，Taq酶的耐高温特性是PCR扩增顺利进行的关键，引物的特异性决定了扩增片段的特异性。 2.琼脂糖凝胶电泳可有效分离和鉴定DNA片段：DNA分子带负电，在电场中向正极移动，迁移速率与分子量大小相关，可通过电泳图谱判断DNA片段的分子量大小、扩增效果和纯度。 3. 实验条件（PCR循环参数、凝胶浓度、电泳电压等）会影响实验结果：适宜的复性温度、足够的循环次数可提高PCR扩增效果；适宜的琼脂糖凝胶浓度和电泳电压可获得清晰的电泳条带，便于结果分析。 4.空白对照和阳性对照的设置可确保实验结果的可靠性：空白对照排除试剂污染，阳性对照验证实验体系的有效性，两者结合可准确判断PCR扩增是否成功。 5. PCR技术和电泳技术是核酸研究的重要手段，可用于DNA片段的扩增、鉴定，为后续基因克隆、基因诊断、刑侦鉴定等提供基础。
【注意事项】 1. 试剂使用规范（核心注意事项）： ① PCR试剂需妥善保存（-20℃冷藏），避免反复冻融，使用前室温放置5~10分钟，防止试剂失效；引物、Taq酶需分装保存，避免污染； ② EB染色液具有致癌性，操作时必须佩戴手套、护目镜，避免接触皮肤和黏膜；染色后的凝胶和废液需单独收集处理，不可随意丢弃；若使用安全型荧光染料，也需规范操作，避免污染； ③ 移液器吸头需一次性使用，避免交叉污染（如配制PCR体系的吸头，不可用于吸取不同试剂或样品）；PCR离心管需无菌，避免污染导致扩增失败。 2.PCR操作规范： ① 配制PCR反应体系时，需按体积从小到大的顺序加入试剂，先加蒸馏水，再加缓冲液、dNTP、引物，最后加Taq酶和模板DNA，避免Taq酶提前接触高温或其他试剂而失活； ② 加入试剂后，需充分混匀，避免气泡产生；若有离心机，离心10秒使试剂集中在管底，确保反应充分； ③ PCR仪参数设置需准确，尤其是变性、复性、延伸的温度和时间，以及循环次数，参数偏差会导致扩增失败或效果不佳；放入PCR管时，确保盖子盖紧，避免漏气影响温度控制。 3.电泳操作规范： ① 配制琼脂糖凝胶时，加热时间不宜过长，避免溶液沸腾溢出；冷却至50~60℃后再加入染色液，避免高温破坏染色剂； ② 凝胶凝固后，拔出梳子时动作要轻柔，避免损坏点样孔；放入电泳槽时，确保凝胶与电极连接正确（点样孔接负极），避免DNA反向迁移； ③ 点样时，吸头垂直对准点样孔，缓慢加入样品，避免吸头触碰凝胶或点样孔边缘，防止样品污染、漏样或点样孔破损；上样量不宜过多（5~8μL），避免条带模糊。 4.结果观察规范： ① 紫外凝胶成像仪使用时，需关闭门窗，避免紫外线照射皮肤和眼睛；观察时间不宜过长，拍摄后及时关闭紫外灯； ② 分析电泳图谱时，需以DNA分子量标准为对照，准确判断目标片段的分子量大小；区分目标条带和杂带，分析扩增效果。 5.实验安全与环保规范： ① 实验过程中佩戴手套、护目镜，避免接触EB染色液、PCR试剂等有害物质；若不慎接触EB，立即用大量清水冲洗； ② 含EB的凝胶、废液、一次性吸头、离心管等危险废物，需放入专用回收容器，统一处理，不可直接倒入下水道或丢弃； ③ 实验结束后，彻底清洗实验器具，避免试剂残留；关闭所有仪器电源，整理实验台，保持环境整洁。 6. 实验操作误区： ① 误认为“循环次数越多，扩增效果越好”：循环次数过多（超过35次）会导致非特异性扩增增加，出现杂带，且Taq酶活性下降，反而影响扩增效果； ② 忽略引物的特异性：引物设计不合理（如引物长度过短、序列不特异）会导致非特异性扩增，出现杂带； ③ 电泳时正负极接反：导致DNA片段反向迁移，无法观察到条带； ④ 配制PCR体系时，先加Taq酶：Taq酶在常温下也有一定活性，提前加入会导致引物与模板非特异性结合，影响扩增效果。
【实验讨论】 1. 实验方法的局限性与改进： 本实验中PCR扩增的特异性可能不足，如何提高PCR扩增的特异性？（提示：优化复性温度，适当提高复性温度可减少非特异性结合；优化引物设计，增加引物长度、提高引物与模板的特异性结合；提高模板DNA纯度，去除杂质）； 电泳条带模糊、拖尾，如何改进？（提示：提高琼脂糖凝胶浓度、降低电泳电压、缩短电泳时间；减少上样量；确保PCR产物未降解）。 2.误差原因的深度分析： 除了试剂失效、操作不当，还有哪些因素会导致PCR扩增失败或电泳结果异常？（提示：模板DNA浓度过低或降解、引物浓度过高或过低、Taq酶用量不足、电泳缓冲液浓度不当、凝胶凝固不充分），如何针对性改进？（提示：选用纯度高、浓度适宜的模板DNA；按说明书控制试剂用量；确保电泳缓冲液浓度为1×；待凝胶完全凝固后再进行电泳）。 3. 实验原理的拓展应用： 临床中，如何利用PCR技术进行遗传病诊断和新冠病毒检测？（提示：提取患者细胞DNA或病毒RNA，通过PCR扩增特定基因或病毒片段，若扩增出目标条带，说明存在相关基因异常或病毒感染）； 刑侦领域中，PCR技术和电泳技术的作用是什么？（提示：提取现场微量DNA，通过PCR扩增放大，再通过电泳鉴定，与嫌疑人DNA图谱对比，为案件侦破提供证据）； PCR技术和电泳技术还可应用于哪些领域？（提示：基因克隆、物种鉴定、亲子鉴定、转基因生物检测等）。
1.核心原理与操作要点汇总：
① 核心机制：PCR扩增（变性90~95℃解旋→复性55~60℃引物结合→延伸72℃Taq酶催化）→ 电泳鉴定（DNA带负电→电场中向正极迁移→分子量越小迁移越快）；
② 实验流程：PCR反应体系配制→PCR扩增（预变性→循环→终延伸）→琼脂糖凝胶配制→点样→电泳→紫外观察→结果分析；
③ 核心区分：PCR三步循环的温度和作用、DNA电泳的正负极判断、目标条带与杂带的区分、空白对照与阳性对照的作用；
④ 关键原则：单一变量（如循环次数、复性温度）、对照（空白对照+阳性对照+Marker对照）、平行重复（每组3个重复）；
⑤ 操作关键：PCR试剂低温保存、体系配制无交叉污染、电泳正负极正确、EB染色规范。
【典例01】下列关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，错误的是（　　）
