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第2节 基因工程的基本操作程序
第3章　基因工程
课程内容标准 核心素养对接
阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测与鉴定等步骤。 1.结合生产实际，举例说出基因工程的基本操作程序。（科学思维）
2.针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。（科学探究）
一、基因工程的基本操作程序
第一步：目的基因的筛选与获取
1.目的基因
（1）概念：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。
（2）类型：根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、生产药物、毒物降解、工业用酶等相关的基因。
2.筛选合适的目的基因
（1）从相关的已知 和 清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
（2）随着测序技术的发展，以及 、 等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，这也为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。
3.利用PCR获取和扩增目的基因
（1）PCR：是 的缩写。
结构
功能
序列数据库
序列比对工具
聚合酶链式反应
（2）原理： 。
（3）发明者： 等人。
（4）反应体系：
①一定的缓冲溶液
② 模板
③分别与两条模板链结合的2种
④4种
⑤耐高温的
⑥控制
DNA半保留复制
穆里斯
DNA
引物
脱氧核苷酸
DNA聚合酶
温度
（5）过程：每次循环分为变性、复性、延伸三步。
①变性：当温度超过 时，双链DNA解聚为单链。
②复性：当温度下降到 左右时，两种引物通过
与两条单链DNA结合。
③延伸：当温度上升到 左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在
的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
90 ℃
50 ℃
碱基互补配对
72 ℃
耐高温
第一轮循环的产物作为第二轮反应的 ，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物。
第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过 三步产生第三轮循环的产物。
（6）结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，即成 形式扩增（约为2n）。
（7）反应场所及产物检测
上述过程可以在 中自动完成，完成以后，常采用 来鉴定PCR的产物。
模板
变性、复性和延伸
指数
PCR扩增仪（PCR仪）
琼脂糖凝胶电泳
4.通过构建 获取目的基因。
第二步：基因表达载体的构建
1. 是基因工程的核心工作。
2.基因表达载体的组成
构建基因表达载体
基因文库
3.基因表达载体的构建过程
用一定的 切割载体，使它出现一个切口；然后用 限制酶或能产生 末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段；再利用
将 拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子。
限制酶
相同
DNA连接酶
目的基因片段
同种
第三步：将目的基因导入受体细胞
1.受体细胞为植物细胞
（1）花粉管通道法
将目的基因导入受体细胞有多种操作方式。例如，可以用微量注射器将含 的DNA溶液直接注入 中；可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助 通道进入 。
目的基因
子房
花粉管
胚囊
（2）农杆菌转化法
①转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
②转化对象：双子叶植物和祼子植物
③特点：农杆菌细胞内的Ti质粒上的 可携带目的基因整合到受体细胞的 DNA上。
T DNA
染色体
④过程：
农杆菌转化法示意图
2.受体细胞为动物细胞
（1）常用方法： 技术。
（2）常用受体细胞： 。
3.受体细胞为原核细胞
（1）用 处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
（2）受体细胞：使用最广泛的是大肠杆菌。
显微注射
受精卵
Ca2+
第四步：目的基因的检测与鉴定
1.分子水平的检测
（1）通过 检测棉花的染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA；
（2）从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行 ，检测目的基因是否翻译成蛋白质。
2. 水平的鉴定
例如，通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定抗虫基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。
PCR等技术
抗原—抗体杂交
个体生物学
