资源简介

实验03 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
2022年新课标 课标解读
一、生命观念
通过实验分离与计数土壤中分解尿素的细菌，理解微生物与环境的相互关系，建立“微生物代谢与环境适应”的生命观念，认同微生物在物质循环中的重要作用。
二、科学思维
运用观察、对比、推理、归纳等科学方法，分析选择培养基的筛选原理，解读菌落形态和数量变化的意义，推理分解尿素细菌的代谢特征，形成基于实验证据的逻辑推理能力和误差分析意识。
三、科学探究
通过设计和实施土壤中分解尿素细菌的分离与计数实验，掌握微生物分离、接种、计数的基本方法，提升实验设计、操作实施、现象描述与数据（菌落数量）分析能力，理解实验设计的对照原则、单一变量原则和平行重复原则。
四、社会责任
结合实验原理，联系土壤微生物在生态系统中的作用，认识微生物在农业生产、环境治理中的应用价值，树立“合理利用微生物资源、保护生态环境”的责任意识，理解科学实验对生产实践的指导价值。 1. 知识目标
基础概念：掌握分解尿素的细菌、脲酶、选择培养基、涂布分离、菌落计数、CFU（菌落形成单位）等核心术语
关键原理：理解分解尿素细菌的代谢特征（能产生脲酶，将尿素分解为氨和二氧化碳），明确选择培养基的筛选原理（以尿素为唯一氮源，抑制不能产生脲酶的微生物生长，保留分解尿素的细菌）；掌握微生物分离与计数的基本原理和方法。
2. 能力目标
操作技能：规范进行土壤样品稀释、涂布接种、恒温培养操作，学会观察和统计菌落的形态、数量、大小，能规范记录实验现象和实验数据，掌握稀释涂布平板法计数的核心技巧。
数据分析：能分析选择培养基的筛选效果，解读菌落数量与细菌浓度的关系，计算土壤中分解尿素细菌的密度，归纳实验结论，排查实验异常现象并分析原因。
3. 价值目标
科学素养：认同实验探究在微生物研究中的作用，培养严谨的科学实验态度、细致的观察能力和规范的实验操作习惯。
跨学科融合：关联化学（尿素的分解反应、pH变化）、农业生产（微生物肥料的应用），理解分解尿素细菌分离与计数的理化基础和实践意义。
重点先知：
1.实验核心是“分离与计数”：通过设置以尿素为唯一氮源的选择培养基，筛选出土壤中能分解尿素的细菌（抑制杂菌生长）；采用稀释涂布平板法，将土壤样品梯度稀释后接种，通过统计菌落数量，计算土壤中分解尿素细菌的密度，核心是抓住“选择培养基的筛选作用”和“菌落计数的准确性”。
2.操作关键是“无菌操作+梯度稀释”：微生物分离与计数实验中，无菌操作是实验成功的核心，任何环节的污染都会导致杂菌生长，干扰筛选和计数结果；梯度稀释的准确性直接影响菌落数量统计，需严格控制稀释倍数，确保接种后菌落数量适中（30~300个/皿），便于计数。
3.核心区分：选择培养基的作用是“筛选”（保留目标细菌、抑制杂菌），而非“鉴别”；脲酶是分解尿素细菌的关键酶，其活性决定细菌能否利用尿素作为氮源，可通过检测培养基pH变化（氨的产生使pH升高）辅助判断目标细菌的存在。
教材内容
（一）实验核心原理
1.分解尿素细菌的代谢特征：土壤中存在多种微生物，其中分解尿素的细菌能产生脲酶，脲酶可将培养基中的尿素分解为氨（NH ）和二氧化碳（CO ），氨溶于水使培养基的pH升高，可通过酚红指示剂显色（变红），辅助鉴别分解尿素的细菌。
2.选择培养基的筛选原理：本实验选用以尿素为唯一氮源的固体培养基，不能产生脲酶的微生物（如大多数细菌、真菌）无法利用尿素作为氮源，生长受到抑制；而能产生脲酶的分解尿素细菌，可利用尿素作为氮源正常生长繁殖，从而实现目标细菌的分离。
3.计数原理：采用稀释涂布平板法，将土壤样品进行梯度稀释，接种到选择培养基上，培养后统计每个培养皿中的菌落数，根据稀释倍数和接种体积，计算每克土壤中分解尿素细菌的数量（公式：每克土壤中细菌数=（平均菌落数×稀释倍数）÷接种体积）；为保证计数准确性，选择菌落数在30~300个的培养皿进行统计，避免菌落过多或过少导致误差。
（二）实验材料的选择与优势
实验选用肥沃的土壤（如菜园土、农田土）作为样品，选用LB固体培养基（基础培养基，用于细菌扩大培养）和尿素选择培养基（筛选目标细菌），核心原因有3点：① 肥沃土壤中微生物种类丰富，分解尿素的细菌数量较多，易分离获得目标菌株；② 尿素选择培养基能特异性筛选分解尿素的细菌，排除杂菌干扰，实验现象显著；③ 分解尿素细菌繁殖速度较快，培养1~2天即可形成清晰菌落，便于观察和计数。
注意：土壤样品需新鲜，采集后及时处理，避免微生物死亡；接种时选用处于对数期的细菌，此时细菌代谢旺盛、繁殖能力强，菌落形态整齐、数量稳定，便于统计和分离。
（三）实验中关键试剂与器具的作用原理
1.尿素选择培养基：含尿素（唯一氮源）、葡萄糖（碳源）、无机盐、琼脂、酚红指示剂，作用是筛选分解尿素的细菌，同时通过酚红指示剂显色（pH升高变红），辅助鉴别目标细菌；
2.脲酶：分解尿素细菌产生的关键酶，可催化尿素分解为氨和二氧化碳，是细菌利用尿素的核心；
3.无菌水/无菌生理盐水：用于土壤样品梯度稀释，控制细菌浓度，使接种后菌落数量适中，同时维持细菌形态，避免细菌吸水破裂；
4.接种环/涂布器：用于细菌接种，涂布器可使菌液均匀分布在培养基表面，便于形成单个菌落和计数；
5.恒温培养箱：控制培养温度在37℃（细菌最适生长温度），为细菌繁殖提供适宜温度条件，促进菌落形成；
6.酚红指示剂：检测培养基pH变化，当细菌分解尿素产生氨，使培养基pH升高到8.0以上时，酚红指示剂变红，可快速鉴别分解尿素的细菌。
（四）实验设计的基本原则
1.对照原则：本实验需设置2组对照，① 空白对照（不含土壤菌液的尿素选择培养基），用于检测培养基灭菌是否彻底，排除杂菌污染；② 对照培养基（以NH NO 为唯一氮源的固体培养基，接种土壤菌液），用于对比选择培养基的筛选效果，验证选择培养基能否特异性保留分解尿素的细菌；
2.单一变量原则：实验的唯一变量是“氮源种类”（选择培养基中为尿素，对照培养基中为NH NO ），其他条件（土壤样品稀释倍数、接种量、培养温度、培养时间、培养基成分）需保持一致，确保实验结果的科学性；
3.平行重复原则：每组实验至少设置3个重复培养皿，接种相同浓度、相同体积的菌液，培养后统计每组菌落数量的平均值，避免单一样本的偶然性，提高实验结果的可靠性；计数时，选择菌落数在30~300个的培养皿进行统计，超出该范围的培养皿需舍弃。
【实验目的】 1.理解分解尿素细菌的代谢特征和选择培养基的筛选原理，掌握脲酶的作用机制。 2.掌握土壤样品梯度稀释、涂布接种、恒温培养的基本操作，学会分解尿素细菌的分离方法。 3.掌握稀释涂布平板法计数的原理和方法，能准确统计土壤中分解尿素细菌的数量，计算细菌密度。 4.联系土壤微生物的生态作用，认识分解尿素细菌在农业生产中的应用价值，培养科学探究能力和严谨的实验素养。
【材料用具】 （一）实验材料
新鲜肥沃土壤样品（菜园土或农田土）、分解尿素细菌标准菌株（实验室保存，用于对照）、无菌水、无菌生理盐水（0.9% NaCl溶液）。 （二）实验器具
恒温培养箱（可调节温度至37℃）、超净工作台、接种环、涂布器、酒精灯、培养皿（无菌）、试管（无菌）、移液管（无菌）、烧杯（无菌）、玻璃棒（无菌）、天平、pH计（或pH试纸）、漏斗、滤纸、标签纸、放大镜、实验记录表。 （三）实验试剂
1. 尿素选择培养基（1000mL）：葡萄糖10g、尿素1g、NaCl 5g、KH PO 2g、酚红指示剂0.02g、琼脂15~20g、蒸馏水1000mL，调节pH至7.2~7.4，灭菌后倒入无菌培养皿中凝固备用；
2. 对照培养基（1000mL）：葡萄糖10g、NH NO 1g、NaCl 5g、KH PO 2g、酚红指示剂0.02g、琼脂15~20g、蒸馏水1000mL，调节pH至7.2~7.4，灭菌备用；
3. 其他试剂：75%酒精溶液（消毒用）、高压蒸汽灭菌所需试剂。 （四）辅助材料
无菌操作手册、分解尿素细菌菌落形态示意图、梯度稀释操作流程图、实验安全防护用品（手套、口罩、护目镜）。
【方法步骤】
1. 实验准备与无菌处理（第1步） ① 培养基与试剂准备：提前配制尿素选择培养基和对照培养基，灭菌后倒入无菌培养皿中（每皿约20mL），凝固后贴上标签（标注“选择培养基”“对照培养基”“空白对照”）； ② 无菌处理：对超净工作台、接种环、涂布器、试管、移液管等实验器具进行灭菌处理（接种环、涂布器灼烧灭菌，其他器具高压蒸汽灭菌）；实验人员佩戴手套、口罩，用75%酒精擦拭双手和实验台面，确保无菌操作环境，避免杂菌污染。 2.土壤样品稀释（第2步） ① 称取10g新鲜土壤样品，放入盛有90mL无菌生理盐水的锥形瓶中，振荡摇匀（约10分钟），制成10 倍稀释的土壤菌液； ② 用无菌移液管吸取1mL 10 倍菌液，注入盛有9mL无菌生理盐水的试管中，振荡摇匀，制成10 倍稀释菌液； ③ 重复上述操作，依次制成10 、10 、10 、10 倍的梯度稀释菌液，每一步稀释后都需振荡摇匀，确保菌液均匀分散； ④ 注意：稀释过程中，移液管需无菌，每稀释一次更换一支移液管，避免交叉污染；稀释倍数根据土壤中细菌数量调整，确保最终接种后菌落数在30~300个/皿。 3.无菌接种（第3步） ① 在超净工作台中，用无菌移液管分别吸取10 、10 、10 倍的稀释菌液各0.1mL，分别滴加在尿素选择培养基和对照培养基表面（每种稀释倍数设置3个重复培养皿）； ② 用灭菌冷却后的涂布器，将菌液均匀涂布在培养基表面（涂布时转动培养皿，确保菌液覆盖整个培养基表面，避免菌液聚集）； ③ 空白对照组：吸取0.1mL无菌生理盐水，滴加在尿素选择培养基表面，涂布均匀，用于检测培养基灭菌效果； ④ 接种后，将所有培养皿盖好，倒置放置（避免培养过程中冷凝水滴落，污染培养基、破坏菌落形态），贴上标签（标注稀释倍数、培养基类型、接种日期）。 4.恒温培养（第4步） 将接种后的所有培养皿，放入37℃恒温培养箱中，倒置培养18~24小时；培养过程中，保持培养箱温度稳定，避免震动和污染；培养后期可观察培养基颜色变化（分解尿素细菌生长处会因氨的产生使酚红指示剂变红）。 5. 菌落观察、鉴别与计数（第5步） ① 观察与鉴别：取出培养后的培养皿，放在超净工作台上，用肉眼或放大镜观察菌落的形态、大小、颜色，结合酚红指示剂显色情况，鉴别分解尿素的细菌（菌落周围出现红色区域，说明该细菌能产生脲酶，分解尿素）；区分杂菌菌落（无红色区域，形态不规则、颜色异常），统计时需排除杂菌； ② 计数：选择菌落数在30~300个的培养皿进行统计，统计每组3个重复培养皿中的菌落数，计算平均值；若菌落数量过多，选取培养基的1/4区域统计，再换算成整个培养皿的菌落数；若菌落重叠，视为单个菌落统计； ③ 计算细菌密度：根据公式计算每克土壤中分解尿素细菌的数量，公式为：每克土壤中细菌数=（平均菌落数×稀释倍数）÷接种体积（0.1mL）； ④ 对比分析：对比选择培养基和对照培养基的菌落数量、形态差异，分析选择培养基的筛选效果。 6. 实验结束与整理（第6步） ① 实验结束后，将所有接种后的培养皿、菌液、试剂等进行灭菌处理（高压蒸汽灭菌30分钟），避免细菌扩散、污染环境； ② 清理实验台，将无菌器具、实验用品归位，关闭超净工作台、恒温培养箱等设备； ③ 整理实验数据，绘制菌落数量对比表格，计算细菌密度，分析实验结果，归纳实验结论，填写实验记录表。
