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实验05 DNA的粗提取与鉴定
人教版2019选择性必修3
DNA作为遗传信息的载体，隐藏着生物遗传的核心密码，而从生物材料中粗提取并鉴定DNA，是开启分子生物学探究的基础步骤，也是高中生物选择性必修3分子生物学模块的核心实验之一。生物组织中DNA与蛋白质、脂质等物质混杂存在，难以直接分离观察，本实验将利用DNA与其他物质在溶解性、耐受性上的差异，通过破碎细胞、去除杂质、沉淀DNA等关键操作，从生物材料中提取出较纯净的DNA，再借助特定试剂的显色反应对其进行鉴定。让我们亲手操作，感受从细胞中“捕获”遗传物质的奇妙过程，理解DNA的理化特性，掌握分子生物学基础实验技能，开启探索遗传物质本质的实验之旅。
一、生命观念
通过实验探究DNA的粗提取与鉴定方法，理解核酸作为遗传物质的化学本质，建立“核酸是细胞内携带遗传信息的物质，其结构与功能相适应”的生命观念，认同DNA的存在形式与细胞结构的关联。
二、科学思维
运用观察、对比、推理、归纳等科学方法，分析DNA粗提取的原理（溶解度差异等），解读实验现象与DNA提取效果的关系，推理实验操作对实验结果的影响，形成基于实验证据的逻辑推理能力和误差分析意识。
类”的责任意识，培养严谨的科学态度。
三、科学探究
通过设计和实施DNA粗提取与鉴定实验，掌握DNA粗提取的基本操作（破碎细胞、过滤、析出、洗涤、鉴定），提升实验设计、操作实施、现象描述与结果分析能力，理解实验设计的单一变量原则、对照原则。
四、社会责任
结合实验原理，联系DNA提取技术在医学、刑侦、生物技术等领域的应用价值，认识核酸技术对人类生产生活、科学研究的重要意义，树立“科学利用生物技术服务人类”的责任意识，培养严谨的科学态度。
提出问题
基础知识
实验设计
实验过程
得出结论，交流讨论
实验原理
2.DNA不溶于酒精，但是细胞中的某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA和蛋白质。
1.DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。
3.在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可作为鉴定DNA的试剂。
（提取原理）
（提取原理）
（鉴定原理）
DNA
+
二苯胺
沸水浴
蓝色
目的要求
（1）了解DNA的物理和化学性质，理解DNA粗提取和鉴定的原理。
（2）学会DNA粗提取的方法以及用二苯胺试剂对DNA进行鉴定。
材料用具
①材料：
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。研磨液、体积分数为95％的酒精、2 mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等。
能否选用牛、羊、马、猪等哺乳动物成熟的红细胞做实验材料？
不能，
哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核和线粒体，几乎不含DNA。
能否选用鸡血细胞做实验材料？
能，鸡是鸟类动物，需加入3 g柠檬酸钠（抗凝剂），防止血液凝固
②用具：
烧杯、量筒、玻璃棒、研钵、纱布、漏斗、试管、试管架、试管夹、酒精灯、石棉网、三脚架、火柴、刀片和天平等。
利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁,可直接吸水涨破(省去研磨步骤)，释放DNA。
材料用具
③试剂：
a.研磨液:
含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl
研磨液
试剂 中文名称 作用
Tris 三羟甲基氨基甲烷 维持缓冲液pH值，稳定DNA：提供缓冲体系，DNA在这个缓冲体系中呈稳定状态
EDTA 乙二胺四乙酸 抑制DNA水解酶，防止DNA被水解，是一种DNA酶的抑制剂，可防止细胞破碎后DNA酶降解DNA，从而保护DNA
SDS 十二烷基硫酸钠 使蛋白质变性，与DNA发生分离，家用洗洁精含有SDS：洗衣粉含有蛋白酶和表面活性剂，可裂解细胞膜、使蛋白质变性。
Hcl 盐酸，浓度：2mol/l 将溶液调节pH至8
材料用具
b.体积分数为95%的酒精：
析出DNA
c.2mol/L 的NaCl溶液：
溶解DNA
d.二苯胺试剂：
鉴定DNA
二苯胺试剂要现配现用，用棕色瓶保存。
③试剂：
材料用具
实验步骤
取材、研磨
过滤
分离
鉴定
结果观察
实验步骤
1.取材、研磨
称取30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL 研磨液，充分研磨
①研磨的目的？
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中。
实验步骤
2.过滤或离心取上清液
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。
也可直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。
①上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？
可能含有核蛋白、多糖等杂质
②低温放置几分钟的作用？
可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解
实验步骤
3.预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；
或将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。
实验步骤
3.预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA
①搅拌时应轻缓、并沿一个方向？
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子
②酒精预冷的作用？
同“低温放置的作用”
实验步骤
4.NaCl溶液溶解DNA并鉴定
取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
实验组
对照组
水浴加热
溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量的多少有关。
实验步骤
DNA鉴定的结果
析出DNA
DNA的鉴定
研磨
称取约30g洋葱切碎，放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。
过滤取上清液
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500 r / min 的转速下离心5 min ，再取上清液放入烧杯中。
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分。或者将溶液倒入塑料离心管中，在10000 r / min 的转速下离心5 min ，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA ）晾干。
取两支试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。
步骤 原理或目的
充分研磨 使细胞破碎，DNA溶解于研磨液中
过滤 （或离心） 除去细胞膜等不溶杂质，得到与蛋白质等杂质结合在一起的溶解于滤液（或上清液）的DNA
搅拌（或离心）析出DNA 加入预冷的酒精溶液，蛋白质溶于酒精，DNA不溶于酒精，将DNA和蛋白质等杂质分离
溶解 用2 mol/L的NaCl溶液溶解DNA
鉴定DNA 二苯胺试剂现配现用，水浴加热，溶液变蓝色则证明有DNA存在
思考：
1.鸟类和哺乳动物的红细胞都适合用来提取DNA吗？请说明理由。
2.实验过程要充分地搅拌和研磨，如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？
哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核，不适合作材料提取DNA。
研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，导致看不到丝状物或沉淀物，用二苯胺鉴定不显示蓝色。
3.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
4.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？
5.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。
本实验可以采取分组的方式进行。可以选取不同的实验材料；也可以查阅资料了解其他提取DNA的方法，对同种材料采用不同的方法。最后从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺试剂显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。
本实验只是对DNA进行了粗提取，请查阅资料，了解实验室提取纯度较高的DNA的一种方法，并与本实验中所使用的方法进行比较，总结两种方法的异同。
实验室提取纯度较高的DNA的方法有不少。例如，可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿—异丙醇混合液(体积比为24：1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。此外由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。
①方法一
用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质,用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。
②方法二
可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开,随后加入氯仿—异丙醇混合液(体积比为24:1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液,可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。
③方法三
由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。
1.如图为鸡血细胞中DNA的粗提取和鉴定实验过程中的部分操作示意图，请据图分析，回答下列问题：
(1)右述图示中，该实验的正确操作顺序是__________________________
(用序号与箭头表示)。
(2)步骤④中使用2 mol/L NaCl溶液的目的是 。
③→②→①→④→⑤
溶解DNA
(3)步骤①的目的是 ，
其依据的原理是 。
析出并获得DNA
DNA不溶于酒精
(4)步骤①中所得到的丝状物为 色，若要鉴定其主要成分为DNA，可滴加 _______试剂， 后，如果出现 则证明该丝状物的主要成分为DNA。
白
二苯胺
沸水浴加热
蓝色
(5)由于鸡血较难找到，某学生试图用猪血代替，结果没有成功，其原因最可能是____________________________________________________。
猪是哺乳动物，哺乳动物血液中成熟的红细胞没有细胞核
2.关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是(　　)
A．整个提取过程中可以不使用离心机
B．研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中
C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
A
3.下列有关“DNA的粗提取和鉴定”实验的叙述，错误的是(　　)
A．制备鸡血细胞液时，可加入适量的柠檬酸钠溶液，防止血液凝固
B．鸡血细胞放入蒸馏水中处理的目的是使其吸水涨破，释放DNA
C．利用DNA在0.14 mol/L的氯化钠溶液中溶解度最小的特点，可将DNA与部分杂质分开
D．提纯后，将DNA溶于95%的乙醇溶液中，再加入二苯胺试剂，经沸水浴再冷却后可观察到蓝色
D
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