二、DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.实验原理
（1）扩增原理：PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够 的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。
自动调控温度
（2）电泳原理：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷 的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为 的紫外灯下被检测出来。
相反
300 nm
2.实验过程
（1）扩增DNA片段
①用微量移液器按照下表中的配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。
PCR反应体系的配方
10倍浓缩的扩增缓冲液 5 μL
20 mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1 μL
20 μmol/L的引物Ⅰ 2.5 μL
20 μmol/L的引物Ⅱ 2.5 μL
H2O 28~33 μL
1~5 U/μL的Taq
DNA聚合酶 1~2 U
模板DNA 5~10 μL
总体积 50 μL
注：模板DNA的用量为1 pg~1 μg。
②待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10 s，使反应液集中在管的底部。
③参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94 ℃，5 min — —
30次 94 ℃， 30 s 55 ℃， 30 s 72 ℃， 1 min
最后1次 94 ℃， 1 min 55 ℃， 30 s 72 ℃， 1 min
（2）扩增DNA片段的电泳
①根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为0.8%~1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖 。稍冷却后，加入适量的 染料混匀。
②将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
③待凝胶溶液完全凝固后，小心拔出梳子，取出凝胶放入 内。
④将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1 mm为宜。
熔化
核酸
电泳槽
⑤将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
⑥接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1~5 V/cm。待指示剂前沿迁移接近 时，停止电泳。
⑦取出凝胶置于 下观察和照相。
凝胶边缘
紫外灯
1.判正误（对的画“√”，错的画“×”）
（1）基因工程操作的核心步骤是目的基因的获取。 （ ）
（2）启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用。 （ ）
（3）转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测才能达到目的。 （ ）
（4）将重组表达载体导入动物受精卵常用显微注射法。 （ ）
×
×
×
√
（5）农杆菌感染植物的机理：Ti质粒上的T DNA可转移到植物受伤细胞内，并且与其染色体DNA整合在一起。 （ ）
（6）从大肠杆菌细胞中获得人胰岛素基因的mRNA，说明目的基因完成了表达。 （ ）
√
×
2.微思考
（1）PCR过程中需要解旋酶吗？所需要的DNA聚合酶应具有什么特点？
提示　PCR过程中，DNA双链解开是在高温下完成的，不需要解旋酶；由于PCR过程温度较高，所以需要能耐高温的DNA聚合酶。
（2）基因工程的四个步骤都涉及碱基互补配对吗？
提示　第三步将目的基因导入受体细胞，没有涉及碱基互补配对。
任务驱动一　利用PCR获取和扩增目的基因
聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，下图为PCR扩增中第一轮的变化，结合所学知识回答下列问题：
1.PCR的原理是什么？
提示　DNA半保留复制。
2.PCR过程中设计引物时引物碱基间能否互补？
提示　引物需要分别与模板DNA分子的每一条单链互补，引物间不能互补配对。
3.PCR过程中若模板DNA分子中G、C碱基对含量较多，则变性时间会怎样变化？
提示　若模板DNA分子中G、C碱基对含量较多，则DNA分子中的氢键增多，破裂氢键需要的能量增多，变性时间会延长。
4.引物是单链还是双链？其基本单位是什么？
提示　单链。基本单位是脱氧核苷酸或核糖核苷酸。
5.一轮PCR有哪些过程？
提示　变性、复性、延伸三个步骤。
1.PCR的过程
温度控制 目的
循环 变性 90~95 ℃ 使双链DNA解聚为单链
复性 50 ℃左右 两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
延伸 70~75 ℃ 在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
2.PCR扩增的计算：理论上DNA呈指数扩增
