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第3章 基因工程
第2节 基因工程的基本操作程序
培育转基因抗虫棉的四个步骤：_____________________、_____________________、___
__________________以及_____________________。
知识一 目的基因的筛选与获取
1．目的基因
(1)概念：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期_____________等的基因就是目的基因。
(2)作用：根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指_____________的基因。
(3)类型：与_____________、_____________、_____________和工业用酶等相关的基因，如培育转基因抗虫棉用到的________________，即Bt基因。
2．筛选合适的目的基因
(1)从__________________________的基因中进行筛选是较为有效的方法。
(2)实例：在培育转基因抗虫棉之前，科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，也对Bt基因的表达产物——Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。
(3)认识基因结构和功能的技术方法：DNA测序技术、序列数据库、序列比对工具。
3．获取目的基因的方法
(1)人工合成目的基因。
(2)常用___________特异性地快速扩增目的基因。
(3)通过构建_____________来获取目的基因。
4．利用PCR获取和扩增目的基因
(1)PCR的含义：PCR是________________的缩写，它是一项根据_______________的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对_____________的核苷酸序列进行大量复制的技术。
(2)基本条件
(3)过程
基于PCR的过程，完成下列问题：
①过程Ⅰ为__________，该阶段的温度为__________以上，目的是使双链DNA解聚为__________。
②过程Ⅱ为__________，该阶段的温度为__________左右，两种引物通过____________与两条单链DNA结合。
③过程Ⅲ为__________，该阶段的温度为__________左右，该过程需要在_______________的催化下，利用_______________为原料，根据碱基互补配对原则从引物的3′端延伸合成新的子链DNA。
(4)仪器：_____________(PCR仪)。
(5)PCR产物的鉴定方法：________________。
[例1]下列有关获取目的基因的叙述，错误的是(　　)
A.目的基因就是编码蛋白质的基因
B.获取目的基因是基因工程的第一步
C.来自苏云金杆菌的Bt抗虫蛋白基因可作为转基因抗虫棉的目的基因
D.序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会
[例2]下列不属于获取目的基因的方法是（　　）
A.从基因文库中提取
B.利用PCR技术合成
C.利用DNA转录合成
D.利用化学方法人工合成
[例3]如图表示利用PCR扩增目的基因的过程，下列相关叙述错误的是(　　)
A.利用PCR扩增目的基因时DNA全解旋再复制，与细胞内DNA复制不同
B.①过程中高温的作用与解旋酶相同，目的是使两条链间的氢键断裂
C.用PCR扩增目的基因时，需要知道目的基因的全部碱基序列
D.③过程使用的酶具有热稳定性，在高温下不会发生结构改变而失去催化活性
知识二 基因表达载体的构建
1．构建基因表达载体的目的
(1)使目的基因在受体细胞中_____________，并且遗传给下一代。
(2)使目的基因能够__________和发挥作用。
2．基因表达载体的组成
3．基因表达载体的构建过程
(1)首先用一定的__________切割载体。
(2)然后用__________限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
(3)再利用___________将目的基因片段拼接到载体的切口处(如图所示)。
[例1]下列关于基因表达载体的说法，错误的是(　　)
A.基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤
B.基因表达载体包含启动子、目的基因、终止子、标记基因等
C.终止子位于目的基因的下游，能够终止翻译过程
D.不同的目的基因所需的启动子不一定相同
[例2]在基因工程的操作过程中，获得重组质粒不需要（　　）
①DNA连接酶　②限制性内切核酸酶 ③RNA聚合酶　④具有标记基因的质粒　⑤目的基因　⑥四种脱氧核苷酸
A.③⑥ B.②④
C.①⑤ D.①②④
知识三 将目的基因导入受体细胞
1．转化
目的基因进入受体细胞，并在受体细胞内__________和__________的过程。
2．目的基因导入受体细胞的方法
(1)目的基因导入植物细胞
①花粉管通道法
Ⅰ.用微量注射器将含目的基因的DNA溶液____________中。
Ⅱ.在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助____________进入__________。
②农杆菌转化法
Ⅰ.农杆菌的特点：农杆菌自然条件下侵染____________和____________；农杆菌的______
__________能够整合到所侵染细胞的______________上。
Ⅱ.转化方法：将目的基因插入农杆菌_______________中，让农杆菌_________________。
提示：受体细胞可以是_____________或____________，因为植物细胞具有全能性。
(2)目的基因导入动物细胞
①常用方法：______________。
②常用受体细胞：___________。
提示：受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的_____________，而高度分化的动物体细胞的全能性受到抑制。
(3)目的基因导入微生物细胞
①方法：用_____________，使细胞处于一种能__________周围环境中____________的生理状态，然后将重组表达载体导入其中。
②常用受体细胞：原核细胞(使用最广泛的是____________)。
提示：大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌为原核细胞，而酵母菌为_____________(具有多种细胞器)，所以酵母菌在用于生产需要加工和分泌的蛋白质时比大肠杆菌有优势。
[例1]受体细胞不同，将目的基因导入受体细胞的方法也不相同，下列受体细胞与导入方法匹配错误的一项是(　　)
选项 受体细胞 导入方法
A 棉花细胞 花粉管通道法
B 大肠杆菌 农杆菌转化法
C 羊受精卵 显微注射法
D 番茄细胞 农杆菌转化法
[例2]下列有关将目的基因导入受体细胞的叙述，正确的是（　　）
A．将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法
B．原核生物有繁殖快、遗传物质少等特点，可用于生产各种有生物活性的蛋白质
C．基因枪法是将目的基因导入动物细胞中最为有效的方法
D．可将含有目的基因的植物病毒作为载体导入Ca2＋处理后的大肠杆菌细胞
知识四 目的基因的检测与鉴定
1．操作目的
检测和鉴定___________是否可以在受体细胞中___________和______________是基因工程的第四步工作，也是检查基因工程是否成功的一步。
2．个体水平检测
(1)检测内容:是否有抗性以及抗性的程度;基因工程产品与天然产品的功能活性是否相同。
(2)检测方法:转基因生物的抗性接种实验,比较基因工程产品与天然产品的功能活性。
(3)结果显示:是否赋予了预期抗性或蛋白质活性。
3．分子水平检测
检测内容 方法 结果显示
目的基因是否插入转基因生物的DNA上 　 电泳带(琼脂糖凝胶电泳来鉴定)
目的基因是否转录出mRNA 　
目的基因是否翻译成蛋白质 是否出现杂交带
[例1]下列用于判断目的基因是否转移成功的方法，不属于分子水平的检测的是(　　)
A.通过观察害虫吃棉叶是否死亡
B.通过PCR检测棉花的染色体DNA上是否插入抗虫基因
C.检测转基因生物中是否转录出相应的mRNA
D.从转基因生物中提取的蛋白质利用抗原—抗体杂交检测是否翻译成功
[例2]目的基因导入受体细胞后，需要检测目的基因是否可以维持稳定和表达其遗传特性。下列关于目的基因的检测和鉴定的叙述，正确的是（　　）
A．目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键是能否转录出mRNA
B．可采用PCR检测目的基因是否转录和翻译
C．可从转基因生物中提取蛋白质来检测目的基因是否翻译成相应蛋白质
D．抗虫、抗病检验用于确定转基因生物是否具备相关性状属于分子水平的检测
难点知识一 利用PCR获取和扩增目的基因
1．条件
条件或参与的组分 在DNA复制中的作用
高温 使DNA双链间的氢键断裂，解聚为单链
DNA母链（DNA模板） 提供DNA复制的模板
4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料
耐高温的DNA聚合酶 催化合成DNA子链
两条模板链结合的2种引物(长度通常为20～30个核苷酸) 2种，分别与两条模板链结合，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
2．PCR技术与体内DNA复制的比较
PCR技术 DNA复制
相同点 原则 碱基互补配对
条件 DNA母链作为模板、引物、 4种脱氧核苷酸为原料（PCR技术实为dNTP）
延伸方向 新链都是从5’端向3’端延伸
不同点 解旋方式 90℃以上高温解旋 解旋酶催化
场所 体外-PCR扩增仪（PCR仪） 体内-主要在细胞核
延伸用酶 耐高温的DNA聚合酶（Taq酶） DNA聚合酶
温度 控制温度，需要在不同温度下进行（90℃以上变性、50℃左右复性、72℃左右延伸） 体内温和条件
过程
结果 大量的DNA片段（目的基因） 形成完整的子代DNA
3．引物
（1）设计引物的依据是：目的基因两端的核苷酸序列。
（2）引物设计时既要考虑目的基因序列，又要考虑载体序列，原因是：为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5’端加上限制酶的酶切位点。
（3）引物设计的要求（或引物失效的原因）
a.每种引物内部不能发生局部碱基互补配对。
b.两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对。
（4）每种引物内部不能发生局部碱基互补配对的原因：防止引物自身折叠。
