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第3章 基因工程
第1节 重组DNA技术的基本工具
知识一 基因工程的概念及理论基础
1．概念
是指按照人们的愿望，通过___________等技术，赋予生物新的___________，创造出更符合人们需要的新的___________和___________。从技术操作层面看，由于基因工程是在
___________上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
基因工程的别名 基因拼接技术或重组DNA技术
操作环境
操作对象
操作水平
操作过程
原理
结果
2．理论基础
（1）所有生物的DNA都以____________________为基本单位，一般情况下，DNA分子具有独特的_____________________，这为不同种生物的DNA成功拼接提供了物质基础。
（2）所有生物共用_____________________，这为某种生物的基因在___________________细胞内正常表达提供了可能。
（3）基因是控制生物性状的遗传物质的___________和___________的基本单位，其表达具有一定的____________，这为___________在受体细胞中的表达提供了前提条件。
[例1]下列对基因工程的说法，错误的是(　　)
A．基因工程是在分子水平上进行设计和施工
B．基因工程产生的变异属于染色体变异
C．基因工程可以导入不同种生物的基因
D．基因工程可定向改变生物性状
知识二 DNA重组技术的基本工具
1．限制性内切核酸酶(简称限制酶)——“分子手术刀”
(1)来源：主要来自___________。
(2)功能：能够识别双链DNA分子的特定___________，并使每一条链中特定部位的______
_____断开。
(3)结果：产生___________或___________。
①黏性末端：由限制酶在它识别序列的__________________将DNA分子的两条链分别切开形成。如图所示为EcoRⅠ(能识别___________序列，在G与A之间切割)的切割结果。
②平末端：由限制酶在它识别序列的___________处将DNA分子的两条链分别切开形成。如图所示为SmaⅠ(能识别___________序列，在G与C之间切割)的切割结果。
2．DNA连接酶——“分子缝合针”
(1)作用：形成磷酸二酯键。
(2)结果：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被___________切开的两个核苷酸之间的___________，形成重组DNA分子。
(3)DNA连接酶作用的特点
即使用不同的限制酶进行切割，但只要切割后产生的____________________就可用DNA连接酶连接起来。　　
(4)种类
种类 来源 特点
E.coli DNA连接酶 ___________ 能将具有______________的DNA片段连接起来，连接具有_ __________的DNA片段的效率要___________T4 DNA连接酶
T4 DNA连接酶 T4噬菌体 既可以“缝合”双链DNA片段互补的___________，又可以“缝合”双链DNA片段的___________
3．基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
(1)种类
___________、___________、动植物病毒等。
(2)常用载体——质粒
①化学本质
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有
___________能力的________________分子。
②质粒作为载体所具备的条件及原因
a．质粒DNA分子上有一个至多个___________________，供外源DNA片段插入其中。
b．携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞中________________，或___
_____________，随___________同步复制。
c．人工改造的质粒常带有___________，便于______________________。
d．对受体细胞___________。
(3)作用
①作为_____________，将外源基因导入___________。
②质粒携带________________在细胞内大量复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
[例1]下列有关基因工程中限制酶的描述，正确的是（ ）
A．同种限制酶既可以切割目的基因又可以切割质粒，因此不具备专一性
B．限制酶只能识别和切割DNA，不能识别RNA
C．限制酶与DNA连接酶的作用部位不相同
D．限制酶只能从原核生物中提取
[例2]DNA连接酶是基因工程的必需工具，下列有关DNA连接酶的叙述，正确的是（ ）
A．DNA连接酶可以将任意的两个DNA片段连接成一个重组DNA分子
B．DNA连接酶发挥作用时需要识别特定的脱氧核苷酸序列
C．DNA连接酶可以催化两个脱氧核苷酸之间磷酸二酯键的形成
D．T4 DNA连接酶仅能连接平末端
[例3]质粒是基因工程中常用的分子载体。下列有关质粒的说法正确的是(　　)
A．质粒是独立于细菌拟核DNA之外的链状DNA分子，可在体外进行自我复制
B．质粒上的基因表达不遵循中心法则，所以可用作外源DNA分子的载体
C．质粒上的抗生素合成基因可作为标记基因用于重组质粒的筛选和鉴定
D．作为外源DNA分子的载体，质粒需具有限制酶能够切割的位点
知识三 DNA的粗提取与鉴定
1、各步骤的原理或目的
步骤 原理或目的
充分研磨 使细胞破碎，___________溶解于研磨液中
过滤(或离心) 除去细胞膜等___________，得到与蛋白质等杂质混合在一起的溶解于__ _________中的DNA
搅拌(或离心)析出DNA 加入___________的酒精溶液，某些___________溶于酒精，___________不溶于酒精，将DNA和某些蛋白质等杂质初步分离
溶解 用___________的NaCl溶液溶解DNA
鉴定DNA 二苯胺试剂现配现用，___________加热，溶液___________则证明有DNA存在
2．各步骤的注意事项
(1)以血液为实验材料时，每100 mL血液中需要加入___________，防止___________。
(2)加入酒精后用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧___________的断裂，导致DNA分子不能形成丝状物。
(3)析出DNA时必须用___________。预冷的酒精具有以下优点：①可___________核酸水解酶的活性，进而抑制___________；②抑制___________，使___________易形成沉淀析出；③低温有利于增加DNA分子的___________，减少其断裂。
(4)实验中出现的丝状物的主要成分是DNA，实际上每一根“丝”都是由许多DNA分子聚集在一起形成的，应用玻璃棒沿___________缓慢搅拌，避免破坏DNA。
(5)粗提取的DNA中可能含有少量的___________等。
(6)为减少DNA的损失，过滤过程一般使用___________。
(7)二苯胺试剂要现用现配，否则会影响鉴定的效果。
[例1]下列有关生物实验试剂以及现象的描述，正确的是（　　）
A．甲紫染色可观察根尖细胞染色体的状态
B．苏丹Ⅲ染液可将蛋白质染成橘黄色
C．二苯胺试剂鉴定DNA结果呈紫色
D．用黑藻观察细胞质流动需对叶绿体染色
[例2]在利用洋葱进行“DNA的粗提取和鉴定”的实验中，相关操作正确的是（ ）
A．研磨洋葱时，加入适量的研磨液瓦解细胞膜，充分释放核DNA
B．利用定性滤纸进行过滤，以去除杂质，提高DNA的含量和纯度
