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第2节 微生物的培养技术及应用
第1章　发酵工程
二 微生物的选择培养和计数
课程内容标准 核心素养对接
1.举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。
2.概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法。
3.概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。 1.理解微生物的选择培养和计数的原理。（生命观念）
2.进行稀释涂布平板法的操作和土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验。（科学探究）
一、选择培养基
实验室中目的菌株的筛选
（1）原理：人为提供有利于 生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时 其他微生物的生长。
（2）方法：利用选择培养基分离。
①选择培养基：允许 的微生物生长，同时 其他种类微生物生长的培养基。
目的菌
抑制或阻止
特定种类
抑制或阻止
②实例：选择分解尿素的细菌的培养基，以 作为唯一氮源，只有能合成 的微生物才能分解尿素。
二、微生物的选择培养
1.铲取土样，将样品装入纸袋中。
2.将10 g土样加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1 mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
尿素
脲酶
3.稀释涂布平板法
操作步骤
（1）系列稀释操作
a.将分别盛有 mL水的6支试管灭菌，并按1×102~1×107的顺序编号。
b.用移液管吸取 mL 1×10的菌液，注入1×102倍稀释的试管中。用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸3次，使菌液与水充分 。
c.从1×102倍稀释的试管中吸取 mL稀释液，注入1×103倍稀释的试管中，重复b步的混匀操作。依次类推，直到完成最后一支试管的稀释。
9
1
混合
1
（2）涂布平板操作
（3）待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板 ，放入30~37 ℃的恒温培养箱中培养1~2 d。在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的 菌落。
三、微生物的数量测定
1.方法一：稀释涂布平板法
（1）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个 。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少 。
倒置
单
活菌
活菌
（2）计数原则：为保证结果准确，一般选择菌落数为 的平板进行计数。样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目。在同一稀释度下，应至少对 个平板进行重复计数，然后求出 。
（3）注意事项：统计的菌落数往往比活菌的实际数目 ，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个 。
30~300
平均值
少
菌落
3
2.方法二：直接计数法
利用显微镜进行直接计数，也是一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法。该方法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量，统计的结果一般是 的总和。
活菌数和死菌数
四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1.土壤取样
从富含有机质、酸碱度接近中性且潮湿的土壤中取样。先铲去表层土，在距地表 cm的土壤层取样。
2.样品的稀释
（1）稀释原因：样品的 直接影响平板上生长的 。
（2）稀释标准：选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证获得菌落数在 之间，便于计数。
（3）第一次做实验时，可以将稀释的范围放宽一点。
3~8
稀释度
菌落数目
30~300
3.微生物的培养与观察
（1）培养：不同种类的微生物，往往需要不同的培养 和培养 。
（2）观察：每隔 统计一次 数目，最后选取菌落数目 时的记录作为结果。
4.操作提示
（1）无菌操作
①取土样的用具在使用前都需要 。
②应在 旁称取土壤，并在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好 。
温度
时间
24 h
菌落
稳定
灭菌
火焰
棉塞