（5）两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对的原因：防止引物之间配对，导致引物不能同模板链结合。
（6）引物长度一般为20-30个核苷酸，若引物长度过短，则引物与模板链结合的特异性较差。
4．扩增目的基因图解
5．结果
复制次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物的DNA 分子数 2 4 8 2n
含其中一种引物的 DNA分子数 21-1 22-1 23-1 2n-1
同时含两种引物的DNA分子数 21-2 22-2 23-2 2n-2
共消耗引物的分子数 22-2 23-2 24-2 2n+1-2
6．PCR产物的鉴定——琼脂糖凝胶电泳
（1）原理
①带电粒子：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。
②迁移动力与方向：在电场的作用下，带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
③迁移速率：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
④检测：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
（2）操作流程
（3）结果（以目的基因为750bp为例）
讨论1：PCR过程中为什么需要引物 引物的作用是什么 引物为什么是两种
讨论2：PCR扩增目的基因需要知道目的基因的全部核苷酸序列吗
讨论3：PCR扩增目的基因时，为什么复性温度的设定是成败的关键之一？影响复性温度的因素有哪些
讨论4：PCR过程中两种引物的碱基序列能否互补 说明理由。
讨论5：要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？
讨论6：在利用PCR获取和扩增目的基因时,从第几轮循环才会产生完整的目的基因
讨论7：用PCR可以扩增mRNA吗？
讨论8：电泳结果如果未出现条带，可能原因是什么？出现不止一条条带，可能原因是什么？
巩固训练1
下列关于PCR技术的叙述，错误的是(　　)
注：A、B、C、D是引物，箭头是延伸方向。
A.PCR技术的原理是DNA的复制
B.该反应体系缓冲液中一般要添加Mg2＋，以激活DNA聚合酶
C.引物应选用图中的A、D
D.引物是一小段DNA或RNA，用于PCR的引物长度通常为30～40个核苷酸
巩固训练2
下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是(　　)
A.二者子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端
B.二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋
C.体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量
D.二者遵循的碱基互补配对原则相同
巩固训练3
下图表示PCR过程中某个阶段反应体系的情况，①②③④表示相关物质，L、R表示方向。下列叙述正确的是（ ）
A．②链从L到R的方向为3′→5′，①②链均可作为子链合成的模板
B．PCR过程需要通过解旋酶断开氢键，且为边解旋边复制
C．以1个DNA为模板经3次循环需消耗7个引物③
D．物质③的5′端添加了某序列，至少需经3次循环才可获得该序列的双链产物
巩固训练4
某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是（ ）
A．增加模板DNA的量 B．延长热变性的时间
C．延长延伸的时间 D．提高复性的温度
难点知识二 基因表达载体的构建
1．过程
2．限制酶的选择方法
根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及是否破坏目的基因和标记基因来确定限制酶的种类。（以图甲、乙为例分析）
(1)应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst Ⅰ；不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
(2)为避免目的基因及质粒的自身环化、反向连接，也可使用不同的限制酶(非同尾酶)切割目的基因所在片段和质粒(双酶切)，如图甲可选择用Pst Ⅰ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。
(3)切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，以用于重组DNA的鉴定和选择，如图乙中的质粒不能使用Sma Ⅰ切割。
3．基因表达载体的组成
(1)启动子
①本质：一段有特殊序列结构的DNA片段。
②位置：位于基因的上游，紧挨转录的起始位点。
③功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
④特殊类型：诱导型启动子。
⑤诱导型启动子的特点：当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。
(2)终止子
①本质：一段有特殊序列结构的DNA片段。
②位置：位于基因的下游。
③功能：使转录在所需要的地方停下来。
(3) 标记基因
①作用：便于重组DNA分子的筛选。
②常见类型抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等
(4)启动子和起始密码子、终止子和终止密码子的区别
启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
化学成分 DNA片段 DNA片段 mRNA上三个相邻碱基 mRNA上三个相邻碱基
位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
作用 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 决定转录的结束 翻译的起始信号 决定翻译过程的结束
讨论1：为什么不直接把目的基因导入受体细胞，而要用载体？
讨论2：作为基因工程表达载体,需要含有的功能元件有哪些
讨论3：构建基因表达载体时目的基因插入的位置应该在哪里 为什么
讨论4：用同一种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA，再用DNA连接酶处理后，形成的产物一定符合要求吗？如何避免存在的问题？
巩固训练5
某目的基因两侧的DNA序列所含的限制性内切核酸酶切割位点如图所示，用下列质粒作为载体最好选用(　　)
巩固训练6
下图所示为基因工程中的相关物质或结构，已知酶Ⅰ切割后可形成图1所示结构，酶Ⅱ的识别序列和切割位点如图2所示，质粒结构如图3所示，目的基因两侧的酶切位点如图4所示，下列有关叙述错误的是（ ）

A．图1中a所示部位与图2中箭头所示部位的结构相同
B．酶Ⅰ和酶Ⅱ切割后的DNA片段可以用E·coliDNA连接酶连接
C．启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，能启动转录过程
D．使用酶Ⅰ和酶Ⅱ同时处理质粒、目的基因，能防止自身环化
难点知识三 将目的基因导入受体细胞
1．目的基因导入不同受体细胞的方法
2．农杆菌转化法
(1)过程
(2)两次拼接和两次导入的比较
第一次拼接是将目的基因拼接到 Ti质粒的T－DNA 上；
第二次拼接(非人工直接操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的 染色体DNA 上；
第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入 农杆菌(Ca2+处理法) ；
第二次导入(非人工直接操作)是指含目的基因的T－DNA导入 受体细胞(农杆菌转化法) 。
讨论1：目的基因导入受体细胞时，不同生物常用的受体细胞分别是什么及其原因。
讨论2：在用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，一定要将目的基因插入Ti质粒的T－DNA上的原因是什么？
讨论3：花粉管通道法与农杆菌转化法相比有什么优点
讨论4：农杆菌转化法中有几次拼接和导入过程
巩固训练7
我国科学家独创的花粉管通道法，可以使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞，是一种十分简便经济的方法，对此认识正确的是(　　)
A.不必构建表达载体就可以直接导入
B.此方法可用于转基因动物
C.受体细胞只能是植物的卵细胞
D.有时可以取代农杆菌转化法
巩固训练8
如图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述错误的是（　　）
A．①→②过程可用不同的限制酶分别切割Ti质粒和含抗虫基因的DNA
B．②→③过程可用Ca2+处理农杆菌细胞
C．③→④过程是将重组Ti质粒整合到受体植物细胞的染色体DNA上
D．④→⑤过程体现了植物细胞的全能性，不同阶段所需的培养条件不同
难点知识四 目的基因的检测与鉴定
1．目的基因的检测与鉴定
（1）检测与鉴定顺序
（2）核酸水平上其他检测技术——分子杂交技术
①DNA水平
②RNA水平
（3）抗原-抗体杂交技术
2．个体生物学水平检测的具体方法及成功标志
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物 饲喂害虫(抗虫接种实验) 害虫死亡
抗病毒(菌)植物 病毒(菌)接种实验 未染病
抗盐植物 盐水浇灌 正常生长
抗除草剂植物 喷洒除草剂 正常生长
获取目的基因产物的转基因生物 提取细胞产物与天然产品进行功能、活性比较 细胞产物功能活性正常
讨论1：标记基因筛选呈阳性一定能确定目的基因导入受体细胞了吗？
讨论2：如何检测目的基因是否整合到受体细胞的染色体上？
讨论3：如果目的基因是抗虫基因，在个体水平上怎样检测？如果目的基因是耐盐基因呢？
巩固训练9
利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列各项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是(　　)
A.番茄细胞中检测到鱼的抗冻蛋白
B.大肠杆菌中检测到人干扰素基因的mRNA
C.山羊乳腺细胞中检测到人生长激素的DNA序列
D.酵母菌细胞中提取到人胰岛素基因
巩固训练10
绿叶海天牛(简称甲)吸食滨海无隔藻(简称乙)后，身体就逐渐变绿，这些“夺来”的叶绿体能够在甲体内长期稳定存在，有科学家推测其原因是在甲的染色体DNA上可能存在乙的编码叶绿体部分蛋白的核基因。为证实上述推测，以这种变绿的甲为材料进行实验，方法和结果最能支持上述推断的是(　　)
A.提取甲的全部DNA，通过PCR技术能克隆出乙的编码叶绿体部分蛋白的核基因
B.通过PCR等技术，在甲体内检测到乙的编码叶绿体部分蛋白的核基因转录出的RNA