C．向DNA滤液中加入等体积、预冷的50%酒精，以获得DNA粗提物
D．将白色丝状物加入4mL二苯胺试剂中沸水浴，以利于发生颜色反应
难点知识一 基因工程的工具酶
1．限制性内切核酸酶
(1)作用特点：具有专一性，表现在以下两个方面
①能够识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列。
②能够切割特定序列中的特定位点。
(2)识别序列的特点：遵循碱基互补配对原则，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如图，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。如以中心线为轴，两侧碱基互补对称；以为轴，两侧碱基互补对称。
(3)作用产物：黏性末端或平末端。
①黏性末端：是限制性内切核酸酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时形成的，如图所示：
②平末端：是限制性内切核酸酶在它识别序列的中心轴线处切开时形成的，如图所示：
(4)产生相同黏性末端的同尾酶
①同尾酶的概念
识别DNA分子中不同的核苷酸序列，但能切割产生 相同黏性末端 的限制酶称为同尾酶。如BamHⅠ和BglⅡ为同尾酶、SpeⅠ和XbaⅠ为同尾酶。
②同尾酶的作用特点
a.识别的序列不同，但可以切割产生相同的黏性末端，且切割产生的黏性末端可以相互配对。
b.两个同尾酶切割的DNA片段连接后，一般情况下，可能不能再被原来的限制识别。
(5)选择限制酶的方法
根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点及是否破坏目的基因和标记基因来确定限制酶的种类。（以图甲和图乙为例分析）
①应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择 PstⅠ（单酶切）；不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择 SmaⅠ。
②为避免目的基因及质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶(非同尾酶)切割目的基因所在片段和质粒(双酶切)，如图甲可选择用PstⅠ和 EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。
③切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，以用于重组DNA的鉴定和选择，如图乙中的质粒不能使用SmaⅠ切割。
2．DNA连接酶
(1)作用：将具有相同或互补黏性末端以及具有平末端的DNA片段“缝合”成新的DNA分子。
(2)连接方式：DNA连接酶可把黏性末端和平末端之间的缝隙“缝合”起来，相当于把梯子两边的扶手的断口连接起来，形成两个磷酸二酯键。DNA连接酶与碱基之间的氢键形成无关。
3．与DNA有关的几种酶的比较
(1)限制酶与DNA连接酶的比较
项目 限制酶 DNA连接酶
来源 大多来自原核生物 E.coli DNA连接酶来自大肠杆菌 ； T4 DNA连接酶来自T4噬菌体
不 同 点 作用 使特定部位的 磷酸二酯键断裂 在DNA片段之间 重新形成磷酸二酯键
应用 用于获取目的基因 和切割载体 用于基因表达载体的构建
相同点 ①都作用于磷酸二酯键，与 氢键 无关； ②都具有催化作用，活性都受 温度、pH 等的影响
(2)与DNA相关的五种酶的比较
名称 作用部位 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段
DNA 连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA 聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA(水 解)酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之 间的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
讨论1：为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
讨论2：限制酶切割一次可断开几个磷酸二酯键？产生多少游离的磷酸基团？产生几个黏性末端？消耗几分子水？
讨论3：同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？
巩固训练1
有关下图所示的黏性末端的说法，错误的是(　　)
A.甲、乙、丙黏性末端分别是由不同的限制酶切割产生的
B.甲、乙具有相同的黏性末端，可形成重组DNA分子，但甲与丙的黏性末端不互补
C.a处是磷酸二酯键
D.切割产生甲的限制酶识别的核苷酸序列是
巩固训练2
下列关于DNA连接酶的叙述，正确的是(　　)
A.DNA连接酶不需要识别特定的脱氧核苷酸序列
B.一种DNA连接酶只能连接一种黏性末端
C.将单个脱氧核苷酸加到某个DNA片段末端，形成磷酸二酯键
D.连接两条DNA链上碱基之间的氢键
巩固训练3
某线性DNA分子含有3 000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如下表。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列有关说法错误的是(　　)
a酶切割产物(bp) b酶再次切割产物(bp)
1 600：1 100：300 800：300
A.在该DNA分子中，a酶与b酶的识别序列分别有3个和2个
B.a酶与b酶切出的黏性末端可相互连接
C.a酶与b酶切断的化学键均为磷酸二酯键
D.a酶与b酶识别切割的序列不同体现了酶的专一性
难点知识二 基因工程中的载体
1．种类
(1)常用载体：质粒，它是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。
(2)其他载体：噬菌体、动植物病毒等。
2．质粒作为载体所具备的条件及原因
3．标记基因的标记原理
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如图所示：
讨论1：将外源基因直接导入受体细胞可行吗？为什么？
讨论2：细胞膜上的载体与基因工程中的载体有什么不同？
讨论3：基因工程中的载体需要具备的条件有哪些？
巩固训练4
下列关于质粒的叙述，正确的是（　　）
A．细菌质粒的复制过程一定是在宿主细胞外独立进行的
B．质粒只有在导入宿主细胞后才能在宿主细胞内复制
C．质粒是能够自主复制的小型环状DNA分子
D．质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器
巩固训练5
某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)示意图。请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是(　　)
插入点 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的培养基上的生长状况
① 能生长 能生长
② 能生长 不能生长
③ 不能生长 能生长
A.①是c；②是b；③是a
B.①是a和b；②是a；③是b
C.①是a和b；②是b；③是a
D.①是c；②是a；③是b
一、选择题
1．科学家把兔子血红蛋白基因导入大肠杆菌细胞中，在大肠杆菌细胞中合成了兔子的血红蛋白。下列关于这一先进技术的理论依据错误的是(　　)
A．所有生物共用一套遗传密码
B．基因能控制蛋白质的合成
C．兔子血红蛋白基因与大肠杆菌的DNA都是由四种脱氧核苷酸构成，都遵循相同的碱基互补配对原则
D．兔子与大肠杆菌有共同的原始祖先
