资源简介

第3章 基因工程（复习讲义）
(
目录
1.
单元目标聚焦·明核心
：
了解课标要求
，识记核心考点
2.
知识图谱梳理·固基础：
掌握知识网络、明晰知识串联
3.
教材要点精析·夯重点：
必
背知识
要点、掌握教材重点
要点
一
基因工程的概念及其诞生和发展
要点二
重组
DNA
技术的基本工具
要点三
目的基因的筛选与获取
要点四
基因表达载体的构建
要点五
将目的基因导入受体细胞
要点六
目的基因的检测与鉴定
要点七
基因工程的应用
要点八
蛋白质工程的原理与应用
4.
考点题型突破·拓思维：
梳理常考题型、通关章节重难点
题型
一
基因工程的概念及理论基础
题型二
重组
DNA
技术的基本工具
题型三
PCR
的原理与过程
题型四
限制酶的选择及基因表达载体的构建
题型五
目的基因导入受体细胞的方法
题型六
目的基因检测与鉴定的方法
题型七
PCR
扩增及电泳图谱的分析
题型八
运用基因工程的原理分析其在不同领域中的应用
题型九
运用蛋白质工程的原理分析具体应用的实例
5.
综合高效练习·提能力：
练习解题思维、提升解题能力
)
课标要求 核心考点
1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学、分子生物学等学科的基础上发展起来的； 2.阐明DNA重组技术需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具概述植物体细胞杂交的基本过程和原理； 3.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤； 4.举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改善了人类的生活品质； 5.概述人们根据基因工程原理进行蛋白质的设计和改造，可以获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质； 6.举例说明依据人类需求对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程。 1.基因工程（重组DNA技术）：关注基因工程的诞生和发展历程，认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新，运用结构与功能观分析基因工程过程中三种基本工具的作用，明确DNA粗提取与鉴定的原理，进行相关实验操作； 2.目的基因的筛选与获取和基因表达载体的构建：运用结构与功能和技术思维理解PCR技术的过程、原理、条件等内容，结合基因工程的基本操作程序，针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计； 3.将目的基因导入受体细胞核目的基因的检测与鉴定：阐明将目的基因导入受体细胞的方法，阐明目的基因的检测与鉴定的方法，明确DNA片段的扩增及电泳鉴定原理，进行相关操作； 4.基因工程的应用：基于基因工程在农牧业、医药卫生和食品工业应用的实例说明基因工程给社会带来的巨大进步，尝试运用基因工程培育优良品种或细胞产品，造福人类； 5.蛋白质工程的原理和应用：运用结构与功能观等观念，说明蛋白质工程设计的原理，基于蛋白质工程的实例，构建蛋白质工程的基本操作模型。
要点一 基因工程的概念及其诞生和发展
重点内容 具体要点 特别提醒
基因工程的概念 概念：基因工程（重组DNA技术）是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 1.操作水平是DNA分子水平。 2.原理是基因重组。
基因工程的理论基础 1.细胞生物的遗传物质都是DNA，空间结构都是规则的双螺旋结构；均遵循碱基互补配对原则，因此不同生物的DNA能拼接起来； 2.基因是控制生物体性状遗传物质的结构和功能单位，具有相对独立性。遗传信息的传递都遵循中心法则。生物界共用一套遗传密码。因此外源基因能够在受体细胞内表达，并使受体表现出相应的性状。 1.与有性生殖的区别：有性生殖中的基因重组是随机的，并且只能在同一物种间进行；基因工程可以使基因在不同物种间进行重组，并且方向性强，可以定向地改变生物的性状。
要点二 重组DNA 技术的基本工具
重点内容 具体要点 特别提醒
“分子手术刀”—— 限制性内切核酸酶 1.简称：限制酶； 2.来源：主要是从原核生物中分离纯化来的； 3.功能：识别双链DNA中特定核苷酸序列，断开每条链中特定部位的磷酸二酯键； 4.酶切结果：①若限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端。若限制酶在识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。 1.限制酶识别的序列都是回文序列； 2.限制酶具有很强的专一性； 3.不同种限制酶虽然识别序列不同，但是也可能酶切后产生相同的黏性末端。 4.在原核生物体内，限制酶的作用是切割外源的DNA从而保护自身。
“分子缝合针”——DNA连接酶 1.作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键； 2. E.coli DNA连接酶来自大肠杆菌，只能连接黏性末端；T4 DNA连接酶来自T4噬菌体，既可以连接黏性末端，又可连接平末端 1. E.coli DNA连接酶连接黏性末端的效率比T4 DNA连接酶连接平末端的效率更高； 2. DNA连接酶无识别特异性，对于相同或互补的黏性末端以及平末端都能连接；
“分子运输车”—— 基因进入受体细胞的载体 1.常见载体是质粒，一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA； 2.其他载体：噬菌体、动植物病毒等； 1.质粒作为载体需具备的条件：能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上（能使目的基因稳定存在且数量可扩增），有一个至多个限制酶切割位点（供外源基因插入），有特殊的标记基因（便于重组DNA分子的筛选），对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤； 2.原核生物中限制酶不切割自身DNA的原因是体内不存在该酶识别序列或识别序列已被修饰
要点三 目的基因的筛选与获取
重点内容 具体要点 特别提醒
目的基因 1.概念：用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因； 2.主要是指编码蛋白质的基因。 1.往往从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
利用PCR获取目的基因 1.PCR的原理：DNA半保留复制； 2.条件：DNA模板链、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、引物、温度、缓冲液； 3.过程：变性（90-95℃）复性（50℃左右）延伸（72℃左右），然后循环； 4. PCR产物的鉴定：用琼脂糖凝胶电泳； 5.利用PCR获取和扩增目的基因时，从第3轮循环才会产生完整的目的基因。 1.原料可以是dNTP； 2.引物的作用，提供3′端，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸； 3.子链延伸的方向：从子链的5′端向3′端； 4.缓冲液(含Mg2＋) ：激活耐高温的DNA聚合酶； 5.复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配；对，过低又会造成引物不能与DNA模板链的特定部位结合。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关。假设引物的长度相同，在GC含量高时，复性温度应设定得更高一些； 6.PCR不需要解旋酶，利用高温来解旋。
通过构建基因文库获取目的基因 1.基因组文库：含有该物种全部基因的文库，用不同种限制酶来构建，往往适用于原核生物基因的获取； 2.部分基因文库：只含有该物种部分基因，用逆转录法构建，常用于真核基因的获取。 1.部分基因文库中的基因往往缺乏非编码区，以及编码区的内含子。
要点四 基因表达载体的构建
重点内容 具体要点 特别提醒
基因表达载体的构建 1.构建目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用； 2.基因表达载体的组成：启动子、目的基因、终止子、标记基因； 3.构建过程：同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段，再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，形成重组DNA分子。 1.构建基因表达载体时，目的基因要插入启动子和终止子之间。因为启动子使转录开始，是RNA聚合酶识别和结合的部位，终止子位于基因的尾端，使转录终止； 2.一般不能将目的基因插入载体的标记基因中，否则标记基因被破坏，无法进行进一步筛选； 3.注意区分启动子与起始密码子，终止子与终止密码子。
要点五 将目的基因导入受体细胞
重点内容 具体要点 特别提醒
转化 1.概念：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 1.转化的实质：基因重组。
目的基因导入植物细胞 1.农杆菌转化法：农杆菌细胞内的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）可携带目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上； 2.花粉管通道法：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中，或者在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 1.农杆菌转化法，主要适用于双子叶植物和裸子植物（农杆菌在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力）； 2.花粉管通道法是我国科学家独创的一种方法。
目的基因导入动物细胞 1.将目的基因导入动物细胞常用显微注射法。 1. 显微注射法常用受精卵作为受体细胞。
目的基因导入原核细胞 1. 将目的基因导入原核细胞常用 Ca2＋处理法(感受态细胞法)。 1. 用Ca2＋处理细胞的目的是使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态——感受态，以便于重组DNA 的进入。
要点六 目的基因的检测与鉴定
重点内容 具体要点 特别提醒
分子水平的检测 1.目的基因是否导入了受体细胞：方法是DNA分子杂交，常用PCR技术+基因探针，目的是检测目的基因是否整合到了受体细胞的染色体DNA上； 2.目的基因是否转录出了mRNA：方法是分子杂交，常用PCR技术+基因探针； 3.目的基因是否翻译出了蛋白质：方法是抗原—抗体杂交。 1.由于插入的目的基因不一定会表达，因此在检测到目的基因已经插入受体细胞的染色体DNA上以后，还要进行转录和翻译水平的检测 2.DNA分子杂交技术的原理是碱基互补配对原则； 3.分子杂交技术的原理是碱基互补配对原则； 4.抗原—抗体杂交技术的原理是抗体与抗原的特异性结合。
个体水平的检测 目的：确定目的基因是否赋予了转基因生物特定的的遗传特性及抗性的程度； 鉴定方法：抗病抗虫的接种实验。 1.鉴定导入的抗虫基因是否表达，并表现出抗虫性状，最简便的方法是用叶片饲喂棉铃虫，观察棉铃虫是否死亡； 2.若培育耐盐的植株，则可用盐水浇灌，观察其能否正常生长；培育抗除草剂的植株，则可喷洒除草剂。
要点七 基因工程的应用
重点内容 具体要点 特别提醒
在植物方面 的应用 1.改良植物品种：培育转基因抗虫、抗病、抗除草剂植物，以及改良植物的品质。 如何培育转基因抗病植株？将病毒、真菌等的抗病基因导入植株； 种植转基因抗虫棉若干年后，害虫会对抗虫棉产生抗性，原因是抗虫棉对棉铃虫的进化起到了选择作用。 3.改良品质的实例：将某种必需氨基酸含量高的蛋白质编码基因作为目的基因导入植物。
在动物方面的应用 1.改良动物品种：提高动物的生长速率或改善畜产品的品质。 1.实例：将外源生长激素基因导入鲫鱼体内，以提高其生长速率，将肠乳糖酶基因导入奶牛体内，以解决乳糖不耐受的问题。
在医药卫生领域的应用 1.利用转基因微生物或动植物生产包括细胞因子、抗体、疫苗和激素等药物； 2.利用乳腺生物反应器生产药物：抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素和α-抗胰蛋白酶等； 3.利用转基因动物作器官移植的供体，常用的方法是抑制抗原决定基因的表达或除去抗原决定基因 ，其优点是不会引起免疫排斥反应； 4.基因工程菌生产药物的过程中，若受体是大肠杆菌等细菌，由于没有内质网和高尔基体等细胞器，不能加工形成有活性的干扰素（一种糖蛋白），需要再加工。 1.生产乳腺生物反应器构建基因表达载体时必须把药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子重组在一起，目的是保证相应的目的基因在其乳腺细胞内表达； 2.膀胱生物反应器，应使药用蛋白基因在膀胱上皮细胞中特异表达。与乳腺生物反应器相比，相同点是收集药用蛋白较容易，且不会对动物造成伤害，区别是乳腺生物反应器须处于生殖期的雌性动物才可生产药用蛋白，而膀胱生物反应器则是任何生长期的雌雄动物均可生产。
在食品工业方面的应用 1.利用基因工程实现天冬氨酸、苯丙氨酸等氨基酸的大规模生产； 2.构建工程菌，大量生产淀粉酶、脂肪酶等。 1.工程菌是指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类。
要点八 蛋白质工程的原理与应用
重点内容 具体要点 特别提醒
蛋白质工程的原理 1.概念：蛋白质工程是基因工程的延伸，是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求； 2.原理：通过改造或合成基因来完成对蛋白质结构的设计和改造； 3.基本思路：从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列或者合成新的基因，借助基因工程获得所需要的蛋白质。 1.基因工程的不足：只能生产自然界中已存在的蛋白质，而天然蛋白质的结构和功能虽符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。而蛋白质工程能产生自然界中不存在的新型蛋白质分子； 2.蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，也需要利用基因工程的基本工具，需要经历基因工程的操作流程； 3.蛋白质工程不能直接对蛋白质分子进行操作，因为蛋白质具有十分复杂的空间结构，基因的结构相对简单，容易改造，改造后的基因可以遗传给下一代，而被改造的蛋白质无法遗传。
蛋白质工程的应用 1.医药方面：将干扰素分子的一个半胱氨酸变成丝氨酸，使其在-70℃可以保存半年； 2.其他方面：改进酶的性能或开发新的工业用酶，增加粮食产量，研发新型农药。 1.利用蛋白质工程可以提高玉米赖氨酸含量：改变赖氨酸合成途径中关键酶的活性，来提高赖氨酸的含量； 2.由于蛋白质的结构是由其氨基酸组成决定的，因此个别氨基酸的改变就会导致其空间结构的改变，从而影响到其性质和功能。
(
题型
一
基因工程的概念及理论基础
)
【例1】科学家把兔子血红蛋白基因导入大肠杆菌细胞中，在大肠杆菌细胞中合成了兔子的血红蛋白。下列不是这一先进技术的理论依据的是(　　)
A．所有生物共用一套遗传密码
B．基因能控制蛋白质的合成
C．兔子血红蛋白基因与大肠杆菌的DNA都是由四种脱氧核苷酸构成，都遵循相同的碱基互补配对原则
D．兔子与大肠杆菌有共同的原始祖先
【答案】D