③在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在 旁操作。
（2）做好标记：本实验使用的平板和试管比较多。为避免混淆，使用前应做好 。
（3）制订计划：对于耗时较长的生物实验，要事先 ，以提高实验效率。
火焰
标记
规划时间
1.判正误（对的画“√”，错的画“×”）
（1）因为土壤中各类微生物的数量不同，所以为获得不同类型的微生物要按不同的稀释倍数进行分离。 （ ）
（2）转换划线角度后需要灼烧接种环再进行划线。 （ ）
（3）筛选分解尿素的细菌所用的培养基为液体培养基。 （ ）
（4）用平板划线法培养计数，应选择有10~100菌落数的平板。 （ ）
√
√
×
×
（5）统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数目。 （ ）
（6）只要培养基中有尿素即可筛选出分解尿素的细菌。 （ ）
（7）分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的pH降低。 （ ）
×
×
×
2.微思考
（1）在纯化大肠杆菌的操作中，如何检验培养基灭菌是否彻底？
提示　将接种后的培养基和一个未接种的培养基，都放在37℃恒温箱中培养，观察并记录结果。
（2）如果你在培养基上观察到了不同形态的菌落，可能是什么原因造成的？
提示　培养基灭菌不彻底或接种过程中感染了杂菌。
任务驱动一　微生物的筛选
下面是筛选能分解尿素的细菌的培养基的配方，请分析回答问题：
组分 含量
KH2PO4 1.4 g
Na2HPO4 2.1 g
MgSO4·7H2O 0.2 g
葡萄糖 10.0 g
组分 含量
尿素 1.0 g
琼脂 15.0 g
H2O 定容至1 000 mL
（1）从物理性质看，该培养基属于　　　　培养基，从功能上看属于
　　　　培养基。
提示　固体　选择
（2）该培养基是如何实现对分解尿素的细菌进行筛选的？
提示　该培养基中唯一氮源为尿素，不能合成脲酶的微生物不能分解尿素，会因缺乏氮源而无法生长繁殖，所以用该培养基能够筛选出能分解尿素的细菌。
1.选择培养基的选择作用
（1）原理：根据不同微生物的特殊营养需求或其对某物理、化学因素的抗性不同而制备培养基。
（2）三种方法的比较：
方法 特点 举例
一 利用营养缺陷型选择培养基进行的选择培养 通过控制培养基的营养成分，使营养缺陷型微生物不能正常生长 缺乏氮源时可以分离固氮微生物
方法 特点 举例
二 利用某种化学物质进行的选择培养 在完全培养基中加入某些化学物质，利用加入的化学物质对微生物产生的影响，抑制某些微生物的生长，同时选择所需的微生物 加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌
三 利用培养条件进行的选择培养 改变微生物的培养条件 将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物
［特别提醒］　能在选择培养基上生长的不一定是所需要的目的菌。原则上选择培养基只能允许特定种类的微生物生长，但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能在选择培养基上生长的微生物不一定都是
所需的微生物，还需进一步鉴定。　
2.平板划线法和稀释涂布平板法的比较
（1）单细胞菌落的获得：
利用平板划线法接种时，单细胞菌落从后划线的区域挑取；利用稀释涂布平板法接种时，只有在合适的稀释度下才能得到单细胞菌落。
（2）两种接种方法的应用：
两种方法都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的；稀释涂布平板法还能对微生物进行计数，而平板划线法不能用于微生物的计数。
［练别提醒］　稀释涂布平板法的注意事项
（1）稀释涂布平板法倒平板所选择的稀释度很重要，一般选择培养后平均菌落数在50个左右的稀释度。
（2）在设计实验时，一定要涂布至少3个平板作为重复组。
（3）在分析结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，如果差别过大，则意味着操作有误，需要重新实验。
（3）微生物筛选过程中，除选择培养基外，另外还需设置两组对照培养基，以提高实验的说服力和科学性。
对照组 作用 现象 结论
未接种培养基 判断有无杂菌污染培养基 未接种的培养基中无菌落生长 培养基未被杂菌污染
接种的全营养培养基 判断选择培养基有无筛选的作用 全营养培养基上的菌落数大于选择培养基上的数目 选择培养基具有筛选作用
物质W是一种含氮有机物，W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。某小组欲从土壤中筛选出能降解W的细菌，结果如下图。下列说法错误的是 （　　 ）
A.透明圈的形成是因为W物质被分解
B.所用的选择培养基应该是以物质W为唯一氮源
C.甲菌落中的细菌可能是利用空气中的氮气作为氮源
D.乙菌落中的细菌都能降解W，不需要进一步纯化
D
解析
