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同步练习5　重组DNA技术的基本工具、基因工程的基本操作程序
一、选择题(本题包括20小题，每小题3分，共60分。每小题只有一个选项符合题目要求。)
1．下列叙述符合基因工程概念的是(　　)
A．在细胞内将DNA进行重组，赋予生物新的遗传特性
B．将人的干扰素基因重组到质粒上后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株
C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株
D．自然界中天然存在的T2噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上
2．(2025·洛阳高二期中)质粒是基因工程中的“分子运输车”，其结构与功能相适应，下列说法错误的是(　　)
A．质粒上含有一个至多个限制酶切割位点，便于外源DNA插入
B．质粒可以携带外源DNA片段进入受体细胞并进行自我复制
C．被用作载体的质粒上常具有某些特殊的标记基因
D．目前常用的质粒主要来自噬菌体或动植物病毒
3．下列关于基因工程的几种工具的叙述，正确的是(　　)
A．DNA连接酶只能连接目的基因与载体的黏性末端
B．限制性内切核酸酶可以将DNA双链切割成两条单链
C．基因工程中使用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等
D．质粒上的抗性基因有利于促进目的基因的表达
4．图1表示某种DNA分子上的多种限制酶切割位点，图2表示EcoRⅠ、BamHⅠ、Sau3AⅠ三种限制酶识别序列和切割位点。下列相关叙述错误的是(　　)
A．获取该目的基因可采用EcoRⅠ和BamHⅠ进行酶切
B．限制酶能使特定碱基序列的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开
C．Sau3AⅠ和BamHⅠ酶切该DNA分子，产生不同的黏性末端
D．能被Sau3AⅠ切割的序列不一定能被BamHⅠ切割
5．(2024·山东，13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是(　　)
A．整个提取过程中可以不使用离心机
B．研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中
C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
6．如图为不同限制酶识别的序列及切割位置(箭头所指)，下列叙述错误的是(　　)
A．图中4种限制酶均不能识别和切割RNA分子内的核苷酸序列
B．若DNA上的碱基随机排列，限制酶NotⅠ切割位点出现频率较其他三种限制酶高
C．酶切时同时使用EcoRⅠ、BamHⅠ两种限制酶是为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化
D．用限制酶BglⅡ切出的目的基因与限制酶BamHⅠ切割的质粒重组后，不能再被这两种酶切开
7．土壤农杆菌侵染植物细胞时，其Ti质粒上的T-DNA片段可转移到植物细胞的基因组中。以Ti质粒作载体，利用农杆菌转化法培育转基因植物。下列相关叙述正确的是(　　)
A．目的基因应插入T-DNA片段外，以防止破坏T-DNA
B．用Ca2＋处理农杆菌，以利于其侵染植物细胞
C．Ti质粒是一种环状DNA分子，属于农杆菌的拟核DNA
D．T-DNA可介导外源DNA整合到植物细胞的染色体DNA上
8．(2025·沧州高二月考)引物在极大程度上决定了PCR的成败，下列关于引物的说法，不正确的是(　　)
A．PCR和生物体内的DNA合成都需要引物，PCR引物一般是单链DNA
B．若引物的C/G碱基含量相对较高，PCR复性阶段的温度需要适当升高
C．在PCR的复性阶段，两种引物分别结合在模板链的3′端和5′端
D．若初始有10个胰岛素基因，PCR中进行10轮循环，至少需要20 460个引物分子
9．下列关于PCR扩增DNA片段及电泳鉴定的叙述，正确的是(　　)
A．PCR反应中，复性阶段需要DNA聚合酶连接磷酸二酯键
B．PCR反应中，延伸阶段需要反应体系中的ATP提供能量
C．电泳时，DNA分子在凝胶中的迁移速率与DNA的大小和构象等有关
D．电泳时，将PCR产物、核酸染料和电泳指示剂混合后注入凝胶加样孔
10．(2025·济宁高二月考)将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88号中，培育耐盐碱海水稻新品种。如图PCR扩增OsMYB56时需要添加引物，应选用的引物组合为(　　)
A．5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TCTGTTGAAT－3′
B．5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TAAGTTGTCT－3′
C．5′－ATTCAACAGA－3′和5′－ATCATCCAAG－3′
D．5′－ATTCAACAGA－3′和5′－GAACCTACTA－3′
11．受伤的双子叶植物能分泌某些酚类物质诱导农杆菌Ti质粒中的Vir基因区段表达，该表达产物能诱导Ti质粒产生一条新的T-DNA单链分子。此单链分子进入植物细胞并整合到染色体后， 通过碱基互补配对形成双链。将目的基因插入T-DNA中，可使目的基因进入植物细胞。下列相关叙述错误的是(　　)
A．借助农杆菌将目的基因导入水稻细胞时需添加酚类物质
B．T-DNA 的整合具有随机性，需经过筛选获得符合要求的转化苗
C．目的基因能够表达依赖T-DNA 上的起始密码子和终止密码子
