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基因工程
1、什么是基因工程：
基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
2、基因工程的诞生（三个理论和三个技术）：
基因工程是在生物化学、分子生物学和微生物学等学科基础上发展起来的，正是这些学科的基础理论和相关技术的发展催生了基因工程，具体有三大理论发现和三个技术突破。
理论基础：DNA是遗传物质；DNA分子的双螺旋结构和半保留复制；遗传密码的通用性和遗传信息传递的方式；
技术基础：限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割；DNA连接酶的发现与DNA片段的连接；基因工程载体的构建与应用
理论上的三大发现
⑴、发现了遗传物质——DNA
1944年，艾弗里（O.T.Avery）的肺炎双球菌转化实验
⑵、揭示了遗传物质的分子机制：DNA分子的双螺旋结构和半保留复制
1953年，沃森（J.D.Watson）和克里克（F.Crick）的DNA双螺旋结构模型、半保留复制图，获1958年诺贝尔奖。
⑶、确立了遗传信息的传递方式：以密码形式传递
1963年，美国尼伦伯格（M.W.Nirenberg）和马太（H.Matthaei）确立了遗传信息以密码形式传递，破译了编码氨基酸的遗传密码(3个核苷酸=1个密码子=1个aa)。
技术上的三大突破
⑴、世界上第一个重组DNA实验：实现不同来源DNA的体外重组
1972年斯坦福大学化学家伯格（P.Berg）借助内切酶和连接酶将猴病毒SV40的DNA和大肠杆菌λ噬菌体的DNA在试管中连接在了一起，第一次成功地实现了DNA的体外重组。
⑵、第一个基因克隆实验：重组DNA表达实验，是世界上第一个基因工程实验
1973年美国斯坦福大学医学院遗传学家科恩（S.Cohen）将体外构建的含有四环素和卡那霉素抗性基因的重组质粒导入大肠杆菌，获得了具有双抗性的大肠杆菌转化子，成功完成了第一个基因克隆实验。是基因工程诞生的标志。
⑶、第一个真核基因在原核生物中的表达：第一次实现了异源真核基因在原核生物中的表达
1974年，科恩（S.Cohen）和博耶（H.Boyer）将非洲爪蟾编码核糖体基因的DNA片断同pSC101质粒重组，并导入大肠杆菌细胞，结果表明动物基因已进入大肠杆菌并转录出相应的mRNA产物，第一次实现了异源真核基因在原核生物中的表达。
1.1 重组DNA技术的基本工具
一、DNA基因工程的基本工具
DNA基因工程至少需要三种工具：
“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）
“分子缝合针”——DNA连接酶
“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体
1、“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）
（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
（2）功能：能识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：粘性末端和平末端。
2、“分子缝合针”——DNA连接酶
(1)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较：
①相同点：都缝合磷酸二酯键。
②区别：E·coli DNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的粘性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。
与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
DNA 连接酶——“分子缝合针”
1. 作用: 将双链 DNA 片段“缝合” 起来, 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
2. 种类:
3、“分子运输车”——载体
（1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。
②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。
③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
（2）最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
（3）其它载体： 噬菌体的衍生物、动植物病毒
4.DNA 的粗提取与鉴定
1. 实验原理:
(1) DNA、 RNA、 蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面有差异, 选用适当的物理或化学方法对
它们进行提取。
①DNA 不溶于酒精, 某些蛋白质溶于酒精, 分离 DNA 和蛋白质。
②DNA 能溶于 2mol/L 的 NaCl 溶液。
(2) DNA 遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
2. 方法步骤:
(1) 研磨:取 30g 洋葱切碎, 倒入 10 mL 研磨液研磨。
(2) 除杂: 漏斗中垫上纱布过滤后, 在 4 ℃冰箱静置后取上清液, 1 500 r/min 的转速下离心后
取上清液。
(3) 提取: 加入体积相等、 体积分数 95%酒精, 溶液出现白色的丝状物是 DNA。