C.给甲提供14CO2，一段时间后检测到其体内的部分有机物出现放射性
D.以乙的编码叶绿体部分蛋白的核基因为探针与甲的染色体DNA杂交，结果显示出杂交带
一、选择题
1．科学家利用重组DNA技术将参与β－胡萝卜素合成的A、B两种酶的基因转入水稻，生产出富含β－胡萝卜素的“黄金大米”。下列关于“黄金大米”的培养过程的叙述，正确的是(　　)
A.所用限制酶的识别位点不能在控制A、B两种酶合成的基因中
B.利用PCR扩增控制A酶合成的基因时，设计的两种引物的碱基序列应互补
C.构建基因表达载体时，选用的质粒中必须含有抗生素抗性基因
D.最好选用E.coli DNA连接酶将具有平末端的控制B酶合成的基因与质粒连接在一起
2．下列关于PCR的叙述，正确的是(　　)
A.PCR是体外复制DNA技术，关键酶是解旋酶和DNA聚合酶
B.DNA聚合酶从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸
C.第三轮循环产物中出现位于两种引物之间的DNA片段
D.延伸过程需要酶、ATP和4种核糖核苷酸
3．X基因是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝X基因，需在PCR反应体系中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。经4轮循环后产物中有5种不同的DNA分子，下列叙述错误的是(　　)
A.第一轮复制得到2个DNA分子，即①②各1个
B.第二轮复制得到4个DNA分子，即①②③④各1个
C.第三轮复制得到8个DNA分子，其中有2个等长的，也就是有2个X基因
D.第四轮复制得到16个DNA分子，其中有4个X基因
4．下图为pUC18质粒图谱，已知目的基因两侧的酶切位点为EcoRI和BamHI。现需将目的基因插入质粒的LacZ基因内，形成重组质粒并导入受体细胞。下列限制酶组合选择及后续处理最合适的是（ ）
（注：图中amp8为氨苄青霉素抗性基因、Ori为复制原点，LacZ表达产物可使X-gal的培养基呈现蓝色）
A．用BamHI酶切质粒和目的基因，将细胞涂布于含氨苄青霉素的培养基
B．用EcoRI酶切质粒和目的基因，将细胞涂布于含氨苄青霉素和X-gal的培养基
C．用EcoRI和BamHI酶切质粒和目的基因，将细胞涂布于含X-gal的培养基
D．用EcoRI和BamHI酶切质粒和目的基因、将细胞涂布于含氨苄青霉素和X-gal的培养基
5．由于某目的基因酶切后的末端为平末端，载体E只有产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将目的基因接入载体E。据图分析，下列叙述正确的是（ ）

A．通过PCR扩增获取目的基因是基因工程的核心工作
B．为了便于该目的基因接入载体E，可用限制酶EcoRV或SmaI切割载体P
C．载体P不能作为基因表达载体，是因为其没有表达该目的基因的启动子与终止子
D．若受体细胞表现出抗性基因的相应性状，表明重组载体成功导入受体细胞
6．用酵母菌来生产人的胰岛素，需要构建基因表达载体，相关叙述错误的是（　　）
A．基因表达载体的构建是在生物体内完成的
B．构建基因表达载体的目的有使目的基因在受体细胞中能稳定存在且能遗传给下一代
C．DNA连接酶不能识别特定的核苷酸序列
D．基因表达载体的构建是基因工程的核心
7．载体是基因工程中携带外源DNA片段(目的基因)进入受体细胞的重要运载工具，常见的载体类型主要有基因克隆载体和基因表达载体。下图是利用细菌生产人胰岛素的基本流程示意图，下列相关叙述错误的是(　　)
A.重组载体A、重组载体B分别是基因克隆载体和基因表达载体
B.载体A和载体B都必须含有限制酶切割位点、复制原点和标记基因
C.必须把目的基因插入重组载体A的启动子和终止子之间
D.培养细菌A和细菌B的培养基在营养成分和功能上有明显差异
8．GUS基因作为一种报告基因，编码β－葡萄糖苷酸酶，该酶可催化特定底物水解，产生蓝色化合物，借此用来观察转基因植物中外源基因的表达情况，鉴定转基因植株。下列说法错误的是(　　)
A.GUS基因是有遗传效应的DNA片段，由多个核糖核苷酸构成
B.GUS基因编码β－葡萄糖苷酸酶合成的过程包括转录和翻译
C.应将GUS基因和外源基因融合后导入受体细胞以观察表达情况
D.蓝色的深浅可表示外源基因表达量的多少
9．THP9基因是野生玉米中控制高蛋白含量的优良基因，研究者利用基因工程技术将THP9基因转到玉米细胞内，从而获得转基因高蛋白玉米新品种。已知图中THP9基因转录的方向为从左往右。下列相关叙述错误的是（ ）
EcoRⅠ BamHⅠ KpnⅠ MfeⅠ Hind Ⅲ
A．THP9基因有2个游离的磷酸基团，而且游离的磷酸基团在5′端
B．构建基因表达载体时，用MfeⅠ、HindⅢ切割质粒，用EcoRⅠ、HindⅢ切割目的基因
C．利用PCR技术获取THP9基因时应选择引物1和引物4
D．为了检测转基因玉米新品种的培育是否成功，需要在个体水平上检测其蛋白质含量
10．利用重叠延伸PCR技术进行定点突变，可以实现对纤维素酶基因的合理性改造，其过程如图所示。下列说法错误的是(　　)
A.产物AB是依赖引物a和引物b扩增的结果
B.引物c和引物b上均含有突变的碱基序列
C.①过程需要先加热至90 ℃以上后再冷却至50 ℃左右
D.②过程需要利用引物a和引物d获得突变产物AD
二、非选择题
11．加端PCR是使扩增产物的末端加上一段DNA的PCR，加端PCR的引物被设计成除与模板配对的那一部分以外再加上若干碱基，以便能使扩增产物的末端加上额外的一段DNA。hIGF－1 cDNA编码成熟蛋白的序列两端无起始密码子和终止密码子的对应位置，也没有合适的限制酶切割位点，实验人员为了在枯草杆菌中表达hIGF－1，应用加端PCR技术对hIGF－1 cDNA进行改造，以期获得含有hIGF－1成熟蛋白79个氨基酸编码序列，并在两端分别带有Pst Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位点。加端PCR技术示意图如下，回答下列问题：
(1)加端PCR时应选用的引物是________。每一个PCR循环要经过____________________三个阶段。
(2)在目的基因的两端添加限制酶切割位点的目的是________________________，
将含有改造后的hIGF－1基因导入枯草杆菌的常用方法是用Ca2＋处理枯草杆菌，其目的是____________________；原核细胞作为基因工程的受体细胞的优点有__________________
_________________________________(至少答出3点)。
(3)在hIGF－1基因的两端加入不同的限制酶切割位点的目的是____________________。如图表示Pst Ⅰ和Sal Ⅰ酶的识别序列，请根据该序列在如图方框中画出两种限制酶切割后产生的黏性末端。
12．普通棉花中β－甘露糖苷酶基因(GhManA2)表达出的3－甘露糖苷酶能催化半纤维素降解，使棉纤维长度变短。为了培育长绒棉，科研人员构建了反义GhManA2基因表达载体，获得了转基因长绒棉新品种，具体过程如图所示，Sma Ⅰ、Not Ⅰ、Hind Ⅲ和BamHⅠ表示酶切位点，LB为T－DNA左边界，RB为T－DNA右边界。回答下列问题：
(1)过程①中不用限制酶Not Ⅰ的原因是__________________________________________
______________________________________________________________。
GhManA2的序列中包含内含子等序列，可增大重组质粒的分子量，使导入效率降低，请提出一个解决此问题的方案：_________________________________________________________
___________________________________________________。
(2)过程②中在培养基中添加________可将含有重组质粒的农杆菌筛选出来。需将反义表达载体T－DNA区段的________________片段整合到棉花细胞的染色体DNA上，并使之在翻译过程中起作用。
(3)过程③将目的基因导入棉花细胞后，可采用____________技术从分子水平上检测目的基因是否插入染色体DNA中；个体水平上的检测为____________________________________
_____________________________________________________。
(4)由图分析可知，转基因长绒棉棉纤维较普通棉棉纤维长的原因是_____________________
____________________。
13．为了培育出抗病毒的优良玉米，研究人员利用基因工程技术进行了相关实验，其中抗病毒基因、P载体及相关限制酶的切割位点如图1所示。已知P载体上含有绿色荧光蛋白基因（GFP）和抗性基因，一般情况下，抗性基因在真核细胞中表达时，细胞具有新霉素抗性，在原核细胞中表达时，细胞具有卡那霉素抗性。请回答下列问题：

(1)据图1分析，利用PCR技术扩增抗病毒基因时，应选择的引物是________。在PCR反应体系中的作用是__________ 。
(2)将抗病毒基因与P载体构建成重组质粒时，应选择的限制酶是________；用限制酶切割后，进行DNA连接时宜选择T4DNA连接酶而不是选用E.coliDNA连接酶，推测原因是________。为了初步鉴定重组质粒是否构建成功、研究人员用上述选择的限制酶切割相应质粒后进行了电泳，结果如图2所示，其中X、Y分别为________。
(3)在筛选转化成功的玉米细胞时，应在培养基中添加________（填“新霉素”或“卡那霉素”）、原因是________。除转基因技术外，培育优良玉米的途径还有________（答出2种）等。
2 / 2第3章 基因工程
第2节 基因工程的基本操作程序
培育转基因抗虫棉的四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞以及目的基因的检测与鉴定。
知识一 目的基因的筛选与获取
1．目的基因
(1)概念：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。
(2)作用：根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指编码蛋白质的基因。
(3)类型：与生物抗逆性、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因，如培育转基因抗虫棉用到的Bt抗虫蛋白基因，即Bt基因。
2．筛选合适的目的基因
(1)从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法。
(2)实例：在培育转基因抗虫棉之前，科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，也对Bt基因的表达产物——Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。