D．农杆菌中合成新的 T-DNA 单链需要农杆菌细胞提供四种脱氧核糖核苷酸
12．(2024·湖南，5)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是(　　)
A．限制酶失活，更换新的限制酶
B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等
C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA
D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
13．(2025·汉中高二期末)研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。以下说法正确的是(　　)
A．目的基因的筛选与获取是培育转基因生物的核心工作
B．海鱼的抗冻蛋白基因afp是培育抗冻番茄用到的目的基因
C．构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和解旋酶
D．只要检测出番茄细胞中含有afp基因就代表抗冻番茄培育成功
14．干扰素是一种广谱抗病毒制剂，是具有多种功能的活性蛋白质(主要是糖蛋白)，如图表示通过基因工程生产干扰素的部分操作，图中①～④表示相关操作过程。下列分析错误的是(　　)
A．过程③需要用到限制酶和DNA连接酶
B．过程②需用耐高温的DNA聚合酶，其操作的原理是DNA半保留复制
C．过程③要注意干扰素基因(目的基因)上有启动子、终止子及标记基因等
D．过程④表示目的基因的导入，最后必须对干扰素进行功能活性鉴定
15．如图为获得抗除草剂转基因玉米A的技术路线，含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达，其产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。下列叙述错误的是(　　)
A．采用PCR扩增目的基因时，设计的引物间要避免形成氢键
B．为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用两种不同的限制酶
C．检测是否转化成功，需要依次利用抗生素抗性基因和报告基因
D．利用T-DNA可以将目的基因插入农杆菌的染色体DNA上
16．(2025·滨州高二期末)某生物兴趣小组进行了DNA的粗提取与鉴定实验，实验材料为不同温度(20 ℃、－20 ℃)条件下保存的花菜、辣椒和蒜黄，DNA鉴定结果如图所示，其中吸光相对值越高表示DNA含量相对越多。下列说法错误的是(　　)
A．高温导致DNA变性但不影响二苯胺试剂与DNA的显色反应
B．相同温度条件下，该实验中使用蒜黄能提取到更多的DNA
C．使用同种实验材料的情况下，低温环境抑制了DNA水解酶的活性从而提高了DNA的提取量
D．DNA粗提取时将研磨液离心，应在沉淀物中加入体积分数为95%的预冷酒精溶液来提取DNA
17．(2025·徐州高二期中)科学家通过改变一种名为NR2B的基因研制出了转基因超级小鼠Hobbie-J，Hobbie-J比普通老鼠更加聪明，大脑运转更加迅速，它能够轻松完成迷宫任务。下列关于Hobbie-J产生过程的叙述，正确的是(　　)
A．通过PCR技术扩增NR2B基因的前提是已知该基因全部的核苷酸序列
B．改变后的NR2B基因作为目的基因，可直接注入小鼠受精卵内
C．启动子和终止密码子均在NR2B基因转录时发挥作用
D．可采用PCR等技术检测改变后的NR2B基因是否导入小鼠体内
18．(2025·石家庄高二期中)花粉管通道法是我国科学家独创的外源基因转化的方法之一。在植物受粉的特定时期，将外源DNA溶液涂于柱头，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵，相关过程如图所示。下列有关分析不正确的是(　　)
A．基因表达载体含有外源基因、启动子和终止子等元件
B．基因表达载体中的标记基因有利于重组DNA分子的筛选
C．外源基因进入植物受精卵后会替换植物基因组中的等位基因
D．相比于农杆菌转化法，花粉管通道法一般可省去植物组织培养步骤
19．RT－PCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式反应相结合的技术，可利用此技术获取目的基因，具体过程如图所示。下列说法不正确的是(　　)
A．设计扩增目的基因的引物时需考虑目的基因两端的碱基序列
B．G/C含量高的引物在与模板链结合时，需要更高的温度
C．该技术用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度
D．过程Ⅰ需要加入缓冲液、原料、耐高温的DNA聚合酶和引物A等
20．某研究小组构建了能表达 ACTA1－GFP 融合蛋白的重组质粒，该重组质粒的部分结构如图所示。下列叙述错误的是(　　)
注：F1和F2表示上游引物，R1和R2表示下游引物。
A．RNA聚合酶与启动子结合，调控ACTA1基因和GFP基因的表达
B．使用F2和R2一对引物，可以确定ACTA1基因插入方向是否正确
C．ACTA1基因转录的模板链是a链，引物F1与b链的部分序列相同
D．为了减少PCR中非特异性条带的产生，可以适当升高复性的温度
二、非选择题(本题包括3小题，共40分。)
21．(12分)人体肝脏细胞中的乙醛脱氢酶2(ALDH2)是人体酒精代谢中的关键酶。如图表示利用基因工程生产ALDH2过程中使用的质粒及目的基因的部分结构，β-半乳糖苷酶(LacZ基因编码产生)能分解无色的X－gal产生蓝色物质。图中氨苄青霉素抗性基因、β-半乳糖苷酶基因、目的基因的序列中分别含有1种、5种、2种限制酶的识别序列及切割位点。
