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第3章 基因工程
第3节 基因工程的应用
知识一 基因工程在农牧业方面的应用
1．转基因抗虫植物
(1)技术方法：从某些生物中分离出具有抗虫功能的基因，将它导入作物中，培育出具有抗虫性的作物。
(2)实例：抗虫棉花、玉米、大豆、水稻和马铃薯等。
2．转基因抗病植物
(1)技术方法：将来源于病毒、真菌等的抗病基因导入植物中，培育出转基因抗病植物。
(2)实例：转基因抗病毒甜椒、番木瓜和烟草等。
3．转基因抗除草剂植物
(1)技术方法：将降解或抵抗某种除草剂的基因导入作物，可培育抗除草剂的作物品种。
(2)实例：转基因抗除草剂玉米、大豆、油菜和甜菜等。
4．改良植物的品质
(1)技术方法：将必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因导入植物中，可以提高这种氨基酸的含量。
(2)实例：赖氨酸含量比对照高30%的转基因玉米、呈现出自然界没有的_颜色变异_的转基因矮牵牛。
5．提高动物的生长速率
(1)技术方法：将外源生长激素基因导入动物体内，提高动物的生长速率。
(2)实例：转基因鲤鱼。（将外源生长激素基因导入动物体内，在其体内合成大量的生长激素，可以使转基因动物生长得_更快_。）
6．改善畜产品的品质
(1)技术方法：将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组。
(2)实例：乳汁中乳糖含量大大降低的转基因奶牛。（将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组乳糖酶―→乳糖分解―→乳汁中的乳糖含量大大降低，其他_营养成分_不受影响，乳汁品质改善。）
[例1]将控制甜菜碱、海藻糖等有机小分子合成的基因转入双子叶植物烟草细胞中，会使烟草的抗旱性增强。下列关于这类转基因烟草及其培育过程的说法，错误的是(　　)
A.转基因烟草细胞中甜菜碱等有机小分子的合成量增加
B.转基因烟草细胞细胞液渗透压升高，可避免细胞过度失水
C.将抗旱基因导入烟草细胞中常用农杆菌转化法
D.可以在干旱条件下筛选出成功导入抗旱基因的烟草细胞
【答案】D
【详解】AB、将控制甜菜碱、海藻糖等有机小分子合成的基因转入烟草细胞中后，细胞中甜菜碱等有机小分子的合成量增加，会使转基因烟草细胞细胞液的渗透压升高，避免细胞过度失水，因此会使烟草的抗旱性增强，A、B正确；
C、将目的基因导入双子叶植物细胞常用农杆菌转化法，C正确；
D、在干旱条件下筛选出的是成功导入并表达抗旱基因的烟草植株，而不是成功导入抗旱基因的烟草细胞，D错误。
故选D。
[例2]下列有关目的基因的操作，能改善产品品质的是（ ）
A．将草鱼的生长激素基因导入鲤鱼体内
B．将人血清白蛋白的基因改造后在山羊的乳腺中表达
C．将肠乳糖酶的基因导入奶牛的基因组
D．将Bt抗虫蛋白基因整合到烟草或棉花的基因组并实现表达
【答案】C
【详解】A、将草鱼的生长激素基因导入鲤鱼体内，这能提高动物的生长速度，不能改善产品品质，A错误；
B、将人血清白蛋白的基因改造后在山羊的乳腺中表达，这能生产药物，但不能改善产品品质，B错误；
C、将肠乳糖酶的基因导入奶牛的基因组，这会导致牛奶中没有乳糖，进而改善畜产品的品质，C正确；
D、将Bt基因整合到烟草或棉花的基因组并实现表达，这可培育抗虫转基因植物，但不能改善产品品质，D错误。
故选C。
知识二 基因工程在医药卫生领域的应用
1．基因工程在医药卫生领域的应用
（1）对微生物或动植物的细胞进行基因改造
目的：使它们能够生产药物。
药物种类：细胞因子、抗体、疫苗和激素等。
（2）让哺乳动物批量生产药物——乳腺生物反应器或乳房生物反应器
措施：将药用蛋白基因与乳腺中特异性表达的基因的启动子等调控元件重组在一起。
受体细胞：动物的受精卵。
导入方法：显微注射法。
（3）建立移植器官工厂
在器官供体的基因组中导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因，再结合克隆技术，培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆动物器官。
2．基因工程在食品工业方面的应用
技术方法 利用基因工程菌生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。例如将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌、黑曲霉或酵母菌的基因组中，再通过工业发酵批量生产凝乳酶
实例 凝乳酶、淀粉酶、脂肪酶、天冬氨酸和苯丙氨酸
[例1]我国科学家将含有人凝血因子基因的DNA片段注射到羊的受精卵中，由该受精卵发育而成的羊分泌的乳汁中含有人的凝血因子，可以治疗血友病。下列叙述错误的是（ ）
A．凝血因子基因与乳腺蛋白基因的启动子重组在一起
B．该羊分泌的乳汁中含有人的凝血因子基因
C．该羊被称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器
D．这项研究说明人和羊共用一套遗传密码
【答案】B
【详解】A、科学家将人凝血因子基因与乳腺蛋白基因的启动子连接在一起，从而使人凝血因子基因只在乳腺细胞中特异表达，进而使羊分泌的乳汁中含有人的凝血因子，A正确；
B、该羊分泌的乳汁中含有人的凝血因子，但不含人的凝血因子基因，B错误；
C、由于人凝血因子只存在于该转基因羊的乳汁中，因此该转基因山羊称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器，C正确；
D、由该受精卵发育而成的羊能表达人的凝血因子基因，说明人和羊共用一套遗传密码，D正确。
故选B。
[例2]下列关于用转基因动物作器官移植供体的研究的叙述，不正确的是（　　）
A．器官短缺和免疫排斥是目前制约人体器官移植的两大难题
B．猪的内脏构造、大小和血管分布与人极为相似
C．灵长类动物体内隐藏的、可导致人类疾病的病毒少于猪
D．无论以哪种动物作为供体，都需要在其基因组中导入某种调节因子以抑制抗原决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因
【答案】C
【详解】A、人体移植器官短缺是一个世界性难题，要实现器官移植时，最大难题是免疫排斥，A正确；
