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第3章 基因工程
第4节 蛋白质工程的原理和应用
知识一 蛋白质工程的概念及基本原理
1．概念
蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础，通过改造或合成基因来改造现有蛋白质进行或制造出一种新的蛋白质。
(1)基础：蛋白质分子的_结构规律_及其与_生物功能_的关系。
(2)手段：通过_改造或合成基因_，来_改造现有蛋白质_，或制造一种_新的蛋白质_。
2．崛起的缘由
(1)基因工程的实质和不足：
①实质：将一种生物的基因转移到另一种生物体内,后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状。
②基因工程存在的不足：原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。
(2)天然蛋白质的不足：天然蛋白质的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。
(3)理论和技术条件的发展：_分子生物学_、晶体学以及计算机技术的迅速发展。
3．基本原理
(1)目标：根据人们对蛋白质功能的_特定需求_，对蛋白质的结构进行_设计改造_。
(2)原理：由预期的蛋白质找到相对应的_脱氧核苷酸序列_(基因)。
(3)蛋白质工程的实质：_改造基因_或_合成基因_
由于基因决定蛋白质，因此要对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过改造或合成基因来完成。
(4)基本思路：预期蛋白质功能→设计预期的_蛋白质结构_→推测应有的_氨基酸序列_→找到并改变相对应的_脱氧核苷酸序列_(基因)。
[例1]蛋白质工程为改造蛋白质的结构和功能提供了新的途径。下列叙述正确的是（　　）
A．蛋白质工程的最终目的是分析蛋白质的三维结构
B．蛋白质工程和基因工程的操作对象存在差异
C．现有基因的脱氧核苷酸序列是蛋白质工程设计实施的出发点
D．利用蛋白质工程技术改造蛋白质的过程仍遵循中心法则
【答案】D
【详解】A、蛋白质工程的最终目的是改造现有蛋白质或制造新的蛋白质，A错误；
B、蛋白质工程和基因工程的操作对象都是基因，B错误；
C、蛋白质工程设计实施的出发点是预期蛋白质功能，C错误；
D、蛋白质工程的基本思路：从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列或合成新的基因，获得所需要的蛋白质。利用蛋白质工程技术改造蛋白质的过程仍遵循中心法则，D正确。
故选D。
[例2]下图为蛋白质工程操作的基本思路，下列相关叙述正确的是(　　)
A.图中⑤⑥过程分别是转录、翻译
B.蛋白质工程的直接操作对象是蛋白质，不需要对基因进行操作
C.根据蛋白质的氨基酸序列推测出的mRNA的碱基序列是唯一的
D.蛋白质工程的目的是改造现有蛋白质或制造新的蛋白质，满足人类的需求
【答案】D
【详解】A、图中⑤⑥过程分别是翻译、折叠，④过程是转录，A错误；
B、蛋白质工程是通过合成或改造基因来实现的，可见蛋白质工程是通过对基因进行操作实现的，B错误；
C、一种氨基酸可能对应多种密码子，所以根据蛋白质的氨基酸序列推测出的mRNA的碱基序列不一定是唯一的，C错误。
D、现有蛋白质并不能满足人类的需求，可以对改造现有的蛋白质或制造新的蛋白质来满足人类的需求，D正确。
故选D。
知识二 蛋白质工程的应用
1．在医药工业方面的应用
(1)研发速效胰岛素类似物：从而有效抑制了_胰岛素的聚合_，研发出速效胰岛素类似物。
(2)提高干扰素的保存期：将干扰素分子上的一个_半胱氨酸_变成_丝氨酸_，提高了干扰素的保存时间。
(3)制备人鼠嵌合抗体
①医学问题：小鼠单克隆抗体会使人产生_免疫反应_，从而导致它的治疗效果大大降低。
②解决方法：通过改造基因，将小鼠抗体上_结合抗原_的区域(即可变区)“嫁接”到_人的抗体_(即恒定区)上(如图所示)，经过这样改造的抗体诱发免疫反应的强度就会降低很多。
2．在其他工业和农业方面的应用
（1）工业方面
蛋白质工程被广泛用于改进酶的性能或开发新的工业用酶。
（2）农业方面
科学家正在尝试改造某些参与调控光合作用的酶，以提高植物光合作用的效率，增加粮食的产量；利用蛋白质工程的思路来设计优良微生物农药，通过改造微生物蛋白质的结构，使它防治病虫害的效果增强。
[例1]研究人员利用点突变技术将干扰素（IFN）第17位的半胱氨酸诱变为丝氨酸后，发现其抗病毒活性提高了100倍，且这种新型的IFN在-70℃下保存150天后仍然稳定。下列相关叙述错误的是（ ）
A．点突变技术通常是直接对蛋白质进行操作，使氨基酸改变
B．IFN抗病毒活性发生改变的直接原因是其空间结构发生改变
C．该技术为蛋白质工程，蛋白质工程常利用的工具酶有限制酶和DNA连接酶等
D．经改造后的新型IFN活性强、稳定性高的性状是可以遗传的
【答案】A
【详解】A、点突变技术属于蛋白质工程，蛋白质工程直接改造的对象是基因，A错误；
B、IFN抗病毒活性发生改变的直接原因是其空间结构发生改变，B正确；
C、蛋白质工程是第二代基因工程，基因工程利用的工具酶有限制酶和DNA连接酶等，C正确；
D、蛋白质工程改造的是控制蛋白质合成的基因，因此经改造后的新型IFN的性状可以遗传，D正确。
故选A。
[例2]T4溶菌酶是一种工业用酶，但在温度较高时容易失活。科学家利用蛋白质工程，将T4溶菌酶的第3位异亮氨酸变为半胱氨酸，获得了耐高温的T4溶菌酶。下列叙述正确的是（ ）
A．蛋白质工程和基因工程的根本区别是操作对象的差异
B．自然界中所有的酶都可通过蛋白质工程进行改造
C．根据设计的T4溶菌酶的氨基酸序列只能推测出一种脱氧核苷酸序列
D．改造后的T4溶菌酶还需进一步测定酶活力等才能应用到生产实践中
【答案】D
【详解】A、蛋白质工程和基因工程的操作对象都是基因。但是，蛋白质工程需要依据蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系，利用基因工程的手段，通过改造或合成基因来改造现有蛋白质，或者制造一种新的蛋白质，基因工程则是通过基因操作把外源基因转入适当的生物体内并在其中进行表达，A错误；
