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(共64张PPT)
第2节 微生物的培养技术及应用
第1章 发酵工程
第二课时 微生物的选择培养和计数
高中生物学·人教版(2019)·选择性必修3
课堂导入
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。
稀释涂布平板法呈现的杂菌群
该怎么办呢
选择培养
01
选择培养基
02
微生物的选择培养
目录
03
微生物的数量测定
04
练习与应用
选择培养基
01
探究新知
一、选择培养基
1.微生物分离的实例——水生栖热菌的筛选
（1）水生栖热菌的应用
水生
栖热菌
提取
耐高温
DNA聚合酶
用于
体外扩增DNA片段的聚合酶链式反应
（PCR）
（2）筛选原理
水生栖热菌能在70～80℃高温条件下生存，绝大多数微生物在此条件下不能生存。
1973年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中筛选出耐热的水生栖热菌。
探究新知
一、选择培养基
1.微生物分离的实例——水生栖热菌的筛选
（3）启示
寻找目的菌种时要根据它对___________的要求，到相应的环境中去寻找。
耐寒微生物
耐热微生物
石油分解菌
生存环境
热泉
冰川冻土层
被石油污染的土壤
实验室中微生物的筛选，可以应用这个原理吗？
探究新知
一、选择培养基
2.实验室中微生物筛选的原理
人为提供____________________的条件（包括______、______和_____等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。
有利于目的菌生长
营养
温度
pH
3.选择培养基的概念
在微生物学中，将允许 生长，同时_____或 其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。
特定种类的微生物
抑制
阻止
培养基中加氨苄青霉素
没有氨苄青霉素抗性的菌落
具有氨苄青霉素抗性的菌落
探究新知
一、选择培养基
4.选择培养基的应用实例
目的 原理 配制选择培养基
分离酵母菌、霉菌等真菌，防止细菌生长
分离固氮菌
分离自养型微生物
分离耐酸菌
青霉素能抑制细菌生长，对真菌无作用
固氮微生物能利用空气中的氮气
自养型微生物能利用无机碳源
耐酸菌能在pH为酸性的条件下生长
使用加入青霉素的培养基
使用不加氮源（以N2为氮源）的培养基
使用不加有机碳源（以CO2为碳源）的培养基
使用将pH调至酸性的培养基
类型 条件 分离得到的菌种
改变培养条件
添加某种 化学物质
营养缺陷
特殊碳、氮源
探究新知
一、选择培养基
5.选择培养基的类型
70～80℃的高温
加入青霉素
石油是唯一碳源
水生栖热菌
酵母菌、霉菌等真菌
能消除石油污染的微生物
加入高浓度食盐
金黄色葡萄球菌
不加碳源
不加氮源
自养型微生物
固氮菌
探究新知
一、选择培养基
思考 讨论
选择培养基的配方设计
【资料】尿素[CO(NH2)2]含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，被某些细菌分解成NH3，NH3再转化成NO3－、NH4＋等才能被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可作为细菌生长的氮源。
CO(NH2)2+H2O
脲酶
CO2+2NH3
讨论
1.如果让你配制一种培养基，让土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
设计一种选择培养基，用尿素作为唯一氮源，可以将分解尿素的细菌分离出来。
尿素
这种培养基与普通培养基相比，只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。
2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
探究新知
一、选择培养基
思考 讨论
选择培养基的配方设计
讨论
探究新知
一、选择培养基
思考 讨论
选择培养基的配方设计
3.怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？
设计思路：设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照组；选择培养基作为实验组。
结果分析：若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数多于该选择培养基的菌落数，则该选择培养基具有选择性。
对照组：基础培养基
实验组：加入氨苄青霉素的培养基
习题巩固
1.用来判断选择培养基是否起到了选择作用和培养基是否被污染需要设置的对照分别是(　　)
①未接种的该选择培养基　
②接种了的该选择培养基　
③接种了的牛肉膏蛋白胨培养基　
④未接种的牛肉膏蛋白胨培养基
A.②① B.④② C.③① D.③②
C
判断选择作用对照组(基础培养基)
判断选择作用/是否被污染实验组
判断是否被污染对照组
习题巩固
2.“筛选”是分离和培养生物新类型常用的手段，下列有关技术中不能筛选成功的是（　　）
A.在牛肉膏蛋白胨培养基中，筛选大肠杆菌
B.在以尿素为唯一氮源的固体培养基中，筛选能够分解尿素的微生物
C.用纤维素为唯一碳源的培养基，筛选能分解纤维素的微生物