【解析】题干表述的是将目的基因导入受体细胞并得以表达的过程，目的基因在不同生物细胞中能够表达出相同的蛋白质，说明控制其合成的mRNA上的密码子是共用的，相同的密码子决定相同的氨基酸，A正确；基因通过转录获得mRNA，进而控制蛋白质的合成，B正确；基因通常是有遗传效应的DNA片段，只要是双链DNA都遵循碱基互补配对原则，其组成原料都是四种脱氧核苷酸，C正确；生物之间是否有共同的原始祖先与重组DNA技术之间没有必然关系，D错误。
(
解题方法点拨
转基因技术是将一种生物的基因导入另一种生物体内，使其表达产生相应的物质或性状。该技术的原理是基因重组。目的基因表达的过程为：目的基因
DNA→
m
RNA
→
蛋白质
→
相应的
性状。
)
【变式1-1】玉米的PEPC酶固定CO2的能力较水稻的强60倍。我国科学家正致力于将玉米的PEPC基因导入水稻中，以提高水稻产量。下列有关该应用技术的叙述，不正确的是(　　)
A．该技术是在DNA水平上进行设计和施工的
B．该技术的操作环境是生物体内
C．该技术的原理是基因重组
D．该技术的优点是定向产生人类需要的生物类型
【答案】B
【解析】由题意可知，该技术为基因工程，是在生物体外进行的操作，B错误。
【变式1-2】不同生物之间能进行转基因并能获得基因产物，其理论依据不包含(　　)
A．这些生物的DNA分子的空间结构和化学成分一致
B．这些生物的DNA分子都遵循碱基互补配对原则
C．这些生物在基因表达时共用一套遗传密码
D．这些生物的基因结构都是相同的
【答案】D
【解析】不同生物的DNA分子的空间结构和化学成分一致，因此不同生物的基因能连接在一起，A正确；不同生物的DNA分子都遵循碱基互补配对原则，因此具有相同黏性末端或平末端的DNA片段能连接起来，B正确；自然界所有生物共用一套遗传密码，因此一种生物的基因能在另一种生物体内表达，C正确；真核生物和原核生物的基因结构不同，D错误。
(
题型二
重组
DNA
技术的基本工具
)
【例2】下表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法中，错误的是(　　)
限制酶名称　 识别序列和切割位点 限制酶名称 识别序列和切割位点
BamHⅠ G↓GATCC KpnⅠ GGTAC↓C
EcoRⅠ C↓AATTC Sau3AⅠ ↓GATC
HindⅡ GTY↓RAC SmaⅠ CCC↓GGG
注：Y为C或T，R为A或G。
A．HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶切割后形成平末端
B．Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部
C．BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端
D．一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列
【答案】D
【解析】HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶沿着中轴线切口切开，切割后形成平末端，A正确；Sau3AⅠ限制酶识别GATC序列，切割位点在识别序列的外部，B正确；BamHⅠ限制酶识别GGATCC序列，Sau3AⅠ限制酶识别GATC序列，切割后形成相同的黏性末端GATC，C正确；HindⅡ能识别GTCAAC，也能识别GTTAAC，D错误。 (
解题方法点拨
相同黏性末端或平末端的判断方法
黏性末端或平末端是否由同一种限制酶切割形成的判断方法
：
将黏性末端或平末端之一旋转
180
°
后
，
看它们是否是完全相同的结构。是
，
则为相同限制酶切割形成的
；
否
，
则为不同限制酶切割形成的。
)
【变式2-1】如图是3种限制性内切核酸酶对DNA分子的识别序列和剪切位点图(箭头表示切点，切出的断面为黏性末端)。下列叙述错误的是(　　)
限制酶1：
限制酶2：
限制酶3：　
A．不同的限制酶有不同的识别序列和切割位点，体现了酶的专一性
B．限制酶2和3识别的序列都包含6个碱基对
C．限制酶1和3剪出的黏性末端相同
D．能够识别和切割RNA分子内一小段核苷酸序列的酶只有限制酶2
【答案】D
【解析】不同的限制酶有不同的识别序列和切割位点，体现了酶具有专一性，A正确；据题图可知，限制酶2和3识别的序列分别是CCGCGG和GGATCC，均为6个碱基对，B正确；限制酶1和3剪出的黏性末端相同，均为GATC，C正确；限制酶只能识别特定的DNA序列，因此三种限制酶均不能识别和切割RNA中核糖核苷酸序列，D错误。
【变式2-2】下列各种酶及其作用对应关系不正确的是(　　)
A．限制酶——识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开
B．RNA聚合酶——与基因的特定位点结合，催化遗传信息的翻译
C．DNA连接酶——将分开的DNA片段通过特定末端连接在一起
D．DNA聚合酶——将单个脱氧核苷酸连接到已有的核苷酸链上
【答案】B
【解析】限制酶能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，A正确；RNA聚合酶与基因的特定位点结合，催化遗传信息的转录，B错误；DNA连接酶将两个DNA片段连接在一起，在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，C正确；DNA聚合酶将单个脱氧核苷酸连接到已有的核苷酸链上，形成磷酸二酯键，D正确。
(
题型三
PCR
的原理与过程
)
【例3】如图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列叙述错误的是(　　)
A．耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3′端
B．在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段
C．引物之间或引物自身发生碱基互补配对，则不能有效扩增目的基因
D．从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占
【答案】D
【解析】由于复制过程中子链的合成方向是从5′端向3′端，所以耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3′端，A正确；图中的引物A和引物B均不在该片段的端点，因此复制出的子链的长短从引物开始一直延伸至模板链的末端，在第二轮复制中才会出现两个引物之间的单链，因此以此单链为模板在第三轮循环产物中可出现两条核苷酸链等长的DNA片段，即引物之间的核苷酸序列，B正确；如果引物之间或引物自身发生碱基互补配对则会降低与模板链结合的效率，因此不能有效扩增目的基因，C正确；第三轮扩增共形成8个DNA分子，共16条链，除去原来的模板链，应该有新形成的14条链，且这14条链中均含有引物，两种引物使用的频率是相同的，即有7条单链含有引物A，每一条单链参与组成1个DNA分子，因此第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占，D错误。
(
解题方法点拨
PCR
过程的两点提醒
1
．
复性不一定均为引物与
DNA
模板结合。复性时
，
引物与
DNA
模板的结合是随机的
，
也存在
DNA
解开的两条链的结合。
2
．
PCR
反应的结果不都是所需的
DNA
片段。因为第一次循环得到的
DNA
片段只有一种引物
，
比所需的
DNA
片段要长
，
从第二次循环才出现所需的
DNA
片段
，
这样的片段存在两种引物。
)
【变式3-1】新型冠状病毒的检测可以采用实时荧光RT－PCR(逆转录聚合酶链式反应)的方法，RT－PCR的具体过程如图。下列有关叙述错误的是(　　)
A．过程①以mRNA为模板合成单链DNA
B．过程②③拟对单链cDNA进行第n次循环的扩增，理论上需要n个引物B
C．该技术用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度
D．游离的脱氧核苷酸只能从引物的3′端开始连接
【答案】B
【解析】过程①是由mRNA形成单链DNA的过程，表示逆转录，A正确；过程②③拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，根据DNA分子半保留复制特点可知，第n次循环理论上至少需要2n－1个引物B，B错误；利用实时荧光RT－PCR技术对某些微量RNA病毒进行检测时可提高检测的灵敏度，是因为增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量(或浓度)，便于检测，C正确；游离的脱氧核苷酸只能从引物的3′端开始连接，D正确。
【变式3-2】下图a、b、c均为PCR扩增的DNA片段，下列有关说法正确的是(　　)
A．片段a、b、c的长度均相同
B．片段a、b只是第一次循环的产物
C．片段c最早出现在第二次循环的产物中
D．经过30次循环后，片段c的数量为230
【答案】C
【解析】图中片段a、b只有一种引物，是由原始DNA链为模板复制而来，其长度比片段c长，A错误；由于原始模板在每次循环中均可作为模板，则每次循环都能产生图中片段a、b，B错误；由于第一次循环的产物只有一种引物，而图中片段c有两种引物，则最早出现在第二次循环，C正确；经过30次循环后，得到的DNA片段总数为230，这包括图中的片段a、b，D错误。
(
题型四
限制酶的选择及基因表达载体的构建
)
【例4】如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列说法错误的是(　　)
A．图示过程是基因工程的核心步骤
B．表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠ
C．抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
D．除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构
【答案】B
【解析】图示过程为基因表达载体的构建过程，是基因工程中的核心步骤，A正确；构建过程中需要将目的基因完整切割下来，此时要用到限制酶PstⅠ、EcoRⅠ，用SmaⅠ会破坏目的基因，B错误；抗卡那霉素基因是标记基因，目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞，C正确；基因表达载体包括复制原点、启动子、目的基因、终止子和标记基因等，D正确。
(
解题方法点拨
启动子、终止子与起始密码子、终止密码子的区别
位置
作用
启动子
位于
DNA
分子上
RNA
聚合酶识别结合位点
，
启动转录过程
起始密码子
位于
mRNA
分子上
决定翻译的开始
终止子
位于
DNA
分子上
决定转录的结束
终止密码子
位于
mRNA
分子上
决定翻译的结束
)
【变式4-1】某科研小组利用质粒(图甲)和目的基因(图乙)构建重组DNA。下列分析错误的是(　　)
A．用限制酶Hind Ⅲ和PstⅠ切割质粒，可得到2条DNA片段
B．不能用AluⅠ酶切割质粒和外源DNA的原因是AluⅠ酶会破坏目的基因
C．构建重组DNA时，需选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA
D．导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长
【答案】C
【解析】限制酶Hind Ⅲ和PstⅠ在质粒上各有一个识别切割位点，用Hind Ⅲ和PstⅠ切割质粒，可得到2条DNA片段，A正确；AluⅠ的识别、切割位点位于目的基因中，用AluⅠ酶切割外源DNA会破坏目的基因，B正确；选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA，质粒中的两个标记基因均会被破坏，C错误；选择Hind Ⅲ和PstⅠ同时切割质粒和外源DNA，会破坏质粒中的氯霉素抗性基因，保留四环素抗性基因，所以导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长，D正确。
【变式4-2】限制酶的发现为DNA的切割和功能基因的获得创造了条件。限制酶Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ的识别序列及切割位点分别为↓GATC、G↓AATTC、G↓GATCC。含某目的基因的DNA片段如图所示，若利用质粒A(含限制酶Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点各1个)构建基因表达载体，为克服目的基因和质粒A的自身环化以及目的基因与质粒的任意连接等，应该如何选择限制酶？(　　)
A．用限制酶EcoRⅠ或BamHⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒A
B．用限制酶Sau3AⅠ和BamHⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒A
C．用限制酶Sau3AⅠ和EcoRⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒A
D．用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒A
【答案】D
【解析】限制酶Sau3AⅠ切割目的基因会破坏目的基因，B、C错误；质粒含有限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，获取目的基因也可以用限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ单独切割，但为了防止目的基因或质粒自身环化，需要使用不同种限制酶进行切割，A错误；所以可以使用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ去切割质粒，也用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ去切割目的基因，则获得重组质粒会进行正常连接，选D。
(
题型五
目的基因导入受体细胞的方法
)
【例5】如图表示培育转基因抗植物病毒番茄的过程示意图。下列叙述正确的是(　　)
A．过程A需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶的参与
B．过程B通常需要用CaCl2处理，以提高番茄细胞壁的通透性
C．过程C需要采用植物组织培养技术
D．抗植物病毒基因一旦整合到番茄细胞的染色体上，就能正常表达
【答案】C
【解析】图中过程A为构建基因表达载体，需要用到限制酶和DNA连接酶，而不需要DNA聚合酶，A错误；CaCl2处理只能提高农杆菌细胞的细胞壁的通透性，B错误；过程C是由一个植物细胞得到一个完整植株的过程，一般要采用植物组织培养技术，C正确；抗植物病毒基因整合到番茄细胞的染色体上，不一定能表达，D错误。
(
解题方法点拨
目的基因导入植物细胞时常选用植物的体细胞作为受体细胞
，
主要是因为植物体细胞具有全能性
，
且取材方便
(
动物的体细胞不易表达全能性
，
常选用全能性最高的受精卵为受体细胞
)
。图中目的基因导入受体细胞采用的是农杆菌转化法，先将目的基因插入到农杆菌的
Ti
质粒的
T-DNA
中，将重组
DNA
导入农杆菌体内，再用转基因的农杆菌去
侵染
植物细胞。
农杆菌转化法中
有
两次拼接、两次导入
1
．
两次拼接
：
第一次拼接是将目的基因拼接到
Ti
质粒的
T-DNA
上
；
第二次拼接
(
非人工操作
)
指被插入目的基因的
T-DNA
拼接到受体细胞染色体的
DNA
上。
2
．
两次导入
：
第一次导入是将
含目的
基因的
Ti
质粒重新导入农杆菌
；
第二次导入
(
非人工操作
)
是指
含目的
基因的
