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实验06 DNA片段的扩增及电泳鉴定
人教版2019选择性必修3
DNA是控制生物性状的遗传物质，对特定DNA片段的研究是分子生物学的核心内容。在体外快速获得大量目的DNA片段，并对其进行分离、鉴定，是基因工程与分子检测的关键基础技术。本实验以PCR技术扩增DNA片段，再通过琼脂糖凝胶电泳对产物进行分离与鉴定，直观呈现DNA的大小与纯度。我们将在严谨的操作中，体会分子水平实验的精准与规范，感受现代生物技术的魅力，从微观视角解读遗传信息的扩增与检测原理，开启探索分子生物学核心技术的实验之旅。
一、生命观念
通过实验探究DNA片段的扩增（PCR技术）及电泳鉴定方法，理解核酸的复制机制和理化性质，建立“核酸的结构与功能相适应、物质变化与能量供应相统一”的生命观念，认同PCR技术对核酸研究的重要意义。
二、科学思维
运用观察、对比、推理、归纳等科学方法，分析PCR扩增的原理、电泳鉴定的原理，解读实验现象与实验结果的关系，推理实验操作对扩增效果、电泳结果的影响，形成基于实验证据的逻辑推理能力和误差分析意识。
三、科学探究
通过设计和实施DNA片段的扩增及电泳鉴定实验,掌握PCR技术的基本操作、琼脂糖凝胶电泳的操作流程，提升实验设计、操作实施、现象描述与结果分析能力，理解实验设计的单一变量原则、对照原则。
四、社会责任
结合实验原理，联系PCR技术、电泳技术在医学、刑侦、生物技术、基因诊断等领域的应用价值，认识核酸技术对人类生产生活、科学研究的重要意义，树立“科学利用生物技术服务人类”的责任意识，培养严谨的科学态度。
提出问题
基础知识
实验设计
实验过程
得出结论，交流讨论
1.实验原理
（1）利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理
①PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环；
②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理；
（2）DNA片段电泳鉴定的原理
①DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳；
②PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定；
③在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关（迁移速率与之呈负相关）
④凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
1.实验原理
（1）了解PCR和电泳鉴定的基本原理
（2）尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物
2.目的要求
①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）
②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）
③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）
④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）
⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
3.材料用具
PCR仪
DNA分子电泳
3.材料用具
微量离心管
推动杆
调节旋钮
卸枪头按钮
体积刻度
吸液杆
枪头
（注意：加不同样品时，需要更换枪头）
移液枪
3.材料用具
⑥4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。
⑦电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等
3.材料用具
10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL
20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL
20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL
20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL
H2O 28～33μL
1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U
模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL
总体积 50μL
⑧PCR反应体系的配方
3.材料用具
4.方法步骤
①移液：
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分
（1）DNA片段的扩增
PCR反应体系的配方
10倍浓缩的扩增缓冲液 5 μL
20 mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1 μL
20 μmol/L的引物Ⅰ 2.5 μL
20 μmol/L的引物Ⅱ 2.5 μL
H2O 28～33 μL
1～5 U/μL的Taq DNA聚合酶 1～2 U
模板DNA 5～10 μL
总体积 50 μL
注：模板DNA的用量为1gp～1μg
4.方法步骤
②离心：
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）
4.方法步骤
③反应：
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃，5min
30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min
最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min
预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。
4.方法步骤
（2）DNA片段的电泳鉴定
①配制琼脂糖溶液
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀
②制备凝胶
A.将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
C.将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜
B.待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
③加样
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
④电泳
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
⑤观察记录
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
（2）DNA片段的电泳鉴定
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套
注意：
(1)你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
(2)你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
课堂小结：DNA片段的扩增及电泳鉴定
实验原理：
材料用具
方法步骤
1.DNA片段的扩增
2.DNA片段的电泳鉴定
移液
离心
扩增
配制琼脂糖溶液
加样
配制琼脂糖凝胶
电泳观察
利用PCR在体外扩增和DNA片段电泳鉴定的原理
1.用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是(　　)
A.PCR产物的分子大小在250至500 bp之间
B.3号样品为不含目的基因的载体DNA
C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
B
2.某实验利用PCR技术获取目的基因,实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外,还有2条非特异性条带(引物和模板不完全配对)。为了减少非特异性条带的产生,以下措施中有效的是(　　)
A.增加模板DNA的量
B.延长热变性的时间
C.延长延伸的时间
D.提高复性的温度
D
3.关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”(实验 Ⅰ)和“DNA的粗提取与鉴定”(实验Ⅱ)的实验操作,下列相关叙述正确的是(　　)
A.实验Ⅰ中,PCR实验所需的移液器、枪头、蒸馏水等必须进行高压蒸汽灭菌处理
B.实验Ⅰ中,将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳,加样前应先接通电源
C.实验Ⅱ中,取洋葱研磨液的上清液,加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNA
D.实验Ⅱ中,将白色丝状物直接加入到二苯胺试剂中并进行沸水浴,用于鉴定DNA
D
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