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第3章 基因工程
第2节　基因工程的基本操作程序
第1课时　目的基因的筛选与获取、
基因表达载体的构建
课时目标 1.运用结构与功能观、物质与能量观，理解PCR技术的过程、原理及条件等内容。(生命观念)
2．运用文字与图示的方式，阐明目的基因的获取和基因表达载体的构建过程。(科学思维)
一、目的基因的筛选与获取
1．筛选合适的目的基因
(1)目的基因
①概念：在基因工程的设计和操作中，用于改变 或获得预期 等的基因。
②作用：主要是指 的基因。
(2)筛选目的基因的方法：从相关的 的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
受体细胞性状
表达产物
编码蛋白质
已知结构和功能清晰
2．获取目的基因的方法：常用 特异性地快速扩增目的基因。
3．利用PCR获取和扩增目的基因
(1)概念：PCR是 的缩写。它是一项在体外提供参与DNA复制的 与 ，对目的基因的 进行大量复制的技术。
(2)原理： 。DNA复制所需的基本条件：
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶(体外用高温代替) 打开DNA双链
PCR
聚合酶链式反应
各种组分
反应条件
核苷酸序列
DNA半保留复制
参与的组分 在DNA复制中的作用
DNA母链 提供DNA复制的
合成DNA子链的原料
催化合成DNA子链
引物 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
模板
(3)过程
(4)鉴定：常采用 来鉴定PCR的产物。
琼脂糖凝胶电泳
二、基因表达载体的构建
1．基因表达载体构建的目的
让目的基因在受体细胞中 ，并且遗传给下一代；同时，使目的基因能够 和 。
2．基因表达载体的组成
稳定存在
表达
发挥作用
3．基因表达载体的构建过程
(1)首先用一定的 切割载体。
(2)然后用 限制酶或能产生 的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
(3)再利用 将目的基因片段拼接到载体的切口处。
限制酶
同种
相同末端
DNA连接酶
◆漫画助学
基因表达载体的家族成员
◆基础速判(对的画“√”，错的画“×”)
1．PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应。(　　　　)
2．PCR扩增技术中，需用解旋酶使双链DNA解聚。(　　　　)
3．PCR过程使用的DNA聚合酶的特点是耐高温。(　　　　)
4．PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解聚为单链所需的温度就越高。(　　　　)
5．基因工程的基本操作程序的核心步骤是目的基因的获取。(　　　　)
6．基因表达载体中含有启动子和终止密码子。(　　　　)
×
×
√
√
×
×
◆思维启迪
1．细胞内DNA复制时是否需要引物？为什么？
提示：需要；因为DNA聚合酶不能从头开始合成DNA单链，只能将游离的脱氧核苷酸连接到一条DNA单链的3'端，所以在延伸子链前，需要提前合成一小段短单链核酸作为引物。
2．用PCR可以扩增mRNA吗？
提示：不能。PCR的原理是DNA半保留复制，只可用于扩增DNA。
任务一 目的基因的筛选与获取
利用PCR扩增目的基因的过程如下图所示。
[问题探究]
1．PCR技术中需要的两种引物碱基序列相同吗？为什么？
答案：不相同。由于DNA两条模板链中碱基序列并不相同，而引物需要分别与两条模板链进行碱基互补配对，因此DNA两条模板链在进行扩增时，需要的两种引物碱基序列是不相同的。
2．PCR技术中，子链的延伸方向是怎样的？
答案：从5'端向3'端延伸。
3．PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗？
答案：不是，PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段。
1．比较PCR扩增技术和体内DNA复制的异同
项目 PCR扩增技术 体内DNA复制
不同点 解旋方式 DNA在高温作用下变性解旋 解旋酶催化
场所 PCR扩增仪内 细胞内(主要在细胞核内)
酶 耐高温的DNA聚合酶 解旋酶、DNA聚合酶
温度条件 需控制温度，在较高温度下进行 细胞内温和条件
结果 DNA片段或目的基因 DNA分子
项目 PCR扩增技术 体内DNA复制
相同点 ①模板：均需要DNA的两条单链作为模板
②原料：均为4种脱氧核苷酸
③酶：均需要DNA聚合酶
2.PCR反应的结果
(1)n次循环(复制)后，DNA片段的含量为2n。
(2)引物数＝新增单链数＝2n+1－2。
(3)同时含有引物 Ⅰ 与 Ⅱ 的DNA分子数＝2n－2。
D
1．(2024·临沂高二检测)PCR是一种体外扩增DNA片段的技术，利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。下列有关PCR过程的叙述，正确的是 (　　)