2．下列有关限制酶的叙述，不正确的是(　　)
A．从反应类型来看，限制酶催化的是一种水解反应
B．限制酶的活性受温度、pH的影响
C．限制酶能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列
D．限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越小
3．下图是几种限制酶的切割位点，下列说法正确的是（ ）
A．限制酶SmaI和EcoRV切割形成的末端，可通过E．coliDNA连接酶相互连接
B．DNA连接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯键的形成
C．所有限制酶的识别序列均由6个核苷酸组成
D．SmaI切割后产生的是黏性末端
4．某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（　　）
A．限制酶失活，更换新的限制酶
B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等
C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA
D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
5．番木瓜容易受番木瓜环班病毒的侵袭而导致产量和品质大幅下降。科学家通过精心设计，利用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环班病毒。下列关于基因工程操作中的“分子工具”的叙述，正确的是（ ）
A．“分子手术刀”限制性内切核酸酶既可以切割DNA分子也可以切割RNA分子
B．“分子缝合针”DNA连接酶能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C．质粒、噬菌体和动植物病毒等可以作为载体将外源基因送入受体细胞
D．三种“分子工具”的化学本质都是蛋白质，都具有专一性
6．三种限制酶MseI、PstI、EcoRI的识别序列及切割位点分别是GAAT↓TAATTC、C↓TGCAG、G↓AATTC，图中箭头表示相关限制酶的酶切点。若要用如图质粒和外源DNA构建重组质粒，需要对质粒进行改造，构建新的限制酶酶切位点。在构建新的限制酶酶切位点的过程中需要使用的酶是（　　）
A．限制酶PstI、DNA聚合酶、DNA连接酶
B．限制酶EcoRI、DNA聚合酶、DNA连接酶
C．限制酶EcoRI、限制酶PstI、DNA聚合酶
D．限制酶PstI、限制酶EcoRI、DNA连接酶
7．某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　)
A.质粒和目的基因都用酶3切割，最好用E.coli DNA连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接
8．下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（ ）
A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低
B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA
C．DNA在不同浓度NaC1溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物
D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质
9．几种限制酶的识别序列及其切割位点(箭头表示相关酶的切割位点)如表所示。限制酶酶切后产生的几种末端如图所示。根据表和图判断，下列说法正确的是(　　)
限制酶 AluⅠ BamH Ⅰ SmaⅠ Sau3AⅠ
识别序列及切割位点
A.BamH Ⅰ切割的是氢键，AluⅠ切割的是磷酸二酯键
B.Sau3AⅠ和BamHⅠ切割产生的片段能够相连，但连接后的片段两者都不能再切割
C.只有②④对应的识别序列能被Sau3AⅠ识别并切割
D.T4 DNA连接酶既能连接①③，也能连接②⑤
10．下面是四种不同质粒的示意图，其中ori为复制必需的序列，AmpR为氨苄青霉素抗性基因，TetR为四环素抗性基因，箭头表示同一种限制性内切核酸酶的酶切位点。若要得到一个能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长的含重组DNA的细胞，应选用的质粒是(　　)
二、非选择题
11．下表中列出了几种限制性内切核酸酶的识别序列及其切割位点，图1、2中箭头表示相关限制性内切核酸酶的切割位点。请回答下列问题。
限制性内切核酸酶 BamHⅠ Hind Ⅲ EcoRⅠ Sma Ⅰ
识别序列及切割位点
(1)一个图1所示的质粒分子经Sma Ⅰ切割前后，分别含有________个游离的磷酸基团。
(2)若对图中质粒进行改造，插入的Sma Ⅰ识别序列越多，质粒的热稳定性越________。
(3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用Sma Ⅰ切割，原因是_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(4)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入________酶。
(5)现使用BamHⅠ和Hind Ⅲ两种限制性内切核酸酶同时处理质粒、外源DNA，并对经拼接获得的重组质粒进行再次酶切，假设所用的酶均可将识别位点完全切开，请根据图1、2中标示的切割位点及表中所列的识别序列，对以下酶切结果作出判断。
①采用BamHⅠ和Hind Ⅲ切割，得到________种DNA片段。
②采用EcoRⅠ和Hind Ⅲ切割，得到________种DNA片段。
12．为制备目的基因Y(图1)与质粒X(图2)的重组DNA，将质粒X与含Y的DNA片段加入含有限制性内切核酸酶BglⅡ与BamHⅠ的反应混合物中，酶切后的片段再加入含有DNA连接酶的反应体系中。其中，质粒X含有leu2基因，可用于合成亮氨酸，目的基因Y含有卡那霉素抗性基因KanR。请回答下列问题：
图1　　　　图2　　　　　　图3
(1)根据图3分别写出BglⅡ与BamHⅠ酶切后形成的末端序列：________、________。
(2)使用BglⅡ处理重组质粒，可以得到________________________。
(3)BglⅡ酶切后的质粒X与BamHⅠ酶切后的目的基因Y能够连接的原因是________________________。
(4)将连接后的产物转入一种Z细菌，Z细菌对卡那霉素敏感，且不能在缺乏亮氨酸的培养基中培养。要筛选含有重组质粒的Z细菌，应选择________________________的培养基。
13．某生物兴趣小组开展DNA粗提取的相关探究活动。具体步骤如下：
材料处理：称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各2份，每份10 g。剪碎后分成两组，一组置于20 ℃、另一组置于－20 ℃条件下保存24 h。
(1)将DNA的粗提取物溶于2 mol/L的NaCl溶液中，加入________试剂，在________条件下进行鉴定，结果如下表：
材料保存温度 花菜 辣椒 蒜黄
20 ℃ ＋＋ ＋ ＋＋＋
－20 ℃ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋＋＋
注：“＋”越多表示蓝色越深。
(2)该探究性实验课题的名称可能是“探究不同材料和不同________对DNA提取量的影响”。
(3)根据实验结果分析：
①结论1：与20 ℃相比，相同实验材料在－20 ℃条件下保存，DNA的提取量更________(填“多”或“少”)。