T-DNA
导入受体细胞。
)
【变式5-1】下列关于目的基因导入受体细胞的方法中，不正确的是(　　)
A．我国利用花粉管通道法培育了转基因抗虫棉
B．用Ca2＋处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞
C．将目的基因导入动物细胞最常用、最有效的方法是显微注射法
D．利用农杆菌转化法培育大多数单子叶转基因植物
【答案】D
【解析】目前我国的转基因抗虫棉是利用花粉管通道法培育的，A正确；为使大肠杆菌易吸收DNA分子，应先用氯化钙溶液进行处理，使大肠杆菌处于易于吸收周围环境中DNA分子的感受态，B正确；显微注射技术是将目的基因导入动物细胞最为有效的一种方法，C正确；农杆菌对大多数单子叶植物没有侵染能力，D错误。
【变式5-2】下图为科学家通过基因工程培育抗虫棉时，从苏云金杆菌中提取抗虫基因“放入”棉花细胞中，与棉花的DNA分子“结合起来”而发挥作用的过程示意图。以下相关说法不正确的是(　　)
A．图中Ⅰ是质粒，步骤①需要用到限制酶和DNA连接酶
B．图中Ⅱ是含目的基因的重组质粒，步骤②是将重组质粒导入棉花细胞
C．图中Ⅲ是农杆菌，通过步骤③将目的基因导入植物细胞
D．剔除培育成功的抗虫棉体内的四环素抗性基因不会影响抗虫基因的表达
【答案】B
【解析】图中Ⅰ为质粒，步骤①为基因表达载体的构建，需要用到限制酶和DNA连接酶，A正确；图中步骤②是将重组质粒导入农杆菌细胞，B错误；图中Ⅲ是农杆菌，通过步骤③将目的基因导入植物细胞，C正确；基因的表达具有一定的独立性，剔除抗虫棉体内的四环素抗性基因不影响抗虫基因的表达，D正确。
(
题型六
目的基因检测与鉴定的方法
)
【例6】利用基因工程技术生产羧酸酯酶(CarE)制剂，用于降解某种农药的残留，基本流程如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A．过程①的反应体系中需要加入逆转录酶和核糖核苷酸
B．过程②需使用限制酶、Taq酶以及DNA连接酶
C．过程③需要使用NaCl溶液制备感受态的大肠杆菌细胞
D．过程④可利用DNA分子杂交技术鉴定CarE基因是否成功导入受体细胞
【答案】D
【解析】过程①表示通过逆转录法合成目的基因，该过程需要逆转录酶和脱氧核苷酸，A错误；②过程是基因表达载体构建，需要使用限制酶、DNA连接酶，不需要使用Taq酶，B错误；过程③常用Ca2＋处理大肠杆菌使其成为易于吸收DNA的感受态细胞，C错误；过程④可利用DNA分子杂交技术鉴定CarE基因是否成功导入受体细胞，D正确。
(
解题方法点拨
检测受体细胞中是否有目的基因是鉴定和检测的第一步
，
但即便受体细胞中存在目的基因
，
不能说明目的基因一定会稳定遗传并表达
。因此需要进一步
检测目的基因是否
转录
mRNA
。
但成功转录出
mRNA
也不一定能翻译成相应的所需蛋白质。检测目的基因是否翻译蛋白质是检测目的基因是否表达的最后步骤
，
如果存在该蛋白质或相应的性状
，
说明目的基因能在受体细胞内稳定存在并能表达
。
)
【变式6-1】某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)示意图，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组细菌的外源基因插入点，正确的一组是(　　)
插入点 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的培养基上的生长状况
① 能生长 能生长
② 能生长 不能生长
③ 不能生长 能生长
A．①是c；②是b；③是a
B．①是a和b；②是a；③是b
C．①是a和b；②是b；③是a
D．①是c；②是a；③是b
【答案】A
【解析】第①组中细菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因没有被破坏；细菌能在含四环素培养基上生长，说明抗四环素基因没有被破坏，说明了外源基因插入位置是c。第②组中细菌能在含氨苄青霉素培养基上生长说明抗氨苄青霉素基因没有被破坏；细菌不能在含四环素培养基上的生长，说明抗四环素基因被破坏，说明了外源基因插入位置是b。第③组细菌不能在含氨苄青霉素培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因被破坏；细菌能在含四环素培养基上生长，说明抗四环素基因没有被破坏，说明了外源基因插入位置是a。
【变式6-2】利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列选项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是(　　)
A．棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因
B．大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNA
C．山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列
D．酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白
【答案】D
【解析】基因表达的产物是蛋白质，因此，只有在受体细胞中检测或提取到了相应蛋白质才能证明目的基因在受体细胞中完成了表达，A、C项只能说明完成了目的基因的导入，B项只能说明完成了目的基因的导入和目的基因的转录过程。
(
题型七
PCR
扩增及电泳图谱的分析
)
【例7】用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样(Marker)，2～10号为PCR产物；其中2号的模板为野生型植株DNA，3～9号模板为转基因植株的DNA，10号使用蒸馏水代替模板DNA。据此做出分析不合理的是(　　)
A．PCR产物的分子大小在250～500 bp之间
B．3号样品植株导入的目的基因一定能成功表达
C．9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D．10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
【答案】B
【解析】PCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段，3～9号是转基因植株，理论上应包含目的基因，结合2号野生型和10号蒸馏水组的结果，推测包含目的基因的片段大小应为250～500 bp，A合理；3号PCR结果包含250～500 bp片段，包含目的基因，但导入的目的基因不一定能成功表达，B不合理；9号PCR结果不包含250～500 bp片段，所以不是所需转基因植株，C合理；10号放入蒸馏水，可排除反应体系等对结果的干扰，D合理。
(
解题方法点拨
电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
，
向着与其所带电荷相反的电极移动
。
待测样品中各种分子的形状、大小及带电性质的差异等会影响其在电泳中的迁移速度
。
)
【变式7-1】实时荧光定量PCR简称qPCR，灵敏度高、特异性好，是目前检测微小残留病变的常用方法。将荧光标记的Taqman探针与待测样本DNA混合，当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被TaqDNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到在特定光激发下发出荧光(如图所示)，随着循环次数的增加，荧光信号强度增加，通过实时检测荧光信号强度，可得Ct值(该值与待测样本中目的基因的个数呈负相关)。下列相关叙述错误的是(　　)
A．每个模板DNA分子含有2个游离的磷酸基团
B．在反应过程中，无需ATP为新链的合成提供能量
C．做qPCR之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成引物和Taqman探针
D．荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明含有的病变的概率越小
【答案】D
【解析】DNA分子为两条反向平行的两条链，每条链都含有1个游离的磷酸基团，则一个DNA分子含有2个游离的磷酸基团，A正确；在反应过程中，dNTP为新链的合成提供能量，无需ATP，B正确；做qPCR之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成1对引物和1种Taqman探针，C正确；若荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明扩增次数少，说明更多的荧光探针与目的基因进行了碱基互补配对，可推测获得的核酸产物中含有病变的概率越大，D错误。
【变式7-2】下图表示形成cDNA并进行PCR扩增的过程。据图分析，下列叙述正确的是(　　)
A．①过程所需的原料是核糖核苷酸
B．②过程所需的酶必须耐高温
C．③过程需要解旋酶破坏氢键
D．④过程的引物对之间不能互补配对
【答案】D
【解析】①过程为逆转录，所需的原料是脱氧核苷酸，A错误；②过程由DNA单链合成DNA双链过程所需要的DNA聚合酶不需要耐高温，B错误；③过程为变性，温度上升到超过90 ℃时，双链DNA解聚为单链，不需要DNA解旋酶破坏氢键，C错误；④过程为复性，温度降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条DNA单链结合，但引物对之间不能互补配对，D正确。
(
题型八
运用基因工程的原理分析其在不同领域中的应用
)
【例8】动物乳腺生物反应器是一项利用转基因动物的乳腺代替传统的生物发酵，进行大规模生产可供治疗人类疾病或用于保健的活性蛋白质的现代生物技术。科学家已在牛和羊等动物乳腺生物反应器中表达出了抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素等重要药品，其大致过程如图所示。下列有关说法错误的是(　　)
A．通过③形成的重组质粒具有人的药用蛋白基因、启动子、终止子和标记基因即可
B．④通常采用显微注射技术
C．在转基因母牛的乳腺细胞中人的药用蛋白基因才会得以表达，因此可以从乳汁中提取药物
D．该技术生产药物的优点是产量高、质量好、易提取
【答案】A
【解析】要让药用蛋白基因在乳腺细胞内表达并分泌含药物的乳汁，重组质粒上必须具有乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件，A错误；转基因动物通常利用的受体细胞是受精卵，采用显微注射技术，B正确；只有母牛到达泌乳期，乳腺细胞才会表达相应的药用蛋白基因，乳汁中含有药物，C正确；从乳汁里提取药物，优点突出，使动物本身成为“批量生产药物的工厂”，D正确。
(
解题方法点拨
乳腺生物反应器
是指将所需目的基因导入到动物的受精卵
，
使转基因动物分泌的乳汁中含有所需要的药物蛋白。为了让目的基因在乳腺细胞中表达，需将目的基因与乳腺蛋白基因的启动子拼接在一起。
)
【变式8-1】蜘蛛丝(丝蛋白)被称为“生物钢”，有着超强的抗张强度，可制成防弹背心、降落伞绳等。蜘蛛丝还可被制成人造韧带和人造肌腱。科学家研究出集中生产蜘蛛丝的方法——培育转基因羊作为乳腺生物反应器。下列有关乳腺生物反应器的说法，错误的是(　　)
A．将丝蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等结合在一起构建成表达载体
B．将含有丝蛋白基因的表达载体导入动物乳腺细胞中即可获得乳腺生物反应器
C．与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受性别等限制，受体来源更广泛
D．转基因动物产生的生殖细胞可能含有药用蛋白基因
【答案】B
【解析】该过程需要将丝蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等结合在一起构建成表达载体，再通过显微注射法导入受精卵中，A正确；将含有丝蛋白基因的表达载体导入动物受精卵中才可获得乳腺生物反应器，B错误；与乳腺生物反应器(只能选雌性)相比，膀胱生物反应器不受性别等限制，受体来源更广泛，C正确；转基因动物产生的生殖细胞可能含有药用蛋白基因，因为体细胞中含有药用蛋白基因，D正确。
【变式8-2】α1-抗胰蛋白酶是肝脏产生的一种糖蛋白，缺乏该酶会引起肺气肿。某公司成功培育出转基因羊，这种羊进入泌乳期后，其乳汁中含有人类的α1-抗胰蛋白酶，可用于治疗肺气肿。下列相关叙述不正确的有(　　)
A．构建基因表达载体需将α1-抗胰蛋白酶基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组
B．构建好的基因表达载体需要通过显微注射技术导入羊的受精卵中
C．受精卵通过早期胚胎培养，一般发育到原肠胚阶段通过胚胎移植到受体子宫孕育
D．为了选育出能泌乳的雌羊，移植前需从胚胎的滋养层取样，通过DNA鉴定分析性别
【答案】C
【解析】基因工程的目的是培育出转基因羊，让其乳汁中含有人类的α1-抗胰蛋白酶，构建基因表达载体时，需将α1-抗胰蛋白酶基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组，A正确；由于动物细胞的全能性受到限制，故构建好的基因表达载体需要通过显微注射技术导入羊的受精卵中，B正确；受精卵通过早期胚胎培养，一般发育到桑葚胚或囊胚阶段，通过胚胎移植到受体子宫孕育，C错误；为了确保选育出的羊是能泌乳的雌羊，移植前需从胚胎的滋养层取样，通过DNA鉴定分析性别，若为雌性再进行胚胎移植，D正确。
(
题型九
运用蛋白质工程的原理分析具体应
用的实例
)
【例9】为心梗患者注射大剂量的t-PA(一种能高效降解血栓的单链糖蛋白，主要由血管内皮细胞合成、分泌并释放进血液)会诱发颅内出血。研究证实，将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血等副作用，据此分析错误的是(　　)
A．若利用大肠杆菌来生产t-PA，需要对其合成的t-PA进行后期改造
B．改造t-PA的技术属于蛋白质工程
C．欲将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，应直接对蛋白质(t-PA)进行改造
D．可利用抗原—抗体杂交技术来检测转基因的大肠杆菌是否分泌了t-PA
【答案】C
【解析】由于大肠杆菌只有核糖体一种细胞器，不含内质网和高尔基体，无法对t-PA进行加工，故若利用大肠杆菌来生产t-PA，需要对其合成的t-PA进行后期改造，A正确；本技术是将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，属于蛋白质工程，B正确；欲将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，应对相应的基因进行改造，不能直接改造蛋白质，C错误；t-PA是一种能高效降解血栓的单链糖蛋白，由于抗原与抗体的结合具有特异性，故可利用抗原—抗体杂交技术来检测转基因的大肠杆菌是否分泌了t-PA，D正确。
(
解题方法点拨
“
两看法
”
判断基因工程和蛋白质工程
1
．
一看基因是否对原有基
因进行改造改造
2
．
二看蛋白质
如果合成的蛋白质是天然蛋白质
，
则是基因工程
；
如果合成的蛋白质和天然蛋白质有差异
，
甚至是自然界中所没有的
，
则为蛋白质工程。
)
【变式9-1】已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。下列叙述正确的是(　　)
A．从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的氨基酸序列(或结构)进行改造
B．直接对蛋白质的氨基酸序列(或结构)进行修饰改造，是蛋白质工程的范畴