(1)(3分)构建基因表达载体时一般至少需要两种限制酶，以防止__________________和__________________。设计启动子的作用是__________________。
(2)为了使目的基因与载体能正确连接，应在扩增的目的基因A、B两端分别引入________和______________两种不同限制酶的识别序列。
(3)(3分)MunⅠ酶切后的末端与EcoRⅠ酶切后的末端能连接，原因是______________
________________________________________________________________________。
(4)以大肠杆菌为受体细胞，在筛选插入ALDH2基因成功的受体细胞时，除营养物质外，还要在培养基中加入的物质有___________________________________________________。
22．(14分)普通棉花中β-甘露糖苷酶基因(GhMnaA2)表达出的3-甘露糖苷酶能催化半纤维素降解，使棉纤维长度变短。为了培育长绒棉，科研人员构建了反义GhMnaA2基因表达载体，获得了转基因长绒棉新品种，具体过程如图所示，SmaⅠ、NotⅠ、HindⅢ和BamHⅠ为酶切位点，LB为T-DNA左边界，RB为T-DNA右边界。回答下列问题：
(1)过程①中不用限制酶NotⅠ的原因是_______________________________________
________________________________________________________________________。
GhMnaA2的序列中包含内含子等序列，可增大重组质粒的分子量，使导入效率降低，请提出一个解决此问题的方案：_____________________________________________________
__________________________________________________________________________。
(2)过程②在培养基中添加__________可将含有重组质粒的农杆菌筛选出来。反义表达载体T-DNA区段的________________________________片段整合到棉花细胞的染色体中，并在翻译过程中起作用。
(3)(2分)过程③中目的基因导入棉花细胞后，可采用__________技术从分子水平上检测目的基因是否插入染色体；个体水平上的检测为____________________________。
(4)(4分)由图分析可知，转基因长绒棉棉纤维较普通棉棉纤维长的原因是______________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________。
23．(14分)(2024·河北，22)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。回答下列问题：
(1)(4分)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN
仅在水稻胚乳表达，GtP应为______________的启动子。Nos为终止子，其作用为____________。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶______________和____________对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。
(2)(3分)利用____________方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测________________，通过______________技术检测是否翻译出r2HN蛋白。
(3)(3分)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合子植株的占比为________。选择纯合子进行后续研究的原因是______________________。
(4)(2分)制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的CD8＋T细胞(细胞毒性T细胞)水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的________免疫和________免疫。
(5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是____________________________(答出两点即可)。
同步练习5　重组DNA技术的基本工具、基因工程的基本操作程序
一、选择题(本题包括20小题，每小题3分，共60分。每小题只有一个选项符合题目要求。)
1．下列叙述符合基因工程概念的是(　　)
A．在细胞内将DNA进行重组，赋予生物新的遗传特性
B．将人的干扰素基因重组到质粒上后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株
C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株
D．自然界中天然存在的T2噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上
答案　B
解析　基因工程是指在生物体外将DNA进行重组，赋予生物新的遗传特性，A不符合题意；用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株，属于诱变育种，C不符合题意；T2噬菌体的DNA整合到细菌DNA上不是人为操作的，不属于基因工程的范畴，D不符合题意。
题点　基因工程的概念
2．(2025·洛阳高二期中)质粒是基因工程中的“分子运输车”，其结构与功能相适应，下列说法错误的是(　　)