【实验结果】
1. 空白对照组结果：不含土壤菌液的空白对照培养基表面，无菌落生长，培养基颜色无变化（仍为淡黄色），说明培养基、实验器具灭菌彻底，实验环境无杂菌污染，实验结果可靠。 2. 对照培养基结果：以NH NO 为唯一氮源的对照培养基表面，菌落数量较多，形态多样，大部分菌落周围无红色区域（说明这些细菌不能产生脲酶，无法分解尿素），仅少数菌落周围出现红色区域（分解尿素的细菌），说明土壤中存在多种微生物，对照培养基无法筛选目标细菌。 3. 尿素选择培养基结果： ① 菌落特征：培养基表面菌落数量少于对照培养基，菌落形态较单一，多为圆形、边缘整齐、表面光滑，颜色为乳白色或淡黄色，大部分菌落周围出现红色区域（说明这些细菌能产生脲酶，分解尿素，为目标细菌）； ② 计数结果：不同稀释倍数的培养皿中，菌落数在30~300个的培养皿可用于计数，例如10 倍稀释菌液接种的培养皿，平均菌落数为50个，则每克土壤中分解尿素细菌数=（50×10 ）÷0.1=5×10 个。 4. 异常结果示例： ① 空白对照组出现菌落：说明培养基、实验器具灭菌不彻底，实验结果不可靠，需重新实验； ② 选择培养基菌落数量过多（超过300个/皿）：可能是土壤样品稀释倍数过低，菌液浓度过高，需重新稀释接种； ③ 选择培养基无菌落或菌落极少：可能是土壤样品中分解尿素细菌数量过少、稀释倍数过高，或培养基配方错误（尿素含量不足、pH不适）； ④ 菌落周围无红色区域：可能是细菌不能产生脲酶，或培养时间过短，氨产生量不足，需延长培养时间； ⑤ 培养基表面出现大量杂菌菌落：可能是无菌操作不规范（接种过程污染、实验台面未消毒），或土壤样品处理不当。
【实验结论】 1. 土壤中存在能分解尿素的细菌，这类细菌能产生脲酶，将尿素分解为氨，使培养基pH升高，酚红指示剂变红，可通过该特征鉴别目标细菌。 2. 以尿素为唯一氮源的选择培养基，能特异性筛选分解尿素的细菌，抑制不能产生脲酶的杂菌生长，可实现目标细菌的有效分离。 3. 稀释涂布平板法可用于土壤中分解尿素细菌的计数，通过梯度稀释和平行重复实验，能提高计数的准确性，计算出每克土壤中分解尿素细菌的密度。 4. 无菌操作、规范的梯度稀释和涂布接种，是实验成功的关键，杂菌污染、稀释不当、接种不规范等会严重干扰实验结果。 5. 分解尿素的细菌在土壤物质循环中具有重要作用，可将土壤中的尿素转化为氨，为植物生长提供氮源，在农业生产中具有潜在应用价值。
【注意事项】 1. 无菌操作规范（核心注意事项）： ① 实验全程需在超净工作台中进行，实验人员佩戴手套、口罩、护目镜，避免手部、呼吸道分泌物污染实验材料； ② 接种环、涂布器每次使用前和使用后，均需在酒精灯火焰上灼烧灭菌（灼烧至红热，冷却后再接种，避免高温杀死细菌）； ③ 培养基、菌液、无菌水等，均需经过高压蒸汽灭菌处理（121℃、101kPa，灭菌20分钟），避免杂菌污染； ④ 接种、涂布过程中，培养皿盖不可完全打开，仅打开一条缝隙，避免空气中的杂菌落入培养基；稀释菌液时，移液管需无菌，每稀释一次更换一支，避免交叉污染。 2. 土壤样品稀释与接种规范： ① 土壤样品需新鲜，称取时需无菌操作，避免污染；稀释过程中，振荡摇匀，确保菌液均匀分散，避免菌液浓度不均导致菌落数量差异过大； ② 稀释倍数需合理，根据土壤肥力调整，确保最终接种后菌落数在30~300个/皿，超出该范围的培养皿需舍弃，不用于计数； ③ 接种时，移液管滴加菌液体积准确（0.1mL/皿），涂布器涂布均匀，避免菌液聚集导致菌落重叠，影响统计结果；每组实验设置3个重复培养皿，确保平行重复原则，减少实验误差。 3.恒温培养规范： ① 培养温度控制在37℃（细菌最适生长温度），温度过高会杀死细菌，过低会抑制细菌繁殖，导致菌落无法形成或数量过少； ② 培养皿需倒置培养，避免培养过程中冷凝水滴落，污染培养基、破坏菌落形态； ③ 培养时间控制在18~24小时，时间过长会导致菌落重叠、形态异常，过短则菌落未形成，氨产生量不足，无法通过酚红指示剂鉴别目标细菌。 4.4. 菌落计数规范： ① 计数时，仅统计尿素选择培养基中周围出现红色区域的菌落（分解尿素的细菌），排除杂菌菌落（无红色区域、形态异常）； ② 选择菌落数在30~300个的培养皿进行统计，菌落过多时选取1/4区域统计，再换算成整个培养皿的菌落数；菌落重叠时，视为单个菌落统计，避免重复统计； ③ 计算细菌密度时，严格按照公式计算，注意稀释倍数和接种体积的准确性，避免计算错误。 5. 实验安全与环保规范： ① 土壤样品、菌液具有一定的污染性，实验过程中避免接触皮肤、黏膜，若不慎接触，需立即用大量清水冲洗； ② 实验结束后，所有接种后的培养皿、菌液、试剂等，必须经过高压蒸汽灭菌处理后再丢弃，避免细菌扩散、污染环境； ③ 实验器具灭菌后，需妥善清洗、归位，避免交叉污染，便于下次使用。 6. 实验操作误区： ① 误认为“选择培养基能鉴别分解尿素的细菌”：选择培养基的作用是筛选（保留目标细菌），酚红指示剂才是用于鉴别目标细菌的试剂； ② 忽略梯度稀释的重要性：稀释倍数过低会导致菌落过多、重叠，稀释倍数过高会导致菌落过少或无菌落，均无法准确计数； ③ 计数时包含杂菌菌落：未排除无红色区域的杂菌，会导致计数结果偏高，影响实验结论的科学性； ④ 培养基pH调节不当：pH过高或过低会抑制分解尿素细菌的生长，导致实验失败，需严格调节至7.2~7.4。
【实验讨论】 1. 实验方法的局限性与改进： 本实验仅采用稀释涂布平板法进行计数，未采用平板划线法进行分离，如何设计实验对比两种方法的分离效果？（提示：设置稀释涂布平板组和平板划线组，保持其他条件一致，对比两组菌落形态和分离效果）； 实验中仅探究了一种土壤样品中分解尿素细菌的数量，如何设计实验探究不同类型土壤（如菜园土、农田土、荒漠土）中分解尿素细菌的数量差异？（提示：选取不同类型土壤样品，采用相同的稀释倍数和接种方法，对比各组菌落数量和细菌密度）。 2. 误差原因的深度分析： 除了杂菌污染、稀释不当、接种不规范，还有哪些因素会导致实验结果异常？（提示：培养基配方错误、酚红指示剂失效、培养温度波动过大、计数方法错误），如何针对性改进？（提示：严格按照配方配制培养基，检查试剂有效性，保持培养箱温度稳定，规范计数方法）。 3. 实验原理的拓展应用： 农业生产中，如何利用分解尿素的细菌制作微生物肥料？（提示：筛选高效分解尿素的细菌菌株，扩大培养后，与载体混合制成微生物肥料，施用于农田，提高土壤中尿素的利用率，减少化肥使用）； 除了分解尿素的细菌，土壤中还有哪些能分解有机物的微生物？（提示：分解纤维素的细菌、分解纤维素的真菌等），它们的分离方法与分解尿素细菌的分离方法有哪些异同？（提示：相同点是均需使用选择培养基，不同点是选择培养基的碳源/氮源不同，需根据微生物的代谢特征调整）。
1.核心原理与操作要点汇总：
① 核心机制：分解尿素细菌产生脲酶→脲酶分解尿素为氨→培养基pH升高（酚红变红）；选择培养基（尿素为唯一氮源）筛选目标细菌→梯度稀释+涂布接种→计数→计算细菌密度；
② 实验流程：无菌处理→土壤样品梯度稀释→接种（选择培养基+对照培养基）→恒温培养（37℃、18~24h，倒置）→菌落观察、鉴别与计数→计算细菌密度；
③ 核心区分：选择培养基（筛选）≠鉴别培养基；脲酶是分解尿素细菌的关键酶，酚红指示剂用于鉴别目标细菌；
④ 关键原则：单一变量（氮源种类）、对照（空白+对照培养基）、平行重复（每组3个重复）；计数原则（菌落数30~300个/皿）；
⑤ 无菌操作：全程无菌，接种环/涂布器灼烧灭菌，培养皿倒置培养，稀释过程避免交叉污染。
【典例01】下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验的叙述，错误的是（　　）
A．实验的核心原理是分解尿素的细菌能产生脲酶，将尿素分解为氨
B．选择培养基以尿素为唯一氮源，可抑制不能产生脲酶的杂菌生长
C．涂布接种时，涂布器无需灭菌，直接涂布即可，不影响实验结果
D．计数时，选择菌落数在30~300个的培养皿进行统计，可提高计数准确性
【答案】C
【详解】A、分解尿素细菌的核心特征是能产生脲酶，脲酶可催化尿素分解为氨，A正确；B、选择培养基以尿素为唯一氮源，不能产生脲酶的杂菌无法利用尿素，生长受抑制，从而筛选出目标细菌，B正确；C、涂布器使用前需灼烧灭菌，避免携带杂菌，污染培养基和菌液，影响实验结果，C错误；D、菌落数在30~300个的培养皿，计数误差较小，可提高计数准确性，超出该范围的培养皿需舍弃，D正确。故选C。
2.实验误差与异常分析：
误差原因1：空白组出现菌落→培养基、实验器具灭菌不彻底，实验结果不可靠；
误差原因2：选择培养基菌落过多/过少→土壤样品稀释倍数不当（过低/过高）；
误差原因3：菌落周围无红色区域→培养时间过短、细菌不能产生脲酶、酚红指示剂失效；
误差原因4：杂菌过多→无菌操作不规范、土壤样品处理不当；
误差原因5：计数结果偏高→统计时包含杂菌菌落、菌落重叠时重复统计；
误差原因6：计数结果偏低→稀释倍数过高、接种量不足、培养温度不适。
【典例02】进行“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验时，发现选择培养基上菌落周围无红色区域，最可能的原因是（　　）
A．土壤样品稀释倍数过高，菌液浓度过低
B．培养时间过短，细菌产生的氨量不足
C．选择培养基中尿素含量过高，抑制细菌生长
D．涂布接种时，菌液涂布不均匀
【答案】B
【详解】A、稀释倍数过高会导致菌落过少，而非菌落周围无红色区域，A错误；B、培养时间过短，分解尿素细菌产生的脲酶量不足，尿素分解产生的氨量少，无法使培养基pH升高到8.0以上，酚红指示剂不变红，B正确；C、尿素含量过高会抑制细菌生长，导致菌落过少，而非无红色区域，C错误；D、涂布不均匀会导致菌落重叠，与菌落周围是否变红无关，D错误。故选B。
模拟题感知练
1.下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验的叙述，正确的是（　　）
A．分解尿素的细菌能产生脲酶，将尿素分解为二氧化碳和水
B．选择培养基的唯一氮源是尿素，可特异性筛选分解尿素的细菌