（1）若开始只有一个DNA 提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为2n个。
（2）若开始有N0个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为N0·2n个。
3.PCR技术与DNA复制的比较
PCR技术 DNA复制
区别 解旋方式 DNA在高温作用下变性解旋 解旋酶催化
场所 细胞外（主要在PCR扩增仪内） 细胞内（主要在细胞核内）
酶 耐热的DNA聚合酶 DNA解旋酶、普通的DNA聚合酶等
温度条件 需控制温度，在较高温度下进行 细胞内的温度条件
合成的对象 DNA片段或基因 DNA分子
联系 ①模板：均需要脱氧核苷酸链作为模板进行物质合成；
②原料：均为四种脱氧核苷酸；
③酶：均需要DNA聚合酶进行催化；
④引物：均需要引物，使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
下列关于PCR过程的叙述，正确的是 （　　）
A.在高温条件下，DNA的磷酸二酯键断裂形成2条DNA单链
B.解旋后，2条单链上和引物结合的部分的碱基序列相同
C.在DNA聚合酶的作用下，2条单链和各自的子链螺旋形成2个新的DNA
D.通过控制PCR仪的温度，可重复循环多次PCR，使DNA数量成指数形式增长
D
解析
在高温条件下，DNA之间的氢键断裂形成2条DNA单链，A错误；解旋后，2条单链上和引物结合的部分的碱基序列不同，因为PCR技术中需要两种引物，B错误； 在耐高温的DNA聚合酶的作用下，以2条单链分别为模板在引物的3'端延伸形成各自的子链，C错误； PCR技术中一次循环需要的步骤为高温变性、低温复性、中温延伸，可见通过控制PCR仪的温度，可重复循环多次PCR，使DNA数量呈指数形式增长，D正确。
［举一反三］
1.（生命观念）PCR的原理、前提分别是什么？
提示　原理：DNA双链复制的原理。前提：有一段已知的目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。
2.（科学思维）PCR的复性中引物是不是一定与DNA模板结合？
提示　复性不一定均为引物与DNA模板结合。复性时，引物与DNA模板的结合是随机的，也存在DNA解开的两条链的结合。
1.下图表示PCR技术的操作过程，有关说法中不正确的是 （　　）
A.PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术
B.PCR技术的原理是DNA双链复制
C.利用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知的目的基因的核苷酸序列
D.PCR扩增中必须有解旋酶才能解开双链DNA
D
解析
PCR是在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，A正确；PCR技术的原理是DNA双链复制，B正确；要有一段已知的目的基因的核苷酸序列作为模板进行DNA复制，C正确；PCR扩增中，目的基因受热变性后解旋为单链，不需要解旋酶，D错误。
2.（2021·全国甲卷）PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题：
（1）若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是　　　　　（用数字序号表示）。
（2）操作③中使用的酶是　　　　　　　。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、　　　　三步，其中复性的结果是　　　　　　　 　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　。
（3）为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与　 　　　　　　　特异性结合。
（4）PCR（多聚酶链式反应）技术是指
　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
答案　（1）④②③①　（2）TaqDNA聚合酶　延伸　TaqDNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成　（3）两条单链DNA　（4）一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术
解析
（1）PCR技术可用于临床的病原菌检测，若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是④采集病人组织样本→②从病人组织样本中提取DNA→③利用PCR扩增DNA片段→①分析PCR扩增结果。在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似，操作③中使用的酶是TaqDNA聚合酶。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、延伸三步，其中复性的结果是TaqDNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成。
解析
（3）DNA复制需要引物，为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与两条单链DNA特异性结合。