结论2：等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，从________中提取的DNA量最多。
②针对结论1，请提出合理的解释：低温抑制了________的活性，DNA降解速度减慢。
2 / 2第3章 基因工程
第1节 重组DNA技术的基本工具
知识一 基因工程的概念及理论基础
1．概念
是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的_遗传特性_，创造出更符合人们需要的新的_生物类型_和_生物产品_。从技术操作层面看，由于基因工程是在_DNA分子水平_上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
基因工程的别名 基因拼接技术或重组DNA技术
操作环境 生物体外
操作对象 基因
操作水平 DNA分子水平
操作过程 剪切→拼接→导入→表达
原理 基因重组
结果 创造出人类需要的新的生物类型和生物产品
2．理论基础
（1）所有生物的DNA都以_4种脱氧核苷酸_为基本单位，一般情况下，DNA分子具有独特的_双螺旋结构_，这为不同种生物的DNA成功拼接提供了物质基础。
（2）所有生物共用_一套遗传密码_，这为某种生物的基因在_其他种类生物_细胞内正常表达提供了可能。
（3）基因是控制生物性状的遗传物质的_结构_和_功能_的基本单位，其表达具有一定的_独立性_，这为目的基因_在受体细胞中的表达提供了前提条件。
[例1]下列对基因工程的说法，错误的是(　　)
A．基因工程是在分子水平上进行设计和施工
B．基因工程产生的变异属于染色体变异
C．基因工程可以导入不同种生物的基因
D．基因工程可定向改变生物性状
【答案】B
【详解】A、基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，A正确；
B、基因工程属于基因重组，B错误；
C、基因工程可以导入不同种生物的基因，C正确；
D、基因工程可按照人们的意愿，定向改变生物性状，D正确。
故选B。
知识二 DNA重组技术的基本工具
1．限制性内切核酸酶(简称限制酶)——“分子手术刀”
(1)来源：主要来自原核生物。
(2)功能：能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
(3)结果：产生黏性末端或平末端。
①黏性末端：由限制酶在它识别序列的_中心轴线两侧_将DNA分子的两条链分别切开形成。如图所示为EcoRⅠ(能识别_GAATTC_序列，在G与A之间切割)的切割结果。
②平末端：由限制酶在它识别序列的_中心轴线_处将DNA分子的两条链分别切开形成。如图所示为SmaⅠ(能识别CCCGGG序列，在G与C之间切割)的切割结果。
2．DNA连接酶——“分子缝合针”
(1)作用：形成磷酸二酯键。
(2)结果：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被_限制酶_切开的两个核苷酸之间的_磷酸二酯键_，形成重组DNA分子。
(3)DNA连接酶作用的特点
即使用不同的限制酶进行切割，但只要切割后产生的_黏性末端相同_就可用DNA连接酶连接起来。　　
(4)种类
种类 来源 特点
E.coli DNA连接酶 大肠杆菌__ 能将具有_互补黏性末端_的DNA片段连接起来，连接具有平末端_的DNA片段的效率要_远远低于_T4 DNA连接酶
T4 DNA连接酶 T4噬菌体 既可以“缝合”双链DNA片段互补的_黏性末端_，又可以“缝合”双链DNA片段的_平末端_
3．基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
(1)种类
质粒、噬菌体、动植物病毒等。
(2)常用载体——质粒
①化学本质
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
②质粒作为载体所具备的条件及原因
a．质粒DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入其中。
b．携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
c．人工改造的质粒常带有标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
d．对受体细胞_无害_。
(3)作用
①作为运输工具，将外源基因导入细胞。
②质粒携带外源DNA片段在细胞内大量复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
[例1]下列有关基因工程中限制酶的描述，正确的是（ ）
A．同种限制酶既可以切割目的基因又可以切割质粒，因此不具备专一性
B．限制酶只能识别和切割DNA，不能识别RNA
C．限制酶与DNA连接酶的作用部位不相同
D．限制酶只能从原核生物中提取
【答案】B
【详解】A、一种限制酶能识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并在特定位点上切割DNA分子，既可以切割目的基因又可以切割质粒，体现了酶的专一性，A错误；
B、限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，B正确；
C、限制酶与DNA连接酶的作用部位相同，都是磷酸二酯键，C错误；
D、限制酶主要从原核生物中提取，D错误。
故选B。
[例2]DNA连接酶是基因工程的必需工具，下列有关DNA连接酶的叙述，正确的是（ ）
A．DNA连接酶可以将任意的两个DNA片段连接成一个重组DNA分子
B．DNA连接酶发挥作用时需要识别特定的脱氧核苷酸序列
C．DNA连接酶可以催化两个脱氧核苷酸之间磷酸二酯键的形成
D．T4 DNA连接酶仅能连接平末端
【答案】C
【详解】A、DNA连接酶可以连接互补配对的黏性末端或平末端，而非任意的两个DNA片段，A错误；
B、DNA连接酶发挥作用时不需要识别特定的脱氧核苷酸序列，B错误；
C、DNA连接酶可以催化两个脱氧核苷酸之间磷酸二酯键的形成，C正确；
D、T4 DNA连接酶能连接黏性末端和平末端，D错误。
故选C。
[例3]质粒是基因工程中常用的分子载体。下列有关质粒的说法正确的是(　　)
A．质粒是独立于细菌拟核DNA之外的链状DNA分子，可在体外进行自我复制
B．质粒上的基因表达不遵循中心法则，所以可用作外源DNA分子的载体
C．质粒上的抗生素合成基因可作为标记基因用于重组质粒的筛选和鉴定
D．作为外源DNA分子的载体，质粒需具有限制酶能够切割的位点
【答案】D
【详解】A、质粒是独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外的小型环状DNA分子，可在体外进行自我复制，A错误；
B、质粒上的基因表达遵循中心法则，B错误；
C、质粒上的抗生素抗性基因可作为标记基因用于重组质粒的筛选和鉴定，C错误；
D、作为外源DNA分子的载体，质粒需具有多个限制酶能够切割的位点，以便于插入目的基因，D正确。
故选D。
知识三 DNA的粗提取与鉴定
1、各步骤的原理或目的
步骤 原理或目的
充分研磨 使细胞破碎，_DNA_溶解于研磨液中
过滤(或离心) 除去细胞膜等_不溶杂质_，得到与蛋白质等杂质混合在一起的溶解于_滤液(或上清液)_中的DNA
搅拌(或离心)析出DNA 加入_预冷_的酒精溶液，某些_蛋白质_溶于酒精，_DNA_不溶于酒精，将DNA和某些蛋白质等杂质初步分离
溶解 用_2_mol/L_的NaCl溶液溶解DNA
鉴定DNA 二苯胺试剂现配现用，_沸水浴_加热，溶液_变蓝色_则证明有DNA存在
2．各步骤的注意事项
(1)以血液为实验材料时，每100 mL血液中需要加入_3_g柠檬酸钠_，防止_血液凝固_。
(2)加入酒精后用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧_DNA分子_的断裂，导致DNA分子不能形成丝状物。