(3)认识基因结构和功能的技术方法：DNA测序技术、序列数据库、序列比对工具。
3．获取目的基因的方法
(1)人工合成目的基因。
(2)常用PCR特异性地快速扩增目的基因。
(3)通过构建基因文库来获取目的基因。
4．利用PCR获取和扩增目的基因
(1)PCR的含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
(2)基本条件
(3)过程
基于PCR的过程，完成下列问题：
①过程Ⅰ为变性，该阶段的温度为90℃以上，目的是使双链DNA解聚为单链。
②过程Ⅱ为复性，该阶段的温度为50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③过程Ⅲ为延伸，该阶段的温度为72℃左右，该过程需要在耐高温的DNA聚合酶的催化下，利用4种脱氧核苷酸为原料，根据碱基互补配对原则从引物的3′端延伸合成新的子链DNA。
(4)仪器：PCR扩增仪(PCR仪)。
(5)PCR产物的鉴定方法：琼脂糖凝胶电泳。
[例1]下列有关获取目的基因的叙述，错误的是(　　)
A.目的基因就是编码蛋白质的基因
B.获取目的基因是基因工程的第一步
C.来自苏云金杆菌的Bt抗虫蛋白基因可作为转基因抗虫棉的目的基因
D.序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会
【答案】A
【详解】A、目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子，A错误；
B、筛选和获取目的基因是基因工程的第一步，B正确；
C、来自苏云金杆菌的Bt抗虫蛋白基因可以表达出Bt蛋白，控制抗虫特性，可以作为转基因抗虫棉的目的基因，C正确；
D、序列比对工具有利于从序列数据库中筛选出目的基因，为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会，D正确。
故选A。
[例2]下列不属于获取目的基因的方法是（　　）
A.从基因文库中提取
B.利用PCR技术合成
C.利用DNA转录合成
D.利用化学方法人工合成
【答案】C
【详解】A、可以从基因文库中获取目的基因，A正确；
B、可以利用PCR技术扩增目的基因，B正确；
C、利用DNA转录合成的是RNA，不是基因，C错误；
D、可以利用化学方法人工合成目的基因，D正确。
故选C。
[例3]如图表示利用PCR扩增目的基因的过程，下列相关叙述错误的是(　　)
A.利用PCR扩增目的基因时DNA全解旋再复制，与细胞内DNA复制不同
B.①过程中高温的作用与解旋酶相同，目的是使两条链间的氢键断裂
C.用PCR扩增目的基因时，需要知道目的基因的全部碱基序列
D.③过程使用的酶具有热稳定性，在高温下不会发生结构改变而失去催化活性
【答案】C
【详解】A、利用PCR扩增目的基因时，DNA片段全部解聚为单链后再进行复制，而细胞内DNA复制时DNA边解旋边复制，A正确；
B、①过程表示变性，通过升高温度使双链DNA解聚为单链，高温的作用与解旋酶相同，目的是使两条链间的氢键断裂，B正确；
C、利用PCR扩增目的基因时，不必知道目的基因的全部碱基序列，只需根据其部分序列设计出相应的引物即可，C错误；
D、③过程表示延伸，使用的是耐高温的DNA聚合酶，该酶具有热稳定性，在高温下不会发生结构改变而失去催化活性，D正确。
故选C。
知识二 基因表达载体的构建
1．构建基因表达载体的目的
(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代。
(2)使目的基因能够表达和发挥作用。
2．基因表达载体的组成
3．基因表达载体的构建过程
(1)首先用一定的限制酶切割载体。
(2)然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
(3)再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处(如图所示)。
[例1]下列关于基因表达载体的说法，错误的是(　　)
A.基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤
B.基因表达载体包含启动子、目的基因、终止子、标记基因等
C.终止子位于目的基因的下游，能够终止翻译过程
D.不同的目的基因所需的启动子不一定相同
【答案】C
【详解】A、基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，A正确；
BC、基因表达载体包括启动子、终止子、目的基因、标记基因等，其中启动子位于目的基因的上游，是启动转录的一段DNA片段，终止子位于目的基因的下游，能够终止转录过程，B正确，C错误；
D、不同的目的基因具有不同的核苷酸序列，目的基因的表达部位也不一定相同，其启动子也不尽相同，D正确。
故选C。
[例2]在基因工程的操作过程中，获得重组质粒不需要（　　）
①DNA连接酶　②限制性内切核酸酶 ③RNA聚合酶　④具有标记基因的质粒　⑤目的基因　⑥四种脱氧核苷酸
A.③⑥ B.②④
C.①⑤ D.①②④
【答案】A
【详解】①DNA连接酶将目的基因与质粒连接，获得重组质粒时需要；②限制性内切核酸酶切割含有目的基因的DNA片段和质粒，获得重组质粒时需要；③RNA聚合酶催化转录过程，获得重组质粒时不需要；④具有标记基因的质粒作为载体，获得重组质粒时需要；⑤目的基因与质粒拼接形成重组质粒，获得重组质粒时需要；⑥四种脱氧核苷酸是合成DNA的原料，获得重组质粒不需要四种脱氧核苷酸。不需要的为③⑥。
故选A。
知识三 将目的基因导入受体细胞
1．转化
目的基因进入受体细胞，并在受体细胞内_维持稳定_和_表达_的过程。
2．目的基因导入受体细胞的方法
(1)目的基因导入植物细胞
①花粉管通道法
Ⅰ.用微量注射器将含目的基因的DNA溶液_直接注入子房_中。
Ⅱ.在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助_花粉管通道_进入_胚囊_。
②农杆菌转化法
Ⅰ.农杆菌的特点：农杆菌自然条件下侵染_双子叶植物_和_裸子植物_；农杆菌的_Ti质粒上的T DNA能够整合到所侵染细胞的_染色体DNA_上。
Ⅱ.转化方法：将目的基因插入农杆菌_Ti质粒的T DNA_中，让农杆菌_侵染植物细胞_。
提示：受体细胞可以是_受精卵_或_体细胞_，因为植物细胞具有全能性。
(2)目的基因导入动物细胞
①常用方法：_显微注射法 。
②常用受体细胞：_受精卵_。
提示：受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的_全能性高_，而高度分化的动物体细胞的全能性受到抑制。
(3)目的基因导入微生物细胞
①方法：用_Ca2＋处理法_，使细胞处于一种能_吸收_周围环境中_DNA分子_的生理状态，然后将重组表达载体导入其中。
②常用受体细胞：原核细胞(使用最广泛的是_大肠杆菌_)。
提示：大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌为原核细胞，而酵母菌为_真核细胞_(具有多种细胞器)，所以酵母菌在用于生产需要加工和分泌的蛋白质时比大肠杆菌有优势。
[例1]受体细胞不同，将目的基因导入受体细胞的方法也不相同，下列受体细胞与导入方法匹配错误的一项是(　　)
选项 受体细胞 导入方法
A 棉花细胞 花粉管通道法
B 大肠杆菌 农杆菌转化法
C 羊受精卵 显微注射法
D 番茄细胞 农杆菌转化法
【答案】B
【详解】A、花粉管通道法是我国科学家独创的一种方法，是一种十分简便、经济的方法，我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的，A正确；
Ca2＋能使大肠杆菌的生理状态发生改变，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，所以将目的基因导入微生物细胞常采用Ca2＋处理法，B错误；
显微注射法的受体细胞一般为动物细胞，则将目的基因导入羊受精卵的方法是显微注射法，C正确；
在自然条件下，农杆菌可侵染双子叶植物和裸子植物，可用农杆菌转化法将目的基因导入番茄细胞，D正确。
故选B。
[例2]下列有关将目的基因导入受体细胞的叙述，正确的是（　　）
A．将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法
B．原核生物有繁殖快、遗传物质少等特点，可用于生产各种有生物活性的蛋白质
C．基因枪法是将目的基因导入动物细胞中最为有效的方法
D．可将含有目的基因的植物病毒作为载体导入Ca2＋处理后的大肠杆菌细胞
【答案】A
【详解】A、由于农杆菌中Ti质粒上的T-DNA可转移到受体细胞并整合到受体细胞的染色体DNA上，故将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法，A正确；
B、原核生物的细胞中没有内质网和高尔基体，不能对蛋白质进行加工，故生产的蛋白质可能没有生物活性，B错误；
C、将目的基因导入动物细胞最常用的方法是显微注射技术，C错误；
D、植物病毒只侵染植物细胞，不侵染大肠杆菌，D错误。
故选A。
知识四 目的基因的检测与鉴定
1．操作目的
检测和鉴定_目的基因_是否可以在受体细胞中_稳定维持_和_表达其遗传特性_是基因工程的第四步工作，也是检查基因工程是否成功的一步。
2．个体水平检测
(1)检测内容:是否有抗性以及抗性的程度;基因工程产品与天然产品的功能活性是否相同。
(2)检测方法:转基因生物的抗性接种实验,比较基因工程产品与天然产品的功能活性。
(3)结果显示:是否赋予了预期抗性或蛋白质活性。
3．分子水平检测
检测内容 方法 结果显示
目的基因是否插入转基因生物的DNA上 PCR技术、电泳　 电泳带(琼脂糖凝胶电泳来鉴定)
目的基因是否转录出mRNA PCR技术、电泳　
目的基因是否翻译成蛋白质 抗原—抗体杂交(蛋白质和蛋白质之间) 是否出现杂交带
[例1]下列用于判断目的基因是否转移成功的方法，不属于分子水平的检测的是(　　)
A.通过观察害虫吃棉叶是否死亡
B.通过PCR检测棉花的染色体DNA上是否插入抗虫基因
C.检测转基因生物中是否转录出相应的mRNA
D.从转基因生物中提取的蛋白质利用抗原—抗体杂交检测是否翻译成功
【答案】A
【详解】A、通过观察害虫吃棉叶是否死亡，属于个体生物学水平的鉴定，A正确；
B、通过PCR等技术检测棉花的染色体DNA上是否插入抗虫基因，属于分子水平的检测，B错误；
C、检测转基因生物中是否转录出相应的mRNA，属于分子水平的检测，C错误；
D、采用抗原—抗体杂交检测目的基因是否翻译成蛋白质，属于分子水平的检测，D错误。
故选A。
[例2]目的基因导入受体细胞后，需要检测目的基因是否可以维持稳定和表达其遗传特性。下列关于目的基因的检测和鉴定的叙述，正确的是（　　）
A．目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键是能否转录出mRNA
B．可采用PCR检测目的基因是否转录和翻译
C．可从转基因生物中提取蛋白质来检测目的基因是否翻译成相应蛋白质
D．抗虫、抗病检验用于确定转基因生物是否具备相关性状属于分子水平的检测