B、由于猪的内脏构造、大小和血管分布与人极为相似，所以人类将解决器官短缺问题的目光集中在小型猪的身上，B正确；
C、猪体内隐藏的、可导致人类疾病的病毒远远少于灵长类动物，C错误；
D、无论哪种动物作为供体，都需要将器官供体基因组导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因，再结合克隆技术，培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆器官，D正确。
故选C。
难点知识一 基因工程在医药卫生领域的应用
1．工程菌生产药物（以生产干扰素为例）
(1)干扰素的作用
干扰素是动物或人体细胞受到病毒侵染后产生的一种细胞因子，是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，在临床上常作为抗病毒的特效药，如用于乙肝、丙肝的治疗。
(2)干扰素的生产过程
2．生物反应器（以乳腺生物反应器为例）
(1)乳腺(房)生物反应器
科学家将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中，由这个受精卵发育成的转基因动物在进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁来生产所需要的药物。
(2)过程
(3)成果
目前，科学家已在牛、山羊等动物乳腺(房)生物反应器中获得了抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素和α 抗胰蛋白酶等重要的医药产品。
(4)优点和不足
优点：产量高、质量好、成本低、易提取。
不足：只有雌性哺乳动物进入泌乳期后才能分泌乳汁，受性别和年龄的限制。
(5)其他生物反应器
膀胱生物反应器是外源基因在膀胱上皮细胞中表达的转基因动物，有着和乳腺生物反应器一样的优点：更易收集产物蛋白，且不对动物造成伤害 。此外，膀胱生物反应器可以从一出生就收集产物，不受动物的性别和年龄的限制，且从动物的尿液中提取产物比从乳汁中提取更简便。　　　　　　　　　　　　　
3．工程菌生产药物与乳腺生物反应器比较
项目 乳腺生物反应器 工程菌生产药物
基因结构 动物基因的结构与人类基因的结构基本相同 细菌或酵母菌等生物的基因结构与人类的基因结构有较大差异
基因产物 与天然蛋白质完全相同 细菌细胞内缺少内质网、高尔基体等细胞器，合成的蛋白质可能不具有生物活性
受体细胞 动物的受精卵 微生物细胞
导入目的基因的方法 显微注射法 Ca+处理法
生产条件 不严格灭菌，温度等外界条件对其影响不大 需严格灭菌，严格控制工程菌所需要的温度、pH、营养物质浓度等外界条件
产物提取 从动物乳汁中提取，相对简单 从微生物细胞中提取，相对复杂
讨论1：为了生产药物，常把药用蛋白基因构建的表达载体导入大肠杆菌或酵母菌细胞中构建工程菌，选用细菌或酵母菌作为受体细胞的优点有哪些？
细菌和酵母菌繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对少，生产能力大等。
讨论2：乳腺生物反应器指的是转基因动物的乳腺吗？
不是，乳腺生物反应器指的就是这个转基因生物。
讨论3：研制膀胱生物反应器时，应如何处理目的基因？
将目的基因与膀胱上皮细胞中特异表达的基因的启动子重组。
讨论4：膀胱生物反应器与乳腺生物反应器有什么相同和不同点？
相同点是收集药用蛋白较容易，且不会对动物造成伤害。不同点是乳腺生物反应器必须是处于生殖期的雌性动物才可生产药用蛋白，而膀胱生物反应器则是任何生长期的雌雄动物均可生产。
巩固训练1
某实验小组将人生长激素基因导入大肠杆菌以制备工程菌，下列相关叙述错误的是(　　)
A．人生长激素基因可以以下丘脑细胞的mRNA为模板通过逆转录获得
B．将人的生长激素基因导入大肠杆菌，需要处理得到能吸收周围环境中DNA分子的细胞
C．利用基因工程菌制备的生长激素需要与天然产品的功能进行活性比较
D．与人细胞分泌的天然生长激素相比，基因工程菌无法对生长激素进行进一步加工和修饰
【答案】A
【详解】A、人生长激素基因在垂体细胞中表达，在下丘脑细胞中不表达，因此下丘脑细胞中没有生长激素基因转录出的mRNA，A错误；
B、将人的生长激素基因导入大肠杆菌，常用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，B正确；
C、利用基因工程菌制备的生长激素需要与天然产品的功能进行活性比较，以确定转基因产品的功能活性是否与天然产品相同，C正确；
D、大肠杆菌为原核生物，无内质网和高尔基体，因此无法对生长激素进行进一步加工和修饰，D正确。
故选A。
巩固训练2
采用基因工程技术培育转基因羊作为乳腺生物反应器，使其能合成人凝血因子且只存在于乳汁中。下列有关叙述，不正确的是（　　）
A．将人凝血因子基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件结合在一起构建成基因表达载B．将含有人凝血因子基因的表达载体导入羊乳腺细胞中即可获得乳腺生物反应器
C．该转基因羊产生的生殖细胞中可能会含有人凝血因子基因
D．与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受性别等限制，受体来源更广泛
【答案】B
【详解】AB、将人凝血因子基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件结合在一起构建成基因表达载体，再通过显微注射技术将含有人凝血因子基因的表达载体导入羊受精卵中，A正确，B错误；
C、培育该转基因羊的受体细胞为受精卵，故其产生的生殖细胞中可能会含有人凝血因子基因，C正确；
D、与乳腺生物反应器（只能选雌性）相比，膀胱生物反应器不受性别等限制，受体来源更广泛，D正确。
故选B。
一、选择题
1．下列有关基因工程应用的叙述，错误的是(　　)
A．动物基因工程技术主要用于提高动物的生长速度
B．利用转基因技术生产的药物已经有很多种，如抗体、疫苗、激素等
C．基因治疗是治疗遗传病最有效的手段，治疗后产生的变异一般是不可遗传的
D．利用植物基因工程提高农作物抗虫能力时所用杀虫基因可以是Bt毒蛋白基因
【答案】A
【详解】A、动物基因工程技术主要用于动物品种改良、建立生物反应器、器官移植等，提高动物的生长速度仅是其中的一个应用，A错误；