B、在自然界中，绝大多数酶是蛋白质，少数酶是RNA。如果酶的化学本质是蛋白质，则可通过蛋白质工程进行改造，B错误；
C、由于密码子的简并（多个密码子编码同一种氨基酸），根据设计的T4溶菌酶的氨基酸序列推测出的脱氧核苷酸序列不一定只有一种，C错误；
D、要将改造后的T4溶菌酶应用到生产实践中，还有很多工作要做。例如，由于改造后酶的空间结构发生了改变，因此它的一些基本特性需要重新明确，包括它能耐受的温度范围、催化反应的最适温度、酶活力的大小等，D正确。
故选D。
难点知识一 蛋白质工程相关理论
1．思路
2．流程
3．蛋白质工程和基因工程的比较
项目 蛋白质工程 基因工程
操作对象 基因 基因
操作起点 预期蛋白质功能 目的基因
操作水平 DNA分子水平 DNA分子水平
操作流程 预期蛋白质功能→设计蛋白质结构→推测氨基酸序列→找到并改变对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新基因→获得所需要的蛋白质 目的基因的筛选与获取→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
结果 可生产自然界没有的蛋白质 生产自然界已有的蛋白质
实质 通过改造或合成基因来定向改造现有蛋白质或制造新的蛋白质 将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状
联系 ①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程； ②蛋白质工程离不开基因工程，其包含基因工程的基本操作。
4．判断基因工程和蛋白质工程的技巧
讨论1：对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？原因是什么？
应该通过对基因的操作来实现对天然蛋白质的改造。主要原因是①蛋白质具有十分复杂的空间结构，基因的结构相对简单，容易改造；②改造后的基因可以遗传给下一代，被改造的蛋白质无法遗传。
讨论2：如何由蛋白质氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列？
先根据氨基酸与密码子的对应关系找到mRNA中相对应的核糖核苷酸序列，再根据mRNA与DNA的碱基互补配对关系找到基因中相对应的脱氧核苷酸序列。
讨论3：确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因？
人工合成目的基因；或从基因文库中获取与目的基因相似的基因并进行改造。对基因的改造经常会用到基因定点突变技术来进行碱基的替换、增添等。
讨论4：蛋白质工程和基因工程的操作对象以及得到的蛋白质相同吗？
①操作对象相同：蛋白质工程和基因工程的操作对象都为基因。②得到的蛋白质不同：蛋白质工程可以得到自然界没有的新的蛋白质；基因工程得到的是自然界已存在的蛋白质。
巩固训练1
蛋白质工程是基因工程的延伸，下列关于蛋白质工程的叙述，错误的是（ ）
A．通过蛋白质工程改造后的蛋白质的性状不可以遗传
B．蛋白质工程和基因工程都需要构建基因表达载体
C．蛋白质工程需要限制酶、DNA连接酶和载体等工具
D．蛋白质工程经常要建立蛋白质高级结构的三维模型
【答案】A
【详解】A、蛋白质工程是通过对基因进行修饰改造或重新合成，从而改造蛋白质进而改造性状，其本质是通过基因控制性状，故可遗传，A错误；
B、蛋白质工程是通过对基因进行修饰改造或重新合成，然后进行表达，同基因工程一样，都需要构建基因表达载体，B正确；
C、蛋白质工程需要限制酶、DNA连接酶和载体等工具，C正确；
D、蛋白质工程先要根据预期蛋白质功能设计建立蛋白质高级结构的三维模型，D正确。
故选A。
巩固训练2
下列关于蛋白质工程和基因工程的比较，不合理的是（　　）
A．蛋白质工程的操作起点是从预期的蛋白质功能出发，设计出相应的基因，并借助基因工程实现
B．蛋白质工程是在基因工程的基础上发展起来的，蛋白质工程最终还是要通过基因修饰或基因合成来完成
C．当得到可以保存半年的干扰素后，在相关酶、氨基酸和适宜的温度、pH条件下，干扰素可以大量自我合成
D．基因工程和蛋白质工程产生的变异都是可遗传的
【答案】C
【详解】A、蛋白质工程的操作起点是从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测出相应的基因序列，进而设计出相应的基因，并借助基因工程实现，A正确；
B、基因工程生产的自然界中已存在的蛋白质不能完全符合人类需要，因此催生了蛋白质工程，但由于基因决定蛋白质，因此蛋白质工程最终还是要通过基因修饰或基因合成来完成，B正确；
C、干扰素作为一种表达产物，其化学本质为蛋白质，蛋白质不具有自我合成的能力，C错误；
D、基因工程产生的变异即为基因重组，目的基因转入后便可以随宿主的基因一同表达并遗传给后代，蛋白质工程最终也要通过基因来改造，因此蛋白质工程产生的变异也可以遗传，D正确。
故选C。
一、选择题
1．蛋白质工程是基因工程的延伸。下列有关蛋白质工程的叙述，正确的是（ ）
A．蛋白质工程是基因工程的延伸，所以不需要遵循中心法则
B．蛋白质工程中可以不用构建基因表达载体
C．生产的蛋白质能在自然界中找到
D．需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶
【答案】D
【详解】A、蛋白质工程最终也是基因控制蛋白质的合成，遵循中心法则，A错误；
B、蛋白质工程是基因工程的延伸，需要构建表达载体，B错误；
C、生产的蛋白质在自然界中找不到，因此才采用蛋白质工程进行合成，C错误；
D、蛋白质工程是基因工程的延伸，需要构建表达载体，需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶，D正确。
故选D。
2．我国科学家刘海燕教授团队开辟了一条全新的蛋白质从头设计的路线（如图所示），实现了核心技术的原始创新，为工业酶、生物医学蛋白等功能蛋白的设计奠定了基础。下列有关蛋白质的叙述错误的是（ ）