（4）据分析可知，PCR（多聚酶链式反应）技术是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
任务驱动二　基因表达载体的构建
分析基因表达载体模式图，回答下面问题。
1.基因工程的核心是什么？
提示　基因工程的核心是基因表达载体的构建。
2.构建基因表达载体的目的是什么？
提示　使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
3.基因表达载体的组成有哪几部分？
提示　目的基因、启动子、终止子、标记基因等。
4.标记基因的作用是什么？常用什么基因来作标记基因？
提示　标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
常用的标记基因为抗生素抗性基因，如氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因。
5.构建基因表达载体时，目的基因应在哪个位置？为什么？
提示　由图知，目的基因要插入启动子和终止子之间。这是因为启动子使转录开始，是RNA聚合酶识别和结合的部位；终止子位于基因的尾端，使转录终止；只有顺序正确，目的基因才能正常转录。
6.为什么不能将目的基因插入载体的标记基因中？
提示　标记基因用于鉴定受体细胞是否成功导入目的基因，以便将含目的基因的细胞筛选出来。若有目的基因插入，则标记基因被破坏，无法进一步筛选。
1.基因表达载体的构建步骤
目的基因与载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。其过程大体为：用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。用同一种限制酶切割目的基因，使其产生相同的黏性末端。将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，就形成了一个重组DNA分子（重组质粒）（如图）。
（1）目的基因是指编码蛋白质的基因，其中不含启动子，若只将目的基因导入受体细胞中将无法进行转录。
（2）目的基因的表达需要调控序列，因而在用作载体的质粒上插入基因的部位之前需要有启动子，之后需要有终止子。
（3）鉴别目的基因是否导入受体细胞中需要有筛选标记——标记基因。因此，一个基因表达载体的组成应该包括：启动子、终止子、目的基因、标记基因等。
2.启动子、终止子与起始密码子、终止密码子的区别
位置 作用
启动子 位于DNA分子上 RNA聚合酶识别结合位点，启动转录过程
起始密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的开始
终止子 位于DNA分子上 决定转录的结束
终止密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的结束
［特别提醒］　（1）由于受体细胞有动物细胞、植物细胞、微生物细胞之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，所以基因表达载体在构建上也会有所差别，不可能是千篇一律的。
（2）基因表达载体的构建过程中，最好用同种限制酶切割目的基因和载体，以获得相同的黏性末端，便于两者进行连接。但有时可用两种限制酶分别切割载体和目的基因，这样可避免载体与载体之间、目的基因与目的基因之间的自身连接，还可以确保目的基因和载体的正向连接。
下列有关基因表达载体构建的说法，错误的是 （　　）
A.基因表达载体的构建是实施基因工程的核心
B.构建基因表达载体是为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，可以遗传给下一代，并且使目的基因能够表达和发挥作用
C.启动子存在于基因的编码区，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动转录
D.标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因
C
解析
基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。构建基因表达载体是为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。启动子存在于基因的非编码区，是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录，最终翻译出蛋白质。载体上标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因。
［举一反三］
1.（生命观念）（1）启动子的位置和作用是什么？
提示　启动子位于基因的首段，是一段有特殊结构的DNA片段；它是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。
（2）终止子的位置和作用是什么？
提示　终止子位于基因的尾端，它也是一段有特殊结构的DNA短片段，作用是使转录在所需要的地方停止下来。
2.（科学思维）构建基因表达载体时切割目的基因和载体是不是只能用同一种限制酶？
提示　切割目的基因和载体并非只能用同一种限制酶。如果两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。