W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明，因此透明圈的形成是因为W物质被分解，A正确；要筛选出能降解W的细菌，所用的选择培养基应该是以物质W为唯一氮源，B正确；该培养基以W物质为唯一氮源，而甲菌落周围未出现透明圈，因此甲菌落中的细菌可能是利用空气中的氮气作为氮源，C正确；乙菌落中的细菌不一定都能降解W，因此仍需要进一步纯化，D错误。
［举一反三］
1.（科学探究）能够对微生物计数的接种方法是哪一种？为了保证结果准确，选择菌落数为多少的平板计数？
提示　可同时用于分离微生物和统计活菌数的接种方法为稀释涂布平板法。为了保证结果准确，一般选择菌落数为30~300的平板进行计数。
2.（科学思维）用稀释涂布平板法和显微计数法对微生物计数时产生的实验误差有何倾向？试分析原因。
提示　稀释涂布平板法计数的值比实际值偏小，原因是当两个或多个细胞连在一起时，在平板上观察到的只是一个菌落；显微计数法计数的结果比实际值偏大，原因是显微镜下无法区分细胞的死活，计数时包括了死细胞。
1.解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲、乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色。下列说法错误的是 （　　）
A.甲菌属于解脂菌
B.实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源
C.可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比
D.该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力
B
解析
根据题干信息“甲菌菌落周围呈现深蓝色”，说明甲可以分泌脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸，脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色，因此甲菌属于解脂菌，A正确；乙菌落周围没有出现深蓝色，说明乙菌落不能产生脂肪酶，不能利用脂肪为其供能，但乙菌落也可以在培养基上生存，说明该培养基不是以脂肪为唯一碳源，B错误；可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比，更加直观，C正确；可以利用该平板来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力，菌落周围呈现深蓝色的范围越大，解脂菌分泌脂肪酶的能力越强，D正确。
2.微生物分离和微生物计数技术广泛应用于人们的生产生活中，下列有关微生物分离和计数的叙述，正确的是 （　　）
A.利用稀释涂布平板法直接测定饮用水中的大肠杆菌数目
B.平板划线法和稀释涂布平板法均有助于获得纯培养物
C.使用血细胞计数板可以对冰激凌中的大肠杆菌进行计数
D.从土壤中分离特定细菌的纯培养物不需借助选择培养基
B
解析
利用稀释涂布平板法统计饮用水中的大肠杆菌数目时，需要先在鉴别培养基上培养，然后看长出来的菌落形态是否符合大肠杆菌的菌落形态，然后进行计数，A错误；平板划线法和稀释涂布平板法都是常见的微生物接种方法，均有助于获得纯培养物，B正确；细菌计数板和血细胞计数板的计数原理相同，但血细胞计数板常用于相对较大的酵母菌细胞等的计数，对于大肠杆菌等较小的细胞需要用细菌计数板进行计数，C错误；选择培养基是指在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需要的微生物生长的培养基，从土壤中分离特定细菌的纯培养物需借助选择培养基，D错误。
任务驱动二　微生物分离与计数
下面是土壤中微生物的分离与计数的实验流程示意图。请分析回答问题：
（1）图示统计菌落数目的方法是　　　　　　　　　，利用该法统计的菌落数往往比活菌的实际数目　　　　，原因是　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　。
提示　稀释涂布平板法　少　当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
（2）甲、乙两名同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
①甲同学在该稀释度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230，该同学的统计结果是否真实可靠？为什么？
提示　不可靠。为增强实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下涂布至少3个平板，统计结果后计算平均值。
②乙同学在该稀释度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。该同学对实验结果的处理是否合理？为什么？