C．实验中可采用平板划线法进行计数，操作简便且计数准确
D．土壤样品无需稀释，直接接种到选择培养基上即可分离目标细菌
【答案】B
【详解】A、脲酶将尿素分解为氨和二氧化碳，而非水，A错误；B、选择培养基以尿素为唯一氮源，不能产生脲酶的杂菌无法生长，可特异性筛选目标细菌，B正确；C、平板划线法适合分离细菌，不适合计数，计数需采用稀释涂布平板法，C错误；D、土壤中细菌数量多，直接接种会导致菌落过多、重叠，无法分离和计数，需梯度稀释后接种，D错误。故选B。
2.下列关于实验材料和试剂作用的叙述，与本实验无关的是（　　）
A．新鲜土壤样品：提供分解尿素的细菌，肥沃土壤中目标细菌数量较多
B．尿素选择培养基：为分解尿素的细菌提供营养，同时抑制杂菌生长
C．酚红指示剂：检测培养基pH变化，鉴别分解尿素的细菌
D．龙胆紫溶液：使细菌染色体着色，便于观察细菌的形态和结构
【答案】D
【详解】A、新鲜肥沃土壤中分解尿素的细菌数量多，是实验的理想样品，与实验密切相关，A不符合题意；B、尿素选择培养基为目标细菌提供碳源、氮源等营养，同时抑制杂菌，与实验密切相关，B不符合题意；C、酚红指示剂可通过显色（变红）鉴别分解尿素的细菌，与实验密切相关，C不符合题意；D、本实验观察的是菌落形态和数量，无需观察细菌染色体，龙胆紫溶液用于染色体染色，与本实验无关，D符合题意。故选D。
3.下列关于无菌操作的叙述，错误的是（　　）
A．实验全程需在超净工作台中进行，可避免空气中的杂菌污染培养基和菌液
B．接种环每次使用前后，均需在酒精灯火焰上灼烧灭菌，冷却后再进行操作
C．土壤样品称取时无需无菌操作，只要后续接种规范，就不会影响实验结果
D．培养基、无菌水、菌液等，均需经过高压蒸汽灭菌处理，确保无菌
【答案】C
【详解】A、超净工作台可提供无菌环境，避免空气中的杂菌污染，是无菌操作的关键，A正确；B、接种环灼烧灭菌可杀死杂菌和残留细菌，冷却后使用可避免高温杀死接种的细菌，B正确；C、土壤样品称取时若不无菌操作，会携带杂菌，污染菌液和培养基，干扰实验结果，C错误；D、培养基、无菌水等经过高压蒸汽灭菌，可确保无菌，避免杂菌污染，D正确。故选C。
4.下列关于菌落观察与鉴别的叙述，错误的是（　　）
A．分解尿素的细菌菌落周围会出现红色区域，这是酚红指示剂显色的结果
B．分解尿素的细菌菌落多为圆形、边缘整齐、表面光滑，颜色为乳白色
C．杂菌菌落周围无红色区域，形态不规则、颜色异常，统计时需排除
D．菌落周围红色区域越大，说明细菌产生的脲酶活性越低，分解尿素的能力越弱
【答案】D
【详解】A、分解尿素的细菌产生的脲酶分解尿素为氨，使培养基pH升高，酚红指示剂变红，菌落周围出现红色区域，A正确；B、分解尿素的细菌菌落具有典型特征，圆形、边缘整齐、表面光滑、乳白色，B正确；C、杂菌不能产生脲酶，菌落周围无红色区域，形态和颜色异常，需排除统计，避免干扰结果，C正确；D、菌落周围红色区域越大，说明细菌产生的脲酶活性越高，分解尿素产生的氨越多，分解尿素的能力越强，D错误。故选D。
5.下列关于实验计数与计算的叙述，正确的是（　　）
A．计数时，所有培养皿中的菌落都可用于计算，无需筛选
B．若某培养皿中菌落数为25个，因少于30个，需舍弃，不用于计数
C．每克土壤中细菌数=（平均菌落数×稀释倍数）÷接种体积（0.1mL）
D．统计时，菌落重叠时，视为多个菌落统计，避免遗漏
【答案】C
【详解】A、计数时需筛选菌落数在30~300个的培养皿，超出该范围的需舍弃，避免误差过大，A错误；B、菌落数为25个，少于30个，计数误差较大，需舍弃，B正确；C、细菌密度的计算公式为：每克土壤中细菌数=（平均菌落数×稀释倍数）÷接种体积，接种体积通常为0.1mL，C正确；D、菌落重叠时，视为单个菌落统计，避免重复统计，导致计数结果偏高，D错误。故选C。
6.下列关于本实验的价值与意义，叙述错误的是（　　）
A．可直观理解选择培养基的筛选原理，掌握微生物分离与计数的方法
B．能深化对土壤微生物代谢特征的理解，认识微生物在物质循环中的作用
C．为农业生产中制作微生物肥料、提高尿素利用率提供实验依据
D．可直接观察到细菌产生脲酶的过程，验证脲酶的作用机制
【答案】D
【详解】A、实验中通过选择培养基筛选目标细菌，可直观理解筛选原理，同时掌握稀释涂布平板法计数的方法，A正确；B、通过实验可了解分解尿素细菌的代谢特征，认识其在土壤氮循环中的作用，B正确；C、筛选高效分解尿素的细菌，可用于制作微生物肥料，提高尿素利用率，减少化肥使用，C正确；D、脲酶的产生是微观过程，无法直接观察到，可通过菌落周围的红色区域间接验证脲酶的作用，D错误。故选D。
7.某小组进行“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验，下列叙述正确的是（　　）
A．稀释土壤菌液时，用蒸馏水替代无菌生理盐水，不影响实验结果
B．接种时，滴加不同稀释倍数的菌液，可在同一培养皿中接种多种稀释倍数
C．恒温培养时，温度波动在35~39℃，对细菌生长和实验结果影响较小
D．统计菌落数量时，将杂菌菌落计入统计，可提高实验结果的准确性
【答案】C
【详解】A、蒸馏水不含无机盐，会导致细菌吸水破裂，影响细菌存活，进而影响实验结果，需用无菌生理盐水稀释，A错误；B、同一培养皿中接种多种稀释倍数的菌液，会导致菌落数量混乱，无法准确计数，需一个培养皿接种一种稀释倍数的菌液，B错误；C、细菌最适生长温度为37℃，温度波动在35~39℃，对细菌繁殖影响较小，实验结果较稳定，C正确；D、杂菌菌落会导致计数结果偏高，干扰实验结论，需排除杂菌菌落，D错误。故选C。
8.平板接种常用在微生物培养中。下列说法正确的是（ ）
A．不含氮源的平板不能用于微生物培养
B．平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒
C．接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃
D．利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物
【答案】D
【详解】A、不含氮源的平板可用于固氮菌的培养，A错误；
B、平板涂布时涂布器使用前必须浸在酒精中，然后在火焰上灼烧灭菌，这种操作属于灭菌，不属于消毒，B错误；
C、使用后的培养基即使未长出菌落也要在丢弃前进行灭菌处理，不能直接丢弃，以免污染环境，C错误；
D、脲酶可以催化尿素分解，在以尿素为唯一氮源的平板上，能合成脲酶的微生物可以分解尿素获得氮源而进行生长繁殖，但是不能合成脲酶的微生物因缺乏氮源而无法生长，因此以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物，D正确。
9.下列是某同学分离高产脲酶菌的实验设计，不合理的是（ ）
A．选择农田或公园土壤作为样品分离目的菌株
B．在选择培养基中需添加尿素作为唯一氮源
C．适当稀释样品是为了在平板上形成单菌落
D．可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌
【答案】D
【详解】A、农田或公园土壤中含有较多的含脲酶的微生物，A正确；
B、为了筛选可分解尿素的细菌，配制的培养基应选择尿素作为唯一氮源，含脲酶的微生物在该培养基上能生长，B正确；
C、当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，C正确；
D、在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红，因此在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，能对分离的菌种做进一步鉴定，D错误。
10.黄酒源于中国，与啤酒、葡萄酒并称世界三大发酵酒。发酵酒的酿造过程中除了产生乙醇外，也产生不利于人体健康的氨基甲酸乙酯（EC）。EC主要由尿素与乙醇反应形成，各国对酒中的EC含量有严格的限量标准。回答下列问题:
(1)某黄酒酿制工艺流程如图所示，图中加入的菌种a是 ，工艺b是 （填“消毒”或“灭菌”），采用工艺b的目的是 。
(2)以尿素为唯一氮源的培养基中加入 指示剂，根据颜色变化，可以初步鉴定分解尿素的细菌。尿素分解菌产生的脲酶可用于降解黄酒中的尿素，脲酶固定化后稳定性和利用效率提高，固定化方法有 （答出两种即可）。
(3)研究人员利用脲酶基因构建基因工程菌L，在不同条件下分批发酵生产脲酶，结果如图所示。推测 是决定工程菌L高脲酶活力的关键因素，理由是 。
(4)某公司开发了一种新的黄酒产品，发现EC含量超标。简要写出利用微生物降低该黄酒中EC含量的思路 。
【答案】(1) 酵母菌 消毒
目的是杀死啤酒的中大多数微生物，并延长其保存期
(2) 酚红 化学结合法、包埋法、物理吸附法
(3) pH 两图中脲酶活力随时间变化的曲线基本一致，而维持pH在6.5不变与pH从6.5降为4.5相比较而言，酶活力值始终要高
(4)方案一：配置一种选择培养基，筛选出产生EC降解酶的细菌，从细菌中分离得到EC降解酶，纯化的EC降解酶进行固定化操作后，加入该黄酒中。
方案二：配置一种选择培养基，筛选出产生脲酶的细菌，从细菌中分离得到脲酶，纯化的脲酶进行固定化操作后，在黄酒工艺流程的发酵环节中加入。
【详解】（1）制造果酒利用的是酵母菌的无氧呼吸，加入的菌种a是酵母菌。过滤能除去啤酒中部分微生物，工艺b是消毒，目的是杀死啤酒的中大多数微生物，并延长其保存期。
（2）由于细菌分解尿素的过程中合成脲酶，脲酶将尿素分解成氨，会使培养基碱性增强，pH升高，所以可以用检测pH的变化的方法来判断尿素是否被分解，故在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂可以鉴别尿素分解菌。固定化酶实质上是将相应酶固定在不溶于水的载体上，实现酶的反复利用，并提高酶稳定性，酶的各项特性（如高效性、专一性和作用条件的温和性）依然保持。固定化酶的方法包括化学结合法、包埋法、物理吸附法等。
（3）对比两坐标曲线，两图中脲酶活力随时间变化的曲线基本一致，说明培养时间不是决定因素；而维持pH在6.5不变与pH从6.5降为4.5相比较而言，酶活力值始终要高，说明pH为6.5时，有利于酶结构的稳定，故pH是决定工程菌L高脲酶活力的关键因素。
（4）从坐标图形看，利用脲酶消除其前体物质尿素可降低该黄酒中EC含量。配置一种选择培养基，筛选出产生EC降解酶的细菌，从细菌中分离得到EC降解酶，纯化的EC降解酶进行固定化操作后，加入该黄酒中。或者配置一种选择培养基，筛选出产生脲酶的细菌，从细菌中分离得到脲酶，纯化的脲酶进行固定化操作后，在黄酒工艺流程的发酵环节中加入。