B、利用转基因技术可生产如抗体、疫苗、激素等多种药物，B正确；
C、基因治疗是治疗遗传病最有效的手段，治疗后产生的变异一般是不可遗传的，C正确；
D、植物抗虫基因有Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等，提高农作物抗虫能力时所用杀虫基因可以是Bt毒蛋白基因，D正确。
故选A。
2．通过基因工程技术，可以将抗草甘膦基因导入大豆，培育出抗除草剂作物。下列相关叙述，错误的是（ ）
A．构建基因表达载体时要用到耐高温的DNA聚合酶和DNA连接酶
B．可以用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞
C．培育过程需要借助植物组织培养技术
D．需要在个体水平上对目的基因进行检测和鉴定
【答案】A
【详解】A、构建基因表达载体不需要耐高温的DNA聚合酶，需要的是限制性内切核酸酶和DNA连接酶，A错误；
B、可以用农杆菌转化法将目的基因导入受体植物细胞，B正确；
C、培育出抗除草剂作物培育过程需要借助植物组织培养技术，C正确；
D、在培育过程中需要在个体水平上对目的基因进行检测和鉴定，D正确。
故选A。
3．SOD是一种抗氧化酶，它能将O转化成H2O2，增强植物的抗逆性。如图为培育农作物新品种的一种方式。以下叙述正确的是(　　)
A．过程①可以用动物病毒作为载体
B．从该农作物新品种的细胞中检测出了SOD基因，说明该基因工程成功了
C．新品种的获得属于可遗传的变异，可能将抗逆性状遗传给子代
D．基因工程又叫重组DNA技术，所用工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体
【答案】C
【详解】A、病毒的寄生具有专一性，所以过程①不能用动物病毒作为载体，A错误；
B、从该农作物新品种的细胞中检测出具有活性的SOD才能说明该基因工程成功了，B错误；
C、新品种的遗传物质发生了改变，属于可遗传的变异，抗逆性状可通过基因的传递遗传给子代，C正确；
D、载体通常有质粒、动植物病毒和噬菌体，不是工具酶，D错误。
故选C。
4．科学家在河南华溪蟹中找到了金属硫蛋白基因，并以质粒为载体，采用转基因方法培育出了硫吸收能力极强的转基因烟草。下列有关该烟草培育的说法正确的是(　　)
A．金属硫蛋白基因需插入到质粒上，才能转移到受体细胞中
B．需用特定的限制酶切割烟草的核酸
C．同种限制酶既可以切割含目的基因的DNA片段又可以切割质粒，因此不具有专一性
D．转基因烟草与原烟草相比基因组成发生了变化，导致两者出现生殖隔离
【答案】A
【详解】A、目的基因需要通过载体才能进入受体细胞，且在受体细胞中稳定存在和表达，A正确；
B、在基因工程中，需用特定的限制酶切割目的基因和载体，而不是切割烟草的核酸，B错误；
C、限制酶具有专一性，能识别特定的脱氧核苷酸序列，C错误；
D、转基因烟草与原烟草之间一般不会出现生殖隔离，D错误。
故选A。
5．科学家利用基因工程培育出了能产生乙肝病毒蛋白质的西红柿，被称之为“西红柿乙肝疫苗”。具体操作是：将乙肝抗原基因M导入农杆菌，然后利用农杆菌将M导入西红柿细胞。实验显示小白鼠连续五周吃这样的西红柿，体内产生了抗乙肝病毒的抗体，下列叙述错误的(　　)
A．实验用PCR技术对M基因进行扩增，需要两种引物
B．含M的重组Ti质粒必须插入到西红柿染色体DNA上
C．即使M在西红柿中成功表达，也要做个体生物学水平鉴定
D．西红柿乙肝疫苗成本相对较低且易于储存
【答案】B
【详解】A、导入目的基因前需要对M基因扩增，PCR需要两种引物结合M基因的两条链合成相应子链，A正确；
B、含M的T-DNA插入到西红柿染色体DNA上，才能稳定存在和表达，而不是整个Ti质粒，B错误；
C、即使M在西红柿中成功表达，也必须在个体生物学水平鉴定，来确定实际效果，C正确；
D、西红柿种植容易，成本低且易储存，D正确。
故选B。
6．八氢番茄红素合酶(其基因用psy表示)和胡萝卜素脱饱和酶(其基因用crtI表示)参与β-胡萝卜素合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtI基因转入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡萝卜素，由此生产出的大米称为“黄金大米”。下列有关叙述错误的是(　　)
A．psy和crtI基因是该项研究中的目的基因
B．以pmi基因作为标记基因便于筛选出导入目的基因的受体细胞
C．检测出水稻中含八氢番茄红素合酶和胡萝卜素脱饱和酶，即表明转基因水稻培育成功
D．可设法将重组载体导入水稻细胞
【答案】C
【详解】A、科学家将psy和crtI基因转入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡萝卜素，显然psy和crtI是该项研究中的目的基因，A正确；
B、由题干信息可知，pmi编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长，因此构建基因表达载体时可用pmi基因作为标记基因，B正确；
C、检测出水稻胚乳细胞中含有β-胡萝卜素，才能说明“黄金大米”培育成功，仅含有八氢番茄红素合酶和胡萝卜素脱饱和酶不能说明转基因水稻培育成功，C错误；
D、在培育“黄金大米”的转基因操作中可将水稻细胞作为受体细胞，然后通过植物组织培养获得转基因植株，因此，可设法将重组载体导入水稻细胞，D正确。
故选C。
7．盐碱胁迫下植物应激反应产生的H2O2对细胞有毒害作用。禾本科农作物AT1蛋白通过调节细胞膜上PIP2s蛋白磷酸化水平，影响H2O2的跨膜转运，如图所示。下列叙述错误的是(　　)
A．细胞膜上PIP2s蛋白高磷酸化水平是其提高H2O2外排能力所必需的
B．PIP2s蛋白磷酸化被抑制，促进H2O2外排，从而减轻其对细胞的毒害
C．敲除AT1基因从而去除禾本科农作物的AT1蛋白可提高其耐盐碱能力
D．从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因是改良农作物抗逆性的有效途径
【答案】B
【详解】A、由题图右侧的信息可知，AT1蛋白缺陷，可以促进PIP2s蛋白的磷酸化，进而促进H2O2排出膜外，A正确；
