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专题19 PCR技术和电泳
考情分析：真题考点分布+命题趋势+备考策略+命题预测
培优讲练：考点梳理+解题秘籍+对点训练
考点01 基础原理
考点02 操作细节
考点03 应用拓展
提升冲关：题型过关练（2大题型）+能力提升练
【高考真题考点分布】
高考考点 三年考情
基础原理 2024·新课标卷，2023·浙江6月，2024·湖南
操作细节 2025·黑吉辽蒙，2024·湖南，2024·河北
应用拓展 2025·山东，2024·黑吉辽蒙，2023·重庆
PCR技术和电泳是高考生物分子生物学的核心考点，命题聚焦“原理应用 + 技术变式 + 情境探究 + 结果分析”，需以“深度理解原理、突破技术变式、强化情境建模”为核心备考。
【命题趋势】
1．考查核心：原理与细节并重
聚焦 PCR 核心步骤（变性、退火、延伸）的温度条件、反应本质，以及电泳中 DNA/蛋白质的迁移规律。
深挖关键要素作用，如 PCR 引物的设计原则、DNA聚合酶的特性，电泳凝胶浓度与片段大小的关系。
2．题型特点：技术变式与情境融合
PCR 技术常考查特殊类型应用，包括 RT-PCR、巢式PCR、降落PCR等变式的原理与优势。
依托真实科研情境命题，如基因编辑、病原体检测、品种培育等，结合实验设计或结果分析设问。
电泳多与 PCR 联动考查，通过电泳图谱分析扩增产物的纯度、大小及实验成败原因。
3．素养导向：凸显科学探究与思维
要求学生根据实验目的选择合适的 PCR 技术或电泳方法，设计引物或优化反应条件。
需解读电泳图谱、温度变化曲线等数据，分析非特异性扩增、无扩增条带等异常结果的成因。
【备考策略】
1．夯实核心知识，构建逻辑网络
梳理 PCR 技术“原理 - 步骤 - 条件 - 变式”逻辑链，明确常规 PCR 与特殊类型的差异，如长片段 PCR 需延长延伸时间，高 GC 含量 PCR 需优化缓冲液成分。
区分两种电泳技术的适用场景：琼脂糖凝胶电泳用于 PCR 产物鉴定，SDS - 聚丙烯酰胺凝胶电泳用于蛋白质分子量测定。
强化关键细节记忆，如引物长度（18-25 个核苷酸）、各步骤温度范围、DNA 迁移速度与分子量的负相关关系。
2．突破技术变式，掌握应用场景
分类总结特殊 PCR 技术的核心优势与适用情境，如巢式PCR 提高特异性，适用于低丰度模板检测；热启动 PCR 减少非特异性扩增。
结合典型例题分析变式技术的命题切入点，如通过流程图考查巢式 PCR 的两轮扩增原理，通过对比表格考查不同 PCR 的条件差异。
3．强化情境建模，提升解题能力
针对“PCR + 电泳”联动题型，构建“实验目的→技术选择→反应条件→结果分析”的解题模型，如根据电泳条带位置判断产物大小，根据条带数量判断扩增特异性。
精选科研情境真题，训练学生从题干中提取关键信息（如引物序列、酶切位点、温度程序）的能力，以及结合原理分析实验结果的逻辑思维。
4．易错点专项突破
纠正认知误区，如引物结合的是模板链的 3' 端一侧、DNA 聚合酶的延伸方向是 5'→3'、电泳时 DNA 向正极移动。
针对高频易错点专项训练，如引物设计的合理性判断、PCR 反应条件的优化分析、电泳异常结果的原因推导。
【命题预测】
1．基础原理类
可能以流程图或表格形式考查 PCR 核心步骤的温度、反应本质及各成分作用，或对比常规 PCR 与 RT-PCR 的过程差异。
电泳部分可能考查迁移规律的应用，如根据片段大小选择凝胶浓度，或分析影响迁移速度的因素。
2．技术变式类
大概率考查巢式 PCR、降落 PCR 或高 GC 含量 PCR 的原理与优势，可能结合实验设计设问，如设计引物组合或优化反应条件。
可能出现 RT-PCR 与病毒检测结合的情境题，考查技术应用与结果分析。
3．情境探究类
热点方向为 “基因编辑 + PCR + 电泳” 联动，如通过 PCR 扩增目标基因，结合酶切与电泳鉴定编辑是否成功。
可能创设未知模板扩增情境，要求根据电泳结果判断实验成败，并分析引物设计、温度设置等方面的问题。
4．素养拓展类
可能结合科研数据（如电泳图谱、PCR 循环曲线），考查学生的数据解读能力与实验推理能力。
或许会出现开放性问题，如设计实验验证某一基因的存在，要求选择合适的 PCR 技术与电泳方法，并说明理由。
考点01 基础原理
高三复习的核心是搭建 “原理→应用→避坑” 的逻辑链！核心结论：PCR 是体外 DNA 扩增技术，电泳是核酸/蛋白质的分离鉴定技术，二者常结合用于分子生物学实验，解题需紧扣 “原理本质 + 实验条件 + 结果分析”。
1． PCR 技术（多聚酶链式反应）