(3)析出DNA时必须用 “冷酒精”_。预冷的酒精具有以下优点：①可_抑制_核酸水解酶的活性，进而抑制_DNA降解_；②抑制_分子运动_，使_DNA_易形成沉淀析出；③低温有利于增加DNA分子的_柔韧性_，减少其断裂。
(4)实验中出现的丝状物的主要成分是DNA，实际上每一根“丝”都是由许多DNA分子聚集在一起形成的，应用玻璃棒沿_一个方向_缓慢搅拌，避免破坏DNA。
(5)粗提取的DNA中可能含有少量的_蛋白质_等。
(6)为减少DNA的损失，过滤过程一般使用_纱布过滤_。
(7)二苯胺试剂要现用现配，否则会影响鉴定的效果。
[例1]下列有关生物实验试剂以及现象的描述，正确的是（　　）
A．甲紫染色可观察根尖细胞染色体的状态
B．苏丹Ⅲ染液可将蛋白质染成橘黄色
C．二苯胺试剂鉴定DNA结果呈紫色
D．用黑藻观察细胞质流动需对叶绿体染色
【答案】A
【详解】A、染色体容易被碱性染料甲紫溶液着色，因此，甲紫染色可观察根尖细胞染色体的状态，A正确；
B、苏丹Ⅲ染液可将脂肪染成橘黄色，蛋白质可与双缩脲试剂产生紫色反应，B错误；
C、DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂，C错误；
D、叶绿体呈现绿色，用黑藻观察细胞质流动不需要对叶绿体染色，D错误。
故选A。
[例2]在利用洋葱进行“DNA的粗提取和鉴定”的实验中，相关操作正确的是（ ）
A．研磨洋葱时，加入适量的研磨液瓦解细胞膜，充分释放核DNA
B．利用定性滤纸进行过滤，以去除杂质，提高DNA的含量和纯度
C．向DNA滤液中加入等体积、预冷的50%酒精，以获得DNA粗提物
D．将白色丝状物加入4mL二苯胺试剂中沸水浴，以利于发生颜色反应
【答案】A
【详解】A、研磨洋葱时，加入适量的研磨液作用是瓦解细胞膜，有利于细胞破裂，充分释放核DNA，A正确；
B、利用纱布进行过滤，以去除杂质，提高DNA的含量和纯度，B错误；
C、向DNA滤液中加入等体积、预冷的95%酒精，以获得DNA粗提物，C错误；
D、将白色丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液中，再加入4mL二苯胺溶液，沸水浴，以利于发生颜色反应，D错误。
故选A。
难点知识一 基因工程的工具酶
1．限制性内切核酸酶
(1)作用特点：具有专一性，表现在以下两个方面
①能够识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列。
②能够切割特定序列中的特定位点。
(2)识别序列的特点：遵循碱基互补配对原则，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如图，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。如以中心线为轴，两侧碱基互补对称；以为轴，两侧碱基互补对称。
(3)作用产物：黏性末端或平末端。
①黏性末端：是限制性内切核酸酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时形成的，如图所示：
②平末端：是限制性内切核酸酶在它识别序列的中心轴线处切开时形成的，如图所示：
(4)产生相同黏性末端的同尾酶
①同尾酶的概念
识别DNA分子中不同的核苷酸序列，但能切割产生 相同黏性末端 的限制酶称为同尾酶。如BamHⅠ和BglⅡ为同尾酶、SpeⅠ和XbaⅠ为同尾酶。
②同尾酶的作用特点
a.识别的序列不同，但可以切割产生相同的黏性末端，且切割产生的黏性末端可以相互配对。
b.两个同尾酶切割的DNA片段连接后，一般情况下，可能不能再被原来的限制识别。
(5)选择限制酶的方法
根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点及是否破坏目的基因和标记基因来确定限制酶的种类。（以图甲和图乙为例分析）
①应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择 PstⅠ（单酶切）；不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择 SmaⅠ。
②为避免目的基因及质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶(非同尾酶)切割目的基因所在片段和质粒(双酶切)，如图甲可选择用PstⅠ和 EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。
③切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，以用于重组DNA的鉴定和选择，如图乙中的质粒不能使用SmaⅠ切割。
2．DNA连接酶
(1)作用：将具有相同或互补黏性末端以及具有平末端的DNA片段“缝合”成新的DNA分子。
(2)连接方式：DNA连接酶可把黏性末端和平末端之间的缝隙“缝合”起来，相当于把梯子两边的扶手的断口连接起来，形成两个磷酸二酯键。DNA连接酶与碱基之间的氢键形成无关。
3．与DNA有关的几种酶的比较
(1)限制酶与DNA连接酶的比较
项目 限制酶 DNA连接酶
来源 大多来自原核生物 E.coli DNA连接酶来自大肠杆菌 ； T4 DNA连接酶来自T4噬菌体
不 同 点 作用 使特定部位的 磷酸二酯键断裂 在DNA片段之间 重新形成磷酸二酯键
应用 用于获取目的基因 和切割载体 用于基因表达载体的构建
相同点 ①都作用于磷酸二酯键，与 氢键 无关； ②都具有催化作用，活性都受 温度、pH 等的影响
(2)与DNA相关的五种酶的比较
名称 作用部位 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段
DNA 连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA 聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA(水 解)酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之 间的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
讨论1：为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
讨论2：限制酶切割一次可断开几个磷酸二酯键？产生多少游离的磷酸基团？产生几个黏性末端？消耗几分子水？
断开2个磷酸二酯键；产生2个游离的磷酸基团；产生2个黏性末端；消耗2分子水。
讨论3：同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？
同种限制酶产生的黏性末端相同；不同的限制酶切割可能会形成相同的黏性末端。
巩固训练1
有关下图所示的黏性末端的说法，错误的是(　　)
A.甲、乙、丙黏性末端分别是由不同的限制酶切割产生的
B.甲、乙具有相同的黏性末端，可形成重组DNA分子，但甲与丙的黏性末端不互补
C.a处是磷酸二酯键
D.切割产生甲的限制酶识别的核苷酸序列是
【答案】D
【详解】AD、切割产生甲的限制酶的识别序列为，切割产生乙的限制酶的识别序列为，切割产生丙的限制酶的识别序列为。三者的切割位点不同，由此可见，甲、乙、丙的黏性末端是由三种不同的限制酶切割产生的，A正确，D错误；
B、甲、乙的黏性末端相同，因此可在DNA连接酶的作用下形成重组DNA分子；但甲、丙的黏性末端不同，它们之间不能形成重组DNA分子，B正确；
C、DNA连接酶催化磷酸基团和脱氧核糖之间形成磷酸二酯键，a处是磷酸二酯键，C正确。
故选D。
巩固训练2
下列关于DNA连接酶的叙述，正确的是(　　)
A.DNA连接酶不需要识别特定的脱氧核苷酸序列
B.一种DNA连接酶只能连接一种黏性末端