11．如下图为研究人员从红棕壤中筛选高效分解尿素细菌的意图，有关叙述不正确的是（ ）
A．步骤③纯化分解尿素的细菌的原理是将聚集的细菌分散，以获得单细胞形成的菌落
B．配制步骤②、③的培养基都要进行严格灭菌
C．步骤④挑取③中不同种的菌落分别接种，比较细菌分解尿素的能力
D．步骤③采用涂布平板法接种，并需向牛肉膏蛋白胨培养基中加入尿素
【答案】D
【分析】从红棕壤中筛选高效分解尿素细菌过程：（1）利用红棕壤和无菌水制备红棕壤浸出液；（2）取上清液2mL放在选择培养基中培养；（3）可用移液器取1mL菌液放在以尿素为唯一氮源的培养基中进行分离单菌落，筛选、纯化分解尿素的细菌；（4）挑选单菌落接种于尿素液体培养基，进行鉴定分解尿素的能力。
【详解】A、以尿素为唯一氮源的培养基，利用涂布分离法将聚集的细菌分散，以获得单细胞形成的菌落是纯化分解尿素的细菌的原理，A正确；
B、配制步骤②、③的培养基时，为防止杂菌污染，应进行严格灭菌，B正确；
C、经过③筛选、纯化分解尿素的细菌，但不同菌分解尿素的能力不同，因此需要挑取③中的不同种的菌落接种于④中，比较细菌分解尿素的能力，C正确；
D、要筛选出能高效分解尿素的细菌，所选用的培养基要以尿素为唯一氮源，但牛肉膏和蛋白胨中都含有氮源，因此步骤③所用的培养基中不能含有牛肉膏、蛋白胨，D错误。
故选D。
12.阅读下列材料，回答下列题。
当培养基以尿素为唯一氮源时，只有能分泌脲酶的微生物才能在该培养基中生长，利用这种培养基就可分离出土壤中能产生脲酶的微生物。微生物利用脲酶分解尿素产生的氨会使培养基的碱性增强，使培养基中的酚红指示剂呈红色，根据菌落周围是否出现红色区域，就可进一步鉴定尿素分解菌。
(1)尿素分解菌能在只有尿素作为氮源的尿素固体培养基中生长，其直接利用的氮源是（ ）
A．尿素 B．氨 C．脲酶 D．蛋白胨
(2)在进行“能分解尿素的微生物的分离与计数”活动时，用来判断培养基是否发挥选择作用的对照组是（ ）
A．未接种的选择培养基 B．已接种的选择培养基
C．未接种的全营养培养基 D．已接种的全营养培养基
【答案】(1)．B (2)．D
(1)题干信息：能分泌脲酶的微生物利用脲酶分解尿素产生的氨，故尿素分解菌能在只有尿素作为氮源的尿素固体培养基中生长，其直接利用的氮源是氨，ACD错误，B正确。
故选B。
(2)实验遵循单一变量和对照原则，实验：进行“能分解尿素的微生物的分离与计数”活动，该实验使用的培养基是选择培养基，故用来判断培养基是否发挥选择作用的对照组是已接种的全营养培养基，ABC错误，D正确。
13．幽门螺杆菌(含有脲酶)感染是急慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因素。在患者体内采集样本并制成菌液后，进行分离培养。下列有关叙述正确的是（ ）
A．分离纯化幽门螺杆菌时应使用以尿素为唯一氮源、pH为中性的培养基
B．进行幽门螺杆菌培养需要提供95%空气和5%CO2的气体环境
C．可采用稀释涂布平板法对幽门螺杆菌进行分离和计数
D．鉴别幽门螺杆菌时应在培养基中加入酚红指示剂
【答案】ACD
【详解】A、幽门螺杆菌可以合成脲酶，可以利用尿素，所以分离纯化幽门螺杆菌时应使用以尿素为唯一氮源的培养基，幽门螺杆菌属于细菌，培养时可将培养基pH调至中性，A正确；
B、需要提供95%空气（含有氧气，利于细胞进行呼吸）和5%CO2（维持培养液的pH）的气体环境进行培养的是动物细胞而非幽门螺杆菌（在培养基中培养而非培养液），B错误；
C、稀释涂布平板法可以用于微生物的分离和计数，因此对幽门螺杆菌进行分离和计数可采用稀释涂布平板法，C正确；
D、由于幽门螺杆菌在分解尿素的过程中会合成脲酶，脲酶将尿素分解成氨，使培养基碱性增强，pH升高，所以可以用检测pH的变化的方法来判断尿素是否被分解，即在培养基中加入酚红指示剂，尿素被分解后产生氨，pH升高，则该菌落周围会出现红色环带，故鉴别幽门螺杆菌时应在培养基中加入酚红指示剂，D正确。
14．为了分离和纯化高效分解石油的细菌，科研人员利用被石油污染过的土壤进行下图A所示的实验。同学甲进行步骤④的操作，其中一个平板经培养后的菌落分布如图B所示。同学乙也按照同学甲的接种方法进行了步骤④的操作：将1mL样品稀释100倍，在5个培养基平板上分别接入0.1mL稀释液，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，无菌落产生。下列叙述正确的是（ ）

A．乙同学计算得出每升样品中的活菌数约为3.3×108个
B．步骤③与步骤②中培养基成分的最大区别是步骤③的培养基中石油是唯一碳源
C．步骤④甲同学出现图B结果可能的操作失误是样品的稀释程度太低导致
D．步骤⑤后取样测定石油含量的目的是筛选出能分解石油的细菌
【答案】B
【详解】A、乙同学实验平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191，数据之间差值过大，应分析误差产生的原因，重新进行实验，不能这些数值去计算，A错误；
B、该实验的目的是为了分离和纯化高效分解石油的细菌，因此步骤③是以石油是唯一碳源的选择培养基，与步骤②中培养基成分相比，最大的区别是石油是唯一碳源，B正确；
C、步骤④甲同学出现图B结果是菌落分布不均匀，可能的操作失误是用涂布器涂布平板时涂布不均导致，C错误；
D、步骤⑤后取样测定石油含量的目的是筛选出能高效分解石油的细菌，D错误。
故选B。
15．自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是有关土壤中分解尿素的细菌分离和计数的实验过程，请回答有关问题。
(1)为分离出土壤中分解尿素的细菌，应该用 的培养基进行分离。
(2)若取土样6g，应加入 mL的无菌水配制成稀释10倍土壤溶液。因土壤中细菌密度很大，需要不断加以稀释，配制成101～107不同浓度的土壤溶液。将103～107倍的稀释液分别吸取0.2mL加入到固体培养基上，用涂布器将菌液铺平，每个稀释度下至少涂布3个平板。将接种的培养皿放置在37℃恒温培养箱中培养24h～48h，观察并统计菌落数，结果如下表，其中 倍的稀释比较合适，由此计算出每克土壤中的菌落数为 。
稀释倍数 103 104 105 106 107
菌落数 （个） 1号平板 478 367 270 26 5
2号平板 496 354 264 20 8
3号平板 509 332 252 29 3
(3)若研究尿素分解菌的群体生长规律，可采用平板划线法分离土壤中的尿素分解菌。操作时，接种环通过灼烧灭菌，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线。这样做的目的是 。将分离纯化后的单个菌落进行液体培养，可采用定期取样的方法进行计数。若以一个大方格（体积为0.1mm3）有25个中方格的计数板为例进行计算，设五个中方格中总菌数为50，菌液稀释倍数为102，那么原菌液的菌群密度为 个/mL。
【答案】(1)尿素作为唯一的氮源
(2) 54 105 1.31×108
(3) 将聚集的菌体逐步稀释以便获得（不连续）单个菌落 2.5×108
【分析】筛选尿素分解菌需要使用尿素为唯一的氮源的选择培养基，尿素分解菌可以使用酚红指示剂进行鉴定；稀释涂布平板法接种可以用来进行微生物的计数；利用稀释涂布平板发估算样品中活菌数时，往往选择菌落数在30-300之间的平板。
【详解】（1）为了纯化分解尿素的细菌，需要抑制其他杂菌的生长，所以需要使用尿素作为唯一氮源的培养基进行分离培养。
（2）将土壤稀释10倍是指土壤占混合液的10%，所以土壤溶液总量应为60ml，故需要添加54ml的无菌水；估算样品中活菌数时，往往选择菌落数在30-300之间的平板，所以稀释倍数为105时效果最佳；每克土壤中的菌落数需先算出三个平板的平均数，再除以滴加量，最后乘稀释倍数，（270+264+252）÷3÷0.2×105=1.31×108。
（3）利用平板划线法分离土壤中的尿素分解菌时，接种环通过灼烧灭菌，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线，这样做每次重新画线菌的数量都会在原有基础上下降，越来越少，最终将聚集的菌体逐步稀释以便获得（不连续）单个菌落；
若以一个大方格（体积为0.1mm3）有25个中方格的计数板为例进行计算，设五个中方格中总菌数为50，菌液稀释倍数为102，那么原菌液的菌群密度为50×5÷0.1×103×102=2.5×108个/mL。
16．尿素[CO(NH2)2]是有机态氮肥，只有在被土壤中的微生物分解后，才能被农作物吸收和利用。某兴趣小组试图从土壤中分离能分解尿素的细菌，相关流程如图所示。回答下列问题：
(1)为了分离得到尿素分解菌，需要配制培养基，培养基中加入的尿素能为微生物提供的营养成分是 。
(2)配制好的培养基，采用 法进行灭菌，待平板冷却凝固后需要将平板 （填放置方式），这样做的目的是 （答出1点）。
(3)据图分析，该兴趣小组设置了三个培养皿进行接种，所采用的接种方法是 ，培养一段时间后，经过统计，在培养基表面分别形成了51、42、45个菌落，据此计算，1g土壤样品中约有分解尿素的细菌 个。
(4)从土壤中分离尿素分解菌的相关流程都应注意 操作，以防影响实验结果。
【答案】(1)碳源和氮源
(2) 高压蒸汽灭菌 倒置 避免培养基表面的水分过快地蒸发；防止皿盖上的冷凝水珠落入培养基，造成污染
(3) 稀释涂布平板法 4.6×108
(4)无菌/防止杂菌污染
【详解】（1）各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求，能为微生物提供的营养成分是碳源和氮源。
（2）培养基一般采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。为了避免培养基表面的水分过快地蒸发，防止皿盖上的冷凝水珠落入培养基，造成污染，待平板冷却凝固后需要将平板倒置。
（3）据图分析，该兴趣小组设置了三个培养皿进行接种，且需要计数，所采用的接种方法是稀释涂布平板法。取lg土壤，按如图稀释后，在三个平板上分别接入0.1ml稀释液后，经适当培养后，3个平板上的菌落数分别是51、42、45个，根据计算公式：每克样品中的菌株数=（C÷V)×M计算，因此1g土壤样品中约有分解尿素的细菌=（51+42+45）/3÷0.1×106=4.6×108个。
（4）从土壤中分离尿素分解菌的相关流程都应注意无菌或防止杂菌污染操作，以防影响实验结果。