A．分泌蛋白合成旺盛的细胞中核仁较小
B．用该技术设计的工业酶可含有C、H、O、N四种元素
C．设计蛋白质的结构时首先要设计蛋白质主链的氨基酸序列
D．蛋白质的合成需要核酸的参与，核酸的合成也需要蛋白质的参与
【答案】A
【详解】A、分泌蛋白合成旺盛的细胞中核仁较大，A错误；
B、工业酶的本质是蛋白质，蛋白质的组成元素为C、H、O、N等，B正确；
C、由图可知，设计蛋白质结构时首先给主链结构设计了氨基酸序列的ABACUS模型，C正确；
D、核酸指导蛋白质的合成，蛋白质的合成需要核酸的参与，核酸的合成也需要DNA聚合酶、RNA聚合酶等蛋白质的参与，D正确。
故选A。
3．腈水合酶（N0）广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域，但不耐高温。利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶（N1）。下列有关叙述错误的是（　　）
A．N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一
B．加入连接肽需要通过改造基因实现
C．获得N1的过程需要进行转录和翻译
D．检测N1的活性时先将N1与底物充分混合，再置于高温环境
【答案】D
【详解】A、在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶（N1），则N1与N0氨基酸序列有所不同，这可能是影响其热稳定性的原因之一，A正确；
B、蛋白质工程的作用对象是基因，即加入连接肽需要通过改造基因实现，B正确；
C、N1为蛋白质，蛋白质的合成需要经过转录和翻译两个过程，C正确；
D、酶具有高效性，检测N1的活性需先将其置于高温环境，再与底物充分混合，D错误。
故选D。
4．萤火虫的荧光素酶能催化ATP激活的荧光素氧化发光，这一现象在生物检测和成像方面有重要的应用价值。为了解决天然荧光素酶不能高效催化人工合成的荧光素DTZ发光的问题，研究人员采用蛋白质工程（又称为第二代基因工程）对它进行了改造。下列关于蛋白质工程改造天然荧光素酶的叙述，正确的是（　　）
A．通过化学诱变剂可定向改造天然荧光素酶的基因序列
B．改造天然荧光素酶所用的基因表达载体不需要启动子和终止子
C．可用PCR方法检测突变的荧光素酶基因是否翻译成蛋白质
D．改造后的荧光素酶在一定条件下催化DTZ发光是将化学能转化为光能
【答案】D
【详解】A、通过化学诱变剂可以让天然荧光素酶的基因序列进行随机突变，但化学诱变通常是不定向的，A错误；
B、改造天然荧光素酶所用的基因表达载体必须包含启动子和终止子，启动子是驱动基因转录的元件，而终止子是指示转录终止的位置，B错误；
C、PCR 方法主要用于检测 DNA 的存在或者染色体 DNA 上是否插入目的基因，检测目的基因是否翻译为蛋白质的方法为抗原﹣抗体杂交，C错误；
D、改造后的荧光素酶在一定条件下催化DTZ发光是将化学能转化为光能，D正确。
故选D。
5．研究发现，为心梗患者注射适量t-PA蛋白会诱发颅内出血，但若将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血等副作用，改良后的t-PA蛋白成为心梗和脑血栓的急救药。下图所示，通过基因工程大量制备改良药物t-PA蛋白，下列说法错误的是（ ）

A．制备改良t-PA蛋白的过程属于蛋白质工程
B．利用重组pCLY11质粒可获得牛乳腺生物反应器
C．选用限制酶XmaI和BglⅡ切割质粒pCLY11，构建重组质粒
D．成功导入重组质粒的受体细胞在含有新霉素的培养基上能存活，且呈现蓝色
【答案】D
【详解】A、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。依题意，改良后的药物t-PA蛋白将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸改良而来，因此，制备改良t-PA蛋白的过程属于蛋白质工程，A正确；
B、科学家将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中，由这个受精卵发育成的转基因动物在进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁来生产所需要的药物，这称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器。因此，利用重组pCLY11质粒也可获得牛乳腺生物反应器，B正确；
C、t-PA改良基因的黏性末端如图所示，则所选的限制酶所获得的切口应与t-PA改良基因的黏性末端相同，因此需选用限制酶XmaI和BglⅡ切开质粒pCLY11，C正确；
D、结合图示可知，限制酶XmaI和BglⅡ会破坏质粒pCLY11上的mlacZ，但不会破坏新霉素抗性基因，导入重组质粒的大肠杆菌具有新霉素抗性，但由于mlacZ基因被破坏，没有相应产物，因而菌落呈现白色，D错误。
故选D。
6．科学家选取纤维素酶分子中若干个氨基酸位点作为改造点，结合中心法则原理，构建了“小而精”的突变体文库，最终获得催化效率更高的纤维素酶分子。下列说法错误的是(　　)
A.改造纤维素酶分子的前提是已知纤维素酶的氨基酸序列及其空间结构
B.该过程设计出的高效纤维素酶分子可能是自然界中不存在的蛋白质
C.该过程的实质是对纤维素酶基因在分子水平上进行改造
D.纤维素酶和高效纤维素酶在细胞内合成过程中遗传信息的流向不同
【答案】D
【详解】A、改造纤维素酶分子的前提是已知纤维素酶的氨基酸序列及其空间结构，以便推测相应基因中的碱基序列，A正确；
B、设计出的高效纤维素酶分子可能是自然界中不存在的蛋白质，B正确；
C、蛋白质工程的实质是通过对基因的改造实现对蛋白质的改造，C正确；
D、纤维素酶和高效纤维素酶在细胞内合成过程中遗传信息的流向是相同的，D错误。
故选D。
7．我国科研人员在实验室中通过构建多酶催化体系的方法，首次实现了在细胞外从二氧化碳固定到合成淀粉的过程。下列有关叙述错误的是(　　)
A.可采用PCR技术从不同物种的基因组中扩增得到多酶催化体系中的目标酶基因