A．质粒上含有一个至多个限制酶切割位点，便于外源DNA插入
B．质粒可以携带外源DNA片段进入受体细胞并进行自我复制
C．被用作载体的质粒上常具有某些特殊的标记基因
D．目前常用的质粒主要来自噬菌体或动植物病毒
答案　D
解析　质粒上含有一个至多个限制酶切割位点，能够给外源DNA片段插入提供更多的选择，便于外源DNA片段插入，A正确；被用作载体的质粒上常具有某些特殊的标记基因，便于筛选含有目的基因的受体细胞，C正确；目前常用的质粒主要来自原核生物，病毒不含质粒，D错误。
题点　载体的条件
3．下列关于基因工程的几种工具的叙述，正确的是(　　)
A．DNA连接酶只能连接目的基因与载体的黏性末端
B．限制性内切核酸酶可以将DNA双链切割成两条单链
C．基因工程中使用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等
D．质粒上的抗性基因有利于促进目的基因的表达
答案　C
解析　DNA连接酶使目的基因与载体的黏性末端或平末端形成磷酸二酯键，实现末端的黏合，形成重组DNA分子，A错误；限制性内切核酸酶可将一个DNA双链片段切割成两个DNA分子片段，而不是切割成两条单链，B错误；基因工程中使用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等，且所用的载体通常是在天然质粒基础上经人工改造后形成的，C正确；质粒上的抗性基因有利于筛选含目的基因的细胞，但不能促进目的基因的表达，D错误。
题点　重组DNA技术的基本工具综合分析
4．图1表示某种DNA分子上的多种限制酶切割位点，图2表示EcoRⅠ、BamHⅠ、Sau3AⅠ三种限制酶识别序列和切割位点。下列相关叙述错误的是(　　)
A．获取该目的基因可采用EcoRⅠ和BamHⅠ进行酶切
B．限制酶能使特定碱基序列的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开
C．Sau3AⅠ和BamHⅠ酶切该DNA分子，产生不同的黏性末端
D．能被Sau3AⅠ切割的序列不一定能被BamHⅠ切割
答案　C
解析　EcoRⅠ和BamHⅠ的酶切位点位于目的基因的两侧，二者的识别序列不同，用EcoRⅠ和BamHⅠ切割目的基因，产生的末端不同，可防止构建基因表达载体时目的基因自连，A正确；限制酶能使特定碱基序列的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，B正确；Sau3AⅠ和BamHⅠ识别的碱基序列不同，但二者切割目的基因时产生的黏性末端相同，C错误；Sau3AⅠ识别的序列，BamHⅠ不一定能识别，所以能被Sau3AⅠ切割的序列不一定能被BamHⅠ切割，D正确。
题点　限制酶的类型及识别序列
5．(2024·山东，13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是(　　)
A．整个提取过程中可以不使用离心机
B．研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中
C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
答案　A
解析　研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B错误；鉴定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变，C错误；加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5分钟以上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较为明显的显色反应，仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D错误。
题点　DNA的粗提取与鉴定的拓展应用
6．如图为不同限制酶识别的序列及切割位置(箭头所指)，下列叙述错误的是(　　)
A．图中4种限制酶均不能识别和切割RNA分子内的核苷酸序列
B．若DNA上的碱基随机排列，限制酶NotⅠ切割位点出现频率较其他三种限制酶高
C．酶切时同时使用EcoRⅠ、BamHⅠ两种限制酶是为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化
D．用限制酶BglⅡ切出的目的基因与限制酶BamHⅠ切割的质粒重组后，不能再被这两种酶切开
答案　B
解析　由于限制酶NotⅠ识别的序列比其他三种限制酶的序列长，若DNA上的碱基随机排列，限制酶NotⅠ切割位点出现频率较其他三种限制酶低，B错误。
题点　限制酶的类型及识别序列
7．土壤农杆菌侵染植物细胞时，其Ti质粒上的T-DNA片段可转移到植物细胞的基因组中。以Ti质粒作载体，利用农杆菌转化法培育转基因植物。下列相关叙述正确的是(　　)
A．目的基因应插入T-DNA片段外，以防止破坏T-DNA
B．用Ca2＋处理农杆菌，以利于其侵染植物细胞
C．Ti质粒是一种环状DNA分子，属于农杆菌的拟核DNA
D．T-DNA可介导外源DNA整合到植物细胞的染色体DNA上
答案　D
解析　农杆菌的Ti质粒上的T-DNA可转移到受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体DNA上，根据农杆菌的这一特点，目的基因应插入T-DNA片段中，通过农杆菌的转化作用，把目的基因整合到植物细胞染色体的DNA上，A错误，D正确；用Ca2＋处理农杆菌，有利于基因表达载体导入农杆菌，B错误；Ti质粒是一种环状DNA分子，独立于农杆菌拟核DNA之外，C错误。
题点　转化概念、农杆菌转化法分析