2 / 2实验03 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
2022年新课标 课标解读
一、生命观念
通过实验分离与计数土壤中分解尿素的细菌，理解微生物与环境的相互关系，建立“微生物代谢与环境适应”的生命观念，认同微生物在物质循环中的重要作用。
二、科学思维
运用观察、对比、推理、归纳等科学方法，分析选择培养基的筛选原理，解读菌落形态和数量变化的意义，推理分解尿素细菌的代谢特征，形成基于实验证据的逻辑推理能力和误差分析意识。
三、科学探究
通过设计和实施土壤中分解尿素细菌的分离与计数实验，掌握微生物分离、接种、计数的基本方法，提升实验设计、操作实施、现象描述与数据（菌落数量）分析能力，理解实验设计的对照原则、单一变量原则和平行重复原则。
四、社会责任
结合实验原理，联系土壤微生物在生态系统中的作用，认识微生物在农业生产、环境治理中的应用价值，树立“合理利用微生物资源、保护生态环境”的责任意识，理解科学实验对生产实践的指导价值。 1. 知识目标
基础概念：掌握分解尿素的细菌、脲酶、选择培养基、涂布分离、菌落计数、CFU（菌落形成单位）等核心术语
关键原理：理解分解尿素细菌的代谢特征（能产生脲酶，将尿素分解为氨和二氧化碳），明确选择培养基的筛选原理（以尿素为唯一氮源，抑制不能产生脲酶的微生物生长，保留分解尿素的细菌）；掌握微生物分离与计数的基本原理和方法。
2. 能力目标
操作技能：规范进行土壤样品稀释、涂布接种、恒温培养操作，学会观察和统计菌落的形态、数量、大小，能规范记录实验现象和实验数据，掌握稀释涂布平板法计数的核心技巧。
数据分析：能分析选择培养基的筛选效果，解读菌落数量与细菌浓度的关系，计算土壤中分解尿素细菌的密度，归纳实验结论，排查实验异常现象并分析原因。
3. 价值目标
科学素养：认同实验探究在微生物研究中的作用，培养严谨的科学实验态度、细致的观察能力和规范的实验操作习惯。
跨学科融合：关联化学（尿素的分解反应、pH变化）、农业生产（微生物肥料的应用），理解分解尿素细菌分离与计数的理化基础和实践意义。
重点先知：
1.实验核心是“分离与计数”：通过设置以尿素为唯一氮源的选择培养基，筛选出土壤中能分解尿素的细菌（抑制杂菌生长）；采用稀释涂布平板法，将土壤样品梯度稀释后接种，通过统计菌落数量，计算土壤中分解尿素细菌的密度，核心是抓住“选择培养基的筛选作用”和“菌落计数的准确性”。
2.操作关键是“无菌操作+梯度稀释”：微生物分离与计数实验中，无菌操作是实验成功的核心，任何环节的污染都会导致杂菌生长，干扰筛选和计数结果；梯度稀释的准确性直接影响菌落数量统计，需严格控制稀释倍数，确保接种后菌落数量适中（30~300个/皿），便于计数。
3.核心区分：选择培养基的作用是“筛选”（保留目标细菌、抑制杂菌），而非“鉴别”；脲酶是分解尿素细菌的关键酶，其活性决定细菌能否利用尿素作为氮源，可通过检测培养基pH变化（氨的产生使pH升高）辅助判断目标细菌的存在。
教材内容
（一）实验核心原理
1.分解尿素细菌的代谢特征：土壤中存在多种微生物，其中分解尿素的细菌能产生脲酶，脲酶可将培养基中的尿素分解为氨（NH ）和二氧化碳（CO ），氨溶于水使培养基的pH升高，可通过酚红指示剂显色（变红），辅助鉴别分解尿素的细菌。
2.选择培养基的筛选原理：本实验选用以尿素为唯一氮源的固体培养基，不能产生脲酶的微生物（如大多数细菌、真菌）无法利用尿素作为氮源，生长受到抑制；而能产生脲酶的分解尿素细菌，可利用尿素作为氮源正常生长繁殖，从而实现目标细菌的分离。
3.计数原理：采用稀释涂布平板法，将土壤样品进行梯度稀释，接种到选择培养基上，培养后统计每个培养皿中的菌落数，根据稀释倍数和接种体积，计算每克土壤中分解尿素细菌的数量（公式：每克土壤中细菌数=（平均菌落数×稀释倍数）÷接种体积）；为保证计数准确性，选择菌落数在30~300个的培养皿进行统计，避免菌落过多或过少导致误差。
（二）实验材料的选择与优势
实验选用肥沃的土壤（如菜园土、农田土）作为样品，选用LB固体培养基（基础培养基，用于细菌扩大培养）和尿素选择培养基（筛选目标细菌），核心原因有3点：① 肥沃土壤中微生物种类丰富，分解尿素的细菌数量较多，易分离获得目标菌株；② 尿素选择培养基能特异性筛选分解尿素的细菌，排除杂菌干扰，实验现象显著；③ 分解尿素细菌繁殖速度较快，培养1~2天即可形成清晰菌落，便于观察和计数。
注意：土壤样品需新鲜，采集后及时处理，避免微生物死亡；接种时选用处于对数期的细菌，此时细菌代谢旺盛、繁殖能力强，菌落形态整齐、数量稳定，便于统计和分离。
（三）实验中关键试剂与器具的作用原理
1.尿素选择培养基：含尿素（唯一氮源）、葡萄糖（碳源）、无机盐、琼脂、酚红指示剂，作用是筛选分解尿素的细菌，同时通过酚红指示剂显色（pH升高变红），辅助鉴别目标细菌；
2.脲酶：分解尿素细菌产生的关键酶，可催化尿素分解为氨和二氧化碳，是细菌利用尿素的核心；
3.无菌水/无菌生理盐水：用于土壤样品梯度稀释，控制细菌浓度，使接种后菌落数量适中，同时维持细菌形态，避免细菌吸水破裂；
4.接种环/涂布器：用于细菌接种，涂布器可使菌液均匀分布在培养基表面，便于形成单个菌落和计数；
5.恒温培养箱：控制培养温度在37℃（细菌最适生长温度），为细菌繁殖提供适宜温度条件，促进菌落形成；
6.酚红指示剂：检测培养基pH变化，当细菌分解尿素产生氨，使培养基pH升高到8.0以上时，酚红指示剂变红，可快速鉴别分解尿素的细菌。
（四）实验设计的基本原则
1.对照原则：本实验需设置2组对照，① 空白对照（不含土壤菌液的尿素选择培养基），用于检测培养基灭菌是否彻底，排除杂菌污染；② 对照培养基（以NH NO 为唯一氮源的固体培养基，接种土壤菌液），用于对比选择培养基的筛选效果，验证选择培养基能否特异性保留分解尿素的细菌；
2.单一变量原则：实验的唯一变量是“氮源种类”（选择培养基中为尿素，对照培养基中为NH NO ），其他条件（土壤样品稀释倍数、接种量、培养温度、培养时间、培养基成分）需保持一致，确保实验结果的科学性；
3.平行重复原则：每组实验至少设置3个重复培养皿，接种相同浓度、相同体积的菌液，培养后统计每组菌落数量的平均值，避免单一样本的偶然性，提高实验结果的可靠性；计数时，选择菌落数在30~300个的培养皿进行统计，超出该范围的培养皿需舍弃。
【实验目的】 1.理解分解尿素细菌的代谢特征和选择培养基的筛选原理，掌握脲酶的作用机制。 2.掌握土壤样品梯度稀释、涂布接种、恒温培养的基本操作，学会分解尿素细菌的分离方法。 3.掌握稀释涂布平板法计数的原理和方法，能准确统计土壤中分解尿素细菌的数量，计算细菌密度。 4.联系土壤微生物的生态作用，认识分解尿素细菌在农业生产中的应用价值，培养科学探究能力和严谨的实验素养。
【材料用具】 （一）实验材料
新鲜肥沃土壤样品（菜园土或农田土）、分解尿素细菌标准菌株（实验室保存，用于对照）、无菌水、无菌生理盐水（0.9% NaCl溶液）。 （二）实验器具
恒温培养箱（可调节温度至37℃）、超净工作台、接种环、涂布器、酒精灯、培养皿（无菌）、试管（无菌）、移液管（无菌）、烧杯（无菌）、玻璃棒（无菌）、天平、pH计（或pH试纸）、漏斗、滤纸、标签纸、放大镜、实验记录表。 （三）实验试剂
1. 尿素选择培养基（1000mL）：葡萄糖10g、尿素1g、NaCl 5g、KH PO 2g、酚红指示剂0.02g、琼脂15~20g、蒸馏水1000mL，调节pH至7.2~7.4，灭菌后倒入无菌培养皿中凝固备用；
2. 对照培养基（1000mL）：葡萄糖10g、NH NO 1g、NaCl 5g、KH PO 2g、酚红指示剂0.02g、琼脂15~20g、蒸馏水1000mL，调节pH至7.2~7.4，灭菌备用；
3. 其他试剂：75%酒精溶液（消毒用）、高压蒸汽灭菌所需试剂。 （四）辅助材料
无菌操作手册、分解尿素细菌菌落形态示意图、梯度稀释操作流程图、实验安全防护用品（手套、口罩、护目镜）。
【方法步骤】
1. 实验准备与无菌处理（第1步） ① 培养基与试剂准备：提前配制尿素选择培养基和对照培养基，灭菌后倒入无菌培养皿中（每皿约20mL），凝固后贴上标签（标注“选择培养基”“对照培养基”“空白对照”）； ② 无菌处理：对超净工作台、接种环、涂布器、试管、移液管等实验器具进行灭菌处理（接种环、涂布器灼烧灭菌，其他器具高压蒸汽灭菌）；实验人员佩戴手套、口罩，用75%酒精擦拭双手和实验台面，确保无菌操作环境，避免杂菌污染。 2.土壤样品稀释（第2步） ① 称取10g新鲜土壤样品，放入盛有90mL无菌生理盐水的锥形瓶中，振荡摇匀（约10分钟），制成10 倍稀释的土壤菌液； ② 用无菌移液管吸取1mL 10 倍菌液，注入盛有9mL无菌生理盐水的试管中，振荡摇匀，制成10 倍稀释菌液； ③ 重复上述操作，依次制成10 、10 、10 、10 倍的梯度稀释菌液，每一步稀释后都需振荡摇匀，确保菌液均匀分散； ④ 注意：稀释过程中，移液管需无菌，每稀释一次更换一支移液管，避免交叉污染；稀释倍数根据土壤中细菌数量调整，确保最终接种后菌落数在30~300个/皿。 3.无菌接种（第3步） ① 在超净工作台中，用无菌移液管分别吸取10 、10 、10 倍的稀释菌液各0.1mL，分别滴加在尿素选择培养基和对照培养基表面（每种稀释倍数设置3个重复培养皿）； ② 用灭菌冷却后的涂布器，将菌液均匀涂布在培养基表面（涂布时转动培养皿，确保菌液覆盖整个培养基表面，避免菌液聚集）； ③ 空白对照组：吸取0.1mL无菌生理盐水，滴加在尿素选择培养基表面，涂布均匀，用于检测培养基灭菌效果； ④ 接种后，将所有培养皿盖好，倒置放置（避免培养过程中冷凝水滴落，污染培养基、破坏菌落形态），贴上标签（标注稀释倍数、培养基类型、接种日期）。 4.恒温培养（第4步） 将接种后的所有培养皿，放入37℃恒温培养箱中，倒置培养18~24小时；培养过程中，保持培养箱温度稳定，避免震动和污染；培养后期可观察培养基颜色变化（分解尿素细菌生长处会因氨的产生使酚红指示剂变红）。 5. 菌落观察、鉴别与计数（第5步） ① 观察与鉴别：取出培养后的培养皿，放在超净工作台上，用肉眼或放大镜观察菌落的形态、大小、颜色，结合酚红指示剂显色情况，鉴别分解尿素的细菌（菌落周围出现红色区域，说明该细菌能产生脲酶，分解尿素）；区分杂菌菌落（无红色区域，形态不规则、颜色异常），统计时需排除杂菌； ② 计数：选择菌落数在30~300个的培养皿进行统计，统计每组3个重复培养皿中的菌落数，计算平均值；若菌落数量过多，选取培养基的1/4区域统计，再换算成整个培养皿的菌落数；若菌落重叠，视为单个菌落统计； ③ 计算细菌密度：根据公式计算每克土壤中分解尿素细菌的数量，公式为：每克土壤中细菌数=（平均菌落数×稀释倍数）÷接种体积（0.1mL）； ④ 对比分析：对比选择培养基和对照培养基的菌落数量、形态差异，分析选择培养基的筛选效果。 6. 实验结束与整理（第6步） ① 实验结束后，将所有接种后的培养皿、菌液、试剂等进行灭菌处理（高压蒸汽灭菌30分钟），避免细菌扩散、污染环境； ② 清理实验台，将无菌器具、实验用品归位，关闭超净工作台、恒温培养箱等设备； ③ 整理实验数据，绘制菌落数量对比表格，计算细菌密度，分析实验结果，归纳实验结论，填写实验记录表。