B.在多酶催化体系中，可能会因为酶的最适反应条件不同而使反应中断
C.该方法可在分子水平上直接改变氨基酸的序列，实现对酶特性的改造和优化
D.若该科研成果成熟后推广应用有助于摆脱耕地和自然环境限制，解决粮食危机
【答案】C
【详解】A、获得的目的基因可利用PCR技术在体外反应体系中扩增，A正确；
B、酶的作用条件较温和，不同酶的最适温度和pH不同，在多酶催化体系中，可能会因为酶的最适反应条件不同而使反应中断，B正确；
C、该方法在分子水平上，通过改变基因的碱基序列，间接改变氨基酸的序列，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化，C错误；
D、该方法实现了在细胞外从二氧化碳固定到合成淀粉的过程，若成熟后推广应用有助于摆脱耕地和自然环境限制，解决粮食危机，D正确。
故选C。
8．研究发现，胰岛素进入血液循环后容易被降解，糖尿病患者需要反复注射胰岛素才能达到治疗效果。科研人员借助蛋白质工程改变了胰岛素中的某些氨基酸，提高了胰岛素在患者体内的稳定性，延长了其作用时间。下列有关叙述错误的是（　　）
A．蛋白质工程的实质是在 DNA 分子水平上进行改造或合成
B．氨基酸序列的差异是影响胰岛素在患者体内是否稳定的原因之一
C．改造胰岛素应首先从设计胰岛素基因中的脱氧核苷酸序列出发
D．蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，因此蛋白质工程难度很大
【答案】C
【详解】A、蛋白质工程的基本流程为：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→据氨基酸序列推出脱氧核苷酸序列（基因）→DNA合成，最终要利用基因工程上来解决蛋白质的合成，因此蛋白质工程的实质是在 DNA 分子水平上进行设计和改造蛋白质，A正确；
B、氨基酸序列差异，导致胰岛素的空间结构有所改变，影响了它的功能，因此氨基酸序列的差异是影响胰岛素在患者体内是否稳定的原因之一，B正确；
C、胰岛素属于蛋白质，改造胰岛素应首先从预期的蛋白质功能出发，C错误；
D、多数蛋白质除具有一级结构（即氨基酸顺序）外，还具有复杂的高级结构，即空间结构，而很多蛋白质的空间结构是人们目前还不清楚的，因此实施蛋白质工程的难度很大，D正确。
故选C。
9．已知生物体内有一种蛋白质（P），该蛋白质是一种载体蛋白，由 305 个氨基酸组成。科学家将P 分子中第158 位的丝氨酸替换成亮氨酸，第240位的谷氨酰胺替换成苯丙氨酸，从而得到了新的蛋白质，将其命名为P ，P 不但保留P 的功能，而且还具有了酶的催化活性。下列说法正确的是（ ）
A．P 蛋白与P 蛋白相比，可以提高相关化学反应的活化能
B．P 蛋白与P蛋白一样，分子或离子通过时不需要与之结合
C．P 蛋白与P 蛋白相比，肽键数目相等但是必需氨基酸含量降低
D．P蛋白改造成 P 蛋白可用基因定点突变技术来进行碱基的替换
【答案】D
【详解】A、P1蛋白与P蛋白相比，具有了酶的催化活性，酶的作用机理是降低化学反应的活化能，A错误；
B、P蛋白是一种载体蛋白，P1蛋白与P蛋白一样，分子或离子通过时需要与之结合，B错误；
C、P1蛋白与P蛋白相比，氨基酸的数目不变，肽键数目相等，但是必需氨基酸含量不一定降低，C错误；
D、P蛋白改造成P1蛋白可用基因定点突变技术来进行碱基的替换，D正确。
故选D。
10．科研人员从某热泉的细菌中发现一种α-淀粉酶（AmyS1）,利用蛋白质工程对其进行改造，获得了具有更高热稳定性和催化效率的重组耐高温α-淀粉酶（AmyS2）。获取AmyS2基因后，构建基因表达载体的过程如图所示。该过程中，将目的基因与原始质粒A构建成质粒B,将质粒B与信号肽（一段能够引导目标蛋白质分泌到细胞外的肽链）基因构建成质粒C。下列分析不正确的是（ ）
A．对淀粉酶结构进行改造最终要通过改造或合成基因来完成
B．生产AmyS2是从预期AmyS2功能出发设计其氨基酸序列
C．可以从导入质粒C的工程菌的培养液中提取获得AmyS2
D．构建质粒B和C,选择的限制酶分别是NdeI和EcoRI、BamHI和Eco52 I
【答案】D
【详解】A、对蛋白质结构进行改造最终要通过改造或合成基因来完成，A正确；
B、α—淀粉酶（AmyS1）的化学本质是蛋白质，蛋白质工程的基本思路是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核糖核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质，正确；
C、将质粒B与信号肽（一段能够引导目标蛋白质分泌到细胞外的肽链）基因构建成质粒C，可以从导入质粒C的工程菌的培养液中提取获得AmyS2，C正确；
D、若用BamH I酶进行切割，会导致目的基因结构破坏，因此选择Nde I和EcoR I，既不会破坏目的基因，也能防止目的基因片段反向连接与质粒自身环化等问题；根据质粒C的结构以及信号肽基因上的酶切位点可知，将质粒B与信号肽基因构建成质粒C，应选择的限制酶是Mlu I和Eco 52Ⅰ，D错误。
故选D。
二、非选择题
11．天然胰岛素制剂易形成二聚体或六聚体，皮下注射后往往需要经历逐渐解聚的过程，这在一定程度上延缓了其疗效。科研人员研制出了速效胰岛素，研发流程如图所示。回答下列问题：
(1)据图可知，速效胰岛素的研发流程遵循蛋白质工程的基本思路，即从预期的蛋白质功能出发→_________→_________→_________→获得所需要的蛋白质。速效胰岛素的生产过程遵循_________法则。
(2)研制速效胰岛素的过程中，科研人员的直接操作对象是____________。在大肠杆菌中表达的新的胰岛素_________（填“有”或“没有”）生物活性，理由是__________。
(3)若想通过乳腺生物反应器来实现速效胰岛素的批量生产，则需要将新的胰岛素基因与 等调控元件重组在一起，用___________的方法，导入哺乳动物如羊的受精卵中，培育出转基因动物，待其进入泌乳期，其乳汁中即含速效胰岛素。
(4)若要比较速效胰岛素和天然胰岛素的疗效差异，请以糖尿病模型鼠为实验材料，简要写出实验设计思路：___________。