核心原理：模拟体内DNA复制过程，在体外快速扩增特定DNA片段。
关键条件：模板DNA、引物（2 种，分别结合目的基因两端）、Taq酶（热稳定 DNA 聚合酶）、dNTP（原料）、缓冲液。
反应过程：变性（90-95℃，DNA双链解旋）→复性（55-60℃，引物与模板结合）→延伸（72℃，Taq 酶催化子链合成），循环 20-30 次。
结果：目的 DNA 片段呈指数级扩增（2 ，n 为循环次数）。
2．电泳技术（以琼脂糖凝胶电泳为例）
核心原理：利用核酸分子（带负电）在电场中向正极移动，迁移速率与分子大小、构象、电荷有关。
关键条件：琼脂糖凝胶（作为支持介质）、电泳缓冲液、核酸染料（如EB，显色用）、电源（正极接凝胶下游）。
分离规律：分子越小，迁移速率越快，离加样孔越远；环状DNA比线性 DNA迁移快（相同分子量下）。
应用：鉴定PCR产物（是否扩增出目的片段、片段大小是否符合预期）、DNA片段纯化、基因分型等。
解题大招：直击高考题型
1．PCR 相关题型解题大招
大招1：引物设计判断题 —— 紧扣 “引物与模板互补、不自身互补、不形成引物二聚体”，且引物长度通常 15-30 个核苷酸。
大招2：循环次数与扩增倍数计算 —— 若初始模板为 1 个，n 次循环后目的片段数为 2 （仅考虑特异性扩增），若有杂质模板需排除非特异性产物干扰。
大招3：反应条件分析题 ——Taq 酶的作用温度（72℃延伸）、变性/复性温度的影响（如复性温度过高，引物无法结合；过低则非特异性结合增加）。
2．电泳相关题型解题技巧
大招4：电泳结果分析 —— 先看“Marker（标准分子量条带）”，再对比目的条带位置，判断片段大小（迁移距离与分子量呈负相关）。
大招5：电场方向与条带移动 —— 核酸带负电，从“加样孔端（负极）” 向“另一端（正极）”移动，错题常考“方向颠倒”。
大招6：实验异常分析 —— 无条带可能是引物设计错误、Taq 酶失活（PCR 环节）或电泳缓冲液失效、染料未加（电泳环节）；条带模糊可能是凝胶浓度不当（片段小用高浓度凝胶，片段大用低浓度凝胶）。
3．二者结合题型
大招7：“PCR + 电泳” 实验设计/结果解读 —— 先明确实验目的（如“验证目的基因是否导入受体细胞”），再推导逻辑：提取 DNA→PCR 扩增（用目的基因特异性引物）→电泳鉴定→若出现预期大小条带，则证明成功。
【典例1】（2024·新课标卷）某种二倍体植物的P1和P2植株杂交得F1，F1自交得F2。对个体的DNA进行PCR检测，产物的电泳结果如图所示，其中①～⑧为部分F2个体，上部2条带是一对等位基因的扩增产物，下部2条带是另一对等位基因的扩增产物，这2对等位基因位于非同源染色体上。下列叙述错误的是（ ）
A．①②个体均为杂合体，F2中③所占的比例大于⑤
B．还有一种F2个体的PCR产物电泳结果有3条带
C．③和⑦杂交子代的PCR产物电泳结果与②⑧电泳结果相同
D．①自交子代的PCR产物电泳结果与④电泳结果相同的占
【典例2】（2023·浙江6月）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠 Gata3 基因一端，如图甲所示（注：图甲中启动子位于 Gata3 基因左侧，GFP 基因整合在 Gata3 基因右侧，两者串联）。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各 1 只，交配以期获得 Gata3-GFP 基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的 4 只新生小鼠的基因型，设计了引物 1 和引物 2 用于 PCR 扩增，PCR 产物电泳结果如图乙所示（注：图乙中条带 1 为大片段，条带 2 为小片段）。下列叙述正确的是（ ）
A．Gata3 基因的启动子无法控制 GFP 基因的表达
B．翻译时先合成 Gata3 蛋白，再合成 GFP 蛋白
C．2 号条带的小鼠是野生型，4 号条带的小鼠是 Gata3-GFP 基因纯合子
D．若用引物 1 和引物 3 进行 PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