D.在培养基中加入不同浓度的氯化钠，筛选抗盐突变体植物
A
几乎所有细菌都能生长
3.请结合下表两种培养基的配方，思考问题：
1.从物理性质来讲，两者属于_______培养基，判断依据是________________；该类培养基的主要用途为_________________；
2.从用途上来讲，培养基二属于_______培养基，
目的是获得_______________________。
3.两种培养基共有的培养基成分有：_____________________________；
培养基一的碳源为_______，氮源为_________；
培养基二的碳源为_______，氮源为_________。
固体
添加了凝固剂琼脂
分离、鉴定、计数
碳源、氮源、无机盐、水
牛肉膏和蛋白胨
牛肉膏和蛋白胨
葡萄糖
尿素
选择
能分解尿素的微生物
习题巩固
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 定容到1000ml
培养基（一）
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
培养基（二）
微生物的选择培养
02
探究新知
二、微生物的选择培养
1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？
分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物
计数：测定分解尿素的细菌的数量
土壤细菌的数量庞大，该如何获得土壤中特定微生物的纯培养物计数呢？
释涂布平板法
探究新知
二、微生物的选择培养
2.稀释涂布平板法的基本操作
概念：将菌液进行一系列________，然后将不同稀释度的菌液分别
_______到固体培养基的表面，进行培养。
梯度稀释
涂布
1.方法
稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。
释涂布平板法
(1)梯度稀释
(2)涂布平板
90 mL的无菌水
铲取土样，将样品装入纸袋中。
1
将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶，充分摇匀。
2
3
取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
探究新知
二、微生物的选择培养
3.稀释涂布平板法具体操作过程
(1)梯度稀释
1 10
1 mL
1×102
1 mL
1×103
1 mL
1×104
1 mL
1×105
1 mL
1×106
1 mL
1×107
9mL无菌水
微量
移液器
趣味交互动画演示
单击上方链接
1.演示链接
2.操作方法
打开界面
点击界面任意处触发模拟动画，再根据语音和右上角文本提示按步骤操作。
3.演示界面预览
稀释涂布平板法——梯度稀释
5
将涂布浸入在盛有
酒精的烧杯中
取0.1mL菌液，
滴加到培养基表面
4
用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
7
将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
6
探究新知
二、微生物的选择培养
3.稀释涂布平板法具体操作过程
(2)涂布平板
滴
浸
涂
灼
探究新知
二、微生物的选择培养
3.稀释涂布平板法具体操作过程
(2)涂布平板
3.稀释涂布平板法具体操作过程
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30~37℃的恒温培养箱中培养1~2d。
在涂有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。
恒温培养箱
探究新知
二、微生物的选择培养
(3)培养与观察
讨论
1.设置空白对照组的目的是什么？
2.根据实验结果，能否计算出细菌的数目是多少？
检测培养基灭菌是否彻底，保证实验结果的准确性。
可以。
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
微生物的数量测定
03
①一般选择菌落数在___________的平板进行计数。
②同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后取其平均值。
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个______，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少______。
原理
原则
缺点
统计的菌落数往往比活菌的实际数目______。
统计结果一般用__________而不用活菌数来表示。
探究新知
三、微生物的数量测定
1.稀释涂布平板法
——间接计数法
活菌
活菌
30~300
少
减少实验误差，保证结果的准确度
因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
菌落数
活菌计数法
恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。
计算公式
每g样品中的菌落数 = ( C ÷ V ) × M
代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL）