B、据题图左侧的信息可知，AT1蛋白能够抑制PIP2s蛋白的磷酸化，减少了H2O2从细胞内输出到细胞外的量，导致抗氧化胁迫能力弱，不能减轻其对细胞的毒害，B错误；
C、AT1蛋白缺陷，可以促进PIP2s蛋白的磷酸化，进而促进H2O2排出膜外，敲除AT1基因或降低其表达，可提高禾本科农作物抗氧化胁迫的能力，进而提高其成活率，C正确；
D、从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因，可通过基因工程技术改良农作物抗逆性，D正确。
故选B。
8．国家生猪种业工程技术研究中心科研团队在转基因猪生物反应器领域取得重要研究进展。在国际上首次利用转基因猪的唾液腺作为生物反应器，高效合成一种对人的神经性疾病具有良好治疗作用的蛋白——人神经生长因子(hNGF)。生产流程如图所示。下列相关说法错误的是(　　)
A．可用人hNGF基因与猪成纤维细胞A中唾液淀粉酶基因的启动子等元件构建基因表达载体
B．重构胚具有发育成个体的潜能，移植到代孕猪C体内无须任何操作便可进行分裂和发育
C．猪卵细胞B需要在体外培养到MⅡ期后通过显微操作去核
D．唾液腺生物反应器与乳腺生物反应器相比具有不受性别限制等特点
【答案】B
【详解】A、用猪成纤维细胞A 中唾液淀粉酶基因的启动子与人hNGF基因构建基因表达载体，能使目的基因在唾液腺细胞中表达，A正确；
B、重构胚需要用物理或化学方法激活后才可进行分裂和发育，B错误；
C、卵细胞需要培养到减数分裂Ⅱ中期去核，C正确；
D、乳腺生物反应器只能是雌性动物，唾液腺生物反应器可以不受性别的限制，D正确。
故选B。
9．2022年1月7日，马兰里医学中心成功将猪心脏移植到一名57岁的心脏病患者身上，虽然这颗心脏仅仅存活了2个月时间，但仍然为异种器官移植的可行性提供了可观的数据。为了减低免疫排斥反应，研究者借助CRISPR/Cas9技术对移植的猪心脏进行了基因编辑。CRISPR/Cas9系统主要由向导RNA(sgRNA)和Cas9蛋白两部分组成，sgRNA可引导Cas9蛋白到特定基因位点进行切割，其机制如图所示。下列说法正确的是(　　)
A．sgRNA通过碱基互补配对原则识别目标DNA分子，Cas9蛋白的功能与DNA连接酶相似
B．若要利用CRISPR/Cas9技术将一个基因从目标DNA分子上去除，通常需设计两个序列不同的sgRNA
C．CRISPR/Cas9技术编辑基因有时会因sgRNA错误结合而出现“脱靶”现象，一般sgRNA序列越短，脱靶率越低
D．接受器官移植的受体往往需服用免疫抑制剂来防止出现过敏现象
【答案】B
【详解】A、“sgRNA可引导Cas9蛋白到特定基因位点进行切割”，说明Cas9蛋白的功能与限制酶相似，A错误；
B、据图可知，一个CRISPR/Cas9系统只能在DNA分子上切开一个切口，去除一个基因需在该基因两端各有一个切口，需要设计两个CRISPR/Cas9系统，其sgRNA的序列不同，B正确；
C、sgRNA序列越短，DNA分子上与其互补的特定序列会越多，错误结合概率越高，脱靶率越高，C错误；
D、免疫抑制剂是降低免疫功能，减轻免疫排斥，不是防止出现过敏，D错误。
故选B。
10．如图表示利用基因工程技术生产人血清白蛋白的两条途径，下列有关叙述正确的是（ ）
A．分子运输车-载体的组成包括目的基因、标记基因、启动密码、终止密码等
B．扩增目的基因时，利用耐高温的DNA连接酶从引物a和引物b起始延伸互补链
C．接受人血清白蛋白基因的绵羊受体细胞是乳腺细胞
D．含目的基因的植物受体细胞可能无需培养成完整植株
【答案】D
【详解】A.基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，A错误；
B.若利用PCR技术扩增目的基因时，利用耐高温的DNA聚合酶延伸子链，B错误；
C.接受人血清白蛋白基因的绵羊受体细胞是受精卵，C错误；
D.为了大量生产人血清白蛋白，可从愈伤组织获得，无需培养为完整植株，D正确。
故选D。
二、非选择题
11．接种疫苗是预防控制新冠肺炎疫情的有效手段，通过接种疫苗能够降低人群感染和发病风险。下表为三种新冠病毒疫苗的研发方法及技术路线。回答下列问题：
方法 技术路线
基因工程疫苗 S蛋白基因→基因表达载体→大肠杆菌→ S蛋白→人体
腺病毒载体重组疫苗 S蛋白基因→腺病毒基因表达载体→人体
mRNA疫苗 S蛋白基因→基因表达载体→大肠杆菌→ mRNA→人体
（1）在制备疫苗的过程中，常采用 ______技术获取和扩增新冠病毒的S蛋白基因，扩增时，除了模板、四种脱氧核苷酸外，还需要加入 ___________和引物。若该过程消耗了62个引物，则进行了 _____轮DNA复制。
（2）基因工程疫苗研制过程中，常用大肠杆菌作为受体细胞的原因是 ___________________________________
______________________。若目的基因进入受体细胞稳定存在并 _______________________，则说明目的基因完成了转化，从分子水平的角度可用 ____________________的方法进行检测。
（3）腺病毒载体疫苗是将S蛋白基因重组到改造后的腺病毒内，改造后的腺病毒载体应具备的条件是 ___________________________________________________________（写出两点）。
【答案】
（1）PCR Taq酶（或耐高温的DNA聚合酶） 5
（2）繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对少 表达基因产物（或S蛋白） 抗原—抗体杂交
（3）对宿主细胞无害；能够在宿主细胞中自我复制；具有（一至多个）限制酶切割位点和标记基因
【详解】
（1）PCR技术是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，在制备疫苗的过程中，常采用PCR技术获取和扩增新冠病毒的S蛋白基因。扩增时，除了模板、四种脱氧核苷酸，还需要加入Taq酶（或耐高温的DNA聚合酶）和引物。假设DNA复制n轮，子代DNA共有2n+1条链，因亲代DNA的两条母链不需要引物，故需要引物2n+1﹣2＝62个，故n＝5。
（2）由于大肠杆菌繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对少，故基因工程疫苗研制过程中，常用大肠杆菌作为受体细胞。若目的基因进入受体细胞内并且稳定存在和表达出基因产物（S蛋白），则说明目的基因完成了转化。由于目的基因能够表达出相关蛋白质，故从分子水平的角度可用抗原﹣抗体杂交法检测。