1.如图为某质粒限制酶酶切图谱。某基因不含图中限制酶识别序列。为使PCR扩增的该基因重组进该质粒，则扩增的该基因两端需分别引入的限制酶的识别序列是 （　　）
A.NdeⅠ和BamHⅠ
B.NdeⅠ和XbaⅠ
C.XbaⅠ和BamHⅠ
D.EcoRⅠ和KpnⅠ
A
解析
根据启动子和终止子的生理作用可知，目的基因应导入启动子和终止子之间。从图中看出，两者之间存在三种限制酶切点，但是由于XbaⅠ在质粒上不止一个酶切位点，因此为使PCR扩增的该基因重组进该质粒，扩增的该基因两端需分别引入NdeⅠ和BamHⅠ两种不同限制酶的识别序列。
2.为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C（图1），拟将其与质粒（图2）重组，再借助农杆菌导入菊花中。
下列操作与实验目的不符的是 （　　）
A.用限制性内切核酸酶EcoRⅠ和DNA连接酶构建重组质粒
B.用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞
C.在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞
D.用PCR等技术检测基因C是否被整合到菊花染色体上
C
解析
根据目的基因两侧的限制酶切割位点可知，用限制性内切核酸酶EcoRⅠ和DNA连接酶构建重组质粒，A正确；将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法，即用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞，B正确；图2中显示标记基因是潮霉素抗性基因，因此可在培养基中添加潮霉素，筛选被转化的菊花细胞，C错误；检测基因C是否被整合到菊花染色体上可用PCR等技术，D正确。
任务驱动三　将目的基因导入受体细胞
转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。将目的基因导入受体细胞是实现转化的必要环节。请回答下列问题：
1.将目的基因导入植物细胞的方法主要有哪两种？其中最常用的是哪种？我国科学家独创的方法是哪种？
提示　农杆菌转化法、花粉管通道法。农杆菌转化法最常用。我国科学家独创的方法是花粉管通道法。
2.农杆菌Ti质粒有何特点？
提示　农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
3.基因工程常用原核生物作为受体细胞的原因是什么？其中哪种生物用得最为广泛？
提示　原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。大肠杆菌应用得最为广泛。
1.常用的转化方法
受体细
胞类型 方法 说明 特点
植物
细胞 农杆
菌转
化法 将目的基因插入农杆菌Ti质粒的T DNA上→转入农杆菌→用农杆菌侵染植物细胞→将目的基因整合到植物细胞的染色体DNA上→目的基因表达 经济、有效，适用于双子叶植物和裸子植物，尤其适用于双子叶植物
受体细
胞类型 方法 说明 特点
植物
细胞 花粉管通
道法 在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头→滴加DNA溶液（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞→目的基因表达 简便、经济，我国科学家独创的一种方法　　
受体细
胞类型 方法 说明 特点
动物
细胞 显微注射
技术 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→含目的基因的受精卵 将目的基因导入动物细胞最为有效的方法
微生物
细胞 Ca2+处理
法（感受态
细胞法） 用Ca2+处理微生物细胞→感受态细胞→感受态细胞吸收DNA分子 简便、经济、有效
2.农杆菌转化法分析
（1）构建基因表达载体需要两种工具酶：限制酶和DNA连接酶。
（2）基因表达载体（重组质粒）导入农杆菌细胞时，要用Ca2+处理农杆菌细胞，使其处于感受态，有利于重组质粒的导入。
（3）由导入目的基因的受体细胞培育到完整的植株要用到植物组织培养技术。
［特别提醒］　
（1）将目的基因导入植物细胞培育转基因植物时，受体细胞可以是体细胞或受精卵，因为植物体细胞具有全能性。
（2）将目的基因导入动物细胞培育转基因动物时，受体细胞是受精卵，不能用体细胞，因为高度分化的动物体细胞的全能性受到限制。
下列关于目的基因导入受体细胞的描述，不正确的是 （　　）
A.微生物常作为受体细胞是因为其体积小，营养价值高
B.显微注射技术是培育转基因动物时常用的方法
C.大肠杆菌细胞最常用的转化方法：Ca2+处理细胞，使细胞的生理状态发生改变
D.农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法
A
解析
微生物常作为受体细胞是因为有繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等优点，A错误；显微注射技术是将目的基因导入动物细胞最有效的方法，B正确；Ca2+处理法能使大肠杆菌细胞的生理状态发生改变，使之成为易于吸收周围环境中DNA分子的感受态，C正确；在自然条件下，农杆菌感染双子叶植物和裸子植物，因此农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法，但不能用于大多数单子叶植物，D正确。
［举一反三］
