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第1节 重组DNA技术的基本工具
第3章　基因工程
课程内容标准 核心素养对接
1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科的基础上发展而来的。
2.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。 1.通过对基因工程的诞生和发展生物学史的学习，认同科学发展的阶段性和继承性。（科学思维）
2.通过对基因工程三种基本工具特点、种类的学习，运用归纳与概括等方法，培养科学的思维习惯和能力。（科学思维）
一、基因工程的概念和理论基础
1.基因工程的概念
基因工程的别名 技术
操作环境 生物体外
操作对象
操作水平 水平
结果 创造出 和生物产品
重组DNA
基因
DNA分子
新的生物类型
2.基因工程的诞生与发展
连线：
二、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
三、DNA连接酶——“分子缝合针”
1.作用：缝合双链DNA片段，恢复被限制酶切开的 。
2.种类：
种类 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源 T4噬菌体
特点 缝合 末端，缝合平末端效率较低 缝合 末端和 末端
作用 缝合双链DNA片段，恢复被限制酶切开的
磷酸二酯键
大肠杆菌
黏性
黏性
平
磷酸二酯键
四、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
3.作用：携带 进入受体细胞。
五、DNA的粗提取与鉴定
1.实验原理
（1）提取的原理：
①DNA不溶于 ，而某些蛋白质可以，利用这一原理，可初步分离出蛋白质。
②DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于 的NaCl溶液。
外源DNA片段
酒精
2 mol/L
（2）鉴定的原理：
在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现 。
2.方法步骤
蓝色
实验步骤、结果及结论
（1）称取约30 g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10 mL研磨液，
（2）在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液
充分研磨
实验步骤、结果及结论
（3）在上清液中加入体积相等的、预冷的 溶液（体积分数为95%），静置2~3 min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的 。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分
酒精
DNA
实验步骤、结果及结论
（4）取两支20 mL的试管，各加入2 mol/L的NaCl溶液5 mL。将丝状物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中各加入4 mL的
试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5 min。待试管冷却后，加入丝状物的试管呈
二苯胺
蓝色
1.判正误（对的画“√”，错的画“×”）
（1）基因工程的原理是基因重组，该技术引起的变异是定向的。（ ）
（2）DNA重组技术所需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体。 （ ）
（3）DNA聚合酶也可以用作DNA重组技术的连接酶。 （ ）
（4）原核细胞内的限制酶对细胞自身有害。 （ ）
（5）载体的种类有质粒、噬菌体、动植物病毒等，其中动植物病毒必须是DNA病毒。 （ ）
√
×
×
×
√
2.微思考
（1）从结构上分析，为什么不同生物的DNA能够重组？
提示　①基本组成单位相同：不同生物的DNA分子都是由脱氧核苷酸构成的。
②空间结构相同：不同生物的DNA分子一般都是由两条反向平行的脱氧核苷酸长链形成的规则的双螺旋结构。
③碱基配对方式相同：不同生物的DNA分子中两条链之间的碱基配对方式均是A与T配对，G与C配对。
（2）原核生物中存在的限制酶有什么作用呢？
提示　原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，原核生物会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效的作用，从而达到保护自身的目的。
任务驱动一　基因工程中的工具酶
下图表示两种限制酶识别DNA分子的特定序列，并在特定位点对DNA分子进行切割的示意图，请回答以下问题：
1.EcoR Ⅰ和Hpa Ⅰ的识别序列和识别位点分别是什么？产生的末端分别是哪种类型？
提示　EcoR Ⅰ限制酶的识别序列是GAATTC，切割位点在G、A之间，切断磷酸二酯键，产生的是黏性末端；Hpa Ⅰ限制酶的识别序列是GTTAAC，切割位点在T、A之间，切断磷酸二酯键，产生的是平末端。
2.DNA连接酶的作用是什么？和DNA聚合酶的作用有什么区别？
提示　DNA连接酶的作用是将2个不同来源的DNA片段拼接成1个完整的新的DNA分子。
区别：DNA连接酶不需要模板，催化连接2个DNA片段断口处的磷酸二酯键的形成；而DNA聚合酶催化DNA复制需要模板，形成与母链互补的子链，从而使DNA分子数增加。
3.DNA连接酶有哪两种？来源有什么不同？作用有什么不同？