（3）腺病毒载体疫苗是将S蛋白基因重组到改造后的腺病毒内，选用的腺病毒需要经过人工改造后，才能作为制备该疫苗的载体。改造后的腺病毒应该具有对宿主细胞无害、能够在宿主细胞中自我复制、具有（一至多个）限制酶切割位点和标记基因等条件。
12．基因工程：制备新型酵母菌
(1)已知酵母菌不能吸收淀粉，若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉发酵，则应导入多步分解淀粉所需的多种酶，推测这些酶生效的场所应该是________________________（填“细胞内”和“细胞外”）。
(2)同源切割是一种代替限制酶、DNA连接酶将目的基因导入基因表达载体的方法。当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入。研究人员，运用同源切割的方式，在目的基因两端加上一组同源序列A．B，已知酵母菌体内DNA有许多A-B序列位点可以同源切割插入。构建完成的目的基因结构如图，则应选择图中的引物____________________对目的基因进行PCR。
(3)已知酵母菌不能合成尿嘧啶，因此尿嘧啶合成基因（UGA）常用作标记基因，又知尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质。
（i）导入目的基因的酵母菌应在_____________________________________________________的培养基上筛选培养。由于需要导入多种酶基因，需要多次筛选，因此在导入一种目的基因后，要切除UGA基因，再重新导入。研究人员在UGA基因序列两端加上酵母菌DNA中不存在的同源C．C’序列，以便对UGA基因进行切除。C．C’的序列方向将影响切割时同源序列的配对方式，进而决定DNA片段在切割后是否可以顺利重连，如图，则应选择方式____________________进行连接。
（ii）切去UGA基因的酵母菌应在___________________________________________的培养基上筛选培养。
(4)综上，目的基因、标记基因和同源序列在导入酵母菌的基因表达载体上的排列方式应该如图_________。
【答案】
(1)细胞外
(2)P1和P6
(3)缺乏尿嘧啶 方式二 含有5-氟乳清酸
(4)图3
【详解】
（1）由于酵母菌不能吸收淀粉，所以导入分解淀粉的酶发挥作用的场所在细胞外。
（2）根据题干信息“当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入”，要保证目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同，需要选择P1和P6这对引物进行PCR。
（3）（i）选择了尿嘧啶合成基因（UGA）常用作标记基因，则应该将酵母菌放在缺乏尿嘧啶的培养基上培养，如果导入成功，则形成菌落；如果没有导入，则缺乏尿嘧啶，不能生存；方式一，C和C'方向相反，如果切割，则末端在一条链上，不能连接，所以选择方式二，连接方向相同，切割后形成末端，便于连接。（ii）由于尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质，所以应该在含有5-氟乳清酸的培养基上，如果切割成功，则不含尿嘧啶，形成菌落，如果切割不成功，则会产生有毒物质，不能形成菌落。
（4）根据前面分析，C和C'的中间插入UGA，A和B之间插入的目的基因，所以图3正确。
13．“基因剪刀手”杨璐菡扫除了猪器官用于人体移植的最大障碍，其研究成果使得美国《科学》杂志打破惯例提前发表科研成果，该技术将为全球上百万病人带来希望。从2014年起，杨璐菡作为异种器官移植课题带头人，带领10个人的科研团队利用新发明的“基因剪刀”技术，敲除猪基因组中可能的致病基因。“基因敲除”技术的主要过程示意图如下：
请根据题述内容回答下列问题：
(1)“基因敲除”技术的原理是__________，将neoR基因插入到靶基因过程中使用的工具酶是________和____________。
(2)将突变基因DNA导入胚胎干细胞之前要________________，该操作的目的是____________________________________________，该步骤中常用不同的限制酶进行切割，这样做的优点在于可以防止______________________________________________________。
(3)要获得一只含失活靶基因的小鼠，则选择的受体细胞应是________，图中的neoR基因的作用是________________________。
(4)用于器官移植的猪最终需要完成基因改造及PERV(猪内源性逆转录病毒)的删除等工作，改造过的猪胚胎可植入母猪体内，胚胎在母猪体内存活的原因是_____________________
___________________________________。
【答案】
(1)基因重组　限制酶　DNA连接酶　
(2)构建基因表达载体　使目的基因在受体细胞中稳定存在并发挥作用　质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，及目的基因与质粒反向连接　
(3)受精卵　获得失活的靶基因　
(4)受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应
【详解】
(1)由图可知，“基因敲除”技术的实质就是使靶基因失活，方法是靶基因和neoR基因的拼接，所以原理是基因重组，基因拼接技术使用的工具酶是限制酶和DNA连接酶。
(2)依据基因工程的操作程序，将突变基因DNA导入胚胎干细胞之前要进行基因表达载体的构建，从而有利于目的基因在受体细胞中稳定存在并发挥作用。用同一种限制酶剪切DNA片段，片段两端黏性末端相同，这样会导致被剪切片段自身环化及目的基因与质粒反向连接。
(3)培育转基因动物，由于体细胞体外培养不能发育成个体，受体细胞一般用受精卵，neoR基因的作用是使靶基因失活。
(4)胚胎工程中外来胚胎可以在受体子宫存活的基础是子宫不对外来胚胎产生免疫排斥反应，这也是改造过的猪胚胎可植入母猪体内存活的原因。