代表稀释倍数
【例1】某研究小组测定某地1克土壤中有多少能分解尿素的细菌。甲同学用稀释倍数105的菌液涂布了3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？
探究新知
三、微生物的数量测定
1.稀释涂布平板法
——间接计数法
（80+90+100）/3
0.1
× 105 =9 ×107个
【例2】如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验中样品稀释示意图。据图分析正确的是(　　)
A.3号试管中的菌液稀释倍数为103倍
B.4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数理论上是5号试管的10倍
C.5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×107个
D.该实验方法统计得到的结果往往会比活菌的实际数目要高
B
探究新知
三、微生物的数量测定
104
低
1.7×109
原理
利用特定的______________或________________，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量，统计的结果一般是_______和_________的总和。
优点
快速、直观、设备简单；
能观察微生物的形态特征。
缺点
①不能区分死菌和活菌，统计结果会_______；
②不适于对运动细菌的计数。
③个体小的细菌在显微镜下难以观察。
细菌计数板
血细胞计数板
较薄，对细菌等较小的细胞进行观察和计数。
较厚，常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。
探究新知
三、微生物的数量测定
2.显微镜直接计数法
——直接计数法
细菌计数板
血细胞计数板
活菌数
死菌数
偏大
台盼蓝染液染色，可以通过统计无色细胞的个数来对活菌进行计数。
方格网上刻有9个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室，供计数用。
②中方格
③小方格
计数用具——血细胞计数板
（双线分割）
①大方格
计数室
边长为1mm，深度为0.1mm
1个计数室的体积为0.1mm3，
1个计数室有400个小方格。
每个小方格的体积是1/4000mm3。
每1毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×104×稀释倍数
探究新知
三、微生物的数量测定
测定方法 稀释涂布平板法 显微镜直接计数法
主要用具
计数数据
优点
缺点
计算结果
计算公式
菌体本身
培养基上的菌落数
计算方便、操作简单
计数的是活菌
不能区分死菌与活菌
不适于对运动细菌的计数
当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
比实际值偏小
比实际值偏大
每克样品中的菌株数
＝(C÷V )×M
每mL含菌量＝每小格平均菌体数×400×104×稀释倍数
显微镜、细菌计数板或血细胞计数板
涂布器
课堂小结
稀释涂布平板法与显微镜直接计数法的比较
比较 平板划线法 稀释涂布平板法
关键 操作
菌体 获取
特点
平板 示图
共同点
课堂小结
平板划线法与稀释涂布平板法的比较
接种环在固体培养基
表面连续划线
系列梯度稀释操作和涂布平板操作
从最后划线的区域挑取
稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落
①都能分离纯化菌种，获得单菌落；
②都是在固体培养基上进行的。
方法简单，但不能计数
可以计数，但操作复杂，需涂布多个平板
习题巩固
1．下图中甲是稀释涂布平板法中的部分操作，乙是平板划线法的操作结果。下列叙述中错误的是（　　）
A.甲涂布前要将涂布器灼烧，冷却后才能涂菌液
B.甲、乙操作中只有甲可以用于微生物的计数
C.乙中接种环需要灼烧5次
D.乙中连续划线的起点是上一次划线的末端
C
6次
2.如图甲、乙是微生物接种常用的两种方法，图丙是接种后培养的效果图解。下列相关叙述不正确的是（　　）
A.图甲是平板划线法，图乙是稀释涂布平板法
B.这两种方法所用的接种工具分别是接种针和接种环
C.图丙是采用图乙所示方法得到的结果
D.两种方法的接种操作都一定要在火焰附近进行，因为火焰附近存在着无菌区域
习题巩固
B
接种环和涂布器
3．营养缺陷型菌株是指缺乏合成某些营养物质（如氨基酸、维生素）的能力，必须在基本培养基中补充特殊营养物质才能正常生长的一类菌株，可自然产生或人工诱导获得。用一定方法诱变大肠杆菌并将其接种到甲培养皿上，一段时间后将菌落影印接种
（不改变菌落在培养基中相应位置）到
乙、丙两培养皿中，进一步培养一段时
间可筛选出营养缺陷型菌株，结果如图
所示。下列说法正确的是（　　）
A.将大肠杆菌接种到甲培养皿的方法为平板划线法
B.甲、丙两培养皿中培养基均添加了特殊营养物质
C.乙培养皿中能生长的为所需的营养缺陷型菌株
D.甲中部分大肠杆菌发生了基因突变或染色体变异
习题巩固
B
稀释涂布平板法
不能
探究新知
三、微生物的数量测定
探究 实践
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1.提出问题
（1）如何分离土壤中能分解尿素的细菌？