【实验结果】
1. 空白对照组结果：不含土壤菌液的空白对照培养基表面，无菌落生长，培养基颜色无变化（仍为淡黄色），说明培养基、实验器具灭菌彻底，实验环境无杂菌污染，实验结果可靠。 2. 对照培养基结果：以NH NO 为唯一氮源的对照培养基表面，菌落数量较多，形态多样，大部分菌落周围无红色区域（说明这些细菌不能产生脲酶，无法分解尿素），仅少数菌落周围出现红色区域（分解尿素的细菌），说明土壤中存在多种微生物，对照培养基无法筛选目标细菌。 3. 尿素选择培养基结果： ① 菌落特征：培养基表面菌落数量少于对照培养基，菌落形态较单一，多为圆形、边缘整齐、表面光滑，颜色为乳白色或淡黄色，大部分菌落周围出现红色区域（说明这些细菌能产生脲酶，分解尿素，为目标细菌）； ② 计数结果：不同稀释倍数的培养皿中，菌落数在30~300个的培养皿可用于计数，例如10 倍稀释菌液接种的培养皿，平均菌落数为50个，则每克土壤中分解尿素细菌数=（50×10 ）÷0.1=5×10 个。 4. 异常结果示例： ① 空白对照组出现菌落：说明培养基、实验器具灭菌不彻底，实验结果不可靠，需重新实验； ② 选择培养基菌落数量过多（超过300个/皿）：可能是土壤样品稀释倍数过低，菌液浓度过高，需重新稀释接种； ③ 选择培养基无菌落或菌落极少：可能是土壤样品中分解尿素细菌数量过少、稀释倍数过高，或培养基配方错误（尿素含量不足、pH不适）； ④ 菌落周围无红色区域：可能是细菌不能产生脲酶，或培养时间过短，氨产生量不足，需延长培养时间； ⑤ 培养基表面出现大量杂菌菌落：可能是无菌操作不规范（接种过程污染、实验台面未消毒），或土壤样品处理不当。
【实验结论】 1. 土壤中存在能分解尿素的细菌，这类细菌能产生脲酶，将尿素分解为氨，使培养基pH升高，酚红指示剂变红，可通过该特征鉴别目标细菌。 2. 以尿素为唯一氮源的选择培养基，能特异性筛选分解尿素的细菌，抑制不能产生脲酶的杂菌生长，可实现目标细菌的有效分离。 3. 稀释涂布平板法可用于土壤中分解尿素细菌的计数，通过梯度稀释和平行重复实验，能提高计数的准确性，计算出每克土壤中分解尿素细菌的密度。 4. 无菌操作、规范的梯度稀释和涂布接种，是实验成功的关键，杂菌污染、稀释不当、接种不规范等会严重干扰实验结果。 5. 分解尿素的细菌在土壤物质循环中具有重要作用，可将土壤中的尿素转化为氨，为植物生长提供氮源，在农业生产中具有潜在应用价值。
【注意事项】 1. 无菌操作规范（核心注意事项）： ① 实验全程需在超净工作台中进行，实验人员佩戴手套、口罩、护目镜，避免手部、呼吸道分泌物污染实验材料； ② 接种环、涂布器每次使用前和使用后，均需在酒精灯火焰上灼烧灭菌（灼烧至红热，冷却后再接种，避免高温杀死细菌）； ③ 培养基、菌液、无菌水等，均需经过高压蒸汽灭菌处理（121℃、101kPa，灭菌20分钟），避免杂菌污染； ④ 接种、涂布过程中，培养皿盖不可完全打开，仅打开一条缝隙，避免空气中的杂菌落入培养基；稀释菌液时，移液管需无菌，每稀释一次更换一支，避免交叉污染。 2. 土壤样品稀释与接种规范： ① 土壤样品需新鲜，称取时需无菌操作，避免污染；稀释过程中，振荡摇匀，确保菌液均匀分散，避免菌液浓度不均导致菌落数量差异过大； ② 稀释倍数需合理，根据土壤肥力调整，确保最终接种后菌落数在30~300个/皿，超出该范围的培养皿需舍弃，不用于计数； ③ 接种时，移液管滴加菌液体积准确（0.1mL/皿），涂布器涂布均匀，避免菌液聚集导致菌落重叠，影响统计结果；每组实验设置3个重复培养皿，确保平行重复原则，减少实验误差。 3.恒温培养规范： ① 培养温度控制在37℃（细菌最适生长温度），温度过高会杀死细菌，过低会抑制细菌繁殖，导致菌落无法形成或数量过少； ② 培养皿需倒置培养，避免培养过程中冷凝水滴落，污染培养基、破坏菌落形态； ③ 培养时间控制在18~24小时，时间过长会导致菌落重叠、形态异常，过短则菌落未形成，氨产生量不足，无法通过酚红指示剂鉴别目标细菌。 4.4. 菌落计数规范： ① 计数时，仅统计尿素选择培养基中周围出现红色区域的菌落（分解尿素的细菌），排除杂菌菌落（无红色区域、形态异常）； ② 选择菌落数在30~300个的培养皿进行统计，菌落过多时选取1/4区域统计，再换算成整个培养皿的菌落数；菌落重叠时，视为单个菌落统计，避免重复统计； ③ 计算细菌密度时，严格按照公式计算，注意稀释倍数和接种体积的准确性，避免计算错误。 5. 实验安全与环保规范： ① 土壤样品、菌液具有一定的污染性，实验过程中避免接触皮肤、黏膜，若不慎接触，需立即用大量清水冲洗； ② 实验结束后，所有接种后的培养皿、菌液、试剂等，必须经过高压蒸汽灭菌处理后再丢弃，避免细菌扩散、污染环境； ③ 实验器具灭菌后，需妥善清洗、归位，避免交叉污染，便于下次使用。 6. 实验操作误区： ① 误认为“选择培养基能鉴别分解尿素的细菌”：选择培养基的作用是筛选（保留目标细菌），酚红指示剂才是用于鉴别目标细菌的试剂； ② 忽略梯度稀释的重要性：稀释倍数过低会导致菌落过多、重叠，稀释倍数过高会导致菌落过少或无菌落，均无法准确计数； ③ 计数时包含杂菌菌落：未排除无红色区域的杂菌，会导致计数结果偏高，影响实验结论的科学性； ④ 培养基pH调节不当：pH过高或过低会抑制分解尿素细菌的生长，导致实验失败，需严格调节至7.2~7.4。
【实验讨论】 1. 实验方法的局限性与改进： 本实验仅采用稀释涂布平板法进行计数，未采用平板划线法进行分离，如何设计实验对比两种方法的分离效果？（提示：设置稀释涂布平板组和平板划线组，保持其他条件一致，对比两组菌落形态和分离效果）； 实验中仅探究了一种土壤样品中分解尿素细菌的数量，如何设计实验探究不同类型土壤（如菜园土、农田土、荒漠土）中分解尿素细菌的数量差异？（提示：选取不同类型土壤样品，采用相同的稀释倍数和接种方法，对比各组菌落数量和细菌密度）。 2. 误差原因的深度分析： 除了杂菌污染、稀释不当、接种不规范，还有哪些因素会导致实验结果异常？（提示：培养基配方错误、酚红指示剂失效、培养温度波动过大、计数方法错误），如何针对性改进？（提示：严格按照配方配制培养基，检查试剂有效性，保持培养箱温度稳定，规范计数方法）。 3. 实验原理的拓展应用： 农业生产中，如何利用分解尿素的细菌制作微生物肥料？（提示：筛选高效分解尿素的细菌菌株，扩大培养后，与载体混合制成微生物肥料，施用于农田，提高土壤中尿素的利用率，减少化肥使用）； 除了分解尿素的细菌，土壤中还有哪些能分解有机物的微生物？（提示：分解纤维素的细菌、分解纤维素的真菌等），它们的分离方法与分解尿素细菌的分离方法有哪些异同？（提示：相同点是均需使用选择培养基，不同点是选择培养基的碳源/氮源不同，需根据微生物的代谢特征调整）。
1.核心原理与操作要点汇总：
① 核心机制：分解尿素细菌产生脲酶→脲酶分解尿素为氨→培养基pH升高（酚红变红）；选择培养基（尿素为唯一氮源）筛选目标细菌→梯度稀释+涂布接种→计数→计算细菌密度；
② 实验流程：无菌处理→土壤样品梯度稀释→接种（选择培养基+对照培养基）→恒温培养（37℃、18~24h，倒置）→菌落观察、鉴别与计数→计算细菌密度；
③ 核心区分：选择培养基（筛选）≠鉴别培养基；脲酶是分解尿素细菌的关键酶，酚红指示剂用于鉴别目标细菌；
④ 关键原则：单一变量（氮源种类）、对照（空白+对照培养基）、平行重复（每组3个重复）；计数原则（菌落数30~300个/皿）；
⑤ 无菌操作：全程无菌，接种环/涂布器灼烧灭菌，培养皿倒置培养，稀释过程避免交叉污染。
【典例01】下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验的叙述，错误的是（　　）
A．实验的核心原理是分解尿素的细菌能产生脲酶，将尿素分解为氨
B．选择培养基以尿素为唯一氮源，可抑制不能产生脲酶的杂菌生长
C．涂布接种时，涂布器无需灭菌，直接涂布即可，不影响实验结果
D．计数时，选择菌落数在30~300个的培养皿进行统计，可提高计数准确性
【答案】C
【详解】A、分解尿素细菌的核心特征是能产生脲酶，脲酶可催化尿素分解为氨，A正确；B、选择培养基以尿素为唯一氮源，不能产生脲酶的杂菌无法利用尿素，生长受抑制，从而筛选出目标细菌，B正确；C、涂布器使用前需灼烧灭菌，避免携带杂菌，污染培养基和菌液，影响实验结果，C错误；D、菌落数在30~300个的培养皿，计数误差较小，可提高计数准确性，超出该范围的培养皿需舍弃，D正确。故选C。
2.实验误差与异常分析：
误差原因1：空白组出现菌落→培养基、实验器具灭菌不彻底，实验结果不可靠；
误差原因2：选择培养基菌落过多/过少→土壤样品稀释倍数不当（过低/过高）；
误差原因3：菌落周围无红色区域→培养时间过短、细菌不能产生脲酶、酚红指示剂失效；
误差原因4：杂菌过多→无菌操作不规范、土壤样品处理不当；
误差原因5：计数结果偏高→统计时包含杂菌菌落、菌落重叠时重复统计；
误差原因6：计数结果偏低→稀释倍数过高、接种量不足、培养温度不适。
【典例02】进行“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验时，发现选择培养基上菌落周围无红色区域，最可能的原因是（　　）
A．土壤样品稀释倍数过高，菌液浓度过低
B．培养时间过短，细菌产生的氨量不足
C．选择培养基中尿素含量过高，抑制细菌生长
D．涂布接种时，菌液涂布不均匀
【答案】B
【详解】A、稀释倍数过高会导致菌落过少，而非菌落周围无红色区域，A错误；B、培养时间过短，分解尿素细菌产生的脲酶量不足，尿素分解产生的氨量少，无法使培养基pH升高到8.0以上，酚红指示剂不变红，B正确；C、尿素含量过高会抑制细菌生长，导致菌落过少，而非无红色区域，C错误；D、涂布不均匀会导致菌落重叠，与菌落周围是否变红无关，D错误。故选B。
模拟题感知练
1.下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验的叙述，正确的是（　　）
A．分解尿素的细菌能产生脲酶，将尿素分解为二氧化碳和水
B．选择培养基的唯一氮源是尿素，可特异性筛选分解尿素的细菌
C．实验中可采用平板划线法进行计数，操作简便且计数准确