2 / 2第3章 基因工程
第3节 基因工程的应用
知识一 基因工程在农牧业方面的应用
1．转基因抗虫植物
(1)技术方法：从某些生物中分离出具有____________的基因，将它导入作物中，培育出具有抗虫性的作物。
(2)实例：____________、玉米、大豆、水稻和马铃薯等。
2．转基因抗病植物
(1)技术方法：将来源于____________________的抗病基因导入植物中，培育出转基因抗病植物。
(2)实例：转基因抗病毒甜椒、番木瓜和烟草等。
3．转基因抗除草剂植物
(1)技术方法：将_________________________的基因导入作物，可培育抗除草剂的作物品种。
(2)实例：转基因抗除草剂玉米、大豆、油菜和甜菜等。
4．改良植物的品质
(1)技术方法：将____________________________________导入植物中，可以提高这种氨基酸的含量。
(2)实例：赖氨酸含量比对照高30%的转基因玉米、呈现出自然界没有的____________的转基因矮牵牛。
5．提高动物的生长速率
(1)技术方法：将________________________导入动物体内，提高动物的生长速率。
(2)实例：转基因鲤鱼。（将外源生长激素基因导入动物体内，在其体内合成大量的生长激素，可以使转基因动物生长得____________。）
6．改善畜产品的品质
(1)技术方法：将________________________导入奶牛基因组。
(2)实例：乳汁中乳糖含量大大降低的转基因奶牛。（将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组乳糖酶―→乳糖分解―→乳汁中的乳糖含量大大降低，其他_______________不受影响，乳汁品质改善。）
[例1]将控制甜菜碱、海藻糖等有机小分子合成的基因转入双子叶植物烟草细胞中，会使烟草的抗旱性增强。下列关于这类转基因烟草及其培育过程的说法，错误的是(　　)
A.转基因烟草细胞中甜菜碱等有机小分子的合成量增加
B.转基因烟草细胞细胞液渗透压升高，可避免细胞过度失水
C.将抗旱基因导入烟草细胞中常用农杆菌转化法
D.可以在干旱条件下筛选出成功导入抗旱基因的烟草细胞
[例2]下列有关目的基因的操作，能改善产品品质的是（ ）
A．将草鱼的生长激素基因导入鲤鱼体内
B．将人血清白蛋白的基因改造后在山羊的乳腺中表达
C．将肠乳糖酶的基因导入奶牛的基因组
D．将Bt抗虫蛋白基因整合到烟草或棉花的基因组并实现表达
知识二 基因工程在医药卫生领域的应用
1．基因工程在医药卫生领域的应用
（1）对微生物或动植物的细胞进行基因改造
目的：使它们能够生产药物。
药物种类：____________、____________、____________和____________等。
（2）让哺乳动物批量生产药物——乳腺生物反应器或乳房生物反应器
措施：将药用蛋白基因与乳腺中________________________等调控元件重组在一起。
受体细胞：动物的____________。
导入方法：____________。
（3）建立移植器官工厂
在器官供体的基因组中导入某种调节因子，以抑制__________________的表达，或设法除去_______________，再结合克隆技术，培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆动物器官。
2．基因工程在食品工业方面的应用
技术方法 利用基因工程菌生产食品工业用______、_________和_________等。例如将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌、黑曲霉或酵母菌的基因组中，再通过____________批量生产____________
实例 凝乳酶、淀粉酶、脂肪酶、天冬氨酸和苯丙氨酸
[例1]我国科学家将含有人凝血因子基因的DNA片段注射到羊的受精卵中，由该受精卵发育而成的羊分泌的乳汁中含有人的凝血因子，可以治疗血友病。下列叙述错误的是（ ）
A．凝血因子基因与乳腺蛋白基因的启动子重组在一起
B．该羊分泌的乳汁中含有人的凝血因子基因
C．该羊被称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器
D．这项研究说明人和羊共用一套遗传密码
[例2]下列关于用转基因动物作器官移植供体的研究的叙述，不正确的是（　　）
A．器官短缺和免疫排斥是目前制约人体器官移植的两大难题
B．猪的内脏构造、大小和血管分布与人极为相似
C．灵长类动物体内隐藏的、可导致人类疾病的病毒少于猪
D．无论以哪种动物作为供体，都需要在其基因组中导入某种调节因子以抑制抗原决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因
难点知识一 基因工程在医药卫生领域的应用
1．工程菌生产药物（以生产干扰素为例）
(1)干扰素的作用
干扰素是动物或人体细胞受到病毒侵染后产生的一种细胞因子，是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，在临床上常作为抗病毒的特效药，如用于乙肝、丙肝的治疗。
(2)干扰素的生产过程
2．生物反应器（以乳腺生物反应器为例）
(1)乳腺(房)生物反应器
科学家将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中，由这个受精卵发育成的转基因动物在进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁来生产所需要的药物。
(2)过程
(3)成果
目前，科学家已在牛、山羊等动物乳腺(房)生物反应器中获得了抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素和α 抗胰蛋白酶等重要的医药产品。
(4)优点和不足
优点：产量高、质量好、成本低、易提取。
不足：只有雌性哺乳动物进入泌乳期后才能分泌乳汁，受性别和年龄的限制。
(5)其他生物反应器
膀胱生物反应器是外源基因在膀胱上皮细胞中表达的转基因动物，有着和乳腺生物反应器一样的优点：更易收集产物蛋白，且不对动物造成伤害 。此外，膀胱生物反应器可以从一出生就收集产物，不受动物的性别和年龄的限制，且从动物的尿液中提取产物比从乳汁中提取更简便。　　　　　　　　　　　　　
