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实验03 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
人教版2019选择性必修3
土壤是微生物的天然“大本营”，其中生活着种类繁多、数量庞大的微生物，它们参与土壤物质循环、推动养分转化，维系着土壤生态系统的稳定。尿素作为一种重要的氮肥，需在分解尿素细菌的作用下分解为氨才能被植物吸收利用，这类细菌的数量与活性直接影响土壤肥力。而土壤中微生物混杂共存，难以直接分离观察，本实验将借助选择培养基的筛选作用，分离出能分解尿素的细菌，并通过科学计数方法测定其数量。让我们通过规范的无菌操作、接种分离与计数实验，探寻土壤中分解尿素细菌的分布规律，掌握微生物分离与计数的核心技能，解锁土壤微生物与农业生产的关联奥秘，开启探究土壤微观生命的实验之旅。
一、生命观念
通过实验分离与计数土壤中分解尿素的细菌，理解微生物与环境的相互关系，建立“微生物代谢与环境适应”的生命观念，认同微生物在物质循环中的重要作用。
二、科学思维
运用观察、对比、推理、归纳等科学方法，分析选择培养基的筛选原理，解读菌落形态和数量变化的意义，推理分解尿素细菌的代谢特征，形成基于实验证据的逻辑推理能力和误差分析意识。
三、科学探究
通过设计和实施土壤中分解尿素细菌的分离与计数实验，掌握微生物分离、接种、计数的基本方法，提升实验设计、操作实施、现象描述与数据（菌落数量）分析能力，理解实验设计的对照原则、单一变量原则和平行重复原则。
四、社会责任
结合实验原理，联系土壤微生物在生态系统中的作用，认识微生物在农业生产、环境治理中的应用价值，树立“合理利用微生物资源、保护生态环境”的责任意识，理解科学实验对生产实践的指导价值。
提出问题
基础知识
实验设计
实验过程
得出结论，交流讨论
1.提出问题
（1）如何从土壤中分离出能够分解尿素的细菌；
（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。
2.基础知识
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成_____的微生物才能分解尿素，利用___________________的_____培养基，可以从土壤中分离出_________的细菌。
脲酶
以尿素作为唯一氮源
选择
分解尿素
CO(NH2)2+H2O
脲酶
2NH3+CO2
组分 含量
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
H2O 定容至1000mL
请你根据前面学过的微生物的选择培养、数量测定的知识以及下面的资料，思考有关问题，然后进行实验设计，并写出详细的实验方案。
【资料一】土壤取样
细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数分布在距地表3 8 cm的土壤层。因此，取样时一般要铲去表层土。在城市，常见的是公园里、街道旁、花盆中的土壤；在农村，则容易收集到农田或菜园里的土壤。你打算选择什么样的土壤做实验呢？
3.实验设计
【资料二】样品的稀释
测定土壤中细菌的数量，一般选用1×104、1×105和1×106倍稀释的稀释液进行平板培养。测定土壤中细菌的总量和能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？如果不同，你打算选用多大的稀释范围？
当你第一次做这个实验的时候，可以将稀释的范围放宽一点。例如，可以将1×103 1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数为30 300的平板进行计数。
3.实验设计
请你根据前面学过的微生物的选择培养、数量测定的知识以及下面的资料，思考有关问题，然后进行实验设计，并写出详细的实验方案。
请你根据前面学过的微生物的选择培养、数量测定的知识以及下面的资料，思考有关问题，然后进行实验设计，并写出详细的实验方案。
【资料三】微生物的培养与观察
不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30 37 ℃的温度下培养1 2 d。本实验中，我们可以每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征。请仔细观察你所分离到的菌落，最好以表格的形式将不同菌落的特征（如形状、大小和颜色等）记录下来。
3.实验设计
（1）土壤取样
①取样地点要求
细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长。
②取样过程
铲去表层土（一般3cm左右）。细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。
③注意事项
取土样时用的铁铲和取样袋在
使用前都需要灭菌。操作完成后一定要洗手。
4.实验步骤
（2）制备培养基
①选择培养基：
以尿素为唯一氮源。
组分 含量
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000ml
②牛肉膏蛋白胨培养基：
作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用。
③KH2PO4和Na2HPO4的作用是
提供无机盐；
调节pH。
4.实验步骤
（3）样品的稀释与涂布平板
测细菌时，一般选用1×104、1×105、×106倍稀释的稀释液进行平板培养。在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，应选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。
①每个浓度至少设置4个平板，1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复），4为牛肉膏蛋白胨培养基
（用以判断选择培养基是否具有选择作用）。
②如何验证培养基中是否含有杂菌？
设置2个平板作为对照：
不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基。
4.实验步骤
①培养条件：
不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。
（细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d）
②观察：
每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。（一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等）