A．PCR扩增的核心原理是模拟体内DNA半保留复制，通过三步循环实现指数级扩增
B．Taq酶具有耐高温特性，可在PCR变性步骤（90~95℃）中保持活性
C．DNA分子带负电，电泳时向负极移动，分子量越小，迁移距离越远
D．PCR反应体系中，引物的作用是与模板DNA结合，提供延伸起始位点
2.实验误差与异常分析：
误差原因1：PCR无条带→ 模板降解、引物失效、Taq酶失活、复性温度过高、循环次数不足；
误差原因2：电泳无条带→ 正负极接反、样品未点入孔中、凝胶浓度过高、电泳时间过短；
误差原因3：出现杂带→ 复性温度过低、引物特异性差、模板纯度低、循环次数过多；
误差原因4：条带模糊→ 凝胶浓度过低、电压过高、上样量过多、PCR产物降解；
误差原因5：空白对照有条带→ 试剂被DNA污染。
【典例02】进行“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验时，PCR扩增后电泳未观察到目标条带，最可能的原因是（　　）
A．PCR循环次数设置为30次，符合实验要求
B．复性温度设置为58℃，与引物特异性匹配
C．模板DNA被核酸酶降解，无法作为扩增模板
D．电泳时，点样孔接负极，凝胶另一端接正极
模拟题感知练
1.某实验利用PCR技术获取目的基因,实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外,还有2条非特异性条带(引物和模板不完全配对)。为了减少非特异性条带的产生,以下措施中有效的是(　　)
A.增加模板DNA的量B.延长热变性的时间
C.延长延伸的时间D.提高复性的温度
2.(多选)为优化目的基因(700 bp)的PCR条件,研究者设计不同的复性温度进行实验,产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图所示。据图分析,下列有关说法正确的是(　　)
A.阴性对照组可用无菌蒸馏水代替模板,其他成分相同
B.电泳条带的宽度、亮度与扩增产物大小呈正相关
C.复性温度的高低会影响PCR扩增产物的纯度
D.58 ℃是本实验中扩增该基因的最佳复性温度
3.(多选)关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验,下列相关叙述正确的是(　　)
A.PCR仪实质上就是一台能自动调控温度的仪器,但在使用时需根据扩增的DNA片段以及引物的情况人工设定合适的温度
B.PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶,该酶主要在延伸过程中起作用
C.为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水和微量移液器等在使用前都必须进行高压蒸汽灭菌处理
D.电泳时,电泳缓冲液不能没过凝胶,以免凝胶加样孔中的电泳样液流出
4.用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时,得到以下电泳图谱,其中1号为DNA标准样液(Marker),10号为蒸馏水,PCR时加入的模板DNA如图所示。据此作出的分析,不合理的是(　　)
A.PCR产物的分子大小在250~500 bp之间
B.3号样品为不含目的基因的载体DNA
C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D.10号确定反应体系等对结果没有干扰
5.关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”(实验 Ⅰ)和“DNA的粗提取与鉴定”(实验Ⅱ)的实验操作,下列相关叙述正确的是(　　)
A.实验Ⅰ中,PCR实验所需的移液器、枪头、蒸馏水等必须进行高压蒸汽灭菌处理
B.实验Ⅰ中,将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳,加样前应先接通电源
C.实验Ⅱ中,取洋葱研磨液的上清液,加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNA
D.实验Ⅱ中,将白色丝状物直接加入到二苯胺试剂中并进行沸水浴,用于鉴定DNA
6.染色质是由一定长度的核小体为基本单位构成的。将大鼠肝细胞中分离出的染色质用非特异性核酸酶水解后去除染色质蛋白,对得到的DNA片段进行凝胶电泳,结果如图所示。若先将染色质中的蛋白质去掉,后用同样的非特异性核酸酶处理,则得到长度随机的DNA片段。据此分析,下列有关叙述错误的是(　　)
A.凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来
B.染色质中的蛋白质可能对DNA具有保护作用
C.构成核小体的基本单位是脱氧核糖核苷酸和氨基酸
D.当DNA分子处于不同构象时,其在琼脂糖凝胶中的移动速率是一样的
7.科研人员利用农杆菌转化法将水稻的耐低磷基因OsPTF转移到大豆植株中,获得转基因大豆。如图为重组Ti质粒上T-DNA的序列结构示意图。下列相关叙述错误的是(　　)
A.通过PCR扩增获得大量OsPTF基因时需要了解该基因的全部序列
B.RNA聚合酶识别到终止子后,会使转录过程停止
C.可通过含除草剂的选择培养基筛选含有目的基因的大豆愈伤组织
D.用图中所示两种限制酶切割重组Ti质粒后,至少得到两条不同长度的片段
8.(多选)下列关于将目的基因导入受体细胞的叙述,正确的是(　　)
A.用一定浓度的CaCl2溶液处理大肠杆菌,以改变大肠杆菌细胞的生理状态
B.将目的基因转入微生物细胞常用显微注射技术
C.对于动物来说,受体细胞一般是受精卵
D.通过基因工程大量获得胰岛素时,受体细胞选择酵母菌比大肠杆菌更有优势
9.氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　)