方法一: 用玻璃杯按一个(填“一个” 或“两个” ) 方向搅拌, 卷起丝状物, 用滤纸吸去上面的水
分。
方法二: 10 000 r/min 的转速下离心 5 min, 取沉淀物晾干。
鉴定:
DNA 的鉴定和还原糖的鉴定都需要加热, 它们有什么不同
提示:还原糖加斐林试剂后, 置于 55～65 ℃热水中加热; 而 DNA 加二苯胺试剂后, 置于沸水中加
热。
1.2 基因工程的基本操作程序
基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
第一步：目的基因的获取
1.目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因 。
2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因常用方法有反转录法和化学合成法
3.PCR技术扩增目的基因
（1）原理：DNA双链复制
（2）过程：a：加热至90-95℃DNA解链；b：冷却到55-60℃，引物结合到互补DNA链；c：加热至70-75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。
第二步：基因表达载体的构建
1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。
2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因
（1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。
（2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段 ，位于基因的尾端。
（3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。
第三步：将目的基因导入受体细胞_
1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2.常用的转化方法：
将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是 农杆菌转化法，其次还有 基因枪法和 花粉管通道法等。
将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 显微注射技术。此方法的受体细胞多是 受精卵。
将目的基因导入微生物细胞：
3.重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。
第四步：目的基因的检测和表达
1.首先要检测 转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用 DNA分子杂交技术。
2.其次还要检测 目的基因是否转录出了mRNA，方法是采用 用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。
3.最后检测 目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取 蛋白质，用相应的 抗体进行 抗原－抗体杂交。
4.有时还需进行 个体生物学水平的鉴定。如 转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。
1.3 基因工程的应用
1. 植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。
2. 动物基因工程：提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物。
3. 基因治疗：把正常的外源基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用。
4、 基因工程在农牧业方面的应用
1. 发展:
(1) 农牧业:1996-2017 年, 全世界转基因作物的种植面积增加了一百多倍, 美国是世界上转基
因作物种植面积最大的国家。 2017 年, 我国转基因作物种植面积居世界第八位。
(2) 动物: 第一种用于食用的转基因动物——转基因大西洋鲑在美国获得批准上市。
2. 实例:
连一连: 基于基因工程在改良动植物品种、 提高作物和畜产品的产量等方面的应用, 将下列转
基因生物和选用的目的基因连线
5、 基因工程在医药卫生领域的应用
1. 生产药物:
(1) 常见的药物:细胞因子、 抗体、 疫苗和激素等。 我国生
产的重组人干扰素、 血小板生成素、 促红细胞生成素和粒细胞集落刺激因子等基因工程药物
均已投放市场。
(2) 批量生产药物:乳腺(房) 生物反应器。
①目的基因:药用蛋白基因。
②启动子:乳腺中特异性表达的基因的启动子。
③受体细胞:受精卵。
2. 移植器官: 在器官供体的基因组中导入某种调节因子, 以抑制抗原决定基因的表达, 或设法
除去抗原决定基因, 培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。
培养乳腺生物反应器转基因动物时为什么要选用乳腺中特异性表达的基因的启动子
提示:乳腺生物反应器通过分泌的乳汁提取相应的基因表达的产品, 乳腺中特异性表达的启动子可让目的基因在乳腺细胞中表达。
6、基因工程在食品工业方面的应用
1. 氨基酸: 利用转基因生物合成阿斯巴甜的原料——天冬氨酸和苯丙氨酸。
2. 酶: 利用转基因生物生产奶酪的凝乳酶; 利用转基因生物加工转化糖浆的淀粉酶; 利用转基因生物加工烘烤食品、 制造生物能源的脂酶等。
3. 维生素。
1.4 蛋白质工程的原理和应用
1、蛋白质工程的概念
蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。
基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质
2、 蛋白质工程崛起的缘由
1. 基因工程的实质和不足:
(1) 实质: 将一种生物的基因转移到另一种生物体内, 后者可以产生它本不能产生的蛋白质, 进
而表现出新的性状。
(2) 基因工程存在的不足:原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。
2. 蛋白质工程的崛起:
(1) 理论和技术条件:分子生物学、 晶体学以及计算机技术的迅猛发展。
(2) 天然蛋白质存在不足:天然蛋白质的结构和功能符合特定物种生存的需要, 却不一定完全
符合人类生产和生活的需要。
(3) 实例:
3、蛋白质工程的基本原理：
它可以根据人的需求来设计蛋白质的结构，又称为第二代的基因工程。
基本途径：从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）以上是蛋白质工程特有的途径；以下按照基因工程的一般步骤进行。（注意：目的基因只能用人工合成的方法）
设计中的困难：如何推测非编码区以及内含子的脱氧核苷酸序列
细胞工程：是指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过细胞水平或细胞器水平上的操作，按着人的意志来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。
根据操作对象的不同，可以分为植物细胞工程和动物细胞工程两大领域。
4、 蛋白质工程的应用
1. 医药工业方面:
(1) 速效胰岛素类似物: 改变氨基酸序列, 抑制胰岛素的聚合。
(2) 干扰素:一个半胱氨酸替换为丝氨酸, 延长保存时间。
(3) 单克隆抗体:将小鼠抗体上结合抗原的区域“嫁接” 到人的抗体上, 降低诱发免疫反应的强
度。
2. 其他工业方面: 广泛用于改进酶的性能或开发新的工业用酶。 如枯草杆菌蛋白酶。
3. 农业方面:
(1) 改造某些参与调控光合作用的酶, 提高植物光合作用的效率。
(2) 改造微生物蛋白质的结构, 增强防治病虫害的效果。
【特别提醒】
有关蛋白质工程的两点提醒
(1) 改造对象是基因:任何一种天然蛋白质都是由基因编码的, 改造了基因即对蛋白质进行了
改造, 而且改造过的蛋白质可以遗传下去。
(2) 基因突变的新基因中含有不编码蛋白质的序列, 而蛋白质工程中的新基因则没有。第4章 生物技术的安全性与伦理问题
4.1 转基因生物的安全性
1、基因生物与食物安全的争论：
反方观点：反对“实质性等同”、出现滞后效应、出现新的过敏原、营养成分改变
正方观点：有安全性评价、科学家负责的态度、无实例无证据
2、转基因生物与生物安全（对生物多样性的影响）的争论：
反方观点：扩散到种植区之外变成野生种类、成为入侵外来物种、重组出有害的病原体、成为超级杂草、有可能造成“基因污染”
正方观点：生命力有限、存在生殖隔离、花粉传播距离有限、花粉存活时间有限
3、转基因生物与环境安全（对生态系统稳定性的影响）的争论：
反方观点：打破物种界限、二次污染、重组出有害的病原微生物、毒蛋白等可能通过食物链进入人体
正方观点：不改变生物原有的分类地位、减少农药使用、保护农田土壤环境
4、理性看待转基因技术
5、我国的农业转基因生物实行了标识制度：农业转基因生物分为四个等级：
安全等级I：尚不存在危险；
安全等级II：具有低度危险；
安全等级III：具有中度危险；
安全等级IV：具有高度危险。
4.2 关注生物技术的伦理问题
三个关于生物技术的伦理的热点问题
1、克隆人：两种不同观点，多数人持否定态度。
否定的理由：克隆人严重违反了人类伦理道德，是克隆技术的滥用；克隆人冲击了现有的婚姻、家庭和两性关系等传统的伦理道德观念；克隆人是在人为的制造在心理上和社会地位上都不健全的人。
肯定的理由：技术性问题可以通过胚胎分级、基因诊断和染色体检查等方法解决。不成熟的技术也只有通过实践才能使之成熟。
中国政府的态度：禁止生殖性克隆，不反对治疗性克隆。四不原则：不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人的实验。
2、试管婴儿：两种目的试管婴儿的区别两种。不同观点，多数人持认可态度。
否定的理由：把试管婴儿当作人体零配件工厂，是对生命的不尊重；早期生命也有活下去的权利，抛弃或杀死多余胚胎，无异于“谋杀”。
肯定的理由：解决了不育问题，提供骨髓中造血干细胞救治患者最好、最快捷的方法，提供骨髓造血干细胞并不会对试管婴儿造成损伤。
3、基因身份证：
否定的理由：个人基因资讯的泄漏造成基因歧视，势必造成遗传学失业大军、造成个人婚姻困难、人际关系疏远等严重后果。
肯定的理由：通过基因检测可以及早采取预防措施，适时进行治疗，达到挽救患者生命的目的。
4、基因检测
基因检测的优点： 通过基因检测可以及早采取预防的措施,适时进行治疗,达到挽救患者生命
的目的.
基因检测引发的问题： ①目前人类对基因结构及基因间相互作用尚缺乏足够的认识,要想通
过基因检测达到预防疾病的目的是困难的;
②基因检测结果本身会给受检者带来巨大的心理压力;
③个人基因资讯的泄露会造成基因歧视.
解决的办法:
对于基因歧视现象,可以通过正确的科学知识传授,伦理道德教育,立法得以解决
5、治疗性克隆和生殖性克隆
治疗性克隆
(1)概念： 指利用克隆技术产生特定细胞或组织(皮肤、 神经或肌肉等)用于治疗性移植。
(2)原理： 干细胞具有强大的多方向分化潜能和自我更新能力。
生殖性克隆
(1)概念： 指将克隆技术用于生育目的， 即用于产生人类个体。
(2)原理： 动物体细胞核的全能性。