D．土壤样品无需稀释，直接接种到选择培养基上即可分离目标细菌
【答案】B
【详解】A、脲酶将尿素分解为氨和二氧化碳，而非水，A错误；B、选择培养基以尿素为唯一氮源，不能产生脲酶的杂菌无法生长，可特异性筛选目标细菌，B正确；C、平板划线法适合分离细菌，不适合计数，计数需采用稀释涂布平板法，C错误；D、土壤中细菌数量多，直接接种会导致菌落过多、重叠，无法分离和计数，需梯度稀释后接种，D错误。故选B。
2.下列关于实验材料和试剂作用的叙述，与本实验无关的是（　　）
A．新鲜土壤样品：提供分解尿素的细菌，肥沃土壤中目标细菌数量较多
B．尿素选择培养基：为分解尿素的细菌提供营养，同时抑制杂菌生长
C．酚红指示剂：检测培养基pH变化，鉴别分解尿素的细菌
D．龙胆紫溶液：使细菌染色体着色，便于观察细菌的形态和结构
【答案】D
【详解】A、新鲜肥沃土壤中分解尿素的细菌数量多，是实验的理想样品，与实验密切相关，A不符合题意；B、尿素选择培养基为目标细菌提供碳源、氮源等营养，同时抑制杂菌，与实验密切相关，B不符合题意；C、酚红指示剂可通过显色（变红）鉴别分解尿素的细菌，与实验密切相关，C不符合题意；D、本实验观察的是菌落形态和数量，无需观察细菌染色体，龙胆紫溶液用于染色体染色，与本实验无关，D符合题意。故选D。
3.下列关于无菌操作的叙述，错误的是（　　）
A．实验全程需在超净工作台中进行，可避免空气中的杂菌污染培养基和菌液
B．接种环每次使用前后，均需在酒精灯火焰上灼烧灭菌，冷却后再进行操作
C．土壤样品称取时无需无菌操作，只要后续接种规范，就不会影响实验结果
D．培养基、无菌水、菌液等，均需经过高压蒸汽灭菌处理，确保无菌
【答案】C
【详解】A、超净工作台可提供无菌环境，避免空气中的杂菌污染，是无菌操作的关键，A正确；B、接种环灼烧灭菌可杀死杂菌和残留细菌，冷却后使用可避免高温杀死接种的细菌，B正确；C、土壤样品称取时若不无菌操作，会携带杂菌，污染菌液和培养基，干扰实验结果，C错误；D、培养基、无菌水等经过高压蒸汽灭菌，可确保无菌，避免杂菌污染，D正确。故选C。
4.下列关于菌落观察与鉴别的叙述，错误的是（　　）
A．分解尿素的细菌菌落周围会出现红色区域，这是酚红指示剂显色的结果
B．分解尿素的细菌菌落多为圆形、边缘整齐、表面光滑，颜色为乳白色
C．杂菌菌落周围无红色区域，形态不规则、颜色异常，统计时需排除
D．菌落周围红色区域越大，说明细菌产生的脲酶活性越低，分解尿素的能力越弱
【答案】D
【详解】A、分解尿素的细菌产生的脲酶分解尿素为氨，使培养基pH升高，酚红指示剂变红，菌落周围出现红色区域，A正确；B、分解尿素的细菌菌落具有典型特征，圆形、边缘整齐、表面光滑、乳白色，B正确；C、杂菌不能产生脲酶，菌落周围无红色区域，形态和颜色异常，需排除统计，避免干扰结果，C正确；D、菌落周围红色区域越大，说明细菌产生的脲酶活性越高，分解尿素产生的氨越多，分解尿素的能力越强，D错误。故选D。
5.下列关于实验计数与计算的叙述，正确的是（　　）
A．计数时，所有培养皿中的菌落都可用于计算，无需筛选
B．若某培养皿中菌落数为25个，因少于30个，需舍弃，不用于计数
C．每克土壤中细菌数=（平均菌落数×稀释倍数）÷接种体积（0.1mL）
D．统计时，菌落重叠时，视为多个菌落统计，避免遗漏
【答案】C
【详解】A、计数时需筛选菌落数在30~300个的培养皿，超出该范围的需舍弃，避免误差过大，A错误；B、菌落数为25个，少于30个，计数误差较大，需舍弃，B正确；C、细菌密度的计算公式为：每克土壤中细菌数=（平均菌落数×稀释倍数）÷接种体积，接种体积通常为0.1mL，C正确；D、菌落重叠时，视为单个菌落统计，避免重复统计，导致计数结果偏高，D错误。故选C。
6.下列关于本实验的价值与意义，叙述错误的是（　　）
A．可直观理解选择培养基的筛选原理，掌握微生物分离与计数的方法
B．能深化对土壤微生物代谢特征的理解，认识微生物在物质循环中的作用
C．为农业生产中制作微生物肥料、提高尿素利用率提供实验依据
D．可直接观察到细菌产生脲酶的过程，验证脲酶的作用机制
【答案】D
【详解】A、实验中通过选择培养基筛选目标细菌，可直观理解筛选原理，同时掌握稀释涂布平板法计数的方法，A正确；B、通过实验可了解分解尿素细菌的代谢特征，认识其在土壤氮循环中的作用，B正确；C、筛选高效分解尿素的细菌，可用于制作微生物肥料，提高尿素利用率，减少化肥使用，C正确；D、脲酶的产生是微观过程，无法直接观察到，可通过菌落周围的红色区域间接验证脲酶的作用，D错误。故选D。
7.某小组进行“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验，下列叙述正确的是（　　）
A．稀释土壤菌液时，用蒸馏水替代无菌生理盐水，不影响实验结果
B．接种时，滴加不同稀释倍数的菌液，可在同一培养皿中接种多种稀释倍数
C．恒温培养时，温度波动在35~39℃，对细菌生长和实验结果影响较小
D．统计菌落数量时，将杂菌菌落计入统计，可提高实验结果的准确性
【答案】C
【详解】A、蒸馏水不含无机盐，会导致细菌吸水破裂，影响细菌存活，进而影响实验结果，需用无菌生理盐水稀释，A错误；B、同一培养皿中接种多种稀释倍数的菌液，会导致菌落数量混乱，无法准确计数，需一个培养皿接种一种稀释倍数的菌液，B错误；C、细菌最适生长温度为37℃，温度波动在35~39℃，对细菌繁殖影响较小，实验结果较稳定，C正确；D、杂菌菌落会导致计数结果偏高，干扰实验结论，需排除杂菌菌落，D错误。故选C。
8.平板接种常用在微生物培养中。下列说法正确的是（ ）
A．不含氮源的平板不能用于微生物培养
B．平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒
C．接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃
D．利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物
【答案】D
【详解】A、不含氮源的平板可用于固氮菌的培养，A错误；
B、平板涂布时涂布器使用前必须浸在酒精中，然后在火焰上灼烧灭菌，这种操作属于灭菌，不属于消毒，B错误；
C、使用后的培养基即使未长出菌落也要在丢弃前进行灭菌处理，不能直接丢弃，以免污染环境，C错误；
D、脲酶可以催化尿素分解，在以尿素为唯一氮源的平板上，能合成脲酶的微生物可以分解尿素获得氮源而进行生长繁殖，但是不能合成脲酶的微生物因缺乏氮源而无法生长，因此以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物，D正确。
9.下列是某同学分离高产脲酶菌的实验设计，不合理的是（ ）
A．选择农田或公园土壤作为样品分离目的菌株
B．在选择培养基中需添加尿素作为唯一氮源
C．适当稀释样品是为了在平板上形成单菌落
D．可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌
【答案】D
【详解】A、农田或公园土壤中含有较多的含脲酶的微生物，A正确；
B、为了筛选可分解尿素的细菌，配制的培养基应选择尿素作为唯一氮源，含脲酶的微生物在该培养基上能生长，B正确；
C、当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，C正确；
D、在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红，因此在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，能对分离的菌种做进一步鉴定，D错误。
10.黄酒源于中国，与啤酒、葡萄酒并称世界三大发酵酒。发酵酒的酿造过程中除了产生乙醇外，也产生不利于人体健康的氨基甲酸乙酯（EC）。EC主要由尿素与乙醇反应形成，各国对酒中的EC含量有严格的限量标准。回答下列问题:
(1)某黄酒酿制工艺流程如图所示，图中加入的菌种a是 ，工艺b是 （填“消毒”或“灭菌”），采用工艺b的目的是 。
(2)以尿素为唯一氮源的培养基中加入 指示剂，根据颜色变化，可以初步鉴定分解尿素的细菌。尿素分解菌产生的脲酶可用于降解黄酒中的尿素，脲酶固定化后稳定性和利用效率提高，固定化方法有 （答出两种即可）。
(3)研究人员利用脲酶基因构建基因工程菌L，在不同条件下分批发酵生产脲酶，结果如图所示。推测 是决定工程菌L高脲酶活力的关键因素，理由是 。
(4)某公司开发了一种新的黄酒产品，发现EC含量超标。简要写出利用微生物降低该黄酒中EC含量的思路 。
【答案】(1) 酵母菌 消毒
目的是杀死啤酒的中大多数微生物，并延长其保存期
(2) 酚红 化学结合法、包埋法、物理吸附法
(3) pH 两图中脲酶活力随时间变化的曲线基本一致，而维持pH在6.5不变与pH从6.5降为4.5相比较而言，酶活力值始终要高
(4)方案一：配置一种选择培养基，筛选出产生EC降解酶的细菌，从细菌中分离得到EC降解酶，纯化的EC降解酶进行固定化操作后，加入该黄酒中。
方案二：配置一种选择培养基，筛选出产生脲酶的细菌，从细菌中分离得到脲酶，纯化的脲酶进行固定化操作后，在黄酒工艺流程的发酵环节中加入。
【详解】（1）制造果酒利用的是酵母菌的无氧呼吸，加入的菌种a是酵母菌。过滤能除去啤酒中部分微生物，工艺b是消毒，目的是杀死啤酒的中大多数微生物，并延长其保存期。
（2）由于细菌分解尿素的过程中合成脲酶，脲酶将尿素分解成氨，会使培养基碱性增强，pH升高，所以可以用检测pH的变化的方法来判断尿素是否被分解，故在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂可以鉴别尿素分解菌。固定化酶实质上是将相应酶固定在不溶于水的载体上，实现酶的反复利用，并提高酶稳定性，酶的各项特性（如高效性、专一性和作用条件的温和性）依然保持。固定化酶的方法包括化学结合法、包埋法、物理吸附法等。
（3）对比两坐标曲线，两图中脲酶活力随时间变化的曲线基本一致，说明培养时间不是决定因素；而维持pH在6.5不变与pH从6.5降为4.5相比较而言，酶活力值始终要高，说明pH为6.5时，有利于酶结构的稳定，故pH是决定工程菌L高脲酶活力的关键因素。
（4）从坐标图形看，利用脲酶消除其前体物质尿素可降低该黄酒中EC含量。配置一种选择培养基，筛选出产生EC降解酶的细菌，从细菌中分离得到EC降解酶，纯化的EC降解酶进行固定化操作后，加入该黄酒中。或者配置一种选择培养基，筛选出产生脲酶的细菌，从细菌中分离得到脲酶，纯化的脲酶进行固定化操作后，在黄酒工艺流程的发酵环节中加入。