8．(2025·沧州高二月考)引物在极大程度上决定了PCR的成败，下列关于引物的说法，不正确的是(　　)
A．PCR和生物体内的DNA合成都需要引物，PCR引物一般是单链DNA
B．若引物的C/G碱基含量相对较高，PCR复性阶段的温度需要适当升高
C．在PCR的复性阶段，两种引物分别结合在模板链的3′端和5′端
D．若初始有10个胰岛素基因，PCR中进行10轮循环，至少需要20 460个引物分子
答案　C
解析　PCR和生物体内的DNA合成都需要引物，生物体内的DNA复制引物通常是RNA，PCR反应中引物一般是单链DNA，A正确；G与C之间有3个氢键，稳定性高，若引物的C/G碱基含量相对较高，PCR复性阶段的温度需要适当升高，B正确；在PCR的复性阶段，两种引物都结合在模板链的3′端，C错误；若初始有10个胰岛素基因，PCR中进行10轮循环，得到10×210＝10 240(个)DNA分子，共10 240×2＝20 480(条)链，由于初始的20条链不需要引物，故至少需要20 480－20＝20 460(个)引物分子，D正确。
题点　PCR的引物选择、数量分析
9．下列关于PCR扩增DNA片段及电泳鉴定的叙述，正确的是(　　)
A．PCR反应中，复性阶段需要DNA聚合酶连接磷酸二酯键
B．PCR反应中，延伸阶段需要反应体系中的ATP提供能量
C．电泳时，DNA分子在凝胶中的迁移速率与DNA的大小和构象等有关
D．电泳时，将PCR产物、核酸染料和电泳指示剂混合后注入凝胶加样孔
答案　C
解析　PCR反应中，复性阶段，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，延伸阶段，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶作用下，合成新的DNA链，A错误；PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，C正确；核酸染料在制备凝胶时加入，将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内，留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物，D错误。
题点　DNA片段的扩增及电泳鉴定的原理
10．(2025·济宁高二月考)将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88号中，培育耐盐碱海水稻新品种。如图PCR扩增OsMYB56时需要添加引物，应选用的引物组合为(　　)
A．5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TCTGTTGAAT－3′
B．5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TAAGTTGTCT－3′
C．5′－ATTCAACAGA－3′和5′－ATCATCCAAG－3′
D．5′－ATTCAACAGA－3′和5′－GAACCTACTA－3′
答案　A
解析　—端为DNA链的5′端，—OH端为DNA链的3′端。进行PCR时，引物与模板链的3′端结合(DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸)，因此在扩增OsMYB56时需要添加的引物是5′—CTTGGATGAT—3′和5′—TCTGTTGAAT—3′，A正确。
题点　PCR的引物选择、数量分析
11．受伤的双子叶植物能分泌某些酚类物质诱导农杆菌Ti质粒中的Vir基因区段表达，该表达产物能诱导Ti质粒产生一条新的T-DNA单链分子。此单链分子进入植物细胞并整合到染色体后， 通过碱基互补配对形成双链。将目的基因插入T-DNA中，可使目的基因进入植物细胞。下列相关叙述错误的是(　　)
A．借助农杆菌将目的基因导入水稻细胞时需添加酚类物质
B．T-DNA 的整合具有随机性，需经过筛选获得符合要求的转化苗
C．目的基因能够表达依赖T-DNA 上的起始密码子和终止密码子
D．农杆菌中合成新的 T-DNA 单链需要农杆菌细胞提供四种脱氧核糖核苷酸
答案　C
解析　农杆菌容易侵染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有侵染能力，因为多数单子叶植物不能合成酚类化合物，借助农杆菌将目的基因导入水稻(单子叶植物)细胞时需添加酚类物质，A正确；目的基因能够表达依赖T-DNA上的启动子和终止子，C错误。
题点　转化概念、农杆菌转化法分析
12．(2024·湖南，5)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是(　　)
A．限制酶失活，更换新的限制酶
B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等
C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA
D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
答案　B
解析　限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确；在酶切条件不合适时，可能会出现DNA完全没有被酶切的情况，需要调整反应条件如温度、pH等，但调整酶的用量没有作用，B错误；质粒DNA突变可能会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒DNA，C正确；质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。
题点　限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