提示　不合理。微生物计数时，如果实验中出现重复实验结果不一致的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出出现差异的原因，再重新实验，而不能简单地舍弃。
1.两种微生物计数方法的比较
间接计数法
（稀释涂布平板法） 直接计数法
（显微计数法）
原理 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌 利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量
间接计数法
（稀释涂布平板法） 直接计数法
（显微计数法）
公式 每毫升原液所含细菌数=每
小格内平均细菌数×400×104×稀释倍数
间接计数法
（稀释涂布平板法） 直接计数法
（显微计数法）
误差 当两个或多个菌体连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 不能区分
细菌死活
结果 比实际值偏小 比实际值偏大
2.结果分析与评价
内容 现象 结论
有无杂
菌污染 对照的培养皿中无菌落生长 未被杂菌污染
培养物中菌落数偏高 被杂菌污染
菌落形态多样，菌落数偏高 培养物中混入其他营养物质
内容 现象 结论
选择培养基的
筛选作用 全营养培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目 选择培养基具筛选作用
样品的
稀释操作 得到2个以上菌落数目在30~300的平板 操作成功
重复组
的结果 若选取同一种土样，统计结果应接近
下图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。据图分析正确的是 （　　）
A.3号试管的稀释倍数为1×103倍
B.4号试管中的稀释液进行平板培养后得到的菌落平均数恰为5号试管的10倍
C.5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×109个
D.该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要高
C
解析
3号试管中样品液的稀释倍数为1×104倍，A错误；4号中的稀释液进行平板培养，稀释倍数是5号的十分之一，如果稀释倍数适当，得到的菌落平均数可能是5号的10倍，B错误；用5号试管涂布平板，计数的结果表明每克土壤中的菌株数为（168+175+167）÷3÷0.1×106=1.7×109（个），C正确；用稀释涂布平板法得到的菌落可能存在两个或多个细菌细胞长成一个菌落的情况，因此该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要低，D错误。
［举一反三］
1.（科学思维）为什么尿素分解菌能够在以尿素为唯一氮源的培养基中生存？
提示　因为这些微生物体内能产生脲酶，能将尿素分解为氨。
2.（科学探究）如何检验分离土壤中分解尿素的细菌实验中所用的选择培养基没有受到污染？
提示　设置一个未涂布的、能筛选分解尿素的细菌的选择培养基作对照。
1.用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中得到以下几种统计结果，正确的是 （　　 ）
A.涂布了一个平板，统计的菌落数是230
B.涂布了两个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值为238
C.涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值为163
D.涂布了三个平板，统计的菌落数分别是210、240和250，取平均值为233
D
解析
用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数时，在每一个梯度浓度内，至少要涂布3个平板，选择菌落数在30~300的进行计数，求平均值，再通过计算得出土壤中细菌总数，故选D。
2.幽门螺杆菌（Hp）感染是急慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因素。在患者体内采集样本并制成菌液后，进行分离培养。实验基本步骤如下，下列叙述错误的是 （　　）
配制培养基 灭菌、倒平板 X 培养 观察
A.在培养时，需将培养皿倒置，若不倒置培养，将可能导致菌种污染
B.在配制培养基时，要加入尿素和酚红指示剂，这是因为Hp含有脲酶，它能以尿素作为氮源；若有Hp，则菌落变黑
B
C.临床上用14C呼气试验检测人体是否感染Hp，其基本原理是Hp能将14C标记的尿素分解为NH3和14CO2
D.步骤X表示接种，在无菌条件下操作时，先将菌液稀释，然后将菌液涂布到培养基平面上，菌液稀释的目的是获得单菌落
解析
在倒平板后，平板冷凝皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。在培养时，也需将培养皿倒置并放在恒温培养箱中，若不倒置培养，将导致培养基被污染，A正确。在配制培养基时，要加入尿素和酚红指示剂，这是因为Hp含有脲酶，它能以尿素作为氮源；若有Hp存在会分解尿素，培养基pH会升高，酚红指示剂将变红，B错误。临床上用14C呼气试验检测人