3．工程菌生产药物与乳腺生物反应器比较
项目 乳腺生物反应器 工程菌生产药物
基因结构 动物基因的结构与人类基因的结构基本相同 细菌或酵母菌等生物的基因结构与人类的基因结构有较大差异
基因产物 与天然蛋白质完全相同 细菌细胞内缺少内质网、高尔基体等细胞器，合成的蛋白质可能不具有生物活性
受体细胞 动物的受精卵 微生物细胞
导入目的基因的方法 显微注射法 Ca+处理法
生产条件 不严格灭菌，温度等外界条件对其影响不大 需严格灭菌，严格控制工程菌所需要的温度、pH、营养物质浓度等外界条件
产物提取 从动物乳汁中提取，相对简单 从微生物细胞中提取，相对复杂
讨论1：为了生产药物，常把药用蛋白基因构建的表达载体导入大肠杆菌或酵母菌细胞中构建工程菌，选用细菌或酵母菌作为受体细胞的优点有哪些？
讨论2：乳腺生物反应器指的是转基因动物的乳腺吗？
讨论3：研制膀胱生物反应器时，应如何处理目的基因？
讨论4：膀胱生物反应器与乳腺生物反应器有什么相同和不同点？
巩固训练1
某实验小组将人生长激素基因导入大肠杆菌以制备工程菌，下列相关叙述错误的是(　　)
A．人生长激素基因可以以下丘脑细胞的mRNA为模板通过逆转录获得
B．将人的生长激素基因导入大肠杆菌，需要处理得到能吸收周围环境中DNA分子的细胞
C．利用基因工程菌制备的生长激素需要与天然产品的功能进行活性比较
D．与人细胞分泌的天然生长激素相比，基因工程菌无法对生长激素进行进一步加工和修饰
巩固训练2
采用基因工程技术培育转基因羊作为乳腺生物反应器，使其能合成人凝血因子且只存在于乳汁中。下列有关叙述，不正确的是（　　）
A．将人凝血因子基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件结合在一起构建成基因表达载B．将含有人凝血因子基因的表达载体导入羊乳腺细胞中即可获得乳腺生物反应器
C．该转基因羊产生的生殖细胞中可能会含有人凝血因子基因
D．与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受性别等限制，受体来源更广泛
一、选择题
1．下列有关基因工程应用的叙述，错误的是(　　)
A．动物基因工程技术主要用于提高动物的生长速度
B．利用转基因技术生产的药物已经有很多种，如抗体、疫苗、激素等
C．基因治疗是治疗遗传病最有效的手段，治疗后产生的变异一般是不可遗传的
D．利用植物基因工程提高农作物抗虫能力时所用杀虫基因可以是Bt毒蛋白基因
2．通过基因工程技术，可以将抗草甘膦基因导入大豆，培育出抗除草剂作物。下列相关叙述，错误的是（ ）
A．构建基因表达载体时要用到耐高温的DNA聚合酶和DNA连接酶
B．可以用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞
C．培育过程需要借助植物组织培养技术
D．需要在个体水平上对目的基因进行检测和鉴定
3．SOD是一种抗氧化酶，它能将O转化成H2O2，增强植物的抗逆性。如图为培育农作物新品种的一种方式。以下叙述正确的是(　　)
A．过程①可以用动物病毒作为载体
B．从该农作物新品种的细胞中检测出了SOD基因，说明该基因工程成功了
C．新品种的获得属于可遗传的变异，可能将抗逆性状遗传给子代
D．基因工程又叫重组DNA技术，所用工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体
4．科学家在河南华溪蟹中找到了金属硫蛋白基因，并以质粒为载体，采用转基因方法培育出了硫吸收能力极强的转基因烟草。下列有关该烟草培育的说法正确的是(　　)
A．金属硫蛋白基因需插入到质粒上，才能转移到受体细胞中
B．需用特定的限制酶切割烟草的核酸
C．同种限制酶既可以切割含目的基因的DNA片段又可以切割质粒，因此不具有专一性
D．转基因烟草与原烟草相比基因组成发生了变化，导致两者出现生殖隔离
5．科学家利用基因工程培育出了能产生乙肝病毒蛋白质的西红柿，被称之为“西红柿乙肝疫苗”。具体操作是：将乙肝抗原基因M导入农杆菌，然后利用农杆菌将M导入西红柿细胞。实验显示小白鼠连续五周吃这样的西红柿，体内产生了抗乙肝病毒的抗体，下列叙述错误的(　　)
A．实验用PCR技术对M基因进行扩增，需要两种引物
B．含M的重组Ti质粒必须插入到西红柿染色体DNA上
C．即使M在西红柿中成功表达，也要做个体生物学水平鉴定
D．西红柿乙肝疫苗成本相对较低且易于储存
6．八氢番茄红素合酶(其基因用psy表示)和胡萝卜素脱饱和酶(其基因用crtI表示)参与β-胡萝卜素合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtI基因转入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡萝卜素，由此生产出的大米称为“黄金大米”。下列有关叙述错误的是(　　)
A．psy和crtI基因是该项研究中的目的基因
B．以pmi基因作为标记基因便于筛选出导入目的基因的受体细胞
C．检测出水稻中含八氢番茄红素合酶和胡萝卜素脱饱和酶，即表明转基因水稻培育成功
D．可设法将重组载体导入水稻细胞
7．盐碱胁迫下植物应激反应产生的H2O2对细胞有毒害作用。禾本科农作物AT1蛋白通过调节细胞膜上PIP2s蛋白磷酸化水平，影响H2O2的跨膜转运，如图所示。下列叙述错误的是(　　)
A．细胞膜上PIP2s蛋白高磷酸化水平是其提高H2O2外排能力所必需的
B．PIP2s蛋白磷酸化被抑制，促进H2O2外排，从而减轻其对细胞的毒害
C．敲除AT1基因从而去除禾本科农作物的AT1蛋白可提高其耐盐碱能力
D．从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因是改良农作物抗逆性的有效途径
8．国家生猪种业工程技术研究中心科研团队在转基因猪生物反应器领域取得重要研究进展。在国际上首次利用转基因猪的唾液腺作为生物反应器，高效合成一种对人的神经性疾病具有良好治疗作用的蛋白——人神经生长因子(hNGF)。生产流程如图所示。下列相关说法错误的是(　　)
A．可用人hNGF基因与猪成纤维细胞A中唾液淀粉酶基因的启动子等元件构建基因表达载体
B．重构胚具有发育成个体的潜能，移植到代孕猪C体内无须任何操作便可进行分裂和发育
C．猪卵细胞B需要在体外培养到MⅡ期后通过显微操作去核