（2）如何计算每克土壤样品中有多少分解尿素的细菌？
2.基础知识
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成________的微生物才能分解尿素。
利用________________________的______培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
组分 含量
KH2PO4 1.4
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
H2O 定容至1000mL
脲酶
CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3
脲酶
以尿素作为唯一氮源
选择
探究新知
三、微生物的数量测定
探究 实践
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
3.实验步骤
（1）土壤取样
①取样地点要求：
②取样过程：
酸碱度接近中性的潮湿土壤（细菌适宜在该环境中生长）
铲去表层土（一般3cm左右）
③注意事项：
取土样时用的铁铲和取样袋使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
（2）制备培养基
①选择培养基：
以尿素为唯一氮源
②牛肉膏蛋白胨培养基：
作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用
公园里、街道旁、花盆中
城市：
农田里、菜园里
农村：
（细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层）
探究新知
三、微生物的数量测定
探究 实践
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
3.实验步骤
（3）样品的稀释与涂布平板
测定土壤中细菌的数量，一般选用1×104、 1×105、 1×106倍稀释倍数进行平板培养。
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，应选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。
探究新知
三、微生物的数量测定
探究 实践
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
3.实验步骤
（3）样品的稀释与涂布平板
_______培养基（重复实验）
选择
______培养基
（牛肉膏蛋白胨培养基）
完全
注：整个实验还要设置 个空白对照平板：未接种的_____________培养基和______培养基以判断培养基中是否含有杂菌。
2
牛肉膏蛋白胨
选择
作为对照，判断选择培养基是否具有选择作用。
①培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。
②观察：每隔 统计一次菌落数目，选取 时的记录作为结果。防止 。
③结果：一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。（最好用表格记录）
因培养时间不足而导致遗漏菌落数目
24h
菌落数目稳定
探究新知
三、微生物的数量测定
探究 实践
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
3.实验步骤
（4）微生物的培养与观察
稀释度 菌落形状 菌落大小 菌落颜色 菌落平均值
104
105
106
探究新知
三、微生物的数量测定
探究 实践
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
（1）将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
（2）取土样时用的铁铲和取样纸袋再使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
（4）本实验耗时较长，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。
（3）本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好再使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
探究新知
三、微生物的数量测定
探究 实践
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
4.操作提示
(1)结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落？
如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。
如果接种后的完全培养基上的菌落明显多于选择培养基的菌落数，说明培养基筛选出了一些尿素分解菌。
(2)你是否获得了某一稀释度下菌落数为30～300的平板？在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近？
如果得到了两个或多个菌落数为30~300的平板，说明稀释度合格，操作比较成功，能够进行菌落的计数。