C.将单个脱氧核苷酸加到某个DNA片段末端，形成磷酸二酯键
D.连接两条DNA链上碱基之间的氢键
【答案】A
【详解】AD、DNA连接酶连接的是两条DNA链上的磷酸和脱氧核糖，形成磷酸二酯键，不需要识别特定的脱氧核苷酸序列，A正确，D错误；
B、DNA连接酶可以连接互补的黏性末端两条链上的磷酸和脱氧核糖，所以一种DNA连接酶可以连接多种黏性末端，B错误；
C、DNA连接酶连接的是两个DNA片段，DNA聚合酶是将单个脱氧核苷酸加到某个DNA片段末端，形成磷酸二酯键，C错误。
故选A。
巩固训练3
某线性DNA分子含有3 000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如下表。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列有关说法错误的是(　　)
a酶切割产物(bp) b酶再次切割产物(bp)
1 600：1 100：300 800：300
A.在该DNA分子中，a酶与b酶的识别序列分别有3个和2个
B.a酶与b酶切出的黏性末端可相互连接
C.a酶与b酶切断的化学键均为磷酸二酯键
D.a酶与b酶识别切割的序列不同体现了酶的专一性
【答案】A
【详解】A、分析题表可知，a酶可以把原有DNA切成3段，说明a酶的识别序列有2个，b酶把大小是1 600的DNA切成大小分别为800和800两个片段，把大小是1 100的DNA片段切成大小分别为800和300两个片段，且a酶和b酶的识别位点不同，说明b酶的识别序列有2个，A错误；
B、a酶与b酶切出的黏性末端相同，用DNA连接酶可以将它们连接起来，B正确；
C、a酶和b酶属于限制酶，限制酶切割的化学键都是磷酸二酯键，C正确；
D、a酶与b酶切割后产生的黏性末端相同，但是两者识别切割的脱氧核苷酸序列不同，说明两种酶的底物不同，体现了酶的专一性，D正确。
故选A。
难点知识二 基因工程中的载体
1．种类
(1)常用载体：质粒，它是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。
(2)其他载体：噬菌体、动植物病毒等。
2．质粒作为载体所具备的条件及原因
3．标记基因的标记原理
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如图所示：
讨论1：将外源基因直接导入受体细胞可行吗？为什么？
不可行。直接把外源基因导入受体细胞，外源基因在细胞内不能进行复制、转录和稳定存在。
讨论2：细胞膜上的载体与基因工程中的载体有什么不同？
化学本质不同：细胞膜上的载体化学成分是蛋白质；基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)、λ噬菌体的衍生物，也可能是生物，如动植物病毒等。
功能不同：细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞；基因工程中的载体是一种“分子运输车”，把目的基因导入受体细胞。
讨论3：基因工程中的载体需要具备的条件有哪些？
能自我复制；有切割位点；具有标记基因；无毒害作用等。
巩固训练4
下列关于质粒的叙述，正确的是（　　）
A．细菌质粒的复制过程一定是在宿主细胞外独立进行的
B．质粒只有在导入宿主细胞后才能在宿主细胞内复制
C．质粒是能够自主复制的小型环状DNA分子
D．质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器
【答案】C
【详解】A、细菌质粒的复制过程是在宿主细胞内进行的，有的质粒可以整合到宿主细胞的染色体DNA上，如大肠杆菌的Ti质粒的T-DNA，A错误；
B、质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外并具有自我复制能力的双链环状DNA分子，即质粒在细菌细胞中也可复制，B错误；
CD、质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子，不是细胞器，C正确，D错误。
故选C。
巩固训练5
某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)示意图。请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是(　　)
插入点 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的培养基上的生长状况
① 能生长 能生长
② 能生长 不能生长
③ 不能生长 能生长
A.①是c；②是b；③是a
B.①是a和b；②是a；③是b
C.①是a和b；②是b；③是a
D.①是c；②是a；③是b
【答案】A
【详解】第①组细菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长，说明氨苄青霉素抗性基因没有被破坏，细菌能在含四环素的培养基上生长，说明四环素抗性基因没有被破坏，由此可知，外源基因插入的位置是c；第②组细菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长，说明氨苄青霉素抗性基因没有被破坏，细菌不能在含四环素的培养基上生长，说明四环素抗性基因被破坏，由此可知，外源基因插入位置是b；第③组细菌不能在含氨苄青霉素的培养基上生长，说明氨苄青霉素抗性基因被破坏，细菌能在含四环素的培养基上生长，说明四环素抗性基因没有被破坏，由此可知，外源基因插入的位置是a。
故选A。
一、选择题
1．科学家把兔子血红蛋白基因导入大肠杆菌细胞中，在大肠杆菌细胞中合成了兔子的血红蛋白。下列关于这一先进技术的理论依据错误的是(　　)
A．所有生物共用一套遗传密码
B．基因能控制蛋白质的合成
C．兔子血红蛋白基因与大肠杆菌的DNA都是由四种脱氧核苷酸构成，都遵循相同的碱基互补配对原则
D．兔子与大肠杆菌有共同的原始祖先
【答案】D
【详解】A、题干表述的是目的基因导入受体细胞并得以表达的过程，目的基因在不同生物细胞中能够表达出相同的蛋白质，说明控制其合成的mRNA上的密码子是通用的，相同的密码子决定相同的氨基酸，A正确；
B、基因是通过转录获得mRNA，进而控制蛋白质的合成，B正确；
C、基因通常是有遗传效应的DNA片段，只要是双链DNA都遵循碱基互补配对原则，其组成原料都是四种脱氧核苷酸，C正确；
D、生物之间是否有共同的原始祖先与转基因技术之间没有必然关系，D错误。
故选D。
2．下列有关限制酶的叙述，不正确的是(　　)
A．从反应类型来看，限制酶催化的是一种水解反应
B．限制酶的活性受温度、pH的影响
C．限制酶能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列
D．限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越小
【答案】D
【详解】A、限制酶能够使DNA每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，磷酸二酯键的断裂是一种水解反应，A正确；
B、限制酶的活性受温度、pH的影响，B正确；
C、限制酶能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并在特定的位点切割磷酸二酯键，C正确；
D、限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大，D错误。
故选D。
3．下图是几种限制酶的切割位点，下列说法正确的是（ ）
A．限制酶SmaI和EcoRV切割形成的末端，可通过E．coliDNA连接酶相互连接
B．DNA连接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯键的形成
C．所有限制酶的识别序列均由6个核苷酸组成
D．SmaI切割后产生的是黏性末端
【答案】B