D．唾液腺生物反应器与乳腺生物反应器相比具有不受性别限制等特点
9．2022年1月7日，马兰里医学中心成功将猪心脏移植到一名57岁的心脏病患者身上，虽然这颗心脏仅仅存活了2个月时间，但仍然为异种器官移植的可行性提供了可观的数据。为了减低免疫排斥反应，研究者借助CRISPR/Cas9技术对移植的猪心脏进行了基因编辑。CRISPR/Cas9系统主要由向导RNA(sgRNA)和Cas9蛋白两部分组成，sgRNA可引导Cas9蛋白到特定基因位点进行切割，其机制如图所示。下列说法正确的是(　　)
A．sgRNA通过碱基互补配对原则识别目标DNA分子，Cas9蛋白的功能与DNA连接酶相似
B．若要利用CRISPR/Cas9技术将一个基因从目标DNA分子上去除，通常需设计两个序列不同的sgRNA
C．CRISPR/Cas9技术编辑基因有时会因sgRNA错误结合而出现“脱靶”现象，一般sgRNA序列越短，脱靶率越低
D．接受器官移植的受体往往需服用免疫抑制剂来防止出现过敏现象
10．如图表示利用基因工程技术生产人血清白蛋白的两条途径，下列有关叙述正确的是（ ）
A．分子运输车-载体的组成包括目的基因、标记基因、启动密码、终止密码等
B．扩增目的基因时，利用耐高温的DNA连接酶从引物a和引物b起始延伸互补链
C．接受人血清白蛋白基因的绵羊受体细胞是乳腺细胞
D．含目的基因的植物受体细胞可能无需培养成完整植株
二、非选择题
11．接种疫苗是预防控制新冠肺炎疫情的有效手段，通过接种疫苗能够降低人群感染和发病风险。下表为三种新冠病毒疫苗的研发方法及技术路线。回答下列问题：
方法 技术路线
基因工程疫苗 S蛋白基因→基因表达载体→大肠杆菌→ S蛋白→人体
腺病毒载体重组疫苗 S蛋白基因→腺病毒基因表达载体→人体
mRNA疫苗 S蛋白基因→基因表达载体→大肠杆菌→ mRNA→人体
（1）在制备疫苗的过程中，常采用 ______技术获取和扩增新冠病毒的S蛋白基因，扩增时，除了模板、四种脱氧核苷酸外，还需要加入 ___________和引物。若该过程消耗了62个引物，则进行了 _____轮DNA复制。
（2）基因工程疫苗研制过程中，常用大肠杆菌作为受体细胞的原因是 ___________________________________
______________________。若目的基因进入受体细胞稳定存在并 _______________________，则说明目的基因完成了转化，从分子水平的角度可用 ____________________的方法进行检测。
（3）腺病毒载体疫苗是将S蛋白基因重组到改造后的腺病毒内，改造后的腺病毒载体应具备的条件是 ___________________________________________________________（写出两点）。
12．基因工程：制备新型酵母菌
(1)已知酵母菌不能吸收淀粉，若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉发酵，则应导入多步分解淀粉所需的多种酶，推测这些酶生效的场所应该是________________________（填“细胞内”和“细胞外”）。
(2)同源切割是一种代替限制酶、DNA连接酶将目的基因导入基因表达载体的方法。当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入。研究人员，运用同源切割的方式，在目的基因两端加上一组同源序列A．B，已知酵母菌体内DNA有许多A-B序列位点可以同源切割插入。构建完成的目的基因结构如图，则应选择图中的引物____________________对目的基因进行PCR。
(3)已知酵母菌不能合成尿嘧啶，因此尿嘧啶合成基因（UGA）常用作标记基因，又知尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质。
（i）导入目的基因的酵母菌应在_____________________________________________________的培养基上筛选培养。由于需要导入多种酶基因，需要多次筛选，因此在导入一种目的基因后，要切除UGA基因，再重新导入。研究人员在UGA基因序列两端加上酵母菌DNA中不存在的同源C．C’序列，以便对UGA基因进行切除。C．C’的序列方向将影响切割时同源序列的配对方式，进而决定DNA片段在切割后是否可以顺利重连，如图，则应选择方式____________________进行连接。
（ii）切去UGA基因的酵母菌应在___________________________________________的培养基上筛选培养。
(4)综上，目的基因、标记基因和同源序列在导入酵母菌的基因表达载体上的排列方式应该如图_________。
13．“基因剪刀手”杨璐菡扫除了猪器官用于人体移植的最大障碍，其研究成果使得美国《科学》杂志打破惯例提前发表科研成果，该技术将为全球上百万病人带来希望。从2014年起，杨璐菡作为异种器官移植课题带头人，带领10个人的科研团队利用新发明的“基因剪刀”技术，敲除猪基因组中可能的致病基因。“基因敲除”技术的主要过程示意图如下：
请根据题述内容回答下列问题：
(1)“基因敲除”技术的原理是__________，将neoR基因插入到靶基因过程中使用的工具酶是________和____________。
(2)将突变基因DNA导入胚胎干细胞之前要________________，该操作的目的是____________________________________________，该步骤中常用不同的限制酶进行切割，这样做的优点在于可以防止______________________________________________________。
(3)要获得一只含失活靶基因的小鼠，则选择的受体细胞应是________，图中的neoR基因的作用是________________________。
(4)用于器官移植的猪最终需要完成基因改造及PERV(猪内源性逆转录病毒)的删除等工作，改造过的猪胚胎可植入母猪体内，胚胎在母猪体内存活的原因是_____________________
___________________________________。
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