(3)你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落是多少？与其他同学统计的结果接近吗？如果差异大，可能是什么原因引起的？
如果用同一土样进行操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。
探究新知
三、微生物的数量测定
探究 实践
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
5.结果分析与评价
本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌，对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。你可以查阅相关资料，进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种。
鉴别培养基
土壤中分解尿素的细菌的鉴定
探究新知
三、微生物的数量测定
探究 实践
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
6.进一步探究
探究新知
三、微生物的数量测定
探究 实践
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
6.进一步探究
土壤中分解尿素的细菌的鉴定
原理：
脲酶催化尿素分解成氨 → 培养基碱性增强 → 酚红变红 → 脲酶阳性
CO(NH2)2+H2O
脲酶
2NH3+CO2
呈碱性，遇酚红指示剂呈 红 色。
方法：
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。
可以直接看液体的变色情况。
液体培养基：
可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。
固体培养基：
鉴别培养基
在培养基中加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应，从而达到鉴定的作用。
伊红—亚甲蓝琼脂培养基
（鉴别大肠杆菌——菌落
呈深紫色，有金属光泽）
刚果红培养基
（鉴别纤维素分解菌
——出现透明圈）
探究新知
三、微生物的数量测定
探究 实践
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
课本P30
课本P20
项目 选择培养基 鉴别培养基
原理
用途
举例
图示
尿素分解菌
大肠杆菌
加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应；使目标菌落出现特定的特征。
培养、分离出目标微生物
鉴别目标微生物
培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌的生长；利用以尿素为唯一氮源的培养基来培养可分解尿素的细菌。
可用伊红—亚甲蓝琼脂培养基鉴定饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌（若有，则菌落呈黑色，且带有金属光泽）。
添加（或缺少）某种化学物质，促进目标微生物生长，而抑制或阻止其他种类微生物生长。
选择培养基与鉴定培养基的比较
拓展延伸
习题巩固
1.(2025·湖南·高考真题)采集果园土壤进行微生物分离或计数。下列叙述正确的是（ ）
A.稀释涂布平板法和平板划线法都能用于尿素分解菌的分离和计数
B.完成平板划线后，培养时需增加一个未接种的平板作为对照
C.土壤中分离得到的醋酸菌能在无氧条件下将葡萄糖分离成乙酸
D.用于筛选尿素分解菌的培养基含有蛋白胨、尿素和无机盐等营养物质
B
以尿素为唯一氮源
习题巩固
2.下列关于土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验的叙述，正确的是（ ）
A.只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素
B.筛选分解尿素的细菌时,应以尿素作为培养基中唯一的营养物质
C.统计样品中的活菌数目一般用平板划线法
D.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂,若指示剂变蓝,则表明选到了能分解尿素的细菌
A
氮源
稀释涂布平板法
变红
习题巩固
3.下列有关土壤中分解尿素的细菌的分离和计数的实验操作，错误的是（ ）
A.取土壤用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都需要灭菌
B.测定土壤中细菌的数量一般选用102、103、104倍的稀释液进行平板培养
C.鉴定分解尿素的细菌，利用了尿素分解成氨，从而使pH升高的原理
D.用牛肉膏蛋白胨培养基作对照，来验证选择培养基是否有选择性
B
104、105和106
习题巩固
4.一次性口罩的主要成分为聚丙烯纤维(PP)，某科研团队准备从土壤中筛选出高效降解一次性口罩的细菌。图甲表示PP分解菌分离与计数的过程，6号试管涂布的三个平板的菌落数为550、601、688；7号试管涂布的三个平板的菌落数为58、73、97；8号试管涂布的三个平板的菌落数为8、15、28。图乙表示在培养基中加入能与PP结合而显色的染色剂，目的菌落周围出现透明圈的情况。下列说法错误的是（　　）
习题巩固