二者主要区别： 获得的早期胚胎在治疗性克隆中用于获得胚胎干细胞， 然后诱导胚胎干细
胞分化出所需的特定的组织或细胞； 在生殖性克隆中获得的胚胎则通过胚胎移植到母体的
子宫内， 由母体孕育出婴儿
4.3 禁止生物武器
1、生物武器：
（1）种类：致病菌、病毒、生化毒剂，以及经过基因重组的致病菌。
（2）散布方式：吸入、误食、接触带菌物品、被带菌昆虫叮咬等。
（3）特点：致病力强、多数具传染性、传染途径多、污染面广、有潜伏期、不易被发现、危害时间长等。
（4）《禁止生物武器公约》及中国政府的态度：在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散。
2、生物武器的传播途径
--经食物与水传播： 霍乱、 肉毒毒素、 病毒、 炭疽
--空气传播： 鼠疫、 炭疽、 类鼻疽、 球孢子菌病
--接触传播： 炭疽、 破伤风
--虫媒传播： 黄热病、 马脑炎、 落矶山斑疹热、 斑疹伤风、 Q 热、 腺鼠疫
--病原体直接传播
3、生物武器的特点
1.单位面积效应大： 生物武器单位战剂的杀伤面积效应很大。 因为生物战剂的感染剂量极小
2.有特定的伤害对象
伤害对象只限于有生命的人、 畜和农作物， 而不破坏无生命的物质。 因而适用于攻
击不易破坏的目标区， 这一特点正符合侵略者发动战争的目的。
3.具有传染性
它能以多种性状如致病性气溶胶、 媒介昆虫及媒介物、 毒菌、 毒液等， 多种途径如借
空气经呼吸道、 借水及食物经消化道、 借媒介昆虫及创口经皮肤粘膜等使人、 畜和农
作物受害， 受害者若不及时处理， 就能互相传染， 不断蔓延， 造成传染病流行， 致使
人、 畜及农作物大量死亡。
4、危害时间久
某些致病菌如炭疽杆菌及毒素能长期存在于外界， 有持久的危害作用， 甚至使当地形
成疫源地， 以致传染病不断蔓延。
5、不易被发现和鉴定
施放生物武器时， 因为没有巨大的爆炸声， 亦无光、 气味和颜色， 鉴定技术也较复杂，
需时也较长。
6、使用者本身易受伤害
生物武器很容易受自然条件如气温、 风力、 阳光和雨雪的影响而丧失作用， 若使用不当
或选择时机不好， 也很容易使使用者本身受到伤害。
7、生物武器造价低、 技术难度不大、 隐蔽性强
可以在任何地方研制和生产。
8、生物武器的局限性
1、 生物武器主要指病原微生物， 所以它们的生存、 繁殖、 死亡易受环境条件的影响。
如温度： 适宜温度——37℃左右。 若温度过高， 40—50℃， 细胞停止繁殖； 50—70℃，
死亡； 但芽孢必须在 100℃以上的温度条件下才会死亡。 若温度过低， 一般会停止繁殖、
生长， 但不会死亡。
2、 还受地形、 风向等多种条件影响。
3、 生物武器使用时不易控制， 使用不当可危害本方安全。第1章　发酵工程
传统发酵技术的应用
一、 发酵与传统发酵技术
1. 发酵: 人们利用微生物, 在适宜的条件下, 将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产
物。
2. 传统发酵食品——腐乳:
(1) 原料: 豆腐。
(2) 参与发酵的微生物: 酵母、 曲霉和毛霉等, 起主要作用的是毛霉。
(3) 物质变化: 蛋白质 小分子的肽和氨基酸。
毛霉是怎样将蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸的
提示: 毛霉产生的蛋白酶将蛋白质分解。
3. 传统发酵技术:
(1) 概念: 直接利用原材料中天然存在的微生物, 或利用前一次发酵保存下来的面团、 卤汁等发
酵物中的微生物进行发酵、 制作食品的技术。
(2) 特点: 以混合菌种的固体发酵及半固体发酵为主, 通常是家庭式或作坊式的。
4. 下列食品是传统发酵食品的是②③④⑥⑦⑧⑨ 。
①豆腐 ②腐乳 ③酱油 ④香醋 ⑤豆油 ⑥泡菜
⑦豆豉 ⑧馒头 ⑨米酒 ⑩豆浆 酸奶 米饭
二、 尝试制作传统发酵食品
(一) 制作泡菜
1. 菌种来源: 植物体表面天然的乳酸菌。
2. 原理: 无氧的情况下, 乳酸菌将葡萄糖分解为乳酸。 反应简式: C 6 H 12 O 6 2C 3 H 6 O 3 (乳酸) +能量。
3. 方法步骤:
4. 结果分析与评价:
判一判: 结合泡菜的制作原理和过程, 判断下列实验分析的正误:
(1) 用水密封泡菜坛可以保证乳酸菌发酵所需要的无氧环境。 (√ )
(2) 随着发酵时间的延长, 泡菜中乳酸含量逐渐增加, 所以泡菜腌制时间越长越好。 (×)
提示: 当乳酸含量为 0. 4%～0. 8%时, 泡菜的口味、 品质最佳, 如果发酵时间过长, 乳酸含量过高,
口味不佳, 还需考虑亚硝酸盐含量的问题。
(3) 制作泡菜时配制的盐水可以直接使用。 (×)
提示: 盐水应该煮沸冷却后再使用。
(4) 蔬菜和香辛料不能装满泡菜坛, 只能装八成满。 (√ )
蔬菜中含有较多的硝酸盐, 试从泡菜的制作过程分析亚硝酸盐产生的原因。
提示: 泡菜是新鲜蔬菜经过乳酸菌等微生物的发酵制作而成的, 蔬菜中的硝酸盐在某些微生物
的作用下被还原成亚硝酸盐。
(二) 制作果酒和果醋
1. 菌种:
(1) 制作果酒菌种: 新鲜水果果皮表面附着的野生酵母菌。
(2) 制作果醋菌种: 醋酸菌。
2. 原理和反应简式:
结果分析与评价:
判一判: 结合果酒和果醋的制作原理和过程, 判断下列实验分析的正误:
(1) 在制作果酒过程中, 发酵液中有气泡产生, 因此发酵瓶需要排气。 (√ )
(2) 在制作果醋时, 发酵液变浑浊, 液面会形成白色菌膜。 (√ )
(3) 在制作果酒过程中, 只有酵母菌进行发酵, 没有其他微生物生长。 (×)
提示: 葡萄皮上除酵母菌外, 还有其他杂菌, 所以发酵过程中, 有多种微生物参与。
(4) 在制作果醋的过程中, 酵母菌的酒精发酵被抑制。 (√ )
(5) 在制作果醋的过程中, 需将瓶盖打开为醋酸菌提供氧气, 盖上纱布以减少空气中尘土等杂