1.（生命观念）利用农杆菌转化法将目的基因导入植物叶片，再培养长成植物，这一过程利用了植物细胞工程的哪种技术？其原理是什么？
提示　植物组织培养技术；其原理为植物细胞的全能性。
2.（科学思维）目的基因整合到受体细胞染色体上后能否稳定遗传？
提示　受体细胞中的同源染色体中有一条含有目的基因，不能视为纯合子，故不一定能稳定遗传，还需经多代纯化，筛选出同源染色体中每一条染色体上都含目的基因的个体。
1.农杆菌能感染双子叶植物而通常不感染单子叶植物，是因为受伤的双子叶植物能分泌某些酚类物质诱导Ti质粒中的Vir基因区段表达，该表达产物能诱导Ti质粒产生一条新的T DNA单链分子。此单链分子可进入植物细胞并整合到染色体上。下列相关叙述错误的是 （　　 ）
A.可以通过在伤口施加相关酚类物质而使单子叶植物也成为农杆菌易感植物
B.农杆菌感染宿主细胞的原理与肺炎链球菌转化实验的原理类似
D
C.使用农杆菌转化法时，目的基因应插入Ti质粒的T DNA中
D.合成新的T DNA单链需要的DNA连接酶与限制酶，均在宿主细胞内合成
解析
农杆菌易感染双子叶植物和裸子植物，对单子叶植物没有感染力，原因是多数单子叶植物细胞不能合成酚类化合物，可以通过在伤口施加相关酚类物质而使单子叶植物也成为农杆菌易感植物，A正确；农杆菌感染宿主细胞是把它的T DNA，通过转化作用，整合到植物细胞染色体的DNA上，其原理与肺炎链球菌转化实验的原理类似，都是基因重组，B正确；使用农杆菌转化法时，T DNA可将插入其中的目的基因转移到植物细胞中，并能整合到染色体DNA上，C正确；Ti质粒中的Vir
解析
基因区段在宿主细胞内的表达产物能诱导Ti质粒产生一条新的T DNA单链分子，而合成新的T DNA单链不需要限制酶，需要DNA聚合酶、DNA连接酶等，因为限制酶的作用是识别DNA中的碱基序列，并在特定位点切割DNA分子，D错误。
2.如图表示培育转基因抗植物病毒番茄的过程示意图。下列叙述正确的是 （　　）
A.过程A需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶的参与
B.过程B通常需要用CaCl2处理，以提高番茄细胞壁的通透性
C.过程C需要采用植物组织培养技术
D.抗植物病毒基因一旦整合到番茄细胞的染色体上，就能正常表达
C
解析
图中过程A为构建基因表达载体，需要用到限制酶和DNA连接酶，而不需要DNA聚合酶，A错误；CaCl2处理只能提高农杆菌细胞的细胞壁的通透性，B错误；过程C为由一个植物细胞得到一个完整植株的过程，一般要采用植物组织培养技术，C正确；抗植物病毒基因整合到番茄细胞的染色体上，不一定能表达，D错误。
知识网络构建
关键知识积累
1.基因工程的基本操作程序有：（1）目的基因的筛选与获取；（2）基因表达载体的构建；（3）将目的基因导入受体细胞；（4）目的基因的检测与鉴定。核心是基因表达载体的构建。
2.基因表达载体由目的基因、启动子、终止子和标记基因等组成。
3.将目的基因导入植物细胞的方法有：（1）农杆菌转化法；（2）花粉管通道法。将目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射法。
4.目的基因的检测方法有分子水平的检测和个体生物学水平的鉴定。
1.下列关于PCR技术的叙述，正确的是 （　　 ）
A.PCR技术建立在对扩增的目的基因序列完全已知的基础上
B.该技术需要解旋酶和热稳定的DNA聚合酶
C.该技术需要一对特异性的引物，要求一对引物的序列是互补的
D.该技术运用体内DNA双链复制原理，也需要模板、原料、能量、酶等条件
D
解析
PCR技术建立在对扩增的目的基因序列已知的基础上，但不需要完全已知，只要知道部分核苷酸序列即可，A错误；PCR技术是通过高温来使DNA解旋的，不需要解旋酶，B错误；该技术需要的一对引物，分别能与模板DNA的两条链的末端进行碱基配对，其序列不是互补的，C错误。
2.下图是基因工程中基因表达载体的模式图，若结构X是表达载体所必需的，则X最可能是 （　　）
A.荧光蛋白基因　　　 B.启动子
C.限制酶 D.DNA连接酶
B
解析
基因表达载体由启动子、终止子、标记基因和目的基因等组成。图中有终止子、标记基因（抗生素基因）、目的基因（插入基因）、复制原点等，还缺少启动子，且启动子位于目的基因的首端，所以X最可能是启动子。
3.将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培育耐盐碱海水稻新品种。 下图PCR扩增OsMYB56时需要添加引物，应选用的引物组合为 （　　）
A
A.5' CTTGGATGAT 3'和
5' TCTGTTGAAT 3'
B.5' CTTGGATGAT 3'和
5' TAAGTTGTCT 3'
C.5' ATTCAACAGA 3'和
5' ATCATCCAAG 3'
D.5' ATTCAACAGA 3'和
5' GAACCTACTA 3'
解析
—P端为DNA链的5'端，—OH端为DNA链的3'端，根据碱基互补配对原则，通过下链两端的碱基序列可推测上链两端的碱基序列。进行PCR时，引物与模板链的3'端结合，因此在扩增OsMYB56时需要添加的引物是5' CTTGGATGAT 3'（与上链3'端互补）和5' TCTGTTGAAT 3'（与下链3'端互补）。
4.目的基因和载体如果用同一种限制酶处理，连接时会出现正反接的情况，为鉴定筛选出的表达载体中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR后，结合电泳技术鉴定，图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，其中目的基因为长度300bp的片段。下列有关说法不正确的是 （　　）