A．图甲、图乙所用培养基分别为选择培养基和鉴别培养基，都以PP作为唯一碳源
B．图甲、图乙所用接种方法分别为稀释涂布平板法和平板划线法，都需在酒精灯火焰旁进行
C．1 g 土壤样品中含有PP分解菌的估算数目是7.6×1010个，此数值一般偏小
D．可选择图乙培养基中D/d比值大的PP分解菌作为目的菌种推广使用
√
微生物分离的实例
微生物筛选的原理
选择培养基的概念及举例
微生物的数量测定
微生物选择培养的方法——稀释涂布平板法
微
生
物
的
选
择
培
养
和
计
数
选择培养基
微生物的选择培养
稀释涂布平板法的操作过程
间接计数法 — 稀释涂布平板法
直接计数 —显微镜直接计数法
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
①土壤取样
②培养基的制备
③样品的稀释与涂布平板
④微生物的培养与观察
课堂小结
练习与应用
04
一、概念检测
1.研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。
(1) 这种培养基是一种选择培养基。（ ）
(2) 利用这种石油降解菌可以降解石油，修复土壤。（ ）
(3) 相对于未被污染的土壤，从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（ ）
教材P20
√
练习与应用
√
√
2. 用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是（ ）
A. 菌落中的细菌数目是恒定的
B. 平板上的一个菌落就是一个细菌
C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
D
二、拓展应用
1. 反刍动物，如牛和羊，具有特殊的器官——瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验，从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。
教材P20
练习与应用
提示：反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡。因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基、还应该参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。
①用“尿素为唯一氮源”的选择培养基进行培养
②创造无氧环境进行培养
2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%~60%能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸秆等生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈（如下图所示）。请回答下列问题。
教材P20
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(1)现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出详细的实验方案。
土壤取样
→ 富含纤维素的环境
→ 以纤维素为唯一碳源，增加目的菌浓度
（选择培养基）
→ 制备系列稀释液
→ 筛选产生透明圈的菌落
选择培养
涂布平板
→ 将样品涂布到含刚果红的培养基上
（鉴别培养基）
梯度稀释
挑选
几种纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的透明圈
教材P20
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(2)你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？
几种纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的透明圈
纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。
(3)有同学说,可以把滤纸埋在土壤中,经过一段时间后,再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。
这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境，腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。
教材P30
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3.某个高温日，某校三位高中学生相约去吃冰激凌，之后两人都出现腹泻现象，于是他们怀疑冰激凌中的大肠杆菌含量超标。老师建议他们利用学过的有关微生物培养的知识对此冰激凌进行检测。经过一番资料查阅，他们提出了如下实验设计思路。
立即去卖冰激凌的小店再买一个同样品牌的同种冰激凌；配制伊红—亚甲蓝琼脂培养基(该培养基可用来鉴别大肠杆菌，生长在此培养基上的大肠杆菌菌落呈深紫色，并有金属光泽)、灭菌、倒平板；取10 mL刚融化的冰激凌作为原液，然后进行梯度稀释，稀释倍数为1×10~1×105；取每个浓度的冰激凌液各0.1mL，用涂布平板法进行接种，每个浓度涂3个平板，一共培养18个平板；在适宜温度下培养48h,统计菌落数目。