A．DNA两条链的解旋过程需要解旋酶的催化
B．需要4种核糖核苷酸为原料
C．PCR过程中需要的两种引物的碱基序列必须是能够相互配对的
D.与细胞内DNA复制相比，PCR所需要的酶耐高温
解析：
体外扩增DNA时高温使氢键断裂，从而达到解旋的目的，A错误；DNA的基本单位是脱氧核苷酸，PCR过程需要4种脱氧核苷酸为原料，B错误；PCR过程中需要的两种引物的碱基序列必须能够与DNA的两条链的两端互补，但两种引物的碱基序列不能相互配对，C错误；PCR是个温控系统，利用高温使DNA解旋，因此整个体系中的物质都必须耐高温，所需的酶为耐高温的DNA聚合酶，比体内的解旋酶、DNA聚合酶等更能耐高温，D正确。
D
2．(2025·西安高二检测)下图表示形成目的基因并进行PCR扩增的过程。据图分析，下列叙述正确的是 (　　)
A．过程①所需的原料是核糖核苷酸
B．过程②所需的酶必须耐高温
C．过程③需要解旋酶破坏氢键
D．过程④的引物对之间不能互补配对
解析：
过程①为逆转录，所需的原料是脱氧核苷酸，A错误；过程②由单链DNA合成双链DNA，所需要的DNA聚合酶不需要耐高温，B错误；过程③为变性，温度超过90 ℃时，双链DNA解聚为单链，不需要解旋酶破坏氢键，C错误；过程④为复性，温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，但引物对之间不能互补配对，D正确。
任务二 基因表达载体的构建
下图为基因表达载体的模式图。
[问题探究]
1．切割目的基因和载体通常要选用相同的限制性内切核酸酶，原因是什么？
答案：选用相同的限制性内切核酸酶切割会产生相同的末端，可以在DNA连接酶的作用下将切割的目的基因和载体连接起来。
2．标记基因的作用是什么？为什么一般不能将目的基因插入载体的标记基因中？
答案：标记基因用于鉴定受体细胞中是否成功导入目的基因，以便将含有目的基因的细胞筛选出来。若将目的基因插入载体的标记基因中，则标记基因被破坏，无法进一步筛选。
3．目的基因为何要插入启动子和终止子之间？
答案：启动子位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动转录开始；终止子位于基因的下游，使转录终止。只有顺序正确，目的基因才能正常转录。
1．限制酶的选择方法
　　
(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类
①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，即图甲可选择Pst Ⅰ 。
②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，即图甲不能选择Sma Ⅰ 。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，图甲也可选择用Pst Ⅰ 和EcoR Ⅰ 两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选择的限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保产生相同的末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，因此所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶Sma Ⅰ 会破坏标记基因。
③如果所选择的酶的切割位点不是一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制原点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
2．目的基因插入的位置
(1)目的基因应插入启动子与终止子之间的部位。
(2)目的基因的插入不能破坏复制原点。
(3)目的基因插入后，基因表达载体上至少保留一个未被破坏的标记基因。
项目 位置 作用
启动子 位于DNA分子上 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动转录过程
起始密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的开始
终止子 位于DNA分子上 决定转录的结束
终止密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的结束
3．启动子、终止子与起始密码子、终止密码子的区别
B
1．(2025·南京高二检测)将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的转基因酵母菌。如图为构建基因表达载体时所用的质粒，下列相关叙述正确的是 (　　)
A.使用限制酶BamH Ⅰ 处理，将乳酸脱氢酶基因插入质粒
B．可用PCR技术扩增获得乳酸菌的乳酸脱氢酶基因
C．在含有尿嘧啶的培养基上筛选含有重组质粒的酵母菌