13．(2025·汉中高二期末)研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。以下说法正确的是(　　)
A．目的基因的筛选与获取是培育转基因生物的核心工作
B．海鱼的抗冻蛋白基因afp是培育抗冻番茄用到的目的基因
C．构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和解旋酶
D．只要检测出番茄细胞中含有afp基因就代表抗冻番茄培育成功
答案　B
解析　基因表达载体的构建是培育转基因生物的核心工作，A错误；实验目的是获得抗冻的番茄品种，因此抗冻蛋白基因afp属于目的基因，B正确；构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶，不需要解旋酶，C错误；只有番茄具有抗冻性才能代表抗冻番茄培育成功，D错误。
题点　基因工程的基本操作程序综合
14．干扰素是一种广谱抗病毒制剂，是具有多种功能的活性蛋白质(主要是糖蛋白)，如图表示通过基因工程生产干扰素的部分操作，图中①～④表示相关操作过程。下列分析错误的是(　　)
A．过程③需要用到限制酶和DNA连接酶
B．过程②需用耐高温的DNA聚合酶，其操作的原理是DNA半保留复制
C．过程③要注意干扰素基因(目的基因)上有启动子、终止子及标记基因等
D．过程④表示目的基因的导入，最后必须对干扰素进行功能活性鉴定
答案　C
解析　过程③表示基因表达载体的构建，该过程需要限制酶和DNA连接酶的作用，A正确；过程②表示通过PCR技术扩增目的基因，其利用原理是DNA半保留复制，该过程需用到耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)，B正确；过程③要注意最终构建的基因表达载体上有干扰素基因、启动子、终止子及标记基因，C错误；过程④表示目的基因的导入，最后必须对酵母菌分泌的干扰素与人体内干扰素的功能活性进行比较，以确定转基因产品的功能活性与人体的相同，D正确。
题点　基因工程的基本操作程序后三步综合
15．如图为获得抗除草剂转基因玉米A的技术路线，含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达，其产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。下列叙述错误的是(　　)
A．采用PCR扩增目的基因时，设计的引物间要避免形成氢键
B．为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用两种不同的限制酶
C．检测是否转化成功，需要依次利用抗生素抗性基因和报告基因
D．利用T-DNA可以将目的基因插入农杆菌的染色体DNA上
答案　D
解析　采用PCR扩增目的基因时，设计的引物与模板链结合，则引物间不能形成氢键，A正确；为防止酶切产物自身环化，构建基因表达载体时一般选择两种不同的限制酶，产生不同的黏性末端，B正确；利用抗生素抗性基因可检测基因表达载体是否导入农杆菌，报告基因可检测目的基因是否转化成功，C正确；利用T-DNA可将目的基因插入植物细胞的染色体DNA上，D错误。
题点　基因工程的基本操作程序综合
16．(2025·滨州高二期末)某生物兴趣小组进行了DNA的粗提取与鉴定实验，实验材料为不同温度(20 ℃、－20 ℃)条件下保存的花菜、辣椒和蒜黄，DNA鉴定结果如图所示，其中吸光相对值越高表示DNA含量相对越多。下列说法错误的是(　　)
A．高温导致DNA变性但不影响二苯胺试剂与DNA的显色反应
B．相同温度条件下，该实验中使用蒜黄能提取到更多的DNA
C．使用同种实验材料的情况下，低温环境抑制了DNA水解酶的活性从而提高了DNA的提取量
D．DNA粗提取时将研磨液离心，应在沉淀物中加入体积分数为95%的预冷酒精溶液来提取DNA
答案　D
解析　在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，所以高温导致DNA变性但不影响二苯胺试剂与DNA的显色反应，A正确；由图可知，相同温度条件下，该实验中蒜黄的吸光相对值最高，表示能提取到更多的DNA，B正确；同种实验材料在－20 ℃条件下DNA粗提取含量更高，其原因可能是与20 ℃相比，－20 ℃的低温抑制了DNA水解酶的活性，从而提高了DNA的提取量，C正确；DNA粗提取时将研磨液离心，应在上清液中加入体积分数为95%的预冷酒精溶液来提取DNA，D错误。
题点　DNA的粗提取与鉴定的材料选择
17．(2025·徐州高二期中)科学家通过改变一种名为NR2B的基因研制出了转基因超级小鼠Hobbie-J，Hobbie-J比普通老鼠更加聪明，大脑运转更加迅速，它能够轻松完成迷宫任务。下列关于Hobbie-J产生过程的叙述，正确的是(　　)
A．通过PCR技术扩增NR2B基因的前提是已知该基因全部的核苷酸序列
B．改变后的NR2B基因作为目的基因，可直接注入小鼠受精卵内
C．启动子和终止密码子均在NR2B基因转录时发挥作用
D．可采用PCR等技术检测改变后的NR2B基因是否导入小鼠体内
答案　D
解析　通过PCR技术扩增NR2B基因的前提是掌握NR2B基因的两端的部分核苷酸序列，以便合成引物，A错误；改变后的NR2B基因作为目的基因，需要先构建基因表达载体，然后将构建好的基因表达载体通过一定方式进入小鼠受精卵内，B错误；启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，可用于驱动基因的转录，而终止密码子位于mRNA上，与基因的翻译过程有关，C错误。
题点　基因工程的基本操作程序综合
18．(2025·石家庄高二期中)花粉管通道法是我国科学家独创的外源基因转化的方法之一。在植物受粉的特定时期，将外源DNA溶液涂于柱头，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵，相关过程如图所示。下列有关分析不正确的是(　　)