C．改变后的蛋白质(P1)与蛋白质(P)的结构相同，功能不同
D．蛋白质工程已被广泛发展应用，极大的满足了人类生产生活的需要
【答案】A
【解析】若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的氨基酸序列(或结构)进行改造，A正确；蛋白质工程通过改造基因来完成对蛋白质的改造，而不是直接对蛋白质的氨基酸序列(或结构)进行修饰改造，B错误；改变后的蛋白质(P1)与蛋白质(P)的结构不相同，功能不同，C错误；由于人们对蛋白质的空间结构了解较少，因此蛋白质工程还没有被广泛发展应用，D错误。
【变式9-2】蛋白酶应用于洗涤剂、制革及丝绸工业。某研究小组利用蛋白质工程将该蛋白酶中第188位丙氨酸替换为脯氨酸、第239位谷氨酰胺替换为精氨酸、第262位缬氨酸替换为亮氨酸，结果发现该酶的催化活性大幅度提高。下列叙述正确的是(　　)
A．对枯草杆菌蛋白酶进行改造通过直接改造蛋白酶的分子结构来实现
B．通过基因工程和蛋白质工程生产的枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列相同
C．改造后的枯草杆菌蛋白酶可能使肽键结构发生改变导致其催化活性提高
D．对枯草杆菌蛋白酶进行分子设计必须从预期蛋白酶的功能特点入手
【答案】D
【解析】对枯草杆菌蛋白酶进行改造通过基因工程改造基因来实现，A错误；基因工程生产的蛋白质是自然界已有的蛋白质，而蛋白质工程能生产出自然界中不存在的新型蛋白质分子，两者的氨基酸序列不同，B错误；改造后的枯草杆菌蛋白酶氨基酸序列可能不同，肽键都是一个氨基和一个羧基脱水缩合形成的，其结构不会发生改变，C错误；对蛋白质进行分子设计应从预期的蛋白质功能出发，对蛋白质的结构进行设计，D正确。
1.（2024·湖南·高考真题）某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（　　）
A．限制酶失活，更换新的限制酶
B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等
C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA
D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
【答案】B
【分析】酶是活细胞产生的具有催化作用的有机物，大多数是蛋白质，少部分是RNA，酶具有特异性、高效性、易受环境因素影响等特点。限制酶特异性识别并切割DNA上的特定位点。
【详解】A、限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确；
B、酶切条件不合适通常会使切割效果下降，调整反应条件如温度和PH等，调整酶的用量没有作用，B错误；
C、质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒，C正确；
D、质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。
故选B。
2.（2023·重庆·高考真题）某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切（下图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是（ ）
A．其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇
B．步骤①所用的酶是SpeI和CfoI
C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段
D．酶切片段和载体连接时，可使用E．coli连接酶或T4连接酶
【答案】B
【分析】E.coliDNA连接酶只能连接黏性末端；T4DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。
【详解】A、由于引物只能引导子链从5＇到3＇，根据碱基互补配对原则，其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇，A正确；
B、根据三种酶的酶切位点，左侧的黏性末端是使用NheI切割形成的，右边的黏性末端是用CfoI切割形成的，B错误；
C、用步骤①的酶对载体进行酶切，使用了NheI和CfoI进行切割，根据他们的识别位点以及原本DNA的序列，切割之后至少获得了2个片段，C正确；
D、图中形成的是黏性末端，而E.coliDNA连接酶能连接黏性末端；T4DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端，D正确。
故选B。
3．（2023·湖北·高考真题）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（　　）
A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落
【答案】D
【分析】图中质粒内，氨苄青霉素抗性基因（AmpR）内含有AcaI和PvuI的酶切位点，四环素抗性基因（TetR）内含有HindIII、SphI和SalI的酶切位点。
【详解】A、若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确。
B、若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因（TetR），因此在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；
C、DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；
D、SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因（AmpR），因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。
故选D。
4.（2025·江苏·高考题改编）图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为，下列相关叙述正确的有（ ）
A．基因A突变为a是一种碱基增添的突变
B．用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末端类型相同
C．用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小一致
D．产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定
【答案】D
【分析】“分子手术刀”——限制酶：（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式，即黏性末端和平末端。
【详解】A 、对比 A 基因和 a 基因的序列，A 基因中 “AAGCTT” 变为 a 基因中 “AAGCTG” ，是碱基替换（T→G），并非碱基增添，A 错误；
B、HindⅢ 切割产生黏性末端，AluⅠ 切割后产生的是平末端，二者末端类型相同，B错误；
C、a基因中有2个Hind Ⅲ切割位点，切割后产生3个片段，有3个Alu Ⅰ切割位点，切割后产生4个片段，用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小不一致，C 错误；
D、因为正常基因 A 和致病基因 a 的 HindⅢ 切割位点数量不同，所以产前诊断时，该致病基因可选用 HindⅢ 限制酶开展酶切鉴定，D 正确。
故选D。
5.（2025·安徽·高考真题）质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是（ ）
A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数
B．如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株
C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株
D．若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌
【答案】C
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】A、使用氯化钙处理大肠杆菌，可使其处于感受态，提高转化效率，即更多的大肠杆菌能吸收质粒，无论吸收的是含目的基因的重组质粒（可能形成白色菌落）还是未重组的质粒K（形成蓝色菌落），都可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数，A正确；
B、由于仅含卡那霉素，未添加X-gal，无论导入的是重组质粒还是空白质粒，因不含X-gal，无法产生蓝色物质，故生长出的菌落均为白色，B正确；
C、筛选平板中长出的白色菌落，可能是导入了重组质粒（含目的基因），但也可能是虽然导入了质粒但目的基因没有成功表达目标蛋白，不能仅仅因为是白色菌落就判定为表达目标蛋白的菌株，C错误；
D、若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌，因为自身环化的质粒K中β - 半乳糖苷酶基因完整，能表达活性β - 半乳糖苷酶，分解X - gal形成蓝色菌落，D正确。
故选C。
6.（2023·山西·高考真题）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（ ）
A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E. coli DNA连接酶连接
B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E. coli DNA连接酶连接
【答案】C
【分析】DNA连接酶：
（1）根据酶的来源不同分为两类：E.coliDNA连接酶、T4DNA连接酶。这二者都能连接黏性末端，此外T4DNA连接酶还可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低。
（2）DNA连接酶连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
【详解】A、酶3切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA连接酶连接，A错误；
B、质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B错误；
C、质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C正确；
D、若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D错误。
故选C。
7.（2025·全国卷·高考真题）琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析，样品1～4的电泳结果如图所示（“+”“-”分别代表电泳槽的阳极和阴极）。已知样品1和2中的DNA分子分别是甲和乙，甲只有限制酶R的一个酶切位点，样品3和4中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是（ ）
A．配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液
B．该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷
C．甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同
D．据图推测样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物
【答案】D
【分析】限制酶酶切其基本原理是利用限制酶对DNA上特定序列的识别，来确定切割位点并实现切割，从而获得所需的特定序列。
【详解】A、配制琼脂糖凝胶时选用适当缓冲溶液，可维持电泳过程中体系的pH稳定，保证核酸分子正常泳动，A正确；
B、电泳时，样品向+极移动，说明在该实验条件下甲、乙两种 DNA 分子均带负电荷，符合核酸分子在电泳中的带电特性，B正确；
C、电泳中，DNA分子的迁移速率与分子大小、电荷的多少等多种因素有关。甲、乙电泳条带位置虽然相同，但影响DNA分子的迁移速率的因素很多，所以碱基对的数量可能不同，C正确；
D、甲只有限制酶R的一个酶切位点，若被酶R完全酶切，只会得到2种DNA片段（2个条带），这两个条带的碱基数量比甲要少，电泳跑的距离要比甲更远，所以据图推测样品4才是甲被酶R完全酶切后的产物，D 错误。
故选D。
8．（2025·广东·高考真题）Solexa测序是一种将PCR与荧光检测相结合的高通量测序技术。为了确保该PCR过程中，DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的（ ）
A．1'-碱基 B．2'-氢 C．3'-羟基 D．5'-磷酸基团
【答案】C
【分析】在DNA复制过程中，在DNA聚合酶的催化作用下，将一个个的脱氧核苷酸连接形成磷酸二酯键，使子链延伸，但是DNA聚合酶催化延伸子链方向只能从5′→3′。
【详解】已知DNA聚合酶催化延伸子链方向只能从5′→3′，原因是脱氧核苷酸的3'碳有羟基，可以结合下一个脱氧核苷酸的5′碳的磷酸基团，故为了DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的3'-羟基，使其不能结合下一个脱氧核苷酸的5′碳的磷酸基团，C正确。
故选C。
9．（2024·江西·高考真题）γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB）导入生产菌株E．coliA，构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E．coliB。下列叙述正确的是（ ）
A．上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB
B．E．coliB发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能
C．E．coliA和E．coliB都能高效降解γ-氨基丁酸
D．可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒
【答案】A
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是Ca2+转化法；
（4）目的基因的检测与鉴定：包括分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。
【详解】 A、上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB，A正确。
B、题意显示，用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一，E．coliB中能表达L-谷氨酸脱羧酶（GadB），因此可用E．coliB发酵生产γ-氨基丁酸，该过程中L-谷氨酸钠的作用不是供能，B错误；
C、E．coliA中没有L-谷氨酸脱羧酶（GadB），因而不能降解L-谷氨酸，而E．coliB中含有该酶的基因，因而能高效降解L-谷氨酸，高效生产γ-氨基丁酸，C错误；
D、图中质粒下方括号内备注含多克隆位点，表明质粒上含有多种限制酶的识别序列，但无法判断能否用其他酶代替，D错误。
故选A。
10.（2024·浙江·高考真题）阅读下列材料，完成下面小题。
疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。
研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。
（1）．下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是（ ）
A．F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段
B．F1-R2引物不能用于特异性地扩增目的片段
C．F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用
D．R2引物可用于特异性地扩增目的片段
（2）．为了筛查疟原虫感染者，以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样，处理后进行PCR。产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳结果如图所示。
1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是（ ）
A．1号和6号 B．2号和4号
C．3号和5号 D．1号、2号、4号和6号
【答案】（1）．D （2）．B
【分析】引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。
（1）．A、根据图乙结果显示可知，F1-R1引物只扩增出一条片段,说明能够用于特异性扩增目的片段，A正确；
B、根据图乙信息可知，F1-R2引物扩增条带为三条，说明其不能用于特异性扩增目的片段，B正确；
C、根据图乙信息可知，F1-R1能扩增目的1条带，F2-R1无法扩增目的条带，所以F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用，C正确；
D、根据图乙显示可知，F1-R1引物只扩增出一条片段，F1-R2引物扩增条带为三条，说明R2引物无法特异性的扩增目的条带，D错误。
故选D。
（2）．根据题干信息可知，疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。根据酶切位点可知，在具有氯喹抗性的基因组没有ApoⅠ酶切位点，而敏感性基因组中具有该酶切位点，因此对6份血样处理后进行PCR，产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳出现两条带则为敏感型，只有一条带的为抗性，所以1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是2号和4号，B正确，ACD错误。
故选B。
11．（2024·山东·高考真题）制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP）的反应管①~④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有（　　）
反应管 加入的单链DNA
① 5'-GCCGATCTTTATA-3' 3'-GACCGGCTAGAAA-5'
② 5'-AGAGCCAATTGGC-3'
③ 5'-ATTTCCCGATCCG-3' 3'-AGGGCTAGGCATA-5'
④ 5'-TTCACTGGCCAGT-3'
A．①② B．②③ C．①④ D．③④
【答案】D
【分析】子链的延伸方向为5'→3'，由题意可知，在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区，要能得到带有荧光标记的DNA探针，需要能根据所提供的模板进行扩增，且扩增子链种含有A。
【详解】分析反应管①～④中分别加入的适量单链DNA可知，①中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，但双链DNA区之外的3'端无模板，因此无法进行DNA合成，不能得到带有荧光标记的DNA探针；②中单链DNA分子内具有自身互补的序列，由于在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区，故一条单链DNA分子不发生自身环化，但两条链可以形成双链DNA区，由于DNA合成的链中不含碱基A，不能得到带有荧光标记的DNA探针；③中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，且双链DNA区之外的3'端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针；④中单链DNA分子内具有自身互补的序列，一条单链DNA分子不发生自身环化，两条链可以形成双链DNA区，且双链DNA区之外的3'端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针。
综上，能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有③④。
故选D。
12．（2024·吉林·高考真题）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（ ）
A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快
D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
【答案】A
【分析】琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的原理主要基于DNA分子在电场作用下的迁移行为以及琼脂糖凝胶的特性。
【详解】A、琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A正确；
B、 凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分子， 当溴酚蓝到凝胶2/3处时(可看蓝色条带)，则停止电泳，B错误；
C、在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA片段实际上是向正极迁移的，而不是向负极迁移。同时，DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢，C错误；
D、琼脂糖凝胶中的DNA分子需染色后，才可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，D错误。
故选A。
13.（2024·重庆·高考真题）大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小），然后克隆了该基因（两品种中基因S序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。
(1)基因S启动子的基本组成单位是 。
(2)通过基因工程方法,将DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题19图所示信息（不考虑未标明序列）判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是 ；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是 。
(3)为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有 。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是 。
(4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ-1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T+基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ-2的种子也变大，但小于YZ-1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是 。
【答案】(1)脱氧核糖核苷酸（脱氧核苷酸）
(2) EcoRⅠ 酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向链接（反向链接）
(3) 酶切后的空载体片段，启动子D+基因S片段 PCR
(4)品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大
【分析】
题干关键信息 所学知识 信息加工
启动子的基本组成单位 基因的结构 启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于启动DNA的转录，是一段DNA片段，其基本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸
电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有哪些成分 PCR及琼脂糖凝胶电泳 电泳可以分离不同大小的DNA片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动子D+基因S”片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段和“启动子D+基因S”片段
检测转入是否成功的技术 检测目的基因是都导入受体细胞的方法 在分子水平上检测目的基因是否转入成功可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA
【详解】（1）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于启动DNA的转录，是一段DNA片段，其基本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸。
（2）①根据图示信息可知，“启动子D＋基因S”的DNA序列上存在EcoR Ⅰ的识别序列，若使用限制酶EcoR Ⅰ，会使目的基因序列被破坏；
②根据图中限制酶的识别序列可知，酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ切割产生的黏性末端相同，若用这两种限制酶切割，形成的DNA片段在构建基因表达载体时，容易出现自我环化，以及无法保证目的基因片段与载体片段单向连接，影响目的基因在受体细胞中的表达。
（3）①DNA电泳可以分离不同大小的DNA片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动子D+基因S”片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段和“启动子D+基因S”片段；
②在分子水平上检测目的基因是否转入成过可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA。
（4）根据（4）题目信息可知，再生植株YZ-1导入的目的基因为取自品种DN的“启动子D＋基因S”序列，再生植株YZ-2导入的目的基因为取自品种TL的“启动子T＋基因S”序列，结合题干信息“两品种中基因S序列无差异”可推测：品种DN的基因S上游的启动子D的效应强于品种TL的启动子T，启动子D使基因S表达量更高，因而种子更大。
14.（2025·山东·高考真题）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。
(1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为 。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和 对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是 。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶 进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为 bp，则一定为正向重组质粒。
(2)为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为 （填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段 ，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为 （填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。
(3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因， （填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。
【答案】(1) 复制原点 XbaI DNA聚合酶 SmaI和SpeI 550bp
(2) 4 环化 测序和序列比对
(3)不能
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；
（3）将目的基因导入受体细胞；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）DNA复制的起点是复制原点，因此Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为复制原点。根据SmaI限制酶识别序列可知，酶切形成的是平末端，若质粒仅用SmaI酶切，抗除草剂基因和质粒可以正向接入也可以反向接入，且无法区分，为了确定是否是正向重组质粒，因此在构建重组质粒时需要用到另一种限制酶，抗除草剂因需要插入到启动子和终止子之间，因此不能选择BamHI，因为该限制酶会破坏终止子，因此可选择XbaI和SmaI进行酶切，XbaI酶切会形成黏性末端，需要用DNA聚合酶聚合脱氧核糖核苷酸单体将产生的黏性末端补平（可使重组质粒最小，同时PstI酶切后产生的黏性末端无法用DNA聚合酶抹平，因为DNA聚合酶只能从3'延伸子链）。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌。重组的T-DNA片段上含有一个SmaI酶切位点和一个SpeI酶切位点，可以选择用SmaI和SpeI进行酶切，转录的方向是从模板的3'→5'，和质粒对应的方向相同，经过两种酶的酶切后并电泳呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为550bp，若反向接，较短的条带长度近似为200bp。
（2）由于后续PCR难以扩增大片段DNA，所以最好选择识别序列为4个碱基的限制酶，原因是识别序列越短，酶切位点越多，切割产生的片段可能越小，更有利于后续的PCR扩增。由于引物是根据已知序列设计的，但此时需要扩增未知序列，因此可以将图乙的片段环化，这样就可以利用现有引物扩增出未知序列。为了确定未知序列是否是同一基因，需要准确比对其上的碱基序列，因此对同一个基因的操作为测序和序列比对。
（3）突变植株成功导入野生型基因，但野生型基因未必可以正常表达，因此不能确定该植株的表型为野生型。
15.（2024·山东·高考真题）研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。