解析
体是否感染Hp，幽门螺杆菌含有脲酶，能分解尿素为菌体提供氮源，故Hp能将14C标记的尿素分解为NH3和14CO2，C正确。步骤X表示在培养基上接种Hp，在无菌条件下操作时，先将菌液稀释，然后将菌液涂布到培养基平面上，菌液稀释的目的是获得单菌落，以便分离到单一菌种，D正确。
知识网络构建
关键知识积累
1.实验室中筛选微生物的原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。
2.在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。
3.测定微生物数量的常用方法有活菌计数法和显微镜直接计数法。稀释涂布平板法常用来统计活菌的数目，但统计结果往往比活菌的实际数目低。
4.只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用以尿素为唯一氮源的选择培养基分离能分解尿素的细菌。
1.土壤中分解尿素的微生物特有的氮源为 （　　）
A.硝酸　　　　　　　　 B.氨
C.尿素 D.蛋白胨
C
解析
只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，若无其他氮源，则其生长、发育及繁殖受到抑制，所以以尿素为唯一氮源的培养基能够选择出能分解尿素的微生物。
2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是 （　　）
A.平板上的一个菌落就是一个细菌
B.菌落中的细菌数是固定的
C.此时的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
D.此方法统计的菌落数一定与活菌的实际数相同
C
解析
用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌，但偶尔也会来自两个或多个细菌，所以此方法统计的菌落数可能低于活菌的实际数目。
3.测定土壤中细菌数量时一般选用1×104、1×105和1×106倍的稀释液进行平板培养，而测定真菌的数量时一般采用1×102、1×103和1×104倍稀释，其原因是 （　　）
A.细菌个体小，真菌个体大
B.细菌易稀释，真菌不易稀释
C.细菌在土壤中数量比真菌多
D.真菌结构比细菌复杂
C
解析
土壤中细菌的数量一般多于真菌的数量，为控制平板上的菌落数在30~300之间，需要选择不同的稀释倍数，故C正确。
4.硒是一种生命活动必需的微量元素。亚硒酸钠对细菌的生长有明显的毒害作用，土壤中的一些富硒细菌可将其还原为红色单质硒。下图表示土壤中富硒细菌的筛选和纯化过程。下列叙述错误的是 （　　）
B
A.步骤②中可重复将1mL菌液加入9mL无菌水进行逐步稀释
B.图中步骤④的培养基属于鉴别培养基，原理是该培养基含红色的富硒细菌
C.步骤④中，可根据菌落周围是否出现红色区域对目的菌株进行筛选
D.通过同时培养灭菌的空白平板，可检测培养基灭菌是否合格
解析
为得到以10倍为梯度的稀释倍数，步骤②中可重复将1mL菌液加入9mL无菌水进行逐步稀释，A正确；图中步骤④的培养基属于鉴别培养基，土壤中的一些富硒细菌可将亚硒酸钠还原为红色单质硒，而其他细菌却没有这种能力，利用此原理可进行鉴定，B错误；步骤④中，如果菌落周围出现红色区域，则说明是富硒细菌形成的菌落，为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围红色区域的大小，从平板中挑取实验效果明显的目的菌株，接种于新的培养基平板，对菌株进行进一步的纯化，C正确；通过同时培养灭菌的空白平板，可检测培养基灭菌是否合格，若空白培养基无菌落生长，则证明灭菌合格，D正确。
5.某同学要分离土壤中能分解尿素的细菌，并统计单位体积内的活菌数目。按照培养基的配方称取营养物质，并将各种物质溶解后，用蒸馏水定容、灭菌，制成固体培养基备用。回答下列问题：
（1）在配制培养基时，需加入　 　　作为唯一的氮源，该培养基从功能上看属于　　　培养基，配制好的培养基应用　　　　　　　　法灭菌。
（2）若要统计土壤样品中尿素分解菌的数目，宜采用　　　　法接种。
（3）实验中使用过的培养基及其培养物必须经过　　　　处理后才能丢弃，以防止微生物的扩散。
答案　（1）尿素　选择　高压蒸汽灭菌　（2）稀释涂布平板　（3）灭菌
解析
（1）要分离土壤中能分解尿素的细菌，在配制培养基时，需加入尿素作为唯一的氮源；由于该培养基能将能分解尿素的细菌选择出来，因此该培养基从功能上看属于选择培养基；培养基的灭菌方法是高压蒸汽灭菌。
（2）要统计土壤样品中尿素分解菌的数目，宜采用稀释涂布平板法接种。
（3）实验中使用过的培养基及其培养物必须经过灭菌处理后才能丢弃，以防止微生物扩散污染环境。

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