【答案】C
【详解】A、目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键是目的基因能否在受体细胞中稳定保存，A错误；
B、可采用PCR检测目的基因是否转录，采用抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否翻译，B错误；
C、检测目的基因是否翻译出相应的蛋白质，应该采用抗原—抗体杂交技术，C正确；
D、抗虫、抗病检验用于确定转基因生物是否具备相关性状属于个体水平鉴定，D错误。
故选C。
难点知识一 利用PCR获取和扩增目的基因
1．条件
条件或参与的组分 在DNA复制中的作用
高温 使DNA双链间的氢键断裂，解聚为单链
DNA母链（DNA模板） 提供DNA复制的模板
4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料
耐高温的DNA聚合酶 催化合成DNA子链
两条模板链结合的2种引物(长度通常为20～30个核苷酸) 2种，分别与两条模板链结合，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
2．PCR技术与体内DNA复制的比较
PCR技术 DNA复制
相同点 原则 碱基互补配对
条件 DNA母链作为模板、引物、 4种脱氧核苷酸为原料（PCR技术实为dNTP）
延伸方向 新链都是从5’端向3’端延伸
不同点 解旋方式 90℃以上高温解旋 解旋酶催化
场所 体外-PCR扩增仪（PCR仪） 体内-主要在细胞核
延伸用酶 耐高温的DNA聚合酶（Taq酶） DNA聚合酶
温度 控制温度，需要在不同温度下进行（90℃以上变性、50℃左右复性、72℃左右延伸） 体内温和条件
过程
结果 大量的DNA片段（目的基因） 形成完整的子代DNA
3．引物
（1）设计引物的依据是：目的基因两端的核苷酸序列。
（2）引物设计时既要考虑目的基因序列，又要考虑载体序列，原因是：为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5’端加上限制酶的酶切位点。
（3）引物设计的要求（或引物失效的原因）
a.每种引物内部不能发生局部碱基互补配对。
b.两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对。
（4）每种引物内部不能发生局部碱基互补配对的原因：防止引物自身折叠。
（5）两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对的原因：防止引物之间配对，导致引物不能同模板链结合。
（6）引物长度一般为20-30个核苷酸，若引物长度过短，则引物与模板链结合的特异性较差。
4．扩增目的基因图解
5．结果
复制次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物的DNA 分子数 2 4 8 2n
含其中一种引物的 DNA分子数 21-1 22-1 23-1 2n-1
同时含两种引物的DNA分子数 21-2 22-2 23-2 2n-2
共消耗引物的分子数 22-2 23-2 24-2 2n+1-2
6．PCR产物的鉴定——琼脂糖凝胶电泳
（1）原理
①带电粒子：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。
②迁移动力与方向：在电场的作用下，带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
③迁移速率：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
④检测：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
（2）操作流程
（3）结果（以目的基因为750bp为例）
讨论1：PCR过程中为什么需要引物 引物的作用是什么 引物为什么是两种
在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，因此DNA复制时应加入引物。引物可以使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。DNA两条反向平行的单链都可作为模板且碱基序列不同。
讨论2：PCR扩增目的基因需要知道目的基因的全部核苷酸序列吗
不需要,只要知道目的基因两端的部分核苷酸序列,以便根据这部分序列合成两种引物。
讨论3：PCR扩增目的基因时，为什么复性温度的设定是成败的关键之一？影响复性温度的因素有哪些
复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对，复性温度过低又会造成引物不能与DNA模板链的特定部位结合。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关
讨论4：PCR过程中两种引物的碱基序列能否互补 说明理由。
不能。因为两种引物分别与两条DNA单链的3′端互补结合,如果两种引物的碱基序列互补会影响引物与DNA单链的结合。
讨论5：要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？
要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。
讨论6：在利用PCR获取和扩增目的基因时,从第几轮循环才会产生完整的目的基因
从第3轮循环才会产生完整的目的基因。
讨论7：用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。
讨论8：电泳结果如果未出现条带，可能原因是什么？出现不止一条条带，可能原因是什么？
未出现条件的原因：可能漏加了PCR反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。
出现不止一条条带的原因：可能引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；复性温度过低；DNA聚合酶质量不好等。
巩固训练1
下列关于PCR技术的叙述，错误的是(　　)
注：A、B、C、D是引物，箭头是延伸方向。
A.PCR技术的原理是DNA的复制
B.该反应体系缓冲液中一般要添加Mg2＋，以激活DNA聚合酶
C.引物应选用图中的A、D
D.引物是一小段DNA或RNA，用于PCR的引物长度通常为30～40个核苷酸
【答案】D
【详解】A、PCR技术是体外进行DNA扩增技术，故原理是DNA的复制，A正确；
真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋的激活，因此缓冲液中一般要添加Mg2＋，B正确；
引物应选用图中的A、D，才能将目的基因片段扩增出来，C正确；
引物是一小段DNA或RNA，用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸，D错误。
故选D。
巩固训练2
下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是(　　)
A.二者子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端
B.二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋
C.体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量
D.二者遵循的碱基互补配对原则相同
【答案】B
【详解】A、DNA体内复制与利用PCR技术扩增DNA时，子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端，A正确；
B、PCR扩增DNA时，解旋不需要解旋酶，而是在高温条件下使氢键断裂，B错误；
C、体内DNA复制与利用PCR扩增DNA时都需要能量，但两者所需能量来源不同，C正确；
D、体内DNA复制与利用PCR扩增DNA时，遵循的碱基互补配对原则相同，D正确。
故选B。
巩固训练3
下图表示PCR过程中某个阶段反应体系的情况，①②③④表示相关物质，L、R表示方向。下列叙述正确的是（ ）
A．②链从L到R的方向为3′→5′，①②链均可作为子链合成的模板
B．PCR过程需要通过解旋酶断开氢键，且为边解旋边复制
C．以1个DNA为模板经3次循环需消耗7个引物③
D．物质③的5′端添加了某序列，至少需经3次循环才可获得该序列的双链产物
【答案】C
【详解】A、根据DNA分子中两条链的反向平行关系可判断，②链从 L 到 R 的方向为 5′→3′，图中①②链均可作为子链合成的模板，A错误；
B、PCR 过程需要通过高温处理使双链中氢键断裂成为单链，而后通过降温使子链和引物之间形成双链结构，而后调节温度是子链沿着引物的3’端延伸，B错误；
C、以 1 个 DNA 为模板经 3 次循环产生的DNA分子数目为23=8，则需消耗 引物③的数目为（8×2-2）÷2=7，C正确；
D、物质③的 5′端添加了某序列，至少需经 2 次循环才可获得以该序列为模板合成的双链DNA产物，D错误。
故选C。
巩固训练4
某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是（ ）
A．增加模板DNA的量 B．延长热变性的时间
C．延长延伸的时间 D．提高复性的温度
【答案】D
【详解】A、增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少非特异性条带，A错误；
BC、延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，故不能有效减少反应非特异性条带，BC错误；
D、非特异性产物增加的原因可能是复性温度过低会造成引物与模板的结合位点增加，故可通过提高复性的温度来减少反应非特异性条带的产生，D正确。
故选D。
难点知识二 基因表达载体的构建
1．过程
2．限制酶的选择方法
根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及是否破坏目的基因和标记基因来确定限制酶的种类。（以图甲、乙为例分析）
(1)应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst Ⅰ；不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
(2)为避免目的基因及质粒的自身环化、反向连接，也可使用不同的限制酶(非同尾酶)切割目的基因所在片段和质粒(双酶切)，如图甲可选择用Pst Ⅰ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。
(3)切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，以用于重组DNA的鉴定和选择，如图乙中的质粒不能使用Sma Ⅰ切割。
3．基因表达载体的组成
(1)启动子
①本质：一段有特殊序列结构的DNA片段。