【答案】(1)设计预期的蛋白质结构 推测应有的氨基酸序列 找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因 中心
(2)（胰岛素）基因 没有 大肠杆菌是原核生物，没有内质网和高尔基体，不能对合成的蛋白质进行加工
(3)乳腺中特异表达的基因的启动子 显微注射
(4)将生理状况相同的糖尿病模型鼠随机均分为三组，一组皮下注射适量速效胰岛素，一组皮下注射等量天然胰岛素，一组皮下注射等量生理盐水，定时检测三组糖尿病模型鼠的血糖情况
【详解】（1）改造蛋白质从根本上来说就是改造基因，蛋白质工程的基本思路，即从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。速效胰岛素的生产过程遵循中心法则。
（2）要研制速效胰岛素，就需要研究胰岛素对应的基因。在大肠杆菌中表达的新的胰岛素没有生物活性，原因是大肠杆菌是原核生物，没有内质网和高尔基体，不能对合成的蛋白质进行加工。
（3）为了让胰岛素基因在乳腺细胞中表达，因此需要将新的胰岛素基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，用显微注射的方法，导入哺乳动物如羊的受精卵中，培育出转基因动物，待其进入泌乳期，其乳汁中即含速效胰岛素。
（4）本实验的自变量是胰岛素的种类（速效胰岛素和天然胰岛素），检测指标是小鼠的血糖情况，因此实验思路是将生理状况相同的糖尿病模型鼠随机均分为三组，一组皮下注射适量速效胰岛素，一组皮下注射等量天然胰岛素，一组皮下注射等量生理盐水，定时检测三组糖尿病模型鼠的血糖情况。
12．某网站报道，我国科学家建立了蛋白质从头设计新方法。报道中记述我国科研人员从头设计的9种蛋白质分子的高分辨晶体结构，其中5种蛋白质具有不同于已知天然蛋白的新颖结构。请回答下列相关问题：
(1)我国科学家建立的蛋白质从头设计新方法，即从________开始设计全新的蛋白质分子结构，获得不同于已知天然蛋白的新颖结构。通过________工程也可达到此目的，该工程通过________，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
(2)若要利用我国科学家建立的蛋白质从头设计的新方法获得全新的氨基酸序列，通过蛋白质工程、基因工程等途径从大肠杆菌中获得蛋白质，其操作的第一步是由此全新的氨基酸序列获得相应的________________，再利用PCR技术扩增；第二步是构建基因表达载体，第三步是将第二步中获得的结构导入大肠杆菌，在操作时一般要用Ca2＋处理大肠杆菌，目的是_______________________________________________________________________。
(3)构建基因表达载体的目的是_________________________________________。构建的基因表达载体除含目的基因外，还必须有____________________(至少答出三点)等。
【答案】(1)蛋白质三维结构　蛋白质　改造或合成基因　
(2)DNA序列　使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态　
(3)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用　复制原点、标记基因、启动子、终止子
【详解】(1)我国科学家建立了蛋白质从头设计新方法，即从蛋白质三维结构开始设计全新的蛋白质分子结构，获得不同于已知天然蛋白的新颖结构；结合分析可知，通过蛋白质工程也可达到此目的，该工程通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
(2)基因决定蛋白质的合成，故若要利用我国科学家建立的蛋白质从头设计的新方法获得全新的氨基酸序列，其操作的第一步是由此全新的氨基酸序列获得相应的DNA序列，再利用PCR技术扩增；第二步是构建基因表达载体；第三步是将第二步中获得的结构导入大肠杆菌，使用的方法是感受态细胞法，在操作时一般要用Ca2＋处理大肠杆菌，目的是使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
(3)构建基因表达载体也就是把目的基因和载体连接，目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用；构建的基因表达载体除含目的基因外.还必须有复制原点、标记基因、启动子、终止子等。
13．大米中铁含量极低，科研人员通过基因工程、植物组织培养等现代生物技术，培育出了铁含量比普通大米高60%的转基因水稻，改良了稻米的营养品质。如图为培育转基因水稻过程示意图，其中①～⑥为过程，EcoRⅠ、Hind Ⅲ、BamHⅠ为限制酶。
(1)该转基因水稻培育过程中选取的目的基因是____________________。PCR是获取大量目的基因的一种方法，PCR反应体系的成分中有两种引物，在复性时引物会结合到互补DNA链，对两种引物的设计要求之一是两种引物之间不能碱基互补配对，试分析原因：___________
______________________________________________________________________________；PCR反应体系的成分中能够决定复制特定DNA片段的是________(填“模板”“引物”或“Taq DNA聚合酶”)；从引物设计的角度考虑，如果目的基因两侧没有酶切位点，用PCR技术________(填“可以”或“不可以”)为目的基因设置酶切位点。
(2)完成图中①过程需选用________________限制酶处理Ti质粒和含目的基因的DNA。为了筛检成功导入重组质粒的农杆菌，1号培养基需要加入________。诱导组织细胞失去分化的是________号培养基。
(3)图中④⑤⑥过程，属于________________技术，该技术依据的基本原理(理论基础)是_