C
A.PCR退火温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链
B.电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小、带电量和构象有关
C.选取引物甲丙，扩增出450bp长度片段时，可以说明目的基因正接
D.选取引物甲乙，扩增出400bp长度片段时，可以说明目的基因反接
解析
退火是在高温解旋后降低温度让引物与模板链结合，退火温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链，A正确；电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小、带电量和构象有关，如电泳一段时间后，较大的DNA分子迁移距离小，离加样孔近，而较小的DNA分子迁移距离大，离加样孔远，B正确；由于使用的引物是甲和丙，没有与基因相应位置配对，因此不管基因正接还是反接，均为450bp，C错误；选取引物甲乙，扩增出400bp长度片段时，可以说明目的基因反接，若正接的话，扩增出来的长度应该是100bp，D正确。
5.（2024·浙江1月高考）锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn2+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，并进行细胞学鉴定。回答下列问题：
（1）锌转运蛋白基因M、N克隆。以该植物　　　　　为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。根据序列信息设计引物进行PCR扩增，PCR每个循环第一步是进行热变性处理，该处理的效果类似于生物体内
　　　　　的作用效果。PCR产物琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子因为含　　　　　而带负电荷，凝胶点样孔端应靠近电泳槽负极接口；当2
个PCR产物分子量接近时，若延长电泳时间，凝胶中这2个条带之间的距离会　　　。回收DNA片段，连接至克隆载体，转化大肠杆菌，测序验证。
（2）重组表达载体构建。分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理，然后利用　　　　　　　连接，将得到的重组表达载体转化大肠杆菌。用PCR快速验证重组转化是否成功。此反应可以用大肠杆菌悬液作为模板的原因是　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 。
（3）酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，直接在固体培养基进行　　　　　　　培养，活化后接种至液体培养基，采用　　　　　　以扩大菌体数量，用重组表达载体转化酵母菌。检测M、N基因在受体细胞中的表达水平，结果无显著差异。
（4）转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6。将菌液用　　　　法逐级稀释至OD600为0.06、0.006和0.0006，然后各取10 μL菌液用涂布器均匀涂布在固体培养基上，培养2天，菌落生长如图。该实验中阴性对照为　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
由实验结果可初步推测：转运蛋白M和N中，转运Zn2+能力更强的是　　　，依据是　　　　。
注：OD600为波长600nm下的吸光值，该值越大，菌液浓度越高；空载体为未插入M或N基因的表达载体。
答案　（1）根　解旋酶　磷酸基团　变长（2）DNA连接酶　热变性使大肠杆菌内的DNA外溢　（3）平板划线分离　振荡培养　（4）梯度稀释　锌吸收缺陷型酵母+空载体　N　转入N基因的这组酵母菌数量较多
解析
（1）由题意可知，锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，所以以该植物的根为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。热变性处理的目的是使DNA解螺旋，相当于生物体内解旋酶的效果。DNA分子因为含有磷酸基团而带负电荷，所以其点样孔端应靠近电泳槽负极接口。随着时间的推移，不同分子量的DNA分子速度不同，时间越长，距离差越大。
解析
（2）内切酶处理后的质粒和目的基因，用DNA连接酶进行连接。由于RCR过程中热变性使大肠杆菌内的DNA外溢，所以可用大肠杆菌悬液当模板，利用PCR快速验证重组转化是否成功。
（3）冻存酵母菌可直接在固体培养基上涂布或平板划线接种后进行培养，进行活化，然后转至液体培养基增殖，培养过程中进行振荡，有利于增加培养液的溶氧量和使酵母菌与培养液充分接触，从而快速增殖。
解析
（4）由题意可知，菌液稀释后OD600为0.06、0.006和0.0006，说明其进行10指数的梯度稀释。由图可知，锌吸收缺陷型酵母+空载体组不会吸收锌，为阴性对照。由图中光谱吸收值可知，转入N基因的这组酵母菌数量较多，说明N转运Zn2+能力更强。

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