提示　DNA连接酶有两种，即E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。前者来源于大肠杆菌，后者是从T4噬菌体中分离出来的。E.coli DNA连接酶只用于将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，连接双链DNA片段的平末端效率较低。而T4 DNA连接酶既能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，又能将双链DNA片段的平末端进行连接。
1.限制酶的辨析
（1）限制酶是一类酶而不是一种酶。
（2）限制酶作用于磷酸二酯键，而不是氢键。
（3）不同种类的限制酶识别的序列与切割的位点不同，这与酶的专一性是一致的。
（4）在切割含目的基因的DNA分子时，需用限制酶切割2次，产生4个末端。只有这样，才能使目的基因的两端都有可连接的末端。
（5）限制酶的识别序列与被作用的DNA序列是不同的。前者一般由6个核苷酸组成，少数由4、5或8个核苷酸组成；后者是双链序列。
（6）判断两个末端是否为同一种限制酶切割产生的方法：将其中一个末端旋转180°，若与另一个完全相同，则说明这两个末端是由同一种限制酶切割产生的。
2.与DNA有关的酶的比较
名称 作用部位 作用底物 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA切成两个片段
DNA
连接酶 磷酸二酯键 DNA片段 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA
聚合酶 磷酸二酯键 脱氧核苷酸 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA
（水解）酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
名称 作用部位 作用底物 作用结果
解旋酶 碱基对之间的氢键 DNA 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
RNA
聚合酶 磷酸二酯键 核糖核苷酸 将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端
下列黏性末端属于同一种限制酶切割而成的是 （　　）
A.①②　　 　　B.①③ C.①④ D.②③
B
解析
限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，且切割后可形成能够互补配对的黏性末端。由题图可知，①③能够互补，其他的不能互补，所以①③属于同一种限制酶切割而成的。
［举一反三］
1.（科学思维）比较基因工程中的载体与细胞膜上的载体的差别。
提示　两者都具有运送作用，但基因工程中的载体是运载目的基因到受体细胞，本质为质粒、噬菌体、动植物病毒；细胞膜上的载体是在协助扩散、主动运输过程中运送细胞需要的营养物质或产生的代谢废物，本质为载体蛋白或通道蛋白。
2.（生命观念）限制酶怎样利用专一性切割DNA片段？
提示　限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
1.下列关于限制酶的说法，正确的是 （　　）
A.限制酶广泛存在于各种生物中，其化学本质是蛋白质
B.一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列
C.不同的限制酶切割DNA后都会形成黏性末端
D.限制酶均特异性地识别含6个核苷酸的序列
B
解析
限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的，A错误；限制酶具有专一性，即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，B正确；限制酶切割DNA后会形成黏性末端或平末端，C错误；大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4、5或8个核苷酸组成，D错误。
2.如图所示，两个核酸片段在适宜条件下，经过X酶的催化作用，发生下列变化。下列相关叙述正确的是 （　　）
A.X酶是DNA聚合酶
B.X酶是从大肠杆菌中分离得到的
C.X酶能催化磷酸二酯键的形成
D.X酶能催化游离的核苷酸合成DNA
C
解析
由题图可知，该酶的作用是将两个DNA片段连接起来，故是DNA连接酶，A错误；DNA连接酶不一定是从大肠杆菌中得到的，也可以从其他生物中得到，B错误；DNA连接酶能催化磷酸二酯键的形成，C正确；DNA聚合酶能催化游离的核苷酸合成DNA，D错误。
任务驱动二　基因工程的载体——“分子运输车”
下图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图：
1.什么是质粒？
提示　一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞核或原核细胞拟核之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子，主要存在于细菌和酵母菌体内。其中最常用的是大肠杆菌质粒。
2.质粒作为基因载体有哪些优点？
提示　质粒是具有自我复制能力的小型双链环状DNA分子，便于进入受体细胞。
3.天然质粒能直接用于基因工程吗？
提示　不能，因为天然质粒上一般没有标记基因。
4.基因工程中常用的载体有哪些？
提示　质粒、噬菌体、动植物病毒。
1.作为载体必须具备的条件
（1）载体DNA必须有一个至多个限制酶切割位点，以便目的基因插入。
（2）能够在受体细胞中保留下来，且载体DNA必须具备自我复制能力，或能够整合到受体细胞染色体DNA上，并随染色体DNA进行同步复制。
（3）载体必须带有特殊的标记基因，以便重组后进行重组DNA的鉴定和筛选。常用的标记基因有抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。