_______________________________________________。
【答案】(1)铁合蛋白基因　两种引物之问若能碱基互补配对，会导致引物结合形成双链，降低引物与DNA模板链结合的效率　引物　可以　
(2)BamHⅠ和Hind Ⅲ　潮霉素　2　
(3)植物组织培养　植物细胞的全能性
【详解】(1)据题图分析，目的基因为铁合蛋白基因。两种引物之间若能碱基互补配对，会导致引物结合形成双链，降低引物与DNA模板链结合的效率。PCR过程中，根据一段已知目的基因的核苷酸序列来合成引物，所以决定复制特定DNA片段的是引物。获得目的基因后一般需要将目的基因连接到质粒载体上，在引物上加酶切位点可以使后续的连接过程简单、可控，因此如果目的基因两侧没有酶切位点，用PCR技术可以为目的基因设置酶切位点。
(2)题图中①过程为基因表达载体的构建。若选用EcoRⅠ限制酶，会破坏目的基因，由于目的基因两侧的酶切位点被Hind Ⅲ、BamHⅠ限制酶识别，且质粒中也存在同样的酶切位点，则所选用的限制酶为BamHⅠ和Hind Ⅲ。质粒中的标记基因是潮霉素抗性基因，所以成功导入重组质粒的农杆菌能够抗潮霉素，则1号培养基需要加入潮霉素。3号培养基中培养的为愈伤组织，其为脱分化的结果，则诱导组织细胞失去分化的是2号培养基。
(3)据题图分析，④⑤⑥过程属于植物组织培养，依据的原理是植物细胞的全能性。
2 / 2第3章 基因工程
第4节 蛋白质工程的原理和应用
知识一 蛋白质工程的概念及基本原理
1．概念
蛋白质分子的_____________及其与_____________的关系为基础，通过改造或合成______来改造_______蛋白质进行或制造出____________________。
(1)基础：蛋白质分子的_____________及其与______________的关系。
(2)手段：通过_____________________，来_______________，或制造一种______________。
2．崛起的缘由
(1)基因工程的实质和不足：
①实质：将一种生物的基因转移到________________,后者可以产生它本不能产生的___
__________，进而表现出_____________。
②基因工程存在的不足：原则上只能生产自然界_____________的蛋白质。
(2)天然蛋白质的不足：天然蛋白质的结构和功能符合_____________生存的需要，却不一定完全符合_________________的需要。
(3)理论和技术条件的发展：______________、晶体学以及计算机技术的迅速发展。
3．基本原理
(1)目标：根据人们对蛋白质功能的_______________，对蛋白质的结构进行______________。
(2)原理：由预期的蛋白质找到相对应的_________________(基因)。
(3)蛋白质工程的实质：_____________或______________
由于基因决定蛋白质，因此要对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过改造或合成基因来完成。
(4)基本思路：预期蛋白质功能→设计预期的_______________→推测应有的_____________
→找到并改变相对应的_________________(基因)。
[例1]蛋白质工程为改造蛋白质的结构和功能提供了新的途径。下列叙述正确的是（　　）
A．蛋白质工程的最终目的是分析蛋白质的三维结构
B．蛋白质工程和基因工程的操作对象存在差异
C．现有基因的脱氧核苷酸序列是蛋白质工程设计实施的出发点
D．利用蛋白质工程技术改造蛋白质的过程仍遵循中心法则
[例2]下图为蛋白质工程操作的基本思路，下列相关叙述正确的是(　　)
A.图中⑤⑥过程分别是转录、翻译
B.蛋白质工程的直接操作对象是蛋白质，不需要对基因进行操作
C.根据蛋白质的氨基酸序列推测出的mRNA的碱基序列是唯一的
D.蛋白质工程的目的是改造现有蛋白质或制造新的蛋白质，满足人类的需求
知识二 蛋白质工程的应用
1．在医药工业方面的应用
(1)研发速效胰岛素类似物：从而有效抑制了__________________，研发出速效胰岛素类似物。
(2)提高干扰素的保存期：将干扰素分子上的一个_____________变成_____________，提高了干扰素的保存时间。
(3)制备人鼠嵌合抗体
①医学问题：小鼠单克隆抗体会使人产生______________，从而导致它的治疗效果大大降低。
②解决方法：通过改造基因，将小鼠抗体上______________的区域(即可变区)“嫁接”到__
___________(即恒定区)上(如图所示)，经过这样改造的抗体诱发免疫反应的强度就会降低很多。
2．在其他工业和农业方面的应用
（1）工业方面
蛋白质工程被广泛用于_____________或开发新的_____________。
（2）农业方面
科学家正在尝试改造某些参与调控光合作用的酶，以提高__________________，增加粮食的产量；利用蛋白质工程的思路来设计优良微生物农药，通过改造___________________，使它防治病虫害的效果增强。
[例1]研究人员利用点突变技术将干扰素（IFN）第17位的半胱氨酸诱变为丝氨酸后，发现其抗病毒活性提高了100倍，且这种新型的IFN在-70℃下保存150天后仍然稳定。下列相关叙述错误的是（ ）
A．点突变技术通常是直接对蛋白质进行操作，使氨基酸改变
B．IFN抗病毒活性发生改变的直接原因是其空间结构发生改变
C．该技术为蛋白质工程，蛋白质工程常利用的工具酶有限制酶和DNA连接酶等
D．经改造后的新型IFN活性强、稳定性高的性状是可以遗传的
[例2]T4溶菌酶是一种工业用酶，但在温度较高时容易失活。科学家利用蛋白质工程，将T4溶菌酶的第3位异亮氨酸变为半胱氨酸，获得了耐高温的T4溶菌酶。下列叙述正确的是（ ）
A．蛋白质工程和基因工程的根本区别是操作对象的差异
B．自然界中所有的酶都可通过蛋白质工程进行改造
C．根据设计的T4溶菌酶的氨基酸序列只能推测出一种脱氧核苷酸序列
D．改造后的T4溶菌酶还需进一步测定酶活力等才能应用到生产实践中
难点知识一 蛋白质工程相关理论