【典例3】（2024·湖南，多选）最早的双脱氧测序法是在 PCR 反应体系中，分别加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP 或 ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸遵循碱基互补配对原则。以加入 ddATP 的体系为例：若配对的为 ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸（dATP），继续延伸。PCR 产物变性后电泳检测，通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示（注：电泳图中条带位置代表片段长度，从下到上片段逐渐变长）。下列叙述正确的是（ ）
A. 上述 PCR 反应体系中只加入一种引物
B. 电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢
C. 5'-CTACCCGTGAT-3' 为对照个体的一段序列
D. 患者该段序列中某位点的碱基 C 突变为 G
易错提醒！！！
1．PCR 技术易错点
易错1：混淆“Taq 酶”与“普通 DNA 聚合酶”——Taq 酶耐高温，普通 DNA 聚合酶在变性温度下失活，无法用于PCR。
易错2：认为“PCR 需要解旋酶”——PCR 通过高温变性解旋，无需解旋酶；体内 DNA 复制需解旋酶和ATP。
易错3：引物结合位置错误 —— 引物结合的是目的基因的“互补链”，而非直接结合目的基因的编码链，解题时需注意碱基互补配对。
易错4：扩增倍数计算忽略“初始模板数量”—— 若初始模板为m个，n次循环后为 m×2n，而非单纯2n。
2． 电泳技术易错点
易错1：核酸电荷判断错误 ——DNA/RNA 均带负电，电泳时向正极移动，而非负极。
易错2：凝胶浓度与片段大小的关系颠倒 —— 片段越小，需用越高浓度的凝胶（如 100bp 片段用 2% 琼脂糖凝胶，1000bp 片段用 1% 琼脂糖凝胶）。
易错3：混淆“条带亮度”与“片段数量”—— 条带亮度反映 DNA 含量（含量越高越亮），与片段大小无关。
易错4：认为 “电泳能分离蛋白质和核酸的原理相同”—— 蛋白质电泳还与等电点有关（如 SDS-PAGE 中 SDS 使蛋白质带负电，消除电荷差异，仅按分子量分离）。
3．二者结合易错点
易错1：PCR 产物电泳无条带，仅考虑 PCR 环节 —— 还可能是电泳时加样孔端接反（条带跑出凝胶）、染料未正确添加（无法显色）。
1．下列关于 PCR 技术和琼脂糖凝胶电泳的叙述，正确的是（ ）
A．PCR 技术中，复性温度过低会导致引物非特异性结合
B．PCR 反应的延伸阶段，DNA 聚合酶催化磷酸二酯键的断裂
C．电泳时，DNA 分子的迁移速率仅与分子大小有关
D．电泳后，DNA 分子需用健那绿染液染色才能观察到
2．利用 PCR 技术扩增某一 DNA 片段，下列关于实验条件的叙述，错误的是（ ）
A．需要四种游离的脱氧核苷三磷酸作为原料
B．需要一对特异性引物引导子链合成
C．反应体系中需加入解旋酶解开双链 DNA
D．反应过程中需控制温度的周期性变化
3．PCR 技术可快速扩增特定 DNA 片段，其基本过程包括变性、复性和延伸。
（1）变性阶段的温度为 90-95℃，目的是将双链 DNA 解旋为________；
（2）复性阶段的温度为 55-60℃，此时________与模板 DNA 的特定序列结合；
（3）延伸阶段的温度为 72℃，需用到的酶是________，该酶的特点是________；
（4）将 PCR 产物进行凝胶电泳，若出现预期条带，说明扩增成功，条带的位置反映了 DNA 片段的________。
考点02 操作细节
操作细节对于提高解题能力很关键！核心结论：PCR 技术聚焦 “反应条件、过程逻辑、引物设计”，电泳操作紧扣 “凝胶类型、迁移规律、结果分析”，解题需抓 “原理 - 操作 - 应用” 的链条，避开 “条件混淆、迁移方向判断错误” 等陷阱。
1．PCR 技术核心知识
（1）定义：体外快速扩增特定 DNA 片段的分子生物学技术，依赖 DNA 聚合酶的催化作用。
（2）反应条件：模板 DNA、引物（两种反向互补）、Taq 酶（耐高温 DNA 聚合酶）、dNTP（原料）、缓冲液（维持 pH）。
（3）反应过程：变性（90-95℃，DNA 双链解旋）→ 复性（55-60℃，引物与模板结合）→ 延伸（72℃，Taq 酶合成子链），循环 25-30 次。
（4）关键特性：特异性由引物决定，高效性来自循环扩增，忠实性依赖 Taq 酶的保真性。
2．电泳操作核心知识
（1）分类：琼脂糖凝胶电泳（分离 DNA 片段，依据分子量和构象）、聚丙烯酰胺凝胶电泳（分离小分子 DNA/蛋白质，分辨率更高）。
（2）原理：带电粒子在电场中向相反电极迁移，DNA 带负电，向正极移动。
（3）操作流程：制胶（加入 EB 或荧光染料，便于观察）→ 点样（加样缓冲液，使样品沉降并指示迁移位置）→ 电泳（控制电压