质的污染。 (√ )
三、 传统发酵食品的品质
1. 由于菌种差异、 杂菌情况不明和发酵过程的控制缺乏标准等, 会造成发酵食品的品质不一。
2. 工业上大规模生产时, 通常会通过微生物培养技术获得单一菌种, 再将它们接种到物料中进
行发酵。
知识点一 泡菜的制作
1. 菌种——乳酸菌:
(1) 代谢类型: 异养厌氧型, 有氧存在时, 无氧呼吸会受到抑制。
(2) 结构特点: 无核膜包被的细胞核, 是原核生物。
(3) 生殖方式: 二分裂。
(4) 种类: 种类很多, 常见的有乳酸链球菌和乳酸杆菌。
2. 制作泡菜的材料选择:
(1) 泡菜坛要选择透气性差的容器, 以创造无氧环境, 有利于乳酸菌发酵, 防止蔬菜腐烂。
(2) 选择新鲜蔬菜: 蔬菜中含有大量的硝酸盐, 若放置时间过长, 蔬菜中的硝酸盐易被还原成亚
硝酸盐, 增加泡菜中的亚硝酸盐含量。
3. 泡菜发酵过程中乳酸菌、 乳酸和亚硝酸盐含量的变化分析:
4. 泡菜制作过程中四个注意问题:
(1) 盐水的比例和使用方法:
①盐水比例适中: 食盐用量过高, 乳酸菌发酵受抑制, 泡菜风味差; 食盐用量过低, 会导致杂菌
大量繁殖, 泡菜腐败。
②盐水要煮沸后冷却使用: 盐水煮沸有两大作用, 一是除去水中的氧气, 二是杀灭盐水中的细
菌。 冷却后使用是防止入坛蔬菜表面带入的微生物被高温杀死。
(2) 蔬菜装至八成满, 不能装满泡菜坛:蔬菜刚入坛时, 其表面带入的微生物, 进行发酵产生较
多的 CO 2 , 蔬菜装至八成满, 可以防止发酵液溢出。
(3) 坛盖边沿的水槽中要注满水, 并经常补充, 以保证乳酸菌发酵所需要的无氧环境。
(4) 发酵温度和时间的控制: 若温度过高, 则易滋生杂菌; 若温度过低, 则发酵时间延长。 时间过
短, 会造成细菌大量繁殖, 亚硝酸盐含量增加; 泡菜的发酵时间长, 亚硝酸盐含量低, 但是发酵
时间过长, 乳酸含量过高, 口味不佳。
5. 进一步探究: 亚硝酸盐含量的测定
(1) 原理: 在盐酸酸化条件下, 亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后, 与 N-1-萘基乙二胺
盐酸盐结合形成玫瑰红色染料。
(2) 方法: 比色法。 将显色后的样品与标准显色液进行对比, 估算亚硝酸盐含量。
(3) 过程: 配制溶液→制备标准显色液→制备样品处理液→比色。
知识点二 果酒和果醋的制作
1. 制作果酒和果醋的菌种和发酵条件的比较:
【特别提醒】 发酵过程中关注“两个变化”
(1) 果酒发酵过程中酵母菌数量和酒精含量的变化:
①菌体数量的变化: 发酵初期, 酵母菌进行有氧呼吸, 大量繁殖。 发酵中期形成无氧环境, 酵母
菌数量增加缓慢, 最后达到稳定。 发酵后期由于酒精含量较高, 可能会导致酵母菌大量死亡。
②酒精含量的变化: 发酵初期, 酵母菌进行有氧呼吸, 酒精含量很低。 发酵中期, 酵母菌进行无
氧呼吸产生大量酒精, 酒精含量增加。 发酵后期, 由于酒精含量升高, 大量酵母菌死亡, 酒精含
量不再增加。
(2) 果酒、 果醋制作过程中 pH 的变化:
①果酒发酵时产生的部分 CO 2 会溶于发酵液, 使发酵液 pH 下降, 最后趋于稳定。
②果醋发酵时产生的醋酸溶于发酵液, 使发酵液 pH 下降, 最后趋于稳定。
2. 制作果酒和果醋的发酵装置:
(1) 各部位的作用:
①充气口: 连接充气泵充入氧气(无菌空气) 。 充气管下端要插入发酵液面以下近瓶底处。
②排气口: 酒精发酵时排出酵母菌无氧呼吸产生的 CO 2 , 平衡容器内外压力; 在醋酸发酵时排出
的是剩余的空气和醋酸菌代谢产生的 CO 2 。 排气管下端离发酵液有一段距离, 外部要弯曲, 并尽
量保证管口向下, 可以防止空气中微生物的污染。
③出料口: 便于取样检测, 及时监测发酵进行的情况或排出废料。
(2) 该装置的使用方法:
使用该装置制果酒时, 应该关闭充气口; 制果醋时, 应将充气口连接气泵, 输入氧气(无菌空
气) 。
【特别提醒】 果酒和果醋制作成功的四个关键点
(1) 选择新鲜的葡萄, 榨汁前先将葡萄进行冲洗, 再除去枝梗, 以防葡萄汁流失及污染。
(2) 葡萄汁装入发酵瓶时, 要留有大约 1/3 的空间: 目的是先让酵母菌进行有氧呼吸快速繁殖,
耗尽瓶内 O 2 后再进行酒精发酵, 还可防止发酵过程中产生的 CO 2 造成发酵液溢出。
(3) 果酒发酵时要适时排气: 防止发酵装置爆裂。 果醋发酵时要及时通气:防止醋酸菌死亡。
(4) 严格控制温度: 18～30 ℃利于酵母菌的繁殖和酒精发酵; 30～35 ℃利于醋酸菌的繁殖和果
醋的发酵。
3. 实验现象及检测:
(1) 实验现象:
(2) 检测:
①酒精发酵: 果酒发酵后取样, 可通过嗅味和品尝进行初步鉴定, 也可以利用酸性重铬酸钾与
酒精反应出现灰绿色来检测酒精。
②醋酸发酵: 可通过观察菌膜的形成、 嗅味和品尝进行初步鉴定, 也可通过检测和比较醋酸发
酵前后的 pH(可用 pH 试纸) 做进一步的鉴定。第 2 章细胞工程
植物细胞工程
1、植物细胞工程的理论基础（原理）：细胞的全能性，即，具有某种生命全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成完整生物体的潜能。这也是为什么植物的一瓣花瓣就可培育出完整的植株的原因。
理论上，生物的任何一个细胞都具有发育成完整植株的潜力。但是，在生物的生长发育过程中，细胞并不会表现出全能性，而是分化成各种组织和器官。这是因为，在特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会有选择性地表达出各种蛋白质，从而构成生物体的不同组织和器官。
全能性表达的难易程度：受精卵＞生殖细胞＞干细胞＞体细胞；植物细胞＞动物细胞