1．思路
2．流程
3．蛋白质工程和基因工程的比较
项目 蛋白质工程 基因工程
操作对象 基因 基因
操作起点 预期蛋白质功能 目的基因
操作水平 DNA分子水平 DNA分子水平
操作流程 预期蛋白质功能→设计蛋白质结构→推测氨基酸序列→找到并改变对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新基因→获得所需要的蛋白质 目的基因的筛选与获取→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
结果 可生产自然界没有的蛋白质 生产自然界已有的蛋白质
实质 通过改造或合成基因来定向改造现有蛋白质或制造新的蛋白质 将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状
联系 ①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程； ②蛋白质工程离不开基因工程，其包含基因工程的基本操作。
4．判断基因工程和蛋白质工程的技巧
讨论1：对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？原因是什么？
讨论2：如何由蛋白质氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列？
讨论3：确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因？
讨论4：蛋白质工程和基因工程的操作对象以及得到的蛋白质相同吗？
巩固训练1
蛋白质工程是基因工程的延伸，下列关于蛋白质工程的叙述，错误的是（ ）
A．通过蛋白质工程改造后的蛋白质的性状不可以遗传
B．蛋白质工程和基因工程都需要构建基因表达载体
C．蛋白质工程需要限制酶、DNA连接酶和载体等工具
D．蛋白质工程经常要建立蛋白质高级结构的三维模型
巩固训练2
下列关于蛋白质工程和基因工程的比较，不合理的是（　　）
A．蛋白质工程的操作起点是从预期的蛋白质功能出发，设计出相应的基因，并借助基因工程实现
B．蛋白质工程是在基因工程的基础上发展起来的，蛋白质工程最终还是要通过基因修饰或基因合成来完成
C．当得到可以保存半年的干扰素后，在相关酶、氨基酸和适宜的温度、pH条件下，干扰素可以大量自我合成
D．基因工程和蛋白质工程产生的变异都是可遗传的
一、选择题
1．蛋白质工程是基因工程的延伸。下列有关蛋白质工程的叙述，正确的是（ ）
A．蛋白质工程是基因工程的延伸，所以不需要遵循中心法则
B．蛋白质工程中可以不用构建基因表达载体
C．生产的蛋白质能在自然界中找到
D．需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶
2．我国科学家刘海燕教授团队开辟了一条全新的蛋白质从头设计的路线（如图所示），实现了核心技术的原始创新，为工业酶、生物医学蛋白等功能蛋白的设计奠定了基础。下列有关蛋白质的叙述错误的是（ ）
A．分泌蛋白合成旺盛的细胞中核仁较小
B．用该技术设计的工业酶可含有C、H、O、N四种元素
C．设计蛋白质的结构时首先要设计蛋白质主链的氨基酸序列
D．蛋白质的合成需要核酸的参与，核酸的合成也需要蛋白质的参与
3．腈水合酶（N0）广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域，但不耐高温。利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶（N1）。下列有关叙述错误的是（　　）
A．N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一
B．加入连接肽需要通过改造基因实现
C．获得N1的过程需要进行转录和翻译
D．检测N1的活性时先将N1与底物充分混合，再置于高温环境
4．萤火虫的荧光素酶能催化ATP激活的荧光素氧化发光，这一现象在生物检测和成像方面有重要的应用价值。为了解决天然荧光素酶不能高效催化人工合成的荧光素DTZ发光的问题，研究人员采用蛋白质工程（又称为第二代基因工程）对它进行了改造。下列关于蛋白质工程改造天然荧光素酶的叙述，正确的是（　　）
A．通过化学诱变剂可定向改造天然荧光素酶的基因序列
B．改造天然荧光素酶所用的基因表达载体不需要启动子和终止子
C．可用PCR方法检测突变的荧光素酶基因是否翻译成蛋白质
D．改造后的荧光素酶在一定条件下催化DTZ发光是将化学能转化为光能
5．研究发现，为心梗患者注射适量t-PA蛋白会诱发颅内出血，但若将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血等副作用，改良后的t-PA蛋白成为心梗和脑血栓的急救药。下图所示，通过基因工程大量制备改良药物t-PA蛋白，下列说法错误的是（ ）

A．制备改良t-PA蛋白的过程属于蛋白质工程
B．利用重组pCLY11质粒可获得牛乳腺生物反应器
C．选用限制酶XmaI和BglⅡ切割质粒pCLY11，构建重组质粒
D．成功导入重组质粒的受体细胞在含有新霉素的培养基上能存活，且呈现蓝色
6．科学家选取纤维素酶分子中若干个氨基酸位点作为改造点，结合中心法则原理，构建了“小而精”的突变体文库，最终获得催化效率更高的纤维素酶分子。下列说法错误的是(　　)
A.改造纤维素酶分子的前提是已知纤维素酶的氨基酸序列及其空间结构
B.该过程设计出的高效纤维素酶分子可能是自然界中不存在的蛋白质
C.该过程的实质是对纤维素酶基因在分子水平上进行改造
D.纤维素酶和高效纤维素酶在细胞内合成过程中遗传信息的流向不同
7．我国科研人员在实验室中通过构建多酶催化体系的方法，首次实现了在细胞外从二氧化碳固定到合成淀粉的过程。下列有关叙述错误的是(　　)
A.可采用PCR技术从不同物种的基因组中扩增得到多酶催化体系中的目标酶基因
B.在多酶催化体系中，可能会因为酶的最适反应条件不同而使反应中断
C.该方法可在分子水平上直接改变氨基酸的序列，实现对酶特性的改造和优化
D.若该科研成果成熟后推广应用有助于摆脱耕地和自然环境限制，解决粮食危机