②位置：位于基因的上游，紧挨转录的起始位点。
③功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
④特殊类型：诱导型启动子。
⑤诱导型启动子的特点：当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。
(2)终止子
①本质：一段有特殊序列结构的DNA片段。
②位置：位于基因的下游。
③功能：使转录在所需要的地方停下来。
(3) 标记基因
①作用：便于重组DNA分子的筛选。
②常见类型抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等
(4)启动子和起始密码子、终止子和终止密码子的区别
启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
化学成分 DNA片段 DNA片段 mRNA上三个相邻碱基 mRNA上三个相邻碱基
位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
作用 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 决定转录的结束 翻译的起始信号 决定翻译过程的结束
讨论1：为什么不直接把目的基因导入受体细胞，而要用载体？
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录并翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。若将目的基因插入载体，由于载体可以在细胞内复制，随着细胞分裂，载体会带着目的基因存在于每个子代细胞中。
讨论2：作为基因工程表达载体,需要含有的功能元件有哪些
目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点等。
讨论3：构建基因表达载体时目的基因插入的位置应该在哪里 为什么
启动子下游和终止子上游；因为只有插入在启动子和终止子之间，目的基因才可以正常表达。
讨论4：用同一种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA，再用DNA连接酶处理后，形成的产物一定符合要求吗？如何避免存在的问题？
不一定，因为同一种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA，会出现质粒和目的基因的自身环化以及目的基因与载体的反向连接的现象。
可以通过同时用两种限制酶切割含目的基因的DNA片段和载体来避免上述现象。
巩固训练5
某目的基因两侧的DNA序列所含的限制性内切核酸酶切割位点如图所示，用下列质粒作为载体最好选用(　　)
【答案】D
【详解】A、目的基因只有一侧含有限制酶Nhe Ⅰ的识别序列，用此酶不能获取目的基因，A错误；
B、目的基因两侧含有限制酶Alu Ⅰ的识别序列，但只用此酶切割可能会导致目的基因和质粒反向连接或自身环化，B错误；
C、目的基因两侧含有限制酶Nhe Ⅰ和Alu Ⅰ的识别序列，但用这两种酶切割可能会获得不含目的基因的片段，C错误；
D、目的基因两侧含有限制酶Nhe Ⅰ和Sma Ⅰ的识别序列，用这两种酶切割会获取目的基因，而且能防止目的基因和质粒的自身环化和反向连接，D正确。
故选D。
巩固训练6
下图所示为基因工程中的相关物质或结构，已知酶Ⅰ切割后可形成图1所示结构，酶Ⅱ的识别序列和切割位点如图2所示，质粒结构如图3所示，目的基因两侧的酶切位点如图4所示，下列有关叙述错误的是（ ）

A．图1中a所示部位与图2中箭头所示部位的结构相同
B．酶Ⅰ和酶Ⅱ切割后的DNA片段可以用E·coliDNA连接酶连接
C．启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，能启动转录过程
D．使用酶Ⅰ和酶Ⅱ同时处理质粒、目的基因，能防止自身环化
【答案】B
【详解】A、图1中a所示部位与图2中箭头所示部位的结构均为磷酸二酯键，A正确；
B、酶Ⅰ和酶Ⅱ切割后的DNA片段黏性末端不同，因此不可以用E·coliDNA连接酶连接，B错误；
C、启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点位于DNA上，能启动转录过程，C正确；
D、使用酶Ⅰ和酶Ⅱ切割后的DNA片段黏性末端不同，因此同时处理质粒、目的基因，能防止自身环化，D正确。
故选B。
难点知识三 将目的基因导入受体细胞
1．目的基因导入不同受体细胞的方法
2．农杆菌转化法
(1)过程
(2)两次拼接和两次导入的比较
第一次拼接是将目的基因拼接到 Ti质粒的T－DNA 上；
第二次拼接(非人工直接操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的 染色体DNA 上；
第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入 农杆菌(Ca2+处理法) ；
第二次导入(非人工直接操作)是指含目的基因的T－DNA导入 受体细胞(农杆菌转化法) 。
讨论1：目的基因导入受体细胞时，不同生物常用的受体细胞分别是什么及其原因。
对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有全能性且容易表现。
对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵表现全能性相对容易，而高度分化的动物体细胞的全能性不易表现。
大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌为原核细胞，而酵母菌为真核细胞(具有多种细胞器)，所以酵母菌在用于生产需要加工和分泌的蛋白质时比大肠杆菌有优势。
讨论2：在用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，一定要将目的基因插入Ti质粒的T－DNA上的原因是什么？
原因是农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA(可转移的DNA)可转移至被侵染的细胞，并且整合到该细胞的染色体DNA上。
讨论3：花粉管通道法与农杆菌转化法相比有什么优点
操作简便；直接将目的基因导入受精卵,无须经过组织培养即可获得植株。
讨论4：农杆菌转化法中有几次拼接和导入过程
农杆菌转化法中有两次拼接和两次导入。第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上,第二次拼接(非人工操作)是将插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上;第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌,第二次导入(非人工操作)是将含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
巩固训练7
我国科学家独创的花粉管通道法，可以使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞，是一种十分简便经济的方法，对此认识正确的是(　　)
A.不必构建表达载体就可以直接导入
B.此方法可用于转基因动物
C.受体细胞只能是植物的卵细胞
D.有时可以取代农杆菌转化法
【答案】D
【详解】A、要让目的基因进入受体细胞后能稳定存在并得到复制和表达，不管采用什么导入方法，都需要构建表达载体才能实现，A错误；
B、花粉管通道法只适用于转基因植物的培育，B错误；
C、采用花粉管通道法时，植物受体细胞一般是植物体细胞或受精卵，通常不选卵细胞，C错误。
D、花粉管通道法具有操作简便；直接将目的基因导入受精卵,无须经过组织培养即可获得植株等优点，故有时可以取代农杆菌转化法，D正确。
故选D。
巩固训练8
如图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述错误的是（　　）
A．①→②过程可用不同的限制酶分别切割Ti质粒和含抗虫基因的DNA
B．②→③过程可用Ca2+处理农杆菌细胞
C．③→④过程是将重组Ti质粒整合到受体植物细胞的染色体DNA上
D．④→⑤过程体现了植物细胞的全能性，不同阶段所需的培养条件不同
【答案】C
【详解】A、①→②过程是构建基因表达载体，可用相同或不同的限制酶分别切割Ti质粒和含抗虫基因的DNA，Ti质粒和含抗虫基因的DNA能产生相同的末端即可，A正确；
B、②→③过程是将重组Ti质粒转入农杆菌，农杆菌是细菌，可用Ca2+处理农杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境DNA分子的生理状态，从而将重组Ti质粒转入农杆菌，B正确；
C、③→④过程是将重组Ti质粒导入植物细胞，重组Ti质粒上的T DNA才能整合到受体植物细胞的染色体DNA上，C错误；
D、④→⑤过程是植物组织培养，体现了植物细胞的全能性，不同阶段所需的光照、营养条件等不同，D正确。
故选C。
难点知识四 目的基因的检测与鉴定
1．目的基因的检测与鉴定
（1）检测与鉴定顺序
（2）核酸水平上其他检测技术——分子杂交技术
①DNA水平
②RNA水平
（3）抗原-抗体杂交技术
2．个体生物学水平检测的具体方法及成功标志
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物 饲喂害虫(抗虫接种实验) 害虫死亡
抗病毒(菌)植物 病毒(菌)接种实验 未染病
抗盐植物 盐水浇灌 正常生长
抗除草剂植物 喷洒除草剂 正常生长
获取目的基因产物的转基因生物 提取细胞产物与天然产品进行功能、活性比较 细胞产物功能活性正常
讨论1：标记基因筛选呈阳性一定能确定目的基因导入受体细胞了吗？
不一定，导入的还可能是不含目的基因的载体（如载体自身环化产物、载体-载体连接物）。
讨论2：如何检测目的基因是否整合到受体细胞的染色体上？
先提取转基因生物的染色体上的DNA，再通过PCR（结合电泳检测）等技术、分子杂交技术鉴定提取的DNA中是否含有目的基因。
讨论3：如果目的基因是抗虫基因，在个体水平上怎样检测？如果目的基因是耐盐基因呢？
如果目的基因是抗虫基因，则要进行抗虫接种实验。如果目的基因是耐盐基因，则要用一定浓度的盐水浇灌。
巩固训练9
利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列各项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是(　　)
A.番茄细胞中检测到鱼的抗冻蛋白
B.大肠杆菌中检测到人干扰素基因的mRNA
C.山羊乳腺细胞中检测到人生长激素的DNA序列
D.酵母菌细胞中提取到人胰岛素基因
【答案】A
【详解】A、番茄细胞中检测到鱼的抗冻蛋白，说明目的基因已经成功导入受体细胞，并且目的基因在受体细胞中已经完成表达，A符合题意；
B、大肠杆菌中检测到人的干扰素基因的mRNA，说明目的基因已经成功转录，但不能说明目的基因已经完成表达，B不符合题意；