D．转基因酵母菌培育成功的标志是产生乳酸脱氢酶
解析：
从图中可知，BamH Ⅰ 酶切位点位于酿酒酵母基因终止子之后，若用限制酶BamH Ⅰ 处理，将乳酸脱氢酶基因插入质粒，无法正常转录，A错误；PCR技术可以在体外大量扩增特定的DNA片段，可以使用PCR技术扩增获得乳酸菌的乳酸脱氢酶基因，B正确；含有重组质粒的酵母菌具有尿嘧啶合成酶基因，可以产生尿嘧啶，所以应该在不含尿嘧啶的培养基上筛选含有重组质粒的酵母菌，C错误；转基因酵母菌培育成功的标志是能产生乳酸，而不是产生乳酸脱氢酶，产生乳酸脱氢酶只是具备了产生乳酸的一个条件，D错误。
C
2．(2024·廊坊高二检测)如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中Pst Ⅰ 、Sma Ⅰ 、EcoR Ⅰ 、Apa Ⅰ 为四种限制酶。下列说法错误的是 (　　)
A．图示对质粒和目的基因的切割用到了两种限制酶
B．卡那霉素抗性基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
C．构建基因表达载体时需要用到限制酶Sma Ⅰ
D．除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构
解析：
为防止酶切后单个含目的基因的DNA片段及质粒自身连接成环状，图示对质粒和目的基因的切割用到了两种限制酶，A正确；卡那霉素抗性基因作为标记基因，主要作用是筛选含有目的基因的受体细胞，B正确；限制酶Sma Ⅰ 的识别序列和切割位点位于目的基因上，因此构建基因表达载体时不能用限制酶Sma Ⅰ ，应用限制酶Pst Ⅰ 、EcoR Ⅰ ，C错误；基因表达载体一般包括目的基因(抗原基因)、标记基因(卡那霉素抗性基因)、启动子和终止子等，D正确。
基因表达载体的构建——科学思维
利用图1和图2所示的质粒X和含S蛋白基因的DNA构建基因表达载体，以培养转S蛋白基因的大肠杆菌，其中限制酶的识别序列及切割位点见下表。
限制酶 BamH Ⅰ Bcl Ⅰ Sau3A Ⅰ Hind Ⅲ
识别序列及切割位点
设计1：考查迁移运用和信息转换能力
(1)BamH Ⅰ 、Bcl Ⅰ 和Sau3A Ⅰ 三种限制酶切割DNA时，形成的末端________(填“能”或“不能”)互连，理由是______________________
____________________________________________________________。
设计2：考查逻辑推理与长句表达能力
(2)利用图1和图2所示的质粒X和含S蛋白基因的DNA构建基因表达载体时，质粒X中能作为标记基因的是____________________，理由是 。
(3)Sau3A Ⅰ ________(填“能”或“不能”)将由质粒X和含S蛋白基因的DNA构建的基因表达载体切割，理由是_________________________
_______________________________。基因工程中，构建基因表达载体时常选用两种限制酶切割载体和含目的基因的DNA，与同一种限制酶切割相比，一般情况下，优点在于可以防止 。
答案：(1)能　这三种限制酶切割DNA形成的末端能发生碱基互补配对(或这三种限制酶切割DNA形成的末端相同)
(2)四环素抗性基因　将S蛋白基因切割下来，需用到BamH Ⅰ 或Bcl Ⅰ 中的一种，其中BamH Ⅰ 会破坏四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因，Bcl Ⅰ 仅破坏氨苄青霉素抗性基因，保留四环素抗性基因
(3)能　构建的基因表达载体中含有Sau3A Ⅰ 识别的—GATC—序列　目的基因和载体的自身环化以及载体与目的基因的反向连接
解析：
(1)由题表分析可知，BamH Ⅰ 、Bcl Ⅰ 和Sau3A Ⅰ 三种限制酶切割DNA时，形成的末端相同，均为—GATC—，能发生碱基互补配对，所以形成的末端之间能互连。(2)由题图分析可知，将S蛋白基因切割下来，需用到BamH Ⅰ 或Bcl Ⅰ 中的一种，其中BamH Ⅰ 会破坏四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因，Bcl Ⅰ 仅破坏氨苄青霉素抗性基因，保留四环素抗性基因，因此利用图1和图2所示的质粒X和含S蛋白基因的DNA构建基因表达载体时，质粒X中能作为标记基因的是四
解析：
环素抗性基因。(3)由于质粒X和含S蛋白基因的DNA构建的基因表达载体中含有Sau3A Ⅰ 识别的—GATC—序列，所以Sau3A Ⅰ 能对该基因表达载体进行切割。一般情况下，两种酶切割形成的末端不同，选用两种限制酶切割载体和含目的基因的DNA，可以防止构建基因表达载体时目的基因和载体的自身环化以及载体与目的基因的反向连接。
C
1．基因工程的操作步骤：①使目的基因与载体相结合，②提取目的基因，③检测目的基因的表达是否符合特定性状要求，④将目的基因导入受体细胞。正确的操作顺序是 (　　)
A．③②①④ B．④①②③
C．②①④③ D．③②④①
解析：