【详解】A、限制酶Sma I和EcoR V切割形成的是平末端，E.coliDNA连接酶只能连接黏性末端，而T4DNA连接酶可连接黏性末端和平末端，但连接效率较低，A错误；
B、DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键；DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸加到已有的核苷酸片段上，形成磷酸二酯键；RNA聚合酶将单个核糖核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键，B正确；
C、并不是所有的限制酶的识别序列都是由6个核苷酸组成，有些限制酶的识别序列有4个或8个核苷酸组成，C错误；
D、SmaI切割后产生的是平末端，D错误。
故选B。
4．某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（　　）
A．限制酶失活，更换新的限制酶
B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等
C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA
D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
【答案】B
【详解】A、限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确；
B、酶切条件不合适通常会使切割效果下降，调整反应条件如温度和PH等，调整酶的用量没有作用，B错误；
C、质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒，C正确；
D、质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。
故选B。
5．番木瓜容易受番木瓜环班病毒的侵袭而导致产量和品质大幅下降。科学家通过精心设计，利用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环班病毒。下列关于基因工程操作中的“分子工具”的叙述，正确的是（ ）
A．“分子手术刀”限制性内切核酸酶既可以切割DNA分子也可以切割RNA分子
B．“分子缝合针”DNA连接酶能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C．质粒、噬菌体和动植物病毒等可以作为载体将外源基因送入受体细胞
D．三种“分子工具”的化学本质都是蛋白质，都具有专一性
【答案】C
【详解】A、“分子手术刀”限制性内切核酸酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，A错误；
B、DNA连接酶连接的是双链DNA片段，而不是单个脱氧核苷酸，B错误；
C、常用的载体有质粒、噬菌体、动植物病毒，C正确；
D、载体不是蛋白质，如质粒为小型环状DNA分子，D错误。
故选C。
6．三种限制酶MseI、PstI、EcoRI的识别序列及切割位点分别是GAAT↓TAATTC、C↓TGCAG、G↓AATTC，图中箭头表示相关限制酶的酶切点。若要用如图质粒和外源DNA构建重组质粒，需要对质粒进行改造，构建新的限制酶酶切位点。在构建新的限制酶酶切位点的过程中需要使用的酶是（　　）
A．限制酶PstI、DNA聚合酶、DNA连接酶
B．限制酶EcoRI、DNA聚合酶、DNA连接酶
C．限制酶EcoRI、限制酶PstI、DNA聚合酶
D．限制酶PstI、限制酶EcoRI、DNA连接酶
【答案】B
【详解】对质粒进行改造是让它增加一种限制酶的酶切位点，其他酶切位点又不能被破坏，故只能用EcoRⅠ切割质粒后增加一部分含有MseⅠ酶切位点的片段，这样保证了在基因工程中目的基因和抗性基因结构的完整性。因此，应先用限制酶EcoRⅠ切割，然后用DNA聚合酶合成MseI酶的识别序列，最后利用DNA连接酶形成环状质粒，B正确，ACD错误。
故选B。
7．某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　)
A.质粒和目的基因都用酶3切割，最好用E.coli DNA连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接
【答案】C
【详解】A、酶3切割后得到的是平末端，因E. coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶，所以最好用T4 DNA连接酶连接，A错误；
B、质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B错误；
C、质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C正确；
D、若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，且酶2和酶4切割后产生的黏性末端相同，易导致目的基因和质粒自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，D错误。
故选C。
8．下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（ ）
A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低
B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA
C．DNA在不同浓度NaC1溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物
D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质
【答案】D
【详解】A、研磨液有利于DNA的溶解，换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低，A正确；
B、DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可分离DNA，B正确；
C、DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变，因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取，C正确；
D、在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA，D错误。
故选D。
9．几种限制酶的识别序列及其切割位点(箭头表示相关酶的切割位点)如表所示。限制酶酶切后产生的几种末端如图所示。根据表和图判断，下列说法正确的是(　　)
限制酶 AluⅠ BamH Ⅰ SmaⅠ Sau3AⅠ
识别序列及切割位点
A.BamH Ⅰ切割的是氢键，AluⅠ切割的是磷酸二酯键
B.Sau3AⅠ和BamHⅠ切割产生的片段能够相连，但连接后的片段两者都不能再切割
C.只有②④对应的识别序列能被Sau3AⅠ识别并切割
D.T4 DNA连接酶既能连接①③，也能连接②⑤
【答案】D
【详解】A、BamHⅠ与AluⅠ切割的均是磷酸二酯键，A错误；
B、分析题表可知，BamHⅠ和Sau3AⅠ切割后产生的黏性末端是相同的，因此二者切割后产生的黏性末端能够相连，连接后仍然存在序列，能被Sau3AⅠ切割，但是BamHⅠ不一定能切割，B错误；
C、②④⑤对应的识别序列都存在，都能被Sau3AⅠ识别并切割，C错误；
D、T4 DNA连接酶既可以连接互补的黏性末端也可以连接平末端，图中①③是平末端，②⑤是互补的黏性末端，D正确。
故选D。