C、山羊乳腺细胞中检测到人生长激素的DNA序列，说明目的基因已经导入受体细胞，但不能说明目的基因已经完成表达，C不符合题意；
D、酵母菌细胞中提取到人胰岛素基因，说明目的基因已经成功导入，但未必成功表达，D不符合题意。
故选A。
巩固训练10
绿叶海天牛(简称甲)吸食滨海无隔藻(简称乙)后，身体就逐渐变绿，这些“夺来”的叶绿体能够在甲体内长期稳定存在，有科学家推测其原因是在甲的染色体DNA上可能存在乙的编码叶绿体部分蛋白的核基因。为证实上述推测，以这种变绿的甲为材料进行实验，方法和结果最能支持上述推断的是(　　)
A.提取甲的全部DNA，通过PCR技术能克隆出乙的编码叶绿体部分蛋白的核基因
B.通过PCR等技术，在甲体内检测到乙的编码叶绿体部分蛋白的核基因转录出的RNA
C.给甲提供14CO2，一段时间后检测到其体内的部分有机物出现放射性
D.以乙的编码叶绿体部分蛋白的核基因为探针与甲的染色体DNA杂交，结果显示出杂交带
【答案】D
【详解】A、通过PCR技术从甲体内的DNA中克隆出属于乙的编码叶绿体部分蛋白的核基因，这只能说明甲体内含有乙的编码叶绿体部分蛋白的核基因，但不能说明乙的编码叶绿体部分蛋白的核基因一定存在于甲的染色体DNA上，A不符合题意；
B、通过PCR等技术，在甲体内检测到乙的编码叶绿体部分蛋白的核基因转录出的RNA，这只能说明甲体内含有乙的编码叶绿体部分蛋白的核基因且发生了转录，但不能说明甲的染色体DNA上存在乙的编码叶绿体部分蛋白的核基因，B不符合题意；
C、给甲提供14CO2，一段时间后检测到其体内的部分有机物出现放射性，这说明甲体内可能进行了光合作用，但不能说明甲的染色体DNA上存在乙的编码叶绿体部分蛋白的核基因，C不符合题意；
D、以乙的编码叶绿体部分蛋白的核基因为探针与甲的染色体DNA杂交，结果显示出杂交带，这能说明甲的染色体DNA上存在乙的编码叶绿体部分蛋白的核基因，D符合题意。
故选D。
一、选择题
1．科学家利用重组DNA技术将参与β－胡萝卜素合成的A、B两种酶的基因转入水稻，生产出富含β－胡萝卜素的“黄金大米”。下列关于“黄金大米”的培养过程的叙述，正确的是(　　)
A.所用限制酶的识别位点不能在控制A、B两种酶合成的基因中
B.利用PCR扩增控制A酶合成的基因时，设计的两种引物的碱基序列应互补
C.构建基因表达载体时，选用的质粒中必须含有抗生素抗性基因
D.最好选用E.coli DNA连接酶将具有平末端的控制B酶合成的基因与质粒连接在一起
【答案】A
【详解】A、控制A、B两种酶合成的基因中不能有所用限制酶的识别位点，否则目的基因会因被切断而失去作用，A正确；
B、在用PCR扩增控制A酶合成的基因时，设计的两种引物之间碱基序列不能互补，以免形成引物之间碱基的互补配对，影响目的基因的扩增，B错误；
C、构建基因表达载体时，选用的质粒中必须含有标记基因，该标记基因不一定是抗生素抗性基因，C错误；
D、因E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶，因此最好选用T4 DNA连接酶将具有平末端的控制B酶合成的基因与质粒连接在一起，D错误。
故选A。
2．下列关于PCR的叙述，正确的是(　　)
A.PCR是体外复制DNA技术，关键酶是解旋酶和DNA聚合酶
B.DNA聚合酶从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸
C.第三轮循环产物中出现位于两种引物之间的DNA片段
D.延伸过程需要酶、ATP和4种核糖核苷酸
【答案】C
【详解】A、PCR体外复制DNA不需要解旋酶，需要耐高温的DNA聚合酶，A错误；
B、DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，B错误；
C、第三轮循环产物中出现位于两种引物之间的DNA片段，C正确；
D、PCR是在较高温度条件下进行的，该过程需要耐高温的DNA聚合酶，且PCR反应的产物是DNA，因此原料是4种游离的脱氧核苷酸，不是核糖核苷酸，也不需要ATP，D错误。
故选C。
3．X基因是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝X基因，需在PCR反应体系中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。经4轮循环后产物中有5种不同的DNA分子，下列叙述错误的是(　　)
A.第一轮复制得到2个DNA分子，即①②各1个
B.第二轮复制得到4个DNA分子，即①②③④各1个
C.第三轮复制得到8个DNA分子，其中有2个等长的，也就是有2个X基因
D.第四轮复制得到16个DNA分子，其中有4个X基因
【答案】D
【详解】A、据题图分析可知，第一轮复制形成2个DNA分子，即①②各1个，A正确；
B、第二轮复制得到22＝4(个)DNA分子：①复制得①和③，②复制得②和④，即得到①②③④各1个，B正确；
C、第三轮复制得到23＝8(个)DNA分子：①复制得①和③，③复制得③和⑤，②复制得②和④，④复制得④和⑤。所以共有①②各1个，③④各2个，⑤2个(等长)，也就是有2个X基因(⑤)，C正确；
D、第四轮复制得到24＝16(个)DNA分子：①复制得①和③，2个③复制得2个③和2个⑤，②复制得②和④，2个④复制得2个④和2个⑤，2个⑤复制得到4个⑤。所以第四轮复制得到的16个DNA分子中有8个⑤(X基因)，D错误。
故选D。
4．下图为pUC18质粒图谱，已知目的基因两侧的酶切位点为EcoRI和BamHI。现需将目的基因插入质粒的LacZ基因内，形成重组质粒并导入受体细胞。下列限制酶组合选择及后续处理最合适的是（ ）
（注：图中amp8为氨苄青霉素抗性基因、Ori为复制原点，LacZ表达产物可使X-gal的培养基呈现蓝色）
A．用BamHI酶切质粒和目的基因，将细胞涂布于含氨苄青霉素的培养基
B．用EcoRI酶切质粒和目的基因，将细胞涂布于含氨苄青霉素和X-gal的培养基
C．用EcoRI和BamHI酶切质粒和目的基因，将细胞涂布于含X-gal的培养基
D．用EcoRI和BamHI酶切质粒和目的基因、将细胞涂布于含氨苄青霉素和X-gal的培养基
【答案】D
【详解】A、单酶切可能导致目的基因反向插入或质粒自连，无法确保定向克隆，A错误；
B、同理，单酶切无法避免自连，且LacZ基因未被完全破坏，无法有效筛选重组体，B错误；
C、缺少氨苄青霉素筛选，无法排除未成功转化的细菌（不含质粒），C错误；
D、双酶切（EcoRI和BamHI）确保目的基因定向插入LacZ基因内部，破坏其表达。重组质粒在含X-gal的培养基上呈白色，非重组质粒呈蓝色。氨苄青霉素筛选仅保留含质粒的细菌，D正确。
故选D。
5．由于某目的基因酶切后的末端为平末端，载体E只有产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将目的基因接入载体E。据图分析，下列叙述正确的是（ ）

A．通过PCR扩增获取目的基因是基因工程的核心工作
B．为了便于该目的基因接入载体E，可用限制酶EcoRV或SmaI切割载体P
C．载体P不能作为基因表达载体，是因为其没有表达该目的基因的启动子与终止子
D．若受体细胞表现出抗性基因的相应性状，表明重组载体成功导入受体细胞
【答案】C
【详解】A、基因工程的核心步骤是构建基因表达载体，不是通过PCR扩增获取目的基因，A错误；
B、要使中间载体P接入载体E，同时防止载体E自身环化，需要用两种限制酶分别切割载体E和中间载体P，由于载体E只有产生黏性末端的酶切位点，而EcoRV切割后的末端是平末端，无法完成上述过程，B错误；
C、由图可知，载体P是中间质粒，不含有表达MT基因的启动子和终止子，C正确；
D、受体细胞表现出抗性基因的相应性状，可能是导入了重组质粒，也可能只导入了空质粒（不含目的基因的质粒），D错误。
故选C。
6．用酵母菌来生产人的胰岛素，需要构建基因表达载体，相关叙述错误的是（　　）
A．基因表达载体的构建是在生物体内完成的
B．构建基因表达载体的目的有使目的基因在受体细胞中能稳定存在且能遗传给下一代
C．DNA连接酶不能识别特定的核苷酸序列
D．基因表达载体的构建是基因工程的核心
【答案】A
【详解】A、基因表达载体的构建是在生物体外完成的，A错误；
B、运载体的特点之一是能够在受体细胞中稳定遗传，故构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中能稳定存在且遗传给下一代，B正确；
C、DNA连接酶将两个DNA片段连接起来，不能识别特定的核苷酸序列，C正确；
D、基因表达载体的组成有目的基因、启动子、终止子、标记基因等，基因表达载体的构建是基因工程的核心，D正确。
故选A。
7．载体是基因工程中携带外源DNA片段(目的基因)进入受体细胞的重要运载工具，常见的载体类型主要有基因克隆载体和基因表达载体。下图是利用细菌生产人胰岛素的基本流程示意图，下列相关叙述错误的是(　　)
A.重组载体A、重组载体B分别是基因克隆载体和基因表达载体
B.载体A和载体B都必须含有限制酶切割位点、复制原点和标记基因
C.必须把目的基因插入重组载体A的启动子和终止子之间
D.培养细菌A和细菌B的培养基在营养成分和功能上有明显差异
【答案】C
【详解】A、重组载体A导入受体菌后随着受体菌的繁殖而扩增，因此是基因克隆载体，而重组载体B导入受体菌后，表达产生胰岛素，因此是基因表达载体，A正确；
B、作为运载体必须要具备的条件有：含有限制酶的切割位点(便于目的基因的插入)、复制原点(便于目的基因的扩增)及标记基因(便于筛选含有目的基因的受体细胞)等，因此载体A和载体B都必须含有限制酶切割位点、复制原点和标记基因，B正确；
C、培养细菌A的目的是扩增目的基因，不需要获得表达产物，因此目的基因不一定要插入重组载体A的启动子和终止子之间，C错误；
D、培养细菌A的目的是扩增目的基因，培养细菌B的目的是获得胰岛素，因此培养两者的培养基在营养成分和功能上有明显差异，D正确。
故选C。
8．GUS基因作为一种报告基因，编码β－葡萄糖苷酸酶，该酶可催化特定底物水解，产生蓝色化合物，借此用来观察转基因植物中外源基因的表达情况，鉴定转基因植株。下列说法错误的是(　　)
A.GUS基因是有遗传效应的DNA片段，由多个核糖核苷酸构成
B.GUS基因编码β－葡萄糖苷酸酶合成的过程包括转录和翻译
C.应将GUS基因和外源基因融合后导入受体细胞以观察表达情况
D.蓝色的深浅可表示外源基因表达量的多少
【答案】A
【详解】A、GUS基因是有遗传效应的DNA片段，DNA的基本单位是脱氧核糖核苷酸，A错误；
B、β－葡萄糖苷酸酶的本质是蛋白质，GUS基因编码β－葡萄糖苷酸酶合成的过程包括转录(以基因的一条链为模板合成RNA)和翻译(以mRNA为模板合成蛋白质)，B正确；
C、GUS基因作为一种报告基因，能够在适宜条件下产生蓝色化合物，故GUS基因和外源基因融合后导入受体细胞，可通过蓝色的产生情况观察表达情况，C正确；
D、GUS基因可编码β－葡萄糖苷酸酶，β－葡萄糖苷酸酶可催化特定底物水解，产生蓝色化合物，将GUS基因和外源基因融合后导入受体细胞，理论上蓝色的深浅可表示外源基因表达量的多少，D正确。
故选A。