A．基因表达载体含有外源基因、启动子和终止子等元件
B．基因表达载体中的标记基因有利于重组DNA分子的筛选
C．外源基因进入植物受精卵后会替换植物基因组中的等位基因
D．相比于农杆菌转化法，花粉管通道法一般可省去植物组织培养步骤
答案　C
解析　基因表达载体的组成包括外源基因、启动子、终止子、标记基因等组件，其中标记基因的作用是便于重组DNA分子的筛选，A、B正确；外源DNA进入受精卵后，不会替换植物基因组中的等位基因，而是整合到染色体的DNA上，即插入植物基因组中，从而实现复制和表达，C错误；花粉管通道法可以直接实现转基因植物的自然生成，而农杆菌转化法需要对成功导入目的基因的受体细胞进行植物组织培养获得转基因植物，花粉管通道法则避免了植物组织培养这一操作，D正确。
题点　将目的基因导入受体细胞综合
19．RT－PCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式反应相结合的技术，可利用此技术获取目的基因，具体过程如图所示。下列说法不正确的是(　　)
A．设计扩增目的基因的引物时需考虑目的基因两端的碱基序列
B．G/C含量高的引物在与模板链结合时，需要更高的温度
C．该技术用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度
D．过程Ⅰ需要加入缓冲液、原料、耐高温的DNA聚合酶和引物A等
答案　D
解析　过程Ⅰ表示逆转录，所以需要加入缓冲液、原料、逆转录酶和引物A等，D错误。
题点　PCR扩增的过程
20．某研究小组构建了能表达 ACTA1－GFP 融合蛋白的重组质粒，该重组质粒的部分结构如图所示。下列叙述错误的是(　　)
注：F1和F2表示上游引物，R1和R2表示下游引物。
A．RNA聚合酶与启动子结合，调控ACTA1基因和GFP基因的表达
B．使用F2和R2一对引物，可以确定ACTA1基因插入方向是否正确
C．ACTA1基因转录的模板链是a链，引物F1与b链的部分序列相同
D．为了减少PCR中非特异性条带的产生，可以适当升高复性的温度
答案　B
解析　据图可知，引物F1、R2或F2、R1结合部位包含ACTA1基因的碱基序列，因此为了确定ACTA1基因插入方向是否正确，进行PCR检测时，若用一对引物，应选择图中的引物F1、R2或F2、R1，B错误；ACTA1基因转录的模板链是a链，引物F1与b链均可以和a链互补配对，二者部分序列相同，C正确。
题点　基因表达载体的构建过程及实例分析
二、非选择题(本题包括3小题，共40分。)
21．(12分)人体肝脏细胞中的乙醛脱氢酶2(ALDH2)是人体酒精代谢中的关键酶。如图表示利用基因工程生产ALDH2过程中使用的质粒及目的基因的部分结构，β-半乳糖苷酶(LacZ基因编码产生)能分解无色的X－gal产生蓝色物质。图中氨苄青霉素抗性基因、β-半乳糖苷酶基因、目的基因的序列中分别含有1种、5种、2种限制酶的识别序列及切割位点。
(1)(3分)构建基因表达载体时一般至少需要两种限制酶，以防止__________________和__________________。设计启动子的作用是__________________。
(2)为了使目的基因与载体能正确连接，应在扩增的目的基因A、B两端分别引入________和______________两种不同限制酶的识别序列。
(3)(3分)MunⅠ酶切后的末端与EcoRⅠ酶切后的末端能连接，原因是______________
________________________________________________________________________。
(4)以大肠杆菌为受体细胞，在筛选插入ALDH2基因成功的受体细胞时，除营养物质外，还要在培养基中加入的物质有___________________________________________________。
答案　(1)质粒或目的基因自身环化　目的基因与质粒反向连接　使目的基因正常转录(表达)(2)XhoⅠ　MunⅠ　(3)MunⅠ与EcoRⅠ酶切后的黏性末端相同(可以互补配对)　(4)氨苄青霉素和X－gal
解析　(1)构建基因表达载体时若只用一种限制酶，可能会出现质粒或目的基因自身环化、目的基因与质粒反向连接等问题，因此一般至少需要两种限制酶，以避免这些问题。启动子是转录的起点，设计启动子的作用是使目的基因正常转录(表达)。(2)由于目的基因内含有SalⅠ和NheⅠ的酶切位点，因此不能选用这两种酶，而EcoRⅠ会同时破坏氨苄青霉素抗性基因、β-半乳糖苷酶基因而失去标记基因，也不能选用，所以选择XhoⅠ、MunⅠ。根据质粒的启动子位置、转录方向和目的基因的转录方向，A、B两端分别引入XhoⅠ、MunⅠ的识别序列。(3)MunⅠ酶切后的黏性末端序列为AATT－，EcoRⅠ酶切后的黏性末端序列也为AATT－，两者相同(可以互补配对)，所以可以连接。(4)通过能够在氨苄青霉素中生存筛选出导入质粒的细胞，再通过不能使X－gal产生蓝色，筛选出其中导入重组质粒的细胞，就是插入ALDH2基因成功的受体细胞，即需要在培养基中加入氨苄青霉素和X－gal，进而可以选择抗氨苄青霉素且菌落呈白色的受体细胞。
题点　基因工程的基本操作程序综合
22．(14分)普通棉花中β-甘露糖苷酶基因(GhMnaA2)表达出的3-甘露糖苷酶能催化半纤维素降解，使棉纤维长度变短。为了培育长绒棉，科研人员构建了反义GhMnaA2基因表达载体，获得了转基因长绒棉新品种，具体过程如图所示，SmaⅠ、NotⅠ、HindⅢ和BamHⅠ为酶切位点，LB为T-DNA左边界，RB为T-DNA右边界。回答下列问题：
(1)过程①中不用限制酶NotⅠ的原因是_______________________________________