2、植物细胞工程的基本技术：植物组织培养技术
3、植物组织培养技术
（1）概念：植物组织培养就是在无菌和人工控制条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。
（2）过程：离体的植物器官、组织或细胞 ―――→愈伤组织 ―――→试管苗 ――→植物体
（3）用途：微型繁殖、作物脱毒、制造人工种子、单倍体育种、细胞产物的工厂化生产。
A、植物繁殖的新途径：
微型繁殖：可以高效快速地实现种苗的大量繁殖
作物脱毒：采用茎尖组织培养来除去病毒（因为植物分生区附近的病毒极少或没有）
人工种子：以植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料，经人工薄膜包装得到的种子。优点：完全保持优良品种的遗传特性，不受季节的限制；方便储藏和运输
B、作物新品种培育
单倍体育种：
a过程：植株（AaBb）通过减数分裂得到花粉（AB、Ab、aB、ab四种类型）；对花粉进行花药离体培养（技术是植物组织培养）；得到单倍体植株；对其幼苗时期进行秋水仙素处理；得到了正常的纯合二倍体植株（AABB、AAbb、aaBB、aabb四种类型）。
b优点：明显缩短育种年限
突变体利用：在组织培养中会出现突变体，通过从有用的突变体中选育出新品种（如筛选抗病、抗盐、含高蛋白的突变体）
细胞产物的生产：通过能够产生对人们有利的产物的细胞进行组织培养，从而让它们能够产生大量的细胞产物。
（4）地位：是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序。
3、植物体细胞杂交技术
（1）概念：植物体细胞杂交就是将不同种的植物体细胞，在一定条件下，融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的技术。
（2）过程：如下图，其中，①去壁；②融合；③再生细胞壁；④脱分化；⑤再分化
（3）诱导融合的方法：物理法包括离心、振动、电刺激等。化学法一般是用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂。
（4）意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。
动物细胞工程
动物细胞工程常用的技术手段：动物细胞培养、动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体等。其中，动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。
1、动物细胞培养
（1）概念：就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。
（2）流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。
（3）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。
（4）需要满足以下条件
①无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。
②营养：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需加入血清、血浆等天然成分。
③温度：适宜温度：哺乳动物多是36.5℃＋0.5℃；pH：7.2～7.4。
④气体环境：95%空气＋5%CO2。O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。
（5）技术应用：制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学研究的各种细胞。
2、动物体细胞核移植技术和克隆动物
（1）概念：
动物体细胞核移植：是将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新胚胎最终发育为动物个体。
克隆动物：用核移植的方法得到的动物，称为克隆动物。
（2）哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植（比较容易）和体细胞核移植（比较难）。
（3）选用去核卵(母)细胞的原因：卵(母)细胞比较大，容易操作；卵(母)细胞细胞质多，营养丰富。细胞质不会抑制细胞核全能性的表达
（4）体细胞核移植的大致过程是（奶牛克隆为例）：
①高产奶牛（提供体细胞）进行细胞培养；
②同时采集卵母细胞，在体外培养到减二分裂中期的卵母细胞，去核（显微操作）；
③将供体细胞注入去核卵母细胞；
④通过电刺激使两细胞融合，供体核进入受体卵母细胞，构建重组胚胎；
⑤将胚胎移入受体（代孕）母牛体内；
⑥生出与供体奶牛遗传基因相同的犊牛
（5）体细胞核移植技术的应用：
①加速家畜遗传改良进程，促进良畜群繁育；②保护濒危物种，增大存活数量；③生产珍贵的医用蛋白；④作为异种移植的供体；⑤用于组织器官的移植等。
（6）体细胞核移植技术存在的问题：克隆动物存在着健康问题、表现出遗传和生理缺陷等。
3、动物细胞融合
（1）概念：动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。
（2）动物细胞融合与植物原生质体融合的原理基本相同，诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法类似，常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电刺激等。