A.若用Hind Ⅲ酶切,目的基因转录的产物可能不同
B.若用Pvu Ⅰ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因
C.若用Sph Ⅰ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D.若用Sph Ⅰ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
10.如图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图,载体质粒P0具有四环素抗性基因(TetR)和氨苄青霉素抗性基因(AmpR)。请回答下列问题:
(1)EcoR Ⅴ酶切位点为,EcoR Ⅴ酶切出来的线性载体P1为　　　　末端。
(2)用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段,其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理,在两端各添加了一个碱基为　　　　的脱氧核苷酸,形成P2;P2和目的基因片段在　　　　酶作用下,形成重组质粒P3。
(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落,采用含有不同抗生素的平板进行筛选,得到A、B、C三类菌落,其生长情况如表(“+”代表生长,“-”代表不生长)。根据表中结果判断,应选择的菌落是　　　　(填表中字母)类,另外两类菌落质粒导入情况分别是　　　　、　　　　。
　　　　　 菌落类型 平板类型
A B C
无抗生素 + + +
氨苄青霉素 + + -
四环素 + - -
氨苄青霉素+四环素 + - -
(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒,拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置,PCR鉴定时应选择的一对引物是　　　　。某学生尝试用图中另外一对引物,结果从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段,原因是
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
11.将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒(辅助T-DNA转移)和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒,共同转入农杆菌,可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同,为提高翻译效率,增强棉花抗病虫害能力,进行如下操作。回答下列问题。
注:F1-F3,R1-R3表示引物;T-DNA-LB表示左边界;T-DNA-RB表示右边界;Ori表示复制原点;KanR表示卡那霉素抗性基因;HygBR表示潮霉素B抗性基因。
(1)从苏云金杆菌提取DNA时,需加入蛋白酶,其作用是
　　　　　　　　　　　　　　　　　。
提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精,其目的是　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)本操作中获取目的基因的方法是　　　　和　　　　。
(3)穿梭质粒中p35s为启动子,其作用是　　　　　　　　　　　　,驱动目的基因转录;插入两个p35s启动子,其目的可能是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置,用　　　　基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。
(5)为检测棉花植株是否导入目的基因,提取棉花植株染色体DNA作模板,进行PCR,应选用的引物是　　　　和　　　　。
12.大豆是重要的粮油作物,提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现,基因S在大豆品种DN(种子较大)中的表达量高于品种TL(种子较小),然后克隆了该基因(两品种中基因S序列无差异)及其上游的启动子序列,并开展相关研究。
注:箭头表示酶的切割位置。
(1)基因S启动子的基本组成单位是　　　　。
(2)通过基因工程方法,将DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题图所示信息(不考虑未标明序列)判断构建重组表达载体时,为保证目标序列的完整性,不宜使用的限制酶是　　　　;此外,不宜同时选用酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ,原因是　　　　　　　　　。
(3)为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上,可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时,对照样品除指示分子大小的标准参照物外,还应有　　　　　　　　　　。经验证的重组表达载体需转入农杆菌,检测转入是否成功的技术是　　　　。
(4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ-1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T+基因S”序列成功导入YZ,所得再生植株YZ-2的种子也变大,但小于YZ-1。综合分析,大豆品种DN较TL种子大的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