(1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越 （填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有 种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'- -3'和5'- -3'。
(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素 筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是 ，其中纯合的突变植株是 （填序号）。
(3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为 ，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
【答案】(1) 低 256 5'-CAAT-3' 5'-GTTT-3'
(2) 卡那霉素 Sac Ⅰ ④ (3)1/4
【分析】
题干关键信息 所学知识 信息加工
黏性末端的种类 基因工程的工具 BsaI切割产生的黏性末端是NNNN，四个碱基最多可能有256种排列顺序
抗生素筛选 目的基因的检测与鉴定 重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株
【详解】（1）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。由此可知，在利用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目的基因时，所用的引物越短，则引物的特异性就越低。根据题意可知，限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，图中给出的只是载体信息，大豆基因组无法从图中看出。只能根据理论来推测，BsaI切割产生的黏性末端是NNNN，四个碱基最多可能有256种排列顺序，故答案应为 256。根据图甲所示的载体信息，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-CAAT-3'、5'-GTTT-3'。
（2）根据图示信息可知，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图甲可知，目标基因L的目标序列跟突变序列之间的差异只有在Sac Ⅰ酶切位点上存在差异，BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ这两个酶切位点完全相同，根据图丙及题意可知，所展示的电泳结果可知，要以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，并对PCR产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶Sac Ⅰ，限制酶Sac Ⅰ在突变序列存在酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两条，目标序列是一条带，根据图丙结果可知，只有④为纯和突变的植株。
（3）根据题意可知，在实验当中获得了一株基因l成功突变的纯合之中，已知该植株具有抗生素抗性，经过检测发现其体细胞中只有一条染色体含有T-DNA插入。根据图示可知，抗生素抗性基因在T-DNA片段上，因此如果用抗生素来筛选该植株进行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含T-DNA（对抗生素敏感）的配子比例为1/2，因此突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为1/2×1/2=1/4，纯突变位点纯合且具有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4，可以筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
2 / 2第3章 基因工程（复习讲义）
课标要求 核心考点
1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学、分子生物学等学科的基础上发展起来的； 2.阐明DNA重组技术需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具概述植物体细胞杂交的基本过程和原理； 3.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤； 4.举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改善了人类的生活品质； 5.概述人们根据基因工程原理进行蛋白质的设计和改造，可以获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质； 6.举例说明依据人类需求对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程。 1.基因工程（重组DNA技术）：关注基因工程的诞生和发展历程，认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新，运用结构与功能观分析基因工程过程中三种基本工具的作用，明确DNA粗提取与鉴定的原理，进行相关实验操作； 2.目的基因的筛选与获取和基因表达载体的构建：运用结构与功能和技术思维理解PCR技术的过程、原理、条件等内容，结合基因工程的基本操作程序，针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计； 3.将目的基因导入受体细胞核目的基因的检测与鉴定：阐明将目的基因导入受体细胞的方法，阐明目的基因的检测与鉴定的方法，明确DNA片段的扩增及电泳鉴定原理，进行相关操作； 4.基因工程的应用：基于基因工程在农牧业、医药卫生和食品工业应用的实例说明基因工程给社会带来的巨大进步，尝试运用基因工程培育优良品种或细胞产品，造福人类； 5.蛋白质工程的原理和应用：运用结构与功能观等观念，说明蛋白质工程设计的原理，基于蛋白质工程的实例，构建蛋白质工程的基本操作模型。
要点一 基因工程的概念及其诞生和发展
重点内容 具体要点 特别提醒
基因工程的概念 概念：基因工程（重组DNA技术）是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 1.操作水平是DNA分子水平。 2.原理是基因重组。
基因工程的理论基础 1.细胞生物的遗传物质都是DNA，空间结构都是规则的双螺旋结构；均遵循碱基互补配对原则，因此不同生物的DNA能拼接起来； 2.基因是控制生物体性状遗传物质的结构和功能单位，具有相对独立性。遗传信息的传递都遵循中心法则。生物界共用一套遗传密码。因此外源基因能够在受体细胞内表达，并使受体表现出相应的性状。 1.与有性生殖的区别：有性生殖中的基因重组是随机的，并且只能在同一物种间进行；基因工程可以使基因在不同物种间进行重组，并且方向性强，可以定向地改变生物的性状。
要点二 重组DNA 技术的基本工具
重点内容 具体要点 特别提醒
“分子手术刀”—— 限制性内切核酸酶 1.简称：限制酶； 2.来源：主要是从原核生物中分离纯化来的； 3.功能：识别双链DNA中特定核苷酸序列，断开每条链中特定部位的磷酸二酯键； 4.酶切结果：①若限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端。若限制酶在识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。 1.限制酶识别的序列都是回文序列； 2.限制酶具有很强的专一性； 3.不同种限制酶虽然识别序列不同，但是也可能酶切后产生相同的黏性末端。 4.在原核生物体内，限制酶的作用是切割外源的DNA从而保护自身。
“分子缝合针”——DNA连接酶 1.作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键； 2. E.coli DNA连接酶来自大肠杆菌，只能连接黏性末端；T4 DNA连接酶来自T4噬菌体，既可以连接黏性末端，又可连接平末端 1. E.coli DNA连接酶连接黏性末端的效率比T4 DNA连接酶连接平末端的效率更高； 2. DNA连接酶无识别特异性，对于相同或互补的黏性末端以及平末端都能连接；
“分子运输车”—— 基因进入受体细胞的载体 1.常见载体是质粒，一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA； 2.其他载体：噬菌体、动植物病毒等； 1.质粒作为载体需具备的条件：能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上（能使目的基因稳定存在且数量可扩增），有一个至多个限制酶切割位点（供外源基因插入），有特殊的标记基因（便于重组DNA分子的筛选），对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤； 2.原核生物中限制酶不切割自身DNA的原因是体内不存在该酶识别序列或识别序列已被修饰
要点三 目的基因的筛选与获取
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目的基因 1.概念：用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因； 2.主要是指编码蛋白质的基因。 1.往往从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
利用PCR获取目的基因 1.PCR的原理：DNA半保留复制； 2.条件：DNA模板链、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、引物、温度、缓冲液； 3.过程：变性（90-95℃）复性（50℃左右）延伸（72℃左右），然后循环； 4. PCR产物的鉴定：用琼脂糖凝胶电泳； 5.利用PCR获取和扩增目的基因时，从第3轮循环才会产生完整的目的基因。 1.原料可以是dNTP； 2.引物的作用，提供3′端，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸； 3.子链延伸的方向：从子链的5′端向3′端； 4.缓冲液(含Mg2＋) ：激活耐高温的DNA聚合酶； 5.复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配；对，过低又会造成引物不能与DNA模板链的特定部位结合。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关。假设引物的长度相同，在GC含量高时，复性温度应设定得更高一些； 6.PCR不需要解旋酶，利用高温来解旋。
通过构建基因文库获取目的基因 1.基因组文库：含有该物种全部基因的文库，用不同种限制酶来构建，往往适用于原核生物基因的获取； 2.部分基因文库：只含有该物种部分基因，用逆转录法构建，常用于真核基因的获取。 1.部分基因文库中的基因往往缺乏非编码区，以及编码区的内含子。
要点四 基因表达载体的构建
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基因表达载体的构建 1.构建目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用； 2.基因表达载体的组成：启动子、目的基因、终止子、标记基因； 3.构建过程：同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段，再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，形成重组DNA分子。 1.构建基因表达载体时，目的基因要插入启动子和终止子之间。因为启动子使转录开始，是RNA聚合酶识别和结合的部位，终止子位于基因的尾端，使转录终止； 2.一般不能将目的基因插入载体的标记基因中，否则标记基因被破坏，无法进行进一步筛选； 3.注意区分启动子与起始密码子，终止子与终止密码子。
要点五 将目的基因导入受体细胞
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转化 1.概念：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 1.转化的实质：基因重组。
目的基因导入植物细胞 1.农杆菌转化法：农杆菌细胞内的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）可携带目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上； 2.花粉管通道法：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中，或者在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 1.农杆菌转化法，主要适用于双子叶植物和裸子植物（农杆菌在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力）； 2.花粉管通道法是我国科学家独创的一种方法。
目的基因导入动物细胞 1.将目的基因导入动物细胞常用显微注射法。 1. 显微注射法常用受精卵作为受体细胞。
目的基因导入原核细胞 1. 将目的基因导入原核细胞常用 Ca2＋处理法(感受态细胞法)。 1. 用Ca2＋处理细胞的目的是使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态——感受态，以便于重组DNA 的进入。
要点六 目的基因的检测与鉴定
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分子水平的检测 1.目的基因是否导入了受体细胞：方法是DNA分子杂交，常用PCR技术+基因探针，目的是检测目的基因是否整合到了受体细胞的染色体DNA上； 2.目的基因是否转录出了mRNA：方法是分子杂交，常用PCR技术+基因探针； 3.目的基因是否翻译出了蛋白质：方法是抗原—抗体杂交。 1.由于插入的目的基因不一定会表达，因此在检测到目的基因已经插入受体细胞的染色体DNA上以后，还要进行转录和翻译水平的检测 2.DNA分子杂交技术的原理是碱基互补配对原则； 3.分子杂交技术的原理是碱基互补配对原则； 4.抗原—抗体杂交技术的原理是抗体与抗原的特异性结合。
个体水平的检测 目的：确定目的基因是否赋予了转基因生物特定的的遗传特性及抗性的程度； 鉴定方法：抗病抗虫的接种实验。 1.鉴定导入的抗虫基因是否表达，并表现出抗虫性状，最简便的方法是用叶片饲喂棉铃虫，观察棉铃虫是否死亡； 2.若培育耐盐的植株，则可用盐水浇灌，观察其能否正常生长；培育抗除草剂的植株，则可喷洒除草剂。
要点七 基因工程的应用
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在植物方面 的应用 1.改良植物品种：培育转基因抗虫、抗病、抗除草剂植物，以及改良植物的品质。 如何培育转基因抗病植株？将病毒、真菌等的抗病基因导入植株； 种植转基因抗虫棉若干年后，害虫会对抗虫棉产生抗性，原因是抗虫棉对棉铃虫的进化起到了选择作用。 3.改良品质的实例：将某种必需氨基酸含量高的蛋白质编码基因作为目的基因导入植物。
在动物方面的应用 1.改良动物品种：提高动物的生长速率或改善畜产品的品质。 1.实例：将外源生长激素基因导入鲫鱼体内，以提高其生长速率，将肠乳糖酶基因导入奶牛体内，以解决乳糖不耐受的问题。