（3）动物细胞融合的意义：克服了远缘杂交的不亲和性，成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物生物新品种培育的重要手段。
（4）动物细胞融合与植物体细胞杂交的对比：
细胞工程 植物体细胞杂交 动物细胞融合
理论基础 细胞的全能性、细胞膜的流动性 细胞增殖、细胞膜的流动性
融合前处理 酶解法去除细胞壁（纤维素酶、果胶酶） 注射特定抗原，免疫处理正常小鼠
融合方法 诱导原生质体融合 使细胞分散后诱导细胞融合
诱导手段 物理法：离心、振动、电激 化学法：聚乙二醇（PEG） 物理法：离心、振动、电激 化学法：聚乙二醇 生物法：灭活的病毒（灭活的仙台病毒）
诱导过程 第①步：原生质体的制备（酶解法） 第②步：原生质体融合（物、化法） 第③步：杂种细胞的筛选和培养 第④步：杂种植株的诱导与鉴定 ①正常小鼠免疫处理 ②动物细胞的融合（物、化、生法） ③杂交瘤细胞的筛选与培养 ④专一抗体检验阳性细胞培养 ⑤单克隆抗体的提纯
应用 克服远缘杂交的不亲和障碍，大大扩展杂交的亲本组合范围 应用：白菜-甘蓝等杂种植株 制备单克隆抗体 诊断、治疗、预防疾病，例如“生物导弹”治疗癌症
4.单克隆抗体
（1）概念：简称单抗，单克隆抗体是指由淋巴B细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇的特异性抗体。单克隆抗体是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体／多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。
（2）抗体：一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。
（3）单克隆抗体的制备过程：(如下图)
对免疫小鼠注射特定的抗原蛋白（目的使小鼠产生了效应B细胞）；
提取B淋巴细胞；
同时用动物细胞培养的方法培养骨髓瘤细胞并提取；
促使它们细胞融合[注：融合的结果是有很多不符合要求的；如有2个B淋巴细胞融合的细胞等，所以要进行筛选]；
在特定的选择培养基上筛选出融合的杂种细胞[特点是能迅速大量增殖，又能产生专一的抗体]；
然后对它进行克隆化培养和抗体检测[筛选出能够分泌所需抗体的杂种细胞]；
最后将杂交瘤细胞在体外做大规模培养或注射入小鼠腹腔内增殖，从细胞培养液或小鼠腹水中可得到大量的单克隆抗体。
（4）杂交瘤细胞的特点：既能大量繁殖，又能产生专一的抗体。
（5）单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并能大量制备。
（6）单克隆抗体的应用：
作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合，准确、高效、简易、快速。
用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症治疗，可制成“生物导弹”，也有少量用于治疗其它疾病。
胚胎工程
1、胚胎工程
（1）概念：对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术。经过处理后获得的胚胎，还需移植到雌性动物体内生产后代，以满足人类的各种需求。
（2）主要的技术手段：如胚胎移植、体外受精、胚胎分割、胚胎干细胞培养等技术。
3.1 体内受精和早期胚胎发育
2、哺乳动物受精和胚胎发育的基本过程
（1）精子的发生：在睾丸内完成的。第一阶段：精原细胞进行有丝分裂，染色体复制，形成初级精母细胞；第二阶段：初级精母细胞进行减数分裂，产生含单倍染色体的精子细胞；第三阶段：圆形精子细胞变形成为精子（变形过程中，细胞核为精子头的主要部分，高尔基体发育为顶体，中心体演变为精子的尾，线粒体在尾基部形成线粒体鞘膜，其他物质浓缩为原生质滴直至脱落）。[线粒体为精子运动提供能量]
（2）卵子的发生：在雌性动物的卵巢内完成。在胎儿时期，卵原细胞进行有丝分裂演变成初级卵母细胞（被卵泡细胞包围）；初级卵母细胞经减数分裂形成成熟的卵子（减一分裂在排卵前后完成，形成次级卵母细胞和第一极体，并进入输卵管准备受精；减二分裂是在受精过程中完成的，次级卵母细胞分裂产生一个成熟卵子和第二极体。
当在卵黄膜和透明带的间隙可以观察到两个极体时，说明卵子已经完成了受精，这是判断卵子是否受精的重要标志。
哺乳动物卵泡的形成和在卵巢内的储备，是在出生前（即胎儿时期）完成的。这是精子与卵子在发生上的重要区别。
（3）受精：是精子与卵子结合形成（即受精卵）的过程。包括受精前的准备阶段和受精阶段。
准备阶段1：精子获能（在雌性动物生殖道内）；
准备阶段2：卵子的准备(排出的卵子要在输卵管中进一步成熟到减二中期才具备受精能力)
受精阶段：精子穿越放射冠和透明带，进入卵黄膜，原核形成和配子结合。具体过程如下：[卵子周围的结构由外到内：放射冠、透明带、卵黄膜]
a）顶体反应：精子释放顶体酶溶解卵丘细胞之间的物质，穿越放射冠。
b）透明带反应：顶体酶可将透明带溶出孔道，精子穿入，在精子触及卵黄膜的瞬间阻止后来精子进入透明带的生理反应[它是防止多精子入卵受精的第一道屏障]；
c）卵黄膜的封闭作用：精子外膜和卵黄膜融合，精子入卵后，卵黄膜会拒绝其他精子再进入卵内的过程[它是防止多精子入卵受精的第二道屏障]；精子尾部脱落，原有核膜破裂形成雄原核，同时卵子完成减二分裂，形成雌原核
注意：受精标志是第二极体的形成；受精完成标志是雌雄原核融合成合子]。
自然条件下，受精是在母体的输卵管上段完成的。
（4）胚胎发育：a卵裂期：受精卵细胞进行有丝分裂，数量增加，胚胎总体积不增加，或略有减小。；
b桑椹胚：胚胎细胞数目达32个左右时，胚胎形成致密的细胞团，形似桑椹。是全能细胞。