13.源于细菌的纤维素酶是一种复合酶,能降解纤维素。为了提高纤维素酶的降解效率,某课题组通过筛选高产纤维素酶菌株,克隆表达降解纤维素的三种酶(如图),研究了三种酶混合的协同降解作用,以提高生物质资源的利用效率。回答下列问题。
(1)过程①②采用以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基筛选菌株X,能起到筛选作用的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
高产纤维素酶菌株筛选时,刚果红培养基上的菌落周围透明圈大小反映了
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)过程④扩增不同目的基因片段需要的关键酶是　　　　。
(3)过程⑤在基因工程中称为　　　　,该过程需要的主要酶有　　　　。
(4)过程⑥大肠杆菌作为受体细胞的优点有　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
该过程用Ca2+处理细胞,使其处于一种　　　　　　　　　　　　　　的生理状态。
(5)课题组用三种酶及酶混合物对不同生物质原料进行降解处理,结果如下表。表中协同系数存在差异的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出两点)。
生物质 原料 降解率/% 协同系数
酶A 酶B 酶C 混1 混2 混1 混2
小麦秸秆 7.08 6.03 8.19 8.61 26.98 74.33 114.64
玉米秸秆 2.62 1.48 3.76 3.92 9.88 24.98 77.02
玉米芯 0.62 0.48 0.86 0.98 6.79 1.82 11.34
注:混1和混2表示三种酶的混合物。
14.新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病,我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN,使其在水稻胚乳特异表达,制备获得r2HN疫苗,并对其免疫效果进行了检测。
回答下列问题:
(1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子,若使r2HN仅在水稻胚乳表达,GtP应为　　　　　　启动子。Nos为终止子,其作用为　　　　　　　　　　　　。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此,可选择限制酶　　　　和　　　　对r2HN基因与载体进行酶切,用于表达载体的构建。
(2)利用　　　　方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况,可通过PCR技术检测　　　　　　　　　　,通过　　　　技术检测是否翻译出r2HN蛋白。
(3)获得转基因植株后,通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后,r2HN纯合体植株的占比为　　　　。选择纯合体进行后续研究的原因是
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(4)制备r2HN疫苗后,为研究其免疫效果,对实验组鸡进行接种,对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的CD8+T细胞(细胞毒性T细胞)水平,结果如图2所示。据此分析,获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的　　　　免疫和　　　　免疫。
(5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出两点即可)。
15.某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中,构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段;再经限制酶切割获得含N基因的片段甲,片段甲两端分别为M1与M2;利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组,得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ~Ⅳ)、引物(P1~P4)的结合位置、片段甲替换区如下图所示,→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。
(1)限制酶切割的化学键是　　　　。为保证N基因能在菌株B2中表达,在构建片段甲时,应将M1与M2片段分别插入质粒的 Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间,原因是　　　　　　　　　　。
(2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C和　　　　　　　　　　。
(3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组,所用的模板是　　　　;若用该模板与引物P3和P4进行PCR,实验结果是
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(4)与秸秆焚烧相比,利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出2点即可)。
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