11．如下图为研究人员从红棕壤中筛选高效分解尿素细菌的意图，有关叙述不正确的是（ ）
A．步骤③纯化分解尿素的细菌的原理是将聚集的细菌分散，以获得单细胞形成的菌落
B．配制步骤②、③的培养基都要进行严格灭菌
C．步骤④挑取③中不同种的菌落分别接种，比较细菌分解尿素的能力
D．步骤③采用涂布平板法接种，并需向牛肉膏蛋白胨培养基中加入尿素
【答案】D
【分析】从红棕壤中筛选高效分解尿素细菌过程：（1）利用红棕壤和无菌水制备红棕壤浸出液；（2）取上清液2mL放在选择培养基中培养；（3）可用移液器取1mL菌液放在以尿素为唯一氮源的培养基中进行分离单菌落，筛选、纯化分解尿素的细菌；（4）挑选单菌落接种于尿素液体培养基，进行鉴定分解尿素的能力。
【详解】A、以尿素为唯一氮源的培养基，利用涂布分离法将聚集的细菌分散，以获得单细胞形成的菌落是纯化分解尿素的细菌的原理，A正确；
B、配制步骤②、③的培养基时，为防止杂菌污染，应进行严格灭菌，B正确；
C、经过③筛选、纯化分解尿素的细菌，但不同菌分解尿素的能力不同，因此需要挑取③中的不同种的菌落接种于④中，比较细菌分解尿素的能力，C正确；
D、要筛选出能高效分解尿素的细菌，所选用的培养基要以尿素为唯一氮源，但牛肉膏和蛋白胨中都含有氮源，因此步骤③所用的培养基中不能含有牛肉膏、蛋白胨，D错误。
故选D。
12.阅读下列材料，回答下列题。
当培养基以尿素为唯一氮源时，只有能分泌脲酶的微生物才能在该培养基中生长，利用这种培养基就可分离出土壤中能产生脲酶的微生物。微生物利用脲酶分解尿素产生的氨会使培养基的碱性增强，使培养基中的酚红指示剂呈红色，根据菌落周围是否出现红色区域，就可进一步鉴定尿素分解菌。
(1)尿素分解菌能在只有尿素作为氮源的尿素固体培养基中生长，其直接利用的氮源是（ ）
A．尿素 B．氨 C．脲酶 D．蛋白胨
(2)在进行“能分解尿素的微生物的分离与计数”活动时，用来判断培养基是否发挥选择作用的对照组是（ ）
A．未接种的选择培养基 B．已接种的选择培养基
C．未接种的全营养培养基 D．已接种的全营养培养基
【答案】(1)．B (2)．D
(1)题干信息：能分泌脲酶的微生物利用脲酶分解尿素产生的氨，故尿素分解菌能在只有尿素作为氮源的尿素固体培养基中生长，其直接利用的氮源是氨，ACD错误，B正确。
故选B。
(2)实验遵循单一变量和对照原则，实验：进行“能分解尿素的微生物的分离与计数”活动，该实验使用的培养基是选择培养基，故用来判断培养基是否发挥选择作用的对照组是已接种的全营养培养基，ABC错误，D正确。
13．幽门螺杆菌(含有脲酶)感染是急慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因素。在患者体内采集样本并制成菌液后，进行分离培养。下列有关叙述正确的是（ ）
A．分离纯化幽门螺杆菌时应使用以尿素为唯一氮源、pH为中性的培养基
B．进行幽门螺杆菌培养需要提供95%空气和5%CO2的气体环境
C．可采用稀释涂布平板法对幽门螺杆菌进行分离和计数
D．鉴别幽门螺杆菌时应在培养基中加入酚红指示剂
【答案】ACD
【详解】A、幽门螺杆菌可以合成脲酶，可以利用尿素，所以分离纯化幽门螺杆菌时应使用以尿素为唯一氮源的培养基，幽门螺杆菌属于细菌，培养时可将培养基pH调至中性，A正确；
B、需要提供95%空气（含有氧气，利于细胞进行呼吸）和5%CO2（维持培养液的pH）的气体环境进行培养的是动物细胞而非幽门螺杆菌（在培养基中培养而非培养液），B错误；
C、稀释涂布平板法可以用于微生物的分离和计数，因此对幽门螺杆菌进行分离和计数可采用稀释涂布平板法，C正确；
D、由于幽门螺杆菌在分解尿素的过程中会合成脲酶，脲酶将尿素分解成氨，使培养基碱性增强，pH升高，所以可以用检测pH的变化的方法来判断尿素是否被分解，即在培养基中加入酚红指示剂，尿素被分解后产生氨，pH升高，则该菌落周围会出现红色环带，故鉴别幽门螺杆菌时应在培养基中加入酚红指示剂，D正确。
14．为了分离和纯化高效分解石油的细菌，科研人员利用被石油污染过的土壤进行下图A所示的实验。同学甲进行步骤④的操作，其中一个平板经培养后的菌落分布如图B所示。同学乙也按照同学甲的接种方法进行了步骤④的操作：将1mL样品稀释100倍，在5个培养基平板上分别接入0.1mL稀释液，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，无菌落产生。下列叙述正确的是（ ）

A．乙同学计算得出每升样品中的活菌数约为3.3×108个
B．步骤③与步骤②中培养基成分的最大区别是步骤③的培养基中石油是唯一碳源
C．步骤④甲同学出现图B结果可能的操作失误是样品的稀释程度太低导致
D．步骤⑤后取样测定石油含量的目的是筛选出能分解石油的细菌
【答案】B
【详解】A、乙同学实验平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191，数据之间差值过大，应分析误差产生的原因，重新进行实验，不能这些数值去计算，A错误；
B、该实验的目的是为了分离和纯化高效分解石油的细菌，因此步骤③是以石油是唯一碳源的选择培养基，与步骤②中培养基成分相比，最大的区别是石油是唯一碳源，B正确；
C、步骤④甲同学出现图B结果是菌落分布不均匀，可能的操作失误是用涂布器涂布平板时涂布不均导致，C错误；
D、步骤⑤后取样测定石油含量的目的是筛选出能高效分解石油的细菌，D错误。
故选B。
15．自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是有关土壤中分解尿素的细菌分离和计数的实验过程，请回答有关问题。
(1)为分离出土壤中分解尿素的细菌，应该用 的培养基进行分离。
(2)若取土样6g，应加入 mL的无菌水配制成稀释10倍土壤溶液。因土壤中细菌密度很大，需要不断加以稀释，配制成101～107不同浓度的土壤溶液。将103～107倍的稀释液分别吸取0.2mL加入到固体培养基上，用涂布器将菌液铺平，每个稀释度下至少涂布3个平板。将接种的培养皿放置在37℃恒温培养箱中培养24h～48h，观察并统计菌落数，结果如下表，其中 倍的稀释比较合适，由此计算出每克土壤中的菌落数为 。
稀释倍数 103 104 105 106 107
菌落数 （个） 1号平板 478 367 270 26 5
2号平板 496 354 264 20 8
3号平板 509 332 252 29 3
(3)若研究尿素分解菌的群体生长规律，可采用平板划线法分离土壤中的尿素分解菌。操作时，接种环通过灼烧灭菌，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线。这样做的目的是 。将分离纯化后的单个菌落进行液体培养，可采用定期取样的方法进行计数。若以一个大方格（体积为0.1mm3）有25个中方格的计数板为例进行计算，设五个中方格中总菌数为50，菌液稀释倍数为102，那么原菌液的菌群密度为 个/mL。
【答案】(1)尿素作为唯一的氮源
(2) 54 105 1.31×108
(3) 将聚集的菌体逐步稀释以便获得（不连续）单个菌落 2.5×108
【分析】筛选尿素分解菌需要使用尿素为唯一的氮源的选择培养基，尿素分解菌可以使用酚红指示剂进行鉴定；稀释涂布平板法接种可以用来进行微生物的计数；利用稀释涂布平板发估算样品中活菌数时，往往选择菌落数在30-300之间的平板。
【详解】（1）为了纯化分解尿素的细菌，需要抑制其他杂菌的生长，所以需要使用尿素作为唯一氮源的培养基进行分离培养。
（2）将土壤稀释10倍是指土壤占混合液的10%，所以土壤溶液总量应为60ml，故需要添加54ml的无菌水；估算样品中活菌数时，往往选择菌落数在30-300之间的平板，所以稀释倍数为105时效果最佳；每克土壤中的菌落数需先算出三个平板的平均数，再除以滴加量，最后乘稀释倍数，（270+264+252）÷3÷0.2×105=1.31×108。
（3）利用平板划线法分离土壤中的尿素分解菌时，接种环通过灼烧灭菌，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线，这样做每次重新画线菌的数量都会在原有基础上下降，越来越少，最终将聚集的菌体逐步稀释以便获得（不连续）单个菌落；
若以一个大方格（体积为0.1mm3）有25个中方格的计数板为例进行计算，设五个中方格中总菌数为50，菌液稀释倍数为102，那么原菌液的菌群密度为50×5÷0.1×103×102=2.5×108个/mL。
16．尿素[CO(NH2)2]是有机态氮肥，只有在被土壤中的微生物分解后，才能被农作物吸收和利用。某兴趣小组试图从土壤中分离能分解尿素的细菌，相关流程如图所示。回答下列问题：
(1)为了分离得到尿素分解菌，需要配制培养基，培养基中加入的尿素能为微生物提供的营养成分是 。
(2)配制好的培养基，采用 法进行灭菌，待平板冷却凝固后需要将平板 （填放置方式），这样做的目的是 （答出1点）。
(3)据图分析，该兴趣小组设置了三个培养皿进行接种，所采用的接种方法是 ，培养一段时间后，经过统计，在培养基表面分别形成了51、42、45个菌落，据此计算，1g土壤样品中约有分解尿素的细菌 个。
(4)从土壤中分离尿素分解菌的相关流程都应注意 操作，以防影响实验结果。
【答案】(1)碳源和氮源
(2) 高压蒸汽灭菌 倒置 避免培养基表面的水分过快地蒸发；防止皿盖上的冷凝水珠落入培养基，造成污染
(3) 稀释涂布平板法 4.6×108
(4)无菌/防止杂菌污染
【详解】（1）各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求，能为微生物提供的营养成分是碳源和氮源。
（2）培养基一般采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。为了避免培养基表面的水分过快地蒸发，防止皿盖上的冷凝水珠落入培养基，造成污染，待平板冷却凝固后需要将平板倒置。
（3）据图分析，该兴趣小组设置了三个培养皿进行接种，且需要计数，所采用的接种方法是稀释涂布平板法。取lg土壤，按如图稀释后，在三个平板上分别接入0.1ml稀释液后，经适当培养后，3个平板上的菌落数分别是51、42、45个，根据计算公式：每克样品中的菌株数=（C÷V)×M计算，因此1g土壤样品中约有分解尿素的细菌=（51+42+45）/3÷0.1×106=4.6×108个。
（4）从土壤中分离尿素分解菌的相关流程都应注意无菌或防止杂菌污染操作，以防影响实验结果。
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