9．THP9基因是野生玉米中控制高蛋白含量的优良基因，研究者利用基因工程技术将THP9基因转到玉米细胞内，从而获得转基因高蛋白玉米新品种。已知图中THP9基因转录的方向为从左往右。下列相关叙述错误的是（ ）
EcoRⅠ BamHⅠ KpnⅠ MfeⅠ Hind Ⅲ
A．THP9基因有2个游离的磷酸基团，而且游离的磷酸基团在5′端
B．构建基因表达载体时，用MfeⅠ、HindⅢ切割质粒，用EcoRⅠ、HindⅢ切割目的基因
C．利用PCR技术获取THP9基因时应选择引物1和引物4
D．为了检测转基因玉米新品种的培育是否成功，需要在个体水平上检测其蛋白质含量
【答案】C
【详解】A、THP9基因有2个游离的磷酸基团，而且游离的磷酸基团在每一条链的5′端，A正确；
B、构建基因表达载体时，用MfeⅠ、HindⅢ切割质粒时，形成的黏性末端分别是AATT-3'和AGCT-3'，用EcoRⅠ、HindⅢ切割目的基因时，形成的黏性末端分别是AATT-3'和AGCT-3'，形成的黏性末端对应相同，可以成功将目的基因插入质粒，同时避免目的基因自身环化和随意连接，B正确；
C、利用PCR技术扩增基因时，引物从5'端朝着3'端延伸,故应与模板链3'端配对，故应选择引物2和引物3，C错误；
D、为了检测转基因玉米新品种的培育是否成功，需要在个体水平上检测玉米蛋白质含量，D正确。
故选C。
10．利用重叠延伸PCR技术进行定点突变，可以实现对纤维素酶基因的合理性改造，其过程如图所示。下列说法错误的是(　　)
A.产物AB是依赖引物a和引物b扩增的结果
B.引物c和引物b上均含有突变的碱基序列
C.①过程需要先加热至90 ℃以上后再冷却至50 ℃左右
D.②过程需要利用引物a和引物d获得突变产物AD
【答案】D
【详解】A、PCR技术中DNA单链延伸的方向是沿着引物的5′端向3′端延伸的，故PCR1过程中的产物AB是依赖引物a和引物b扩增的结果，A正确；
B、引物c和引物b分别与DNA的两条链互补，若引物c和引物b完全与模板互补，则引物c和引物b会发生碱基互补配对，导致引物失效，故引物c和引物b上均含有与模板链不能互补的碱基，即均应含有突变的碱基序列，B正确；
C、①过程是双链DNA解聚为单链的过程，需加热至90 ℃以上完成变性，而后将温度下降到50 ℃左右复性，为子链的延伸作准备，C正确；
D、②过程是子链延伸的过程，该过程需要利用AB上链和CD下链作为母链进行延伸，获得突变产物AD，不需要引物，D错误。
故选D。
二、非选择题
11．加端PCR是使扩增产物的末端加上一段DNA的PCR，加端PCR的引物被设计成除与模板配对的那一部分以外再加上若干碱基，以便能使扩增产物的末端加上额外的一段DNA。hIGF－1 cDNA编码成熟蛋白的序列两端无起始密码子和终止密码子的对应位置，也没有合适的限制酶切割位点，实验人员为了在枯草杆菌中表达hIGF－1，应用加端PCR技术对hIGF－1 cDNA进行改造，以期获得含有hIGF－1成熟蛋白79个氨基酸编码序列，并在两端分别带有Pst Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位点。加端PCR技术示意图如下，回答下列问题：
(1)加端PCR时应选用的引物是________。每一个PCR循环要经过____________________三个阶段。
(2)在目的基因的两端添加限制酶切割位点的目的是________________________，
将含有改造后的hIGF－1基因导入枯草杆菌的常用方法是用Ca2＋处理枯草杆菌，其目的是____________________；原核细胞作为基因工程的受体细胞的优点有__________________
_________________________________(至少答出3点)。
(3)在hIGF－1基因的两端加入不同的限制酶切割位点的目的是____________________。如图表示Pst Ⅰ和Sal Ⅰ酶的识别序列，请根据该序列在如图方框中画出两种限制酶切割后产生的黏性末端。
【答案】
(1)引物1和引物4　变性、复性和延伸　
(2)使目的基因经限制酶切割后能产生黏性末端和质粒相连　使枯草杆菌处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态　原核细胞为单细胞，细胞繁殖速度快、遗传物质相对较少、易培养、代谢速度快　
(3)防止切割后的目的基因发生自身环化
【详解】
(1)由题图可知，加端PCR所选引物应有一部分序列不与模板链配对，题图中引物1和引物4具有部分不配对序列，是加端PCR所用引物。PCR的循环要经过变性、复性和延伸三步。(2)在目的基因的两端添加限制酶切割位点的目的是使目的基因经限制酶切割后能产生黏性末端和质粒相连。用Ca2＋处理枯草杆菌，可使枯草杆菌处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。原核细胞为单细胞，其繁殖速度快、遗传物质相对较少、易培养、代谢速度快，因此常用原核细胞作为基因工程的受体细胞。(3)在hIGF－1基因的两端加入不同的限制酶切割位点后，再利用相应的限制酶切割，会产生不同的黏性末端，由于末端的序列不同而不能发生碱基互补配对，利用DNA连接酶连接时，可防止切割后的目的基因发生自身环化。由题图可知，Pst Ⅰ酶切割产生的黏性末端序列为—TGCA—，即，Sal Ⅰ酶切割产生的黏性末端序列为—TCGA—，即。
12．普通棉花中β－甘露糖苷酶基因(GhManA2)表达出的3－甘露糖苷酶能催化半纤维素降解，使棉纤维长度变短。为了培育长绒棉，科研人员构建了反义GhManA2基因表达载体，获得了转基因长绒棉新品种，具体过程如图所示，Sma Ⅰ、Not Ⅰ、Hind Ⅲ和BamHⅠ表示酶切位点，LB为T－DNA左边界，RB为T－DNA右边界。回答下列问题：
(1)过程①中不用限制酶Not Ⅰ的原因是__________________________________________
______________________________________________________________。
GhManA2的序列中包含内含子等序列，可增大重组质粒的分子量，使导入效率降低，请提出一个解决此问题的方案：_________________________________________________________
___________________________________________________。
(2)过程②中在培养基中添加________可将含有重组质粒的农杆菌筛选出来。需将反义表达载体T－DNA区段的________________片段整合到棉花细胞的染色体DNA上，并使之在翻译过程中起作用。
(3)过程③将目的基因导入棉花细胞后，可采用____________技术从分子水平上检测目的基因是否插入染色体DNA中；个体水平上的检测为____________________________________
_____________________________________________________。
(4)由图分析可知，转基因长绒棉棉纤维较普通棉棉纤维长的原因是_____________________
____________________。
【答案】
(1)限制酶Not Ⅰ会破坏目的基因，且质粒上没有Not Ⅰ的切割位点　从棉花细胞中提GhManA2基因的mRNA，逆转录获得cDNA　
(2)抗生素　E6启动子和GhManA2基因
(3)PCR　观察转基因棉花的棉纤维是否变长　
(4)转基因长绒棉细胞内的反义GhManA2基因转录的mRNA能与细胞内的GhManA2基因转录的mRNA互补配对，从而抑制该基因的表达，使植物缺少3－甘露糖苷酶，半纤维素不被降解，从而使转基因长绒棉的棉纤维长于普通棉花
【详解】
(1)由于限制酶Not Ⅰ会破坏目的基因，且质粒上没有Not Ⅰ的切割位点，因此过程①中不用限制酶Not Ⅰ；基因转录形成的mRNA不含内含子对应序列，故从棉花细胞中提取GhManA2基因转录的mRNA，再逆转录获得cDNA，以此为目的基因，可减小重组质粒的分子量，解决导入效率低的问题。
(2)过程②中在培养基中添加抗生素可将含有重组质粒的农杆菌筛选出来；需将反义表达载体T－DNA区段的E6启动子和GhManA2基因片段整合到棉花细胞的染色体中，有利于目的基因的转录，以在翻译过程中起作用。
(3)过程③中目的基因导入棉花细胞后，可采用PCR技术从分子水平上检测目的基因是否插入染色体DNA中；个体水平上的检测为观察植株是否表现相应性状，即棉纤维是否变长。
(4)分析题图，由启动子的方向可知，反义GhManA2基因转录的mRNA可与棉花细胞内的GhManA2基因转录的mRNA互补配对，从而阻止GhManA2基因转录的mRNA翻译成3－甘露糖苷酶，使半纤维素不被降解，因此转基因长绒棉的棉纤维长于普通棉花。
13．为了培育出抗病毒的优良玉米，研究人员利用基因工程技术进行了相关实验，其中抗病毒基因、P载体及相关限制酶的切割位点如图1所示。已知P载体上含有绿色荧光蛋白基因（GFP）和抗性基因，一般情况下，抗性基因在真核细胞中表达时，细胞具有新霉素抗性，在原核细胞中表达时，细胞具有卡那霉素抗性。请回答下列问题：

(1)据图1分析，利用PCR技术扩增抗病毒基因时，应选择的引物是________。在PCR反应体系中的作用是__________ 。
(2)将抗病毒基因与P载体构建成重组质粒时，应选择的限制酶是________；用限制酶切割后，进行DNA连接时宜选择T4DNA连接酶而不是选用E.coliDNA连接酶，推测原因是________。为了初步鉴定重组质粒是否构建成功、研究人员用上述选择的限制酶切割相应质粒后进行了电泳，结果如图2所示，其中X、Y分别为________。
(3)在筛选转化成功的玉米细胞时，应在培养基中添加________（填“新霉素”或“卡那霉素”）、原因是________。除转基因技术外，培育优良玉米的途径还有________（答出2种）等。
【答案】
(1)引物1和引物4 激活DNA聚合酶
(2)Hind Ⅲ和Sma Ⅰ 限制酶切割产生的是平末端 P载体、重组质粒
(3)新霉素 玉米细胞是真核细胞，抗性基因表达后具有新霉素抗性 杂交育种、诱变育种
【详解】
（1）引物作为子链延伸的起点，应与模板的3'端结合，因此选择引物1和引物4。在PCR反应体系中 Mg2+ 的作用是激活DNA聚合酶。
（2）由于Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ会切断抗病毒基因，因此应当选择的限制酶是Hind Ⅲ和Sma Ⅰ。由于E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶，推测选用T4 DNA连接酶的原因是限制酶切割产生的是平末端。图中XY切割后有相同的长片段，而Y含有抗病毒基因，X不含。因此X、Y分别为P载体、重组质粒。
（3）抗性基因 Kanr/Neor 在真核细胞中表达时，细胞具有新霉素抗性，玉米细胞是真核细胞，应在培养基中添加新霉素筛选导入重组质粒的玉米细胞。除转基因技术外，培育优良玉米的途径还有杂交育种、诱变育种等。
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