c囊胚：细胞开始分化（该时期细胞的全能性仍比较高），其中聚集在胚胎一端个体较大的细胞叫内细胞团，将来可发育成胎儿的各种组织；而滋养层细胞将来发育成胎膜和胎盘；胚胎内部的空腔称为囊胚腔。（注：囊胚的扩大会导致透明带的破裂，胚胎伸展出来，这一过程叫孵化）；
d原肠胚：有了三胚层的分化，内细胞团表层形成外胚层，下方细胞形成内胚层，由内胚层包围的囊腔叫原肠腔。[细胞分化在胚胎期达到最大限度]
3.2 体外受精和胚胎的早期培养
3、体外受精：
哺乳动物的体外受精：主要包括卵母细胞的采集、精子的获取和受精等步骤。属于有性生殖过程。
（1）卵母细胞的采集和培养：对体型小的动物用促性腺激素处理，使其排出更多的卵子，从输卵管冲取卵子（可直接与获能的精子在体外受精）；对体型大的动物从卵巢中直接或间接（借助超声波探测仪、腹腔镜等）采集卵母细胞。（卵母细胞要在体外人工培养成熟后，才能与获能的精子受精）。
（2）精子的采集和获能：假阴道法、手握法和电刺激法；获能：对啮齿动物、兔、猪等的精子用培养法（放入人工配制的获能液中）；对牛、羊等精子用化学法（放在肝素或钙离子载体溶液中）；在体外受精前，要对精子进行获能处理。精子获能的方法有：培养法和化学诱导法两种。
（3）受精：获能的精子和培养成熟的卵子，一般情况下都可以在获能溶液或专用受精溶液中完成受精过程。
4、胚胎的早期培养：精子与卵子在体外受精后，应将受精卵移入发育培养液中继续培养，以检查受精状况和受精卵的发育能力。
a）培养液成分：无机盐、有机盐、维生素、激素、氨基酸、核苷酸、血清等[注意与动物细胞培养液成分的比较]；
b）胚胎发育到适宜阶段时，可将培养的胚胎取出，向受体移植或冷冻保存。
不同动物胚胎移植的时间不同。(牛、羊一般要培育到桑椹胚或囊胚阶段才能进行移植；小鼠、家兔等实验动物可在更早的阶段移植，人的体外受精胚胎可在4个细胞阶段移植。)
3.3 胚胎工程的应用
目前，胚胎工程应用较多的是家畜的胚胎移植、胚胎分隔、体外生产胚胎技术。
5、胚胎移植：
（1）概念：将雌性动物的早期胚胎移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物的体内，使之继续发育为新个体的技术。
其中提供胚胎的个体称为“供体”，接受胚胎的个体称为“受体”。（供体为优良品种，作为受体的雌性动物应为常见或存量大的品种。）
是生产胚胎的供体和孕育胚胎的受体共同繁殖后代的过程，通过转基因、核移植、体外受精获得的胚胎必须移植给受体才能获得后代。是胚胎工程的最后一道“工序”。
（2）优势：可以充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力，缩短供体本身的繁殖周期。
（3）胚胎移植的生理学基础：
同种动物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的[对供体和受体进行同期发情处理]；
早期胚胎形成后处于游离状态，为胚胎的收集提供可能；
受体对移入子宫的外来胚胎基本不发生免疫排斥反应，为胚胎在受体的存活提供了可能；
供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，移入受体的供体胚胎的遗传特性在孕育过程中不受影响。
（4）胚胎移植的程序：
对供、受体母牛进行选择，选择遗传特性和生产性能优秀的供体，有健康的体质和正常繁殖能力的受体，供体和受体是同一物种。用激素进行同期发情处理；
对供体母牛用促性腺激素做超数排卵处理；
选同种优秀公牛配种或人工授精[有性生殖过程]；
对胚胎的收集、检查、培养或保存。配种或输精后第7天，用特制的冲卵装置，把供体母牛子宫内的胚胎冲洗出来(也叫冲卵)。
对胚胎进行质量检查，此时的胚胎应发育到桑椹或胚囊胚阶段。
直接向受体进行胚胎移植或放入－196℃的液氮中保存。
胚胎移植；
移植后的检查。对受体母牛进行是否妊娠的检查。
产下胚胎移植的犊牛。
6、胚胎分割：
（1）概念：用机械方法将早期胚胎切割成2、4、8等分等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。由于来自同一胚胎的后代具有相同的遗传物质，因此胚胎分割可看作是动物无性繁殖或克隆的方法之一。
（2）基本过程：选择良好的桑椹胚或囊胚（期间的发育过程中，细胞开始分化，但其全能性仍很高，也可以用于胚胎分割）移入培养皿中，用分割针或分割刀片将其切开，吸出其中的半个胚胎注入透明带中或直接移植给受体。（注意：对囊胚阶段的胚胎分割时，内细胞团要均等分割，否则会影响胚胎的恢复和进一步发育）。
7、胚胎干细胞（ES或EK细胞）
（1）概念：由早期胚胎（囊胚）或原始性腺（胎儿）中分离出来的一类细胞，又叫ES或EK细胞。
（2）特征：具有胚胎细胞的特征，在形态上体积小、细胞核大、核仁明显；功能上具有发育的全能性，即可分化为成年动物体内任何一种组织细胞。在体外培养下，ES细胞可以只增殖不分化；可以进行冷冻保存，也可以进行遗传改造。
（3）应用：用于治疗人类疾病，如利用ES细胞诱导其分化成新的组织细胞特性，移植ES细胞可使坏死或退化的部位得以修复。
8、胚胎干细胞的主要用途有：
① 可用于研究哺乳动物个体发生和发育规律；
② 是在体外条件下研究细胞分化的理想材料，在培养液中加入分化诱导因子，如牛黄酸等化学物质时，就可以诱导ES细胞向不同类型的组织细胞分化，这为揭示细胞分化和细胞凋亡的机理提供了有效的手段；
③ 可以用于治疗人类的某些顽疾，如帕金森综合症、少年糖尿病等；
④ 利用可以被诱导分化形成新的组织细胞的特性，移植ES细胞可使坏死或退化的部位得以修复并恢复正常功能；
⑤ 随着组织工程技术的发展，通过ES细胞体外诱导分化，定向培育出人造组织器官，用于器官移植，解决供体器官不足和器官移植后免疫排斥的问题。

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