（4）对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动。
2.载体的三个要点分析
（1）基因工程中的载体≠细胞膜上的载体
两种载体的不同：前者的实质是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞，后者的实质是蛋白质，与细胞膜的选择透过性有关。
（2）载体需要加工：一般来说，天然载体不能同时满足所有条件，要对其进行人工改造才可以使用。
（3）标记基因的筛选原理。
①前提：载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。
②过程：含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性，然后在培养基中加入该抗生素。
③结果：在培养基上，被抗生素杀死的是没有抗性的受体细胞，没被杀死的具有抗性的受体细胞得以筛选。
作为基因工程的运输工具——载体，必须具备的条件及理由对应不正确的是 （　　）
A.能够在宿主细胞中稳定保存并大量复制，以便提供大量的目的基因
B.具有多个限制酶切割位点，以便于目的基因的插入
C.具有某些标记基因，以便目的基因能够准确定位与其结合
D.对宿主细胞无伤害，以便于目的基因在宿主细胞中复制并稳定保存
C
解析
载体必须能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因，A正确；载体必须具有多个限制酶切割位点，以便于目的基因的插入，B正确；载体必须具有某些标记基因，以便于重组后进行重组DNA分子的筛选，C错误；携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，停留在细胞中进行自我复制，或整合到染色体DNA上，随着染色体DNA进行同步复制，故载体必须对宿主细胞无伤害，以便于目的基因在宿主细胞中复制并稳定保存，D正确。
［举一反三］
1.（生命观念）请用一句话概括质粒的特点。
提示　质粒是一种裸露、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
2.（科学思维）基因工程中质粒有什么作用？
提示　在基因工程中质粒起到载体的作用，具体作用如下：①作为运载工具，将目的基因运送到受体细胞中去。②在宿主（寄主）细胞内对目的基因进行大量复制和稳定保存。
1.下列有关质粒的说法正确的是 （　　）
A.在基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒
B.质粒上碱基之间数量存在A+G=U+C
C.质粒是一种独立于细菌拟核DNA之外的链状DNA分子
D.质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因
D
解析
在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行人工改造获得的，A错误；质粒是一种双链环状DNA分子，不存在U，B、C错误；质粒DNA分子上有限制酶切割位点和标记基因。
2.下列有关细菌质粒的叙述，正确的是 （　　）
A.质粒是存在于细菌细胞中的一种颗粒状的细胞器
B.质粒是细菌细胞质中能自主复制的小型环状DNA分子
C.质粒只能在侵入宿主细胞后在宿主细胞内复制
D.细菌质粒的复制过程一定是在宿主细胞外独立进行的
B
解析
质粒是存在于细菌中的一种环状DNA分子，不是细胞器，A错误；质粒的化学本质是DNA，是细菌细胞中能自主复制的小型环状DNA分子，B正确；在体外，若给予适宜的条件，质粒也可能进行复制，C错误；有的质粒可以整合到宿主细胞的染色体DNA上，如农杆菌的Ti质粒的T DNA，D错误。
知识网络构建
关键知识积累
1.DNA重组技术的基本工具有限制性内切核酸酶、DNA连接酶和使基因进入受体细胞的载体。
2.限制性内切核酸酶可识别双链DNA分子特定的核苷酸序列，并在特定位点上切割。
3.DNA连接酶根据来源不同可分为E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。
4.在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等。
1.基因工程技术也称“重组DNA技术”，其实施必须具备的4个条件是 （　　 ）
A.模板DNA、信使RNA、质粒、受体细胞
B.工具酶、目的基因、载体、受体细胞
C.目的基因、限制性核酸内切酶、载体、受体细胞
D.重组DNA、RNA聚合酶、限制性核酸内切酶、DNA连接酶
B
解析
mRNA是基因转录的产物，基因工程中不需要该物质，质粒是运载体中的一种，除了质粒运载体还有动植物病毒和噬菌体衍生物，因此质粒不是基因工程中必需的，A错误；限制酶和DNA连接酶属于工具酶，另外运载体、目的基因和受体细胞是基因工程中必须具备的条件，B正确；目的基因、限制酶、运载体、受体细胞是基因工程必须具备的条件，此外还需要DNA连接酶，C错误；重组DNA是由目的基因和质粒重组形成的，RNA聚合酶是转录需要的酶，细胞中具有该种酶，因此不是基因工程必需的，D错误。
2.某线性DNA分子含有5 000个碱基对（bp），先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如下表。限制酶a和b的识别序列和切割位点如下图所示。下列有关说法错误的是 （　　）
a酶切割产物（bp） b酶再次切割产物（bp）
2 100；1 400；1 000；500 1 900；200；800；600；1 000；500
D
A.在该DNA分子中，a酶与b酶的识别位点分别有3个和2个
B.a酶与b酶切割后形成的黏性末端是相同的
C.a酶与b酶切断的化学键都是磷酸二酯键
D.用a酶切割与线性DNA相同碱基序列的质粒，也得到4种切割产物
解析