在医药卫生领域的应用 1.利用转基因微生物或动植物生产包括细胞因子、抗体、疫苗和激素等药物； 2.利用乳腺生物反应器生产药物：抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素和α-抗胰蛋白酶等； 3.利用转基因动物作器官移植的供体，常用的方法是抑制抗原决定基因的表达或除去抗原决定基因 ，其优点是不会引起免疫排斥反应； 4.基因工程菌生产药物的过程中，若受体是大肠杆菌等细菌，由于没有内质网和高尔基体等细胞器，不能加工形成有活性的干扰素（一种糖蛋白），需要再加工。 1.生产乳腺生物反应器构建基因表达载体时必须把药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子重组在一起，目的是保证相应的目的基因在其乳腺细胞内表达； 2.膀胱生物反应器，应使药用蛋白基因在膀胱上皮细胞中特异表达。与乳腺生物反应器相比，相同点是收集药用蛋白较容易，且不会对动物造成伤害，区别是乳腺生物反应器须处于生殖期的雌性动物才可生产药用蛋白，而膀胱生物反应器则是任何生长期的雌雄动物均可生产。
在食品工业方面的应用 1.利用基因工程实现天冬氨酸、苯丙氨酸等氨基酸的大规模生产； 2.构建工程菌，大量生产淀粉酶、脂肪酶等。 1.工程菌是指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类。
要点八 蛋白质工程的原理与应用
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蛋白质工程的原理 1.概念：蛋白质工程是基因工程的延伸，是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求； 2.原理：通过改造或合成基因来完成对蛋白质结构的设计和改造； 3.基本思路：从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列或者合成新的基因，借助基因工程获得所需要的蛋白质。 1.基因工程的不足：只能生产自然界中已存在的蛋白质，而天然蛋白质的结构和功能虽符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。而蛋白质工程能产生自然界中不存在的新型蛋白质分子； 2.蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，也需要利用基因工程的基本工具，需要经历基因工程的操作流程； 3.蛋白质工程不能直接对蛋白质分子进行操作，因为蛋白质具有十分复杂的空间结构，基因的结构相对简单，容易改造，改造后的基因可以遗传给下一代，而被改造的蛋白质无法遗传。
蛋白质工程的应用 1.医药方面：将干扰素分子的一个半胱氨酸变成丝氨酸，使其在-70℃可以保存半年； 2.其他方面：改进酶的性能或开发新的工业用酶，增加粮食产量，研发新型农药。 1.利用蛋白质工程可以提高玉米赖氨酸含量：改变赖氨酸合成途径中关键酶的活性，来提高赖氨酸的含量； 2.由于蛋白质的结构是由其氨基酸组成决定的，因此个别氨基酸的改变就会导致其空间结构的改变，从而影响到其性质和功能。
【例1】科学家把兔子血红蛋白基因导入大肠杆菌细胞中，在大肠杆菌细胞中合成了兔子的血红蛋白。下列不是这一先进技术的理论依据的是(　　)
A．所有生物共用一套遗传密码
B．基因能控制蛋白质的合成
C．兔子血红蛋白基因与大肠杆菌的DNA都是由四种脱氧核苷酸构成，都遵循相同的碱基互补配对原则
D．兔子与大肠杆菌有共同的原始祖先
【变式1-1】玉米的PEPC酶固定CO2的能力较水稻的强60倍。我国科学家正致力于将玉米的PEPC基因导入水稻中，以提高水稻产量。下列有关该应用技术的叙述，不正确的是(　　)
A．该技术是在DNA水平上进行设计和施工的
B．该技术的操作环境是生物体内
C．该技术的原理是基因重组
D．该技术的优点是定向产生人类需要的生物类型
【变式1-2】不同生物之间能进行转基因并能获得基因产物，其理论依据不包含(　　)
A．这些生物的DNA分子的空间结构和化学成分一致
B．这些生物的DNA分子都遵循碱基互补配对原则
C．这些生物在基因表达时共用一套遗传密码
D．这些生物的基因结构都是相同的
【例2】下表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法中，错误的是(　　)
限制酶名称　 识别序列和切割位点 限制酶名称 识别序列和切割位点
BamHⅠ G↓GATCC KpnⅠ GGTAC↓C
EcoRⅠ C↓AATTC Sau3AⅠ ↓GATC
HindⅡ GTY↓RAC SmaⅠ CCC↓GGG
注：Y为C或T，R为A或G。
A．HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶切割后形成平末端
B．Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部
C．BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端
D．一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列
【变式2-1】如图是3种限制性内切核酸酶对DNA分子的识别序列和剪切位点图(箭头表示切点，切出的断面为黏性末端)。下列叙述错误的是(　　)
限制酶1：
限制酶2：
限制酶3：　
A．不同的限制酶有不同的识别序列和切割位点，体现了酶的专一性
B．限制酶2和3识别的序列都包含6个碱基对
C．限制酶1和3剪出的黏性末端相同
D．能够识别和切割RNA分子内一小段核苷酸序列的酶只有限制酶2
【变式2-2】下列各种酶及其作用对应关系不正确的是(　　)
A．限制酶——识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开
B．RNA聚合酶——与基因的特定位点结合，催化遗传信息的翻译
C．DNA连接酶——将分开的DNA片段通过特定末端连接在一起
D．DNA聚合酶——将单个脱氧核苷酸连接到已有的核苷酸链上
【例3】如图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列叙述错误的是(　　)
A．耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3′端
B．在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段
C．引物之间或引物自身发生碱基互补配对，则不能有效扩增目的基因
D．从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占
【变式3-1】新型冠状病毒的检测可以采用实时荧光RT－PCR(逆转录聚合酶链式反应)的方法，RT－PCR的具体过程如图。下列有关叙述错误的是(　　)
A．过程①以mRNA为模板合成单链DNA
B．过程②③拟对单链cDNA进行第n次循环的扩增，理论上需要n个引物B
C．该技术用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度
D．游离的脱氧核苷酸只能从引物的3′端开始连接
【变式3-2】下图a、b、c均为PCR扩增的DNA片段，下列有关说法正确的是(　　)
A．片段a、b、c的长度均相同
B．片段a、b只是第一次循环的产物
C．片段c最早出现在第二次循环的产物中
D．经过30次循环后，片段c的数量为230
【例4】如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列说法错误的是(　　)
A．图示过程是基因工程的核心步骤
B．表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠ
C．抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
D．除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构
【变式4-1】某科研小组利用质粒(图甲)和目的基因(图乙)构建重组DNA。下列分析错误的是(　　)
A．用限制酶Hind Ⅲ和PstⅠ切割质粒，可得到2条DNA片段
B．不能用AluⅠ酶切割质粒和外源DNA的原因是AluⅠ酶会破坏目的基因
C．构建重组DNA时，需选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA
D．导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长
【变式4-2】限制酶的发现为DNA的切割和功能基因的获得创造了条件。限制酶Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ的识别序列及切割位点分别为↓GATC、G↓AATTC、G↓GATCC。含某目的基因的DNA片段如图所示，若利用质粒A(含限制酶Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点各1个)构建基因表达载体，为克服目的基因和质粒A的自身环化以及目的基因与质粒的任意连接等，应该如何选择限制酶？(　　)
A．用限制酶EcoRⅠ或BamHⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒A
B．用限制酶Sau3AⅠ和BamHⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒A
C．用限制酶Sau3AⅠ和EcoRⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒A
D．用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒A
【例5】如图表示培育转基因抗植物病毒番茄的过程示意图。下列叙述正确的是(　　)
A．过程A需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶的参与
B．过程B通常需要用CaCl2处理，以提高番茄细胞壁的通透性
C．过程C需要采用植物组织培养技术
D．抗植物病毒基因一旦整合到番茄细胞的染色体上，就能正常表达
【变式5-1】下列关于目的基因导入受体细胞的方法中，不正确的是(　　)
A．我国利用花粉管通道法培育了转基因抗虫棉
B．用Ca2＋处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞
C．将目的基因导入动物细胞最常用、最有效的方法是显微注射法
D．利用农杆菌转化法培育大多数单子叶转基因植物
【变式5-2】下图为科学家通过基因工程培育抗虫棉时，从苏云金杆菌中提取抗虫基因“放入”棉花细胞中，与棉花的DNA分子“结合起来”而发挥作用的过程示意图。以下相关说法不正确的是(　　)
A．图中Ⅰ是质粒，步骤①需要用到限制酶和DNA连接酶
B．图中Ⅱ是含目的基因的重组质粒，步骤②是将重组质粒导入棉花细胞
C．图中Ⅲ是农杆菌，通过步骤③将目的基因导入植物细胞
D．剔除培育成功的抗虫棉体内的四环素抗性基因不会影响抗虫基因的表达
【例6】利用基因工程技术生产羧酸酯酶(CarE)制剂，用于降解某种农药的残留，基本流程如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A．过程①的反应体系中需要加入逆转录酶和核糖核苷酸
B．过程②需使用限制酶、Taq酶以及DNA连接酶
C．过程③需要使用NaCl溶液制备感受态的大肠杆菌细胞
D．过程④可利用DNA分子杂交技术鉴定CarE基因是否成功导入受体细胞
【变式6-1】某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)示意图，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组细菌的外源基因插入点，正确的一组是(　　)
插入点 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的培养基上的生长状况
① 能生长 能生长
② 能生长 不能生长
③ 不能生长 能生长
A．①是c；②是b；③是a
B．①是a和b；②是a；③是b
C．①是a和b；②是b；③是a
D．①是c；②是a；③是b
【变式6-2】利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列选项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是(　　)
A．棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因
B．大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNA
C．山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列
D．酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白
【例7】用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样(Marker)，2～10号为PCR产物；其中2号的模板为野生型植株DNA，3～9号模板为转基因植株的DNA，10号使用蒸馏水代替模板DNA。据此做出分析不合理的是(　　)
A．PCR产物的分子大小在250～500 bp之间
B．3号样品植株导入的目的基因一定能成功表达
C．9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D．10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
【变式7-1】实时荧光定量PCR简称qPCR，灵敏度高、特异性好，是目前检测微小残留病变的常用方法。将荧光标记的Taqman探针与待测样本DNA混合，当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被TaqDNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到在特定光激发下发出荧光(如图所示)，随着循环次数的增加，荧光信号强度增加，通过实时检测荧光信号强度，可得Ct值(该值与待测样本中目的基因的个数呈负相关)。下列相关叙述错误的是(　　)
A．每个模板DNA分子含有2个游离的磷酸基团
B．在反应过程中，无需ATP为新链的合成提供能量
C．做qPCR之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成引物和Taqman探针
D．荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明含有的病变的概率越小
【变式7-2】下图表示形成cDNA并进行PCR扩增的过程。据图分析，下列叙述正确的是(　　)
A．①过程所需的原料是核糖核苷酸
B．②过程所需的酶必须耐高温
C．③过程需要解旋酶破坏氢键
D．④过程的引物对之间不能互补配对
【例8】动物乳腺生物反应器是一项利用转基因动物的乳腺代替传统的生物发酵，进行大规模生产可供治疗人类疾病或用于保健的活性蛋白质的现代生物技术。科学家已在牛和羊等动物乳腺生物反应器中表达出了抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素等重要药品，其大致过程如图所示。下列有关说法错误的是(　　)
A．通过③形成的重组质粒具有人的药用蛋白基因、启动子、终止子和标记基因即可
B．④通常采用显微注射技术
C．在转基因母牛的乳腺细胞中人的药用蛋白基因才会得以表达，因此可以从乳汁中提取药物
D．该技术生产药物的优点是产量高、质量好、易提取
【变式8-1】蜘蛛丝(丝蛋白)被称为“生物钢”，有着超强的抗张强度，可制成防弹背心、降落伞绳等。蜘蛛丝还可被制成人造韧带和人造肌腱。科学家研究出集中生产蜘蛛丝的方法——培育转基因羊作为乳腺生物反应器。下列有关乳腺生物反应器的说法，错误的是(　　)