10．下面是四种不同质粒的示意图，其中ori为复制必需的序列，AmpR为氨苄青霉素抗性基因，TetR为四环素抗性基因，箭头表示同一种限制性内切核酸酶的酶切位点。若要得到一个能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长的含重组DNA的细胞，应选用的质粒是(　　)
【答案】C
【详解】A、A质粒的ori被破坏，该质粒无法自我复制，不能作为载体，A错误；
B、B质粒的TetR和AmpR均保持完整，说明含该质粒的细胞在四环素培养基和氨苄青霉素培养基上均能生长，B错误；
C、C质粒的TetR保持完整，而AmpR被破坏，说明含该质粒的细胞能在四环素培养基上生长，而不能在氨苄青霉素培养基上生长，C正确；
D、D质粒的TetR被破坏，而AmpR保持完整，说明含该质粒的细胞能在氨苄青霉素培养基上生长而不能在四环素培养基上生长，D错误。
故选C。
二、非选择题
11．下表中列出了几种限制性内切核酸酶的识别序列及其切割位点，图1、2中箭头表示相关限制性内切核酸酶的切割位点。请回答下列问题。
限制性内切核酸酶 BamHⅠ Hind Ⅲ EcoRⅠ Sma Ⅰ
识别序列及切割位点
(1)一个图1所示的质粒分子经Sma Ⅰ切割前后，分别含有________个游离的磷酸基团。
(2)若对图中质粒进行改造，插入的Sma Ⅰ识别序列越多，质粒的热稳定性越________。
(3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用Sma Ⅰ切割，原因是_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(4)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入________酶。
(5)现使用BamHⅠ和Hind Ⅲ两种限制性内切核酸酶同时处理质粒、外源DNA，并对经拼接获得的重组质粒进行再次酶切，假设所用的酶均可将识别位点完全切开，请根据图1、2中标示的切割位点及表中所列的识别序列，对以下酶切结果作出判断。
①采用BamHⅠ和Hind Ⅲ切割，得到________种DNA片段。
②采用EcoRⅠ和Hind Ⅲ切割，得到________种DNA片段。
【答案】
(1)0、2　
(2)高　
(3)Sma Ⅰ会破坏质粒上的抗生素抗性基因和外源DNA中的目的基因　
(4)DNA连接　
(5)2　3
【详解】
(1)题图1中的质粒为环状，在没有经过Sma Ⅰ切割前，其不含游离的磷酸基团；当被Sma Ⅰ切割后，该质粒变成了一个链状DNA分子，含有2条单链，而在每条单链的5′端都含有1个游离的磷酸基团，故含有2个游离的磷酸基团。
(2)对题图中质粒进行改造是插入Sma Ⅰ识别序列，Sma Ⅰ识别序列中含有多个C—G碱基对，含有的C—G碱基对越多，则所含的氢键越多，因此质粒的热稳定性越高。
(3)在质粒和目的基因上都有一个Sma Ⅰ的切割位点，当使用Sma Ⅰ切割时，会破坏质粒上的抗生素抗性基因和外源DNA中的目的基因。抗生素抗性基因被破坏会导致后期无法根据抗性基因筛选含重组质粒的受体细胞，目的基因被破坏则导致无法得到目的基因的表达产物。
(4)要想将两个DNA片段连接在一起，需要使用DNA连接酶。
(5)用BamHⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA，并经拼接获得的重组质粒中，这两种酶的识别序列仍然完整存在，再用BamHⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶进行切割时，可再度被切开，形成2种DNA片段；而EcoRⅠ的识别序列在原质粒中存在且没有被破坏，同时切下的含目的基因的外源DNA片段中还存在1个EcoRⅠ的识别序列，因此在重组质粒中存在2个EcoRⅠ的识别序列，用EcoRⅠ和Hind Ⅲ切割时，可得到3种DNA片段。
12．为制备目的基因Y(图1)与质粒X(图2)的重组DNA，将质粒X与含Y的DNA片段加入含有限制性内切核酸酶BglⅡ与BamHⅠ的反应混合物中，酶切后的片段再加入含有DNA连接酶的反应体系中。其中，质粒X含有leu2基因，可用于合成亮氨酸，目的基因Y含有卡那霉素抗性基因KanR。请回答下列问题：
图1　　　　图2　　　　　　图3
(1)根据图3分别写出BglⅡ与BamHⅠ酶切后形成的末端序列：________、________。
(2)使用BglⅡ处理重组质粒，可以得到________________________。
(3)BglⅡ酶切后的质粒X与BamHⅠ酶切后的目的基因Y能够连接的原因是________________________。
(4)将连接后的产物转入一种Z细菌，Z细菌对卡那霉素敏感，且不能在缺乏亮氨酸的培养基中培养。要筛选含有重组质粒的Z细菌，应选择________________________的培养基。
【答案】
(1)或　或　
(2)长度为3300 bp的环状DNA　
(3)酶切后产生相同的黏性末端，并遵循碱基互补配对原则　
(4)含卡那霉素但不含亮氨酸
【详解】
(1)见答案。
(2)经BglⅡ酶切后的质粒与BamHⅠ酶切后的目的基因形成的重组DNA分子上没有BglⅡ酶的识别序列，因此使用BglⅡ处理重组质粒，得到的是长度为3300 bp的环状DNA。
(3)BglⅡ酶切后的质粒X与BamHⅠ酶切后的目的基因Y具有相同的黏性末端，根据碱基互补配对原则，它们能够连接形成重组DNA。
(4)由于质粒X含有leu2基因，可用于合成亮氨酸，目的基因Y含有卡那霉素抗性基因KanR，因此要筛选含有重组质粒的Z细菌，应选择含卡那霉素但不含亮氨酸的培养基。
13．某生物兴趣小组开展DNA粗提取的相关探究活动。具体步骤如下：
材料处理：称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各2份，每份10 g。剪碎后分成两组，一组置于20 ℃、另一组置于－20 ℃条件下保存24 h。
(1)将DNA的粗提取物溶于2 mol/L的NaCl溶液中，加入________试剂，在________条件下进行鉴定，结果如下表：
材料保存温度 花菜 辣椒 蒜黄
20 ℃ ＋＋ ＋ ＋＋＋
－20 ℃ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋＋＋
注：“＋”越多表示蓝色越深。
(2)该探究性实验课题的名称可能是“探究不同材料和不同________对DNA提取量的影响”。
(3)根据实验结果分析：
①结论1：与20 ℃相比，相同实验材料在－20 ℃条件下保存，DNA的提取量更________(填“多”或“少”)。
结论2：等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，从________中提取的DNA量最多。
②针对结论1，请提出合理的解释：低温抑制了________的活性，DNA降解速度减慢。
【答案】
(1) 二苯胺 沸水浴
(2)(保存)温度
(3) 多 蒜黄 (核酸水解)酶
【详解】
（1）鉴定DNA时可用二苯胺试剂，在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。
（2）根据表格可知该实验的自变量是温度和不同材料，因此该探究性实验课题的名称可能是“探究不同材料和不同(保存)温度对DNA提取量的影响”。
（3）①结论1：与20 ℃相比，相同实验材料在－20 ℃条件下保存，与二苯胺进行沸水浴加热后蓝色更深，说明DNA的提取量更多。
结论2：结合表格信息可知，等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，从蒜黄中提取的DNA量最多，因此其与二苯胺进行沸水浴加热后蓝色最深。
②出现结论1的原因是低温抑制了(核酸水解)酶的活性，DNA降解速度减慢，因而能获取更多的DNA。
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