________________________________________________________________________。
GhMnaA2的序列中包含内含子等序列，可增大重组质粒的分子量，使导入效率降低，请提出一个解决此问题的方案：_____________________________________________________
__________________________________________________________________________。
(2)过程②在培养基中添加__________可将含有重组质粒的农杆菌筛选出来。反义表达载体T-DNA区段的________________________________片段整合到棉花细胞的染色体中，并在翻译过程中起作用。
(3)(2分)过程③中目的基因导入棉花细胞后，可采用__________技术从分子水平上检测目的基因是否插入染色体；个体水平上的检测为____________________________。
(4)(4分)由图分析可知，转基因长绒棉棉纤维较普通棉棉纤维长的原因是______________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________。
答案　(1)限制酶NotⅠ会破坏目的基因，且质粒上没有NotⅠ的切割位点　从棉花细胞中提取GhMnaA2的mRNA，逆转录获得GhMnaA2的cDNA　(2)抗生素　E6启动子和GhMnaA2基因　(3)PCR　观察转基因棉花的棉纤维是否变长　(4)转基因长绒棉细胞内的反义GhMnaA2基因转录的mRNA能与细胞内的GhMnaA2基因转录的mRNA互补配对，从而抑制GhMnaA2基因的表达，缺少3-甘露糖苷酶，半纤维素不被降解，从而使转基因长绒棉的棉纤维长于普通棉花
题点　基因工程的基本操作程序综合
23．(14分)(2024·河北，22)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。回答下列问题：
(1)(4分)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN
仅在水稻胚乳表达，GtP应为______________的启动子。Nos为终止子，其作用为____________。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶______________和____________对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。
(2)(3分)利用____________方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测________________，通过______________技术检测是否翻译出r2HN蛋白。
(3)(3分)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合子植株的占比为________。选择纯合子进行后续研究的原因是______________________。
(4)(2分)制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的CD8＋T细胞(细胞毒性T细胞)水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的________免疫和________免疫。
(5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是____________________________(答出两点即可)。
答案　(1)水稻胚乳细胞中特异表达的基因　终止转录　HindⅢ　EcoRⅠ　(2)农杆菌转化　r2HN是否转录出了mRNA　抗原—抗体杂交(3)1/4　纯合子自交后代不发生性状分离　(4)体液　细胞　(5)不受性别的限制、可大量种植、成本低、安全性高
解析　(1)根据题意可知，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP(启动子)应为水稻胚乳中特异表达的基因的启动子。Nos为终止子，其作用为终止转录过程。GtP内部含有KpnⅠ的酶切位点，用KpnⅠ酶切会破坏启动子，Nos下游含有SacⅠ的酶切位点，用SacⅠ酶切会使重组基因表达载体缺失终止子，故构建基因表达载体时，可选择限制酶HindⅢ和EcoRⅠ对r2HN基因与载体进行酶切。(2)水稻是单子叶植物，可用农杆菌转化法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN基因表达情况，可用PCR技术检测r2HN基因是否转录出了mRNA，若要检测r2HN基因是否翻译出r2HN蛋白，可用抗原—抗体杂交技术。(3)选择单一位点插入目的基因的植株(用RO表示)进行自交一代，根据分离定律，r2HN纯合子植株(RR)占1/4，无r2HN基因的纯合子植株(OO)占1/4，杂合子植株(RO)占1/2。由于纯合子植株遗传性状稳定，故选择r2HN纯合子植株进行后续研究。(4)通过体液免疫，机体可产生较多相应抗体，通过细胞免疫，机体可产生较多细胞毒性T细胞。据题图可知，实验组的抗体和CD8＋T细胞(细胞毒性T细胞)水平明显高于对照组，因此获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的体液免疫和细胞免疫。
题点　基因工程的基本操作程序综合

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