A．将丝蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等结合在一起构建成表达载体
B．将含有丝蛋白基因的表达载体导入动物乳腺细胞中即可获得乳腺生物反应器
C．与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受性别等限制，受体来源更广泛
D．转基因动物产生的生殖细胞可能含有药用蛋白基因
【变式8-2】α1-抗胰蛋白酶是肝脏产生的一种糖蛋白，缺乏该酶会引起肺气肿。某公司成功培育出转基因羊，这种羊进入泌乳期后，其乳汁中含有人类的α1-抗胰蛋白酶，可用于治疗肺气肿。下列相关叙述不正确的有(　　)
A．构建基因表达载体需将α1-抗胰蛋白酶基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组
B．构建好的基因表达载体需要通过显微注射技术导入羊的受精卵中
C．受精卵通过早期胚胎培养，一般发育到原肠胚阶段通过胚胎移植到受体子宫孕育
D．为了选育出能泌乳的雌羊，移植前需从胚胎的滋养层取样，通过DNA鉴定分析性别
【例9】为心梗患者注射大剂量的t-PA(一种能高效降解血栓的单链糖蛋白，主要由血管内皮细胞合成、分泌并释放进血液)会诱发颅内出血。研究证实，将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血等副作用，据此分析错误的是(　　)
A．若利用大肠杆菌来生产t-PA，需要对其合成的t-PA进行后期改造
B．改造t-PA的技术属于蛋白质工程
C．欲将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，应直接对蛋白质(t-PA)进行改造
D．可利用抗原—抗体杂交技术来检测转基因的大肠杆菌是否分泌了t-PA
【变式9-1】已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。下列叙述正确的是(　　)
A．从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的氨基酸序列(或结构)进行改造
B．直接对蛋白质的氨基酸序列(或结构)进行修饰改造，是蛋白质工程的范畴
C．改变后的蛋白质(P1)与蛋白质(P)的结构相同，功能不同
D．蛋白质工程已被广泛发展应用，极大的满足了人类生产生活的需要
【变式9-2】蛋白酶应用于洗涤剂、制革及丝绸工业。某研究小组利用蛋白质工程将该蛋白酶中第188位丙氨酸替换为脯氨酸、第239位谷氨酰胺替换为精氨酸、第262位缬氨酸替换为亮氨酸，结果发现该酶的催化活性大幅度提高。下列叙述正确的是(　　)
A．对枯草杆菌蛋白酶进行改造通过直接改造蛋白酶的分子结构来实现
B．通过基因工程和蛋白质工程生产的枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列相同
C．改造后的枯草杆菌蛋白酶可能使肽键结构发生改变导致其催化活性提高
D．对枯草杆菌蛋白酶进行分子设计必须从预期蛋白酶的功能特点入手
1.（2024·湖南·高考真题）某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（　　）
A．限制酶失活，更换新的限制酶
B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等
C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA
D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
2.（2023·重庆·高考真题）某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切（下图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是（ ）
A．其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇
B．步骤①所用的酶是SpeI和CfoI
C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段
D．酶切片段和载体连接时，可使用E．coli连接酶或T4连接酶
3．（2023·湖北·高考真题）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（　　）
A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落
4.（2025·江苏·高考题改编）图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为，下列相关叙述正确的有（ ）
A．基因A突变为a是一种碱基增添的突变
B．用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末端类型相同
C．用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小一致
D．产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定
5.（2025·安徽·高考真题）质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是（ ）
A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数
B．如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株
C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株
D．若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌
6.（2023·山西·高考真题）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（ ）
A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E. coli DNA连接酶连接
B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E. coli DNA连接酶连接
7.（2025·全国卷·高考真题）琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析，样品1～4的电泳结果如图所示（“+”“-”分别代表电泳槽的阳极和阴极）。已知样品1和2中的DNA分子分别是甲和乙，甲只有限制酶R的一个酶切位点，样品3和4中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是（ ）
A．配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液
B．该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷
C．甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同
D．据图推测样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物
8．（2025·广东·高考真题）Solexa测序是一种将PCR与荧光检测相结合的高通量测序技术。为了确保该PCR过程中，DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的（ ）
A．1'-碱基 B．2'-氢 C．3'-羟基 D．5'-磷酸基团
9．（2024·江西·高考真题）γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB）导入生产菌株E．coliA，构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E．coliB。下列叙述正确的是（ ）
A．上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB
B．E．coliB发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能
C．E．coliA和E．coliB都能高效降解γ-氨基丁酸
D．可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒
10.（2024·浙江·高考真题）阅读下列材料，完成下面小题。
疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。
研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。
（1）．下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是（ ）
A．F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段
B．F1-R2引物不能用于特异性地扩增目的片段
C．F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用
D．R2引物可用于特异性地扩增目的片段
（2）．为了筛查疟原虫感染者，以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样，处理后进行PCR。产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳结果如图所示。
1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是（ ）
A．1号和6号 B．2号和4号
C．3号和5号 D．1号、2号、4号和6号
11．（2024·山东·高考真题）制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP）的反应管①~④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有（　　）
反应管 加入的单链DNA
① 5'-GCCGATCTTTATA-3' 3'-GACCGGCTAGAAA-5'
② 5'-AGAGCCAATTGGC-3'
③ 5'-ATTTCCCGATCCG-3' 3'-AGGGCTAGGCATA-5'
④ 5'-TTCACTGGCCAGT-3'
A．①② B．②③ C．①④ D．③④
12．（2024·吉林·高考真题）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（ ）
A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快
D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
13.（2024·重庆·高考真题）大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小），然后克隆了该基因（两品种中基因S序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。
(1)基因S启动子的基本组成单位是 。
(2)通过基因工程方法,将DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题19图所示信息（不考虑未标明序列）判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是 ；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是 。
(3)为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有 。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是 。
(4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ-1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T+基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ-2的种子也变大，但小于YZ-1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是 。
14.（2025·山东·高考真题）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。
(1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为 。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和 对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是 。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶 进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为 bp，则一定为正向重组质粒。
(2)为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为 （填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段 ，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为 （填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。
(3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因， （填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。
15.（2024·山东·高考真题）研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。
(1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越 （填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有 种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'- -3'和5'- -3'。
(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素 筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是 ，其中纯合的突变植株是 （填序号）。
(3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为 ，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
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