(1)请你从下面几个角度对这三位同学的思路进行评议。
①他们只打算对一个冰激凌进行检测，理由是：两个人吃过冰激凌后，都拉肚子了，所以再检测一个就足以说明问题。你同意这样的观点吗？为什么？
不同意。提示：只检测一个冰激凌数据太少，不能排除偶然因素的影响。
教材P30
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(1)请你从下面几个角度对这三位同学的思路进行评议。
②有没有必要对冰激凌原液进行梯度稀释？为什么？【提示：我国卫生部门规定的饮用水标准是：1mL自来水中细菌总数不可以超过100个(37℃培养48h), 不得检出总大肠菌群】
没有必要。提示：根据国家的标准，自来水中总大肠菌群不得检出。即使冰激凌中大肠杆菌数目超标了，也不可能很离谱，如果进行梯度稀释，最后得到的菌落数可能不在计数要求的范围内，从而导致结果误差大。解答这个问题的时候，应该让学生明白并不是所有的细菌检测培养都需要进行梯度稀释，而是要根据实际情况来确定培养方案。
③他们认为，在用该方法统计菌落数目时不需要设计对照组，所以只准备培养18个平板。你认为在这项检测中是否需要对照组？为什么？
需要设置对照组。严格来说，应该设置两组对照组。一组为阴性对照组，平板不进行涂布或者用无菌水涂布；另一组为阳性对照组，平板上涂布大肠杆菌。前者可以说明培养基是否被污染，后者可以说明该培养基能否培养出大肠杆菌。
教材P30
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(2)下图所示为4种菌落分布图，一般不能由涂布平板法得到的是 _____ 。
B
(3)在完善实验设计思路后，三位同学进行了实验。培养结果显示，除了深紫色菌落，还有其他菌落存在，这说明了什么？如果以菌落数代表样品中的大肠杆菌数量，则统计结果比实际值是偏大还是偏小？为什么？
说明冰激凌中不仅有大肠杆菌，还有其他细菌或真菌等。统计结果比实际值偏小。因为有些菌落可能会重叠，统计时容易将其误认为是一个菌落，并且这种计数方法统计的是活菌的数目。
(4)如果实验结果显示，检测的冰激凌中大肠杆菌含量超标了。接下来他们应该做什么？
应该马上去小店告知店主这批冰激凌不能再卖了；还要告知食品卫生管理部门，以对这批冰激凌的来源进行追踪调查。其他合理答案也可。
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4.用纸片扩散法测定某病原菌对各种抗生素敏感性的实验，是在某病原菌均匀分布的平板上，铺设含有不同种抗生素的纸片后进行培养。图示2为培养的结果，其中抑菌圈是在纸片周围出现的透明区域。下列分析正确的是（ ）
A．在图示固体培养基上可用平板划线法或稀释涂布平板法接种病原菌
B．图2中Ⅳ的抑菌圈中出现了部分菌落是病原菌与抗生素接触后发生了抗性变异
C．接种后的平板在培养时的放置应如图1中②所示，可以防止污染
D．不同抗生素在平板上的扩散速度不同会对实验结果造成影响
D
①
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5.刚果红是一种染料，它可与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。图为土壤中几种纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的透明圈，其中a、b、c、d表示四种菌落。下列叙述错误的是（　　）
A．取样时用到的纸袋、铁铲和采集的土壤等都需进行灭菌处理
B．纤维素分解菌产生的纤维素酶可以分泌到细胞外发挥作用
C．图中的接种方法为稀释涂布平板法，一个菌落一般来源于一个活菌
D．纤维素分解能力与透明圈和菌落的直径比值正相关，因此d最高效
A
6.如表是某大肠杆菌的培养基配方，请根据表格和所学知识回答下列相关问题。
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成分 蛋白胨 乳糖 蔗糖 K2HPO4 伊红美蓝 琼脂
含量/g 10.0 5.0 5.0 2.0 0.2 12.0
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL
(1)培养基常用的灭菌方法是 。
高压蒸汽灭菌
(2)若根据用途划分，该培养基属于 (填“选择”或“鉴别”)培养基，若要用上述培养基来筛选土壤中的尿素分解菌，培养基的营养成分必须怎样更改？ ，指示剂可用 代替。
鉴别
将蛋白胨改成尿素
酚红指示剂
(3)图1和图2是培养某细菌的结果图，其对应的接种方法分别是 和 ，这两种方法接种后
稀释涂布平板法
平板划线法
(4)一位同学在用稀释涂布平板法纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成一片，最可能的原因是 ，应当怎样操作才可以避免此种现象？
_______________________________ _
练习与应用
培养基上都可以得到由单个细胞繁殖形成的______，其中，____(填“图1”或“图2”)所用的接种方法可用来对活菌进行计数。
菌液浓度过高
菌落
图1
对菌液进行梯度稀释(或加大稀释倍数)

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