基因工程的操作步骤：②提取目的基因→①使目的基因与载体相结合→④将目的基因导入受体细胞→③检测目的基因的表达是否符合特定性状要求，C正确。
B
2．(2025·邯郸高二期中)关于基因表达载体构建及其组件相关说法，正确的是 (　　)
A.启动子是与DNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录
B．构建基因表达载体时，一般要用同种限制酶切割含有目的基因的片段和载体
C．构建基因表达载体时，目的基因的转录模板链的5'端应与启动子连接
D．基因上的终止密码子能够使转录在相应的位置停止
解析：
启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录，A错误；构建基因表达载体时，一般要用同种限制酶切割含有目的基因的片段和载体，以便形成相同的黏性末端，B正确；转录时RNA聚合酶沿着DNA模板链的3'端向5'端延伸，因此构建基因表达载体时，目的基因的转录模板链的3'端应与启动子连接，C错误；终止密码子位于mRNA上，D错误。
B
3．(2024·深圳高二期中)PCR引物的3'端为结合模板DNA的关键，5'端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列，dNTP是DNA合成的原料，还可为DNA的合成供能。下列相关说法正确的是 (　　)
A．图示过程表示复性，该过程所需温度比下一个环节高
B．引物是能与模板链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸
C．耐高温的DNA聚合酶只能从引物的5'端开始延伸DNA子链
D．经过1个循环后，两个子代DNA分子的脱氧核苷酸数量完全相同
解析：
图示环节为引物与模板碱基互补配对，表示的是复性环节，复性的下一环节为延伸，复性的温度比延伸的温度低，A错误；引物是能与模板链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，B正确；耐高温的DNA聚合酶只能从引物的3'端开始延伸DNA子链，C错误；由于两个引物均不在该片段的端点，因此一个循环后，两个子代DNA分子的脱氧核苷酸数量不相同，D错误。
D
4．图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，NeoR表示新霉素抗性基因。下列叙述不正确的是 (　　)
A．在构建重组质粒时，可用Pst Ⅰ 和Hind Ⅲ 切割质粒和外源DNA
B．在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因
C．若只用Pst Ⅰ 处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接
D．导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长
解析：
切割目的基因时，用BamH Ⅰ 切割会破坏目的基因，只用Pst Ⅰ 切割目的基因和质粒，会出现目的基因和质粒的自身环化，或目的基因和质粒的反向连接，而用Pst Ⅰ 和Hind Ⅲ 进行酶切，能确保目的基因和质粒的正向连接，并且质粒上保留新霉素抗性基因作为标记基因，A、C正确；在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因，至少需保留其中的一个，B正确；用Pst Ⅰ 切割后，质粒上氨苄青霉素抗性基因被破坏，导入重组质粒的大肠杆菌不可以在含氨苄青霉素的培养基中生长，D错误。
5．现有甲、乙两种双子叶植物，植物甲因含有抗旱基因而具有极强的抗旱性，植物乙抗旱性弱。若将该抗旱基因转移至植物乙中，有可能提高后者的抗旱性。目前，基因工程中使用的限制酶主要是从原核生物中分离纯化获得的。含有限制酶的细胞通常还具有相应的甲基化酶，它可对自身DNA序列进行甲基化修饰。回答下列问题：
(1)使用PCR技术扩增抗旱基因时，可选择图中A、B、C、D四种单链DNA片段中的______作为引物，此过程还需要__________________酶，但不需要解旋酶，这是因为PCR反应利用________使DNA解聚。
(2)原核细胞中的限制酶可切割外源DNA，但不破坏自身DNA，其原因可能是① ；
② 。
答案：(1)B、C　耐高温的DNA聚合　高温
(2)①细胞自身的DNA分子中没有该限制酶的识别序列　
②甲基化酶对细胞自身的DNA序列进行甲基化修饰，限制酶无法识别修饰后的DNA序列
解析：
(1)DNA合成的方向为5'→3'，因此使用PCR技术扩增抗旱基因时，应选用图中的B、C作为引物，该过程需要耐高温的DNA聚合酶，不需要解旋酶，这是因为PCR反应利用高温使DNA解聚。(2)原核细胞中的限制酶可切割外源DNA，但不破坏自身的DNA，可能的原因是①细胞自身DNA分子中没有该限制酶的识别序列；②甲基化酶对细胞自身的DNA序列进行甲基化修饰，限制酶无法识别修饰后的DNA序列。

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