a酶可以把原有DNA切成4段，说明a酶的识别位点有3个；b酶把大小为2 100 bp的DNA切成大小分别为1 900 bp和200 bp的两个片段，把大小为1 400 bp的DNA切成大小分别为800 bp和600 bp的两个片段，说明有2个位点；即在该DNA分子中，a酶和b酶的识别位点分别有3个和2个，A正确；a酶与b酶切割后形成的黏性末端相同，用DNA连接酶可以将它们连接起来，B正确；限制酶切割的化学键都是磷酸二酯键，C正确；质粒是环状DNA分子，与线性DNA相同碱基序列的质粒含有3个a酶的切割位点，则其被a酶切割后可以得到3种切割产物，D错误。
3.下表列举了几种限制酶的识别序列及其切割位点（箭头表示相关酶的切割位点）。下图是切割后产生的几种末端。下列说法正确的是 （　　）
B
A.BamHⅠ切割的是氢键，AluⅠ切割的是磷酸二酯键
B.Sau3AⅠ和BamHⅠ切割的序列产生的片段能够相连，连接后的片段还能被Sau3AⅠ切割
C.DNA连接酶能连接②⑤，不能连接②④
D.E.coli DNA连接酶连接①③的效率比T4 DNA连接酶高
解析
BamHⅠ与AluⅠ切割的均是磷酸二酯键，A错误；BamHⅠ切割G↓GATCC，Sau3AⅠ切割↓GATC，故二者切割后产生的黏性末端是相同的，因此二者切割后产生的黏性末端能够相连，连接后能被Sau3AⅠ切割，但是BamHⅠ不一定能切割，B正确；②、⑤的黏性末端相同，②、④的黏性末端也相同，因此DNA连接酶能连接②、⑤，也能连接②、④，C错误；E.coli DNA连接酶连接平末端的效率比T4 DNA连接酶低得多，题图中①、③属平末端，一般只能用T4 DNA连接酶连接，D错误。
4.（2022·山东卷）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是 （　　）
A.过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C.在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质
B
解析
低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，可能有蛋白质不溶于酒精，在体积分数为95%的冷酒精中与DNA一起析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。
5.（2021·全国卷）用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。
回答下列问题：
（1）常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中　　　　　　　　　酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。上图中　　　　　　　　　　　　　　酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
（2）DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是　　　　　。
（3）DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能　　　　　；质粒DNA分子上有　　　　　　　　　　　　　　，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因（如某种抗生素抗性基因），利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
（4）表达载体含有启动子，启动子是指
。
答案　（1）EcoRⅠ、PstⅠ　EcoRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ和EcoRⅤ　（2）磷酸二酯键　（3）自我复制　一个至多个限制酶切割位点　用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞　（4）位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程
解析
（1）限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的是平末端，E.coli DNA连接酶来源于大肠杆菌，连接平末端时效率较低，只用于将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而T4 DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端。因此图中EcoRⅠ和PstⅠ切割后的DNA片段（黏性末端）可以用E.coli DNA连接酶连接；除了这两种限制酶切割的DNA片段，限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割后的DNA片段（平末端）也可以用T4 DNA连接酶连接。
解析
（2）DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯键。
（3）质粒是小型环状的DNA分子，常作为基因表达的载体。首先质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制。质粒DNA分子上有一个至多个限制性内切核酸酶的酶切位点，便于目的基因的导入。质粒上的标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。
解析
（4）启动子是一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得需要的蛋白质。

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