（4）微生物的培养与观察
4.实验步骤
1.将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
2.要按照前面学习过的无菌操作的方法，进行规范操作。取土样时用的铁铲和取样纸袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
3.本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
4.本实验耗时较长，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。
1.结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落
如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。
如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。
2.你是否获得了某一稀释度下菌落数为30-300的平板？在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近？
如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。
3.你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学统计的结果接近吗？如果差异很大,可能是什么原因引起的？
两组的土壤不同；某一组被杂菌污染等；
4.秋水仙素与低温都能诱导染色体数目加倍，这两种方法在原理上有什么相似之处？
作用于正在分裂的细胞时，能够抑制纺锤体的形成，导致染色体不能移向细胞的两极，从而引起细胞内染色体数目加倍。染色体
数目加倍的细胞继续进行有丝分裂，就可能发育成多倍体植株。
本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌,对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。你可以查阅相关资料,进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种。
CO(NH2)2+H2O
脲酶
2NH3+CO2
方法：在培养基中加入酚红指示剂
呈碱性，遇酚红指示剂呈 红 色。
——鉴别培养基
①液体培养基可以直接看液体的变色情况；
②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带。
一、实验核心基础
1.熟练掌握了微生物实验的核心操作技术，包括培养基的精准配制与高压蒸汽灭菌流程，能严格把控培养基pH、成分比例及灭菌条件（121℃、101kPa、20分钟），确保实验无菌环境基础；规范完成了土壤样品的梯度稀释操作，掌握了从10 到10 倍稀释的分步操作要点，能避免交叉污染和稀释倍数偏差。
2.精通稀释涂布平板法的接种技巧，学会了无菌移液管的规范使用、菌液的均匀涂布方法，能准确控制接种量（0.1mL/皿），确保菌落均匀分布；掌握了菌落的观察、鉴别与计数方法，能根据菌落形态（圆形、表面光滑等）和酚红指示剂显色（红色区域）筛选目标细菌，精准统计30~300个/皿的有效菌落数。
二、实验原理深度理解
1.明确了分解尿素细菌的代谢本质：这类细菌能产生脲酶，将尿素分解为氨和二氧化碳，氨使培养基pH升高，酚红指示剂变红，这一特性是鉴别目标细菌的关键依据；深入理解了选择培养基的筛选原理——以尿素为唯一氮源，可特异性抑制不能产生脲酶的杂菌生长，仅保留分解尿素的细菌，实现目标菌的高效分离。
2.掌握了微生物计数的核心逻辑：稀释涂布平板法通过梯度稀释降低菌液浓度，使单个细菌在培养基上形成独立菌落，通过统计菌落数和换算稀释倍数，可计算出每克土壤中目标细菌的密度，理解了“菌落形成单位（CFU）”的实际意义，明确了平行重复实验（每组3个重复）和选择30~300个菌落的培养皿计数的误差控制原理。
三、科学素养与思维提升
1.强化了实验设计的科学原则意识，能清晰区分空白对照（检测培养基灭菌效果）和条件对照（验证选择培养基筛选作用）的目的，理解了单一变量原则（仅氮源种类不同）在实验中的应用，培养了严谨的实验设计思维。
2.提升了实验异常分析能力，能针对“空白组出现菌落”“选择培养基菌落过多/过少”“菌落无红色区域”等异常现象，排查灭菌不彻底、稀释倍数不当、无菌操作不规范等原因，形成了基于实验现象反向推导问题的逻辑思维。
3.深化了理论与实践的关联思维，明确了实验原理在农业生产中的应用价值——分解尿素的细菌可将土壤中难以利用的尿素转化为植物可吸收的氨，为微生物肥料的研发和合理利用提供了实验依据，理解了微生物在土壤物质循环中的重要作用。
四、实验态度与责任意识培养
1.养成了严谨的无菌操作习惯，深刻认识到无菌环境是微生物实验成功的核心，从实验器具灭菌、超净工作台使用到接种操作的每一个环节，都做到规范严谨，避免杂菌污染，培养了科学实验的敬畏之心。
2.树立了合理利用微生物资源的责任意识，通过实验了解到土壤微生物的多样性和应用潜力，认识到滥用化肥可能导致土壤微生物群落失衡，进而理解了科学利用微生物改善土壤肥力、减少化肥使用的环保意义，强化了生态保护的社会责任。当前文件内容过长，豆包只阅读了前 0%。
1.平板接种常用在微生物培养中。下列说法正确的是（ ）
A．不含氮源的平板不能用于微生物培养
B．平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒
C．接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃
D．利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物
D
2．下列是某同学分离高产脲酶菌的实验设计，不合理的是（ ）
A．选择农田或公园土壤作为样品分离目的菌株
B．在选择培养基中需添加尿素作为唯一氮源
C．适当稀释样品是为了在平板上形成单菌落
D．可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌
D
3.幽门螺杆菌(含有脲酶)感染是急慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因素。在患者体内采集样本并制成菌液后，进行分离培养。下列有关叙述正确的是（ ）
A．分离纯化幽门螺杆菌时应使用以尿素为唯一氮源、pH为中性的培养基
B．进行幽门螺杆菌培养需要提供95%空气和5%CO2的气体环境
C．可采用稀释涂布平板法对幽门螺杆菌进行分离和计数
D．鉴别幽门螺杆菌时应在培养基中加入酚红指示剂
ACD
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