8．研究发现，胰岛素进入血液循环后容易被降解，糖尿病患者需要反复注射胰岛素才能达到治疗效果。科研人员借助蛋白质工程改变了胰岛素中的某些氨基酸，提高了胰岛素在患者体内的稳定性，延长了其作用时间。下列有关叙述错误的是（　　）
A．蛋白质工程的实质是在 DNA 分子水平上进行改造或合成
B．氨基酸序列的差异是影响胰岛素在患者体内是否稳定的原因之一
C．改造胰岛素应首先从设计胰岛素基因中的脱氧核苷酸序列出发
D．蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，因此蛋白质工程难度很大
9．已知生物体内有一种蛋白质（P），该蛋白质是一种载体蛋白，由 305 个氨基酸组成。科学家将P 分子中第158 位的丝氨酸替换成亮氨酸，第240位的谷氨酰胺替换成苯丙氨酸，从而得到了新的蛋白质，将其命名为P ，P 不但保留P 的功能，而且还具有了酶的催化活性。下列说法正确的是（ ）
A．P 蛋白与P 蛋白相比，可以提高相关化学反应的活化能
B．P 蛋白与P蛋白一样，分子或离子通过时不需要与之结合
C．P 蛋白与P 蛋白相比，肽键数目相等但是必需氨基酸含量降低
D．P蛋白改造成 P 蛋白可用基因定点突变技术来进行碱基的替换
10．科研人员从某热泉的细菌中发现一种α-淀粉酶（AmyS1）,利用蛋白质工程对其进行改造，获得了具有更高热稳定性和催化效率的重组耐高温α-淀粉酶（AmyS2）。获取AmyS2基因后，构建基因表达载体的过程如图所示。该过程中，将目的基因与原始质粒A构建成质粒B,将质粒B与信号肽（一段能够引导目标蛋白质分泌到细胞外的肽链）基因构建成质粒C。下列分析不正确的是（ ）
A．对淀粉酶结构进行改造最终要通过改造或合成基因来完成
B．生产AmyS2是从预期AmyS2功能出发设计其氨基酸序列
C．可以从导入质粒C的工程菌的培养液中提取获得AmyS2
D．构建质粒B和C,选择的限制酶分别是NdeI和EcoRI、BamHI和Eco52 I
二、非选择题
11．天然胰岛素制剂易形成二聚体或六聚体，皮下注射后往往需要经历逐渐解聚的过程，这在一定程度上延缓了其疗效。科研人员研制出了速效胰岛素，研发流程如图所示。回答下列问题：
(1)据图可知，速效胰岛素的研发流程遵循蛋白质工程的基本思路，即从预期的蛋白质功能出发→_________→_________→_________→获得所需要的蛋白质。速效胰岛素的生产过程遵循_________法则。
(2)研制速效胰岛素的过程中，科研人员的直接操作对象是____________。在大肠杆菌中表达的新的胰岛素_________（填“有”或“没有”）生物活性，理由是__________。
(3)若想通过乳腺生物反应器来实现速效胰岛素的批量生产，则需要将新的胰岛素基因与 等调控元件重组在一起，用___________的方法，导入哺乳动物如羊的受精卵中，培育出转基因动物，待其进入泌乳期，其乳汁中即含速效胰岛素。
(4)若要比较速效胰岛素和天然胰岛素的疗效差异，请以糖尿病模型鼠为实验材料，简要写出实验设计思路：___________。
12．某网站报道，我国科学家建立了蛋白质从头设计新方法。报道中记述我国科研人员从头设计的9种蛋白质分子的高分辨晶体结构，其中5种蛋白质具有不同于已知天然蛋白的新颖结构。请回答下列相关问题：
(1)我国科学家建立的蛋白质从头设计新方法，即从________开始设计全新的蛋白质分子结构，获得不同于已知天然蛋白的新颖结构。通过________工程也可达到此目的，该工程通过________，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
(2)若要利用我国科学家建立的蛋白质从头设计的新方法获得全新的氨基酸序列，通过蛋白质工程、基因工程等途径从大肠杆菌中获得蛋白质，其操作的第一步是由此全新的氨基酸序列获得相应的________________，再利用PCR技术扩增；第二步是构建基因表达载体，第三步是将第二步中获得的结构导入大肠杆菌，在操作时一般要用Ca2＋处理大肠杆菌，目的是_______________________________________________________________________。
(3)构建基因表达载体的目的是_________________________________________。构建的基因表达载体除含目的基因外，还必须有____________________(至少答出三点)等。
13．大米中铁含量极低，科研人员通过基因工程、植物组织培养等现代生物技术，培育出了铁含量比普通大米高60%的转基因水稻，改良了稻米的营养品质。如图为培育转基因水稻过程示意图，其中①～⑥为过程，EcoRⅠ、Hind Ⅲ、BamHⅠ为限制酶。
(1)该转基因水稻培育过程中选取的目的基因是____________________。PCR是获取大量目的基因的一种方法，PCR反应体系的成分中有两种引物，在复性时引物会结合到互补DNA链，对两种引物的设计要求之一是两种引物之间不能碱基互补配对，试分析原因：___________
______________________________________________________________________________；PCR反应体系的成分中能够决定复制特定DNA片段的是________(填“模板”“引物”或“Taq DNA聚合酶”)；从引物设计的角度考虑，如果目的基因两侧没有酶切位点，用PCR技术________(填“可以”或“不可以”)为目的基因设置酶切位点。
(2)完成图中①过程需选用________________限制酶处理Ti质粒和含目的基因的DNA。为了筛检成功导入重组质粒的农杆菌，1号培养基需要加入________。诱导组织细胞失去分化的是________号培养基。
(3)图中④⑤⑥过程，属于________________技术，该技术依据的基本原理(理论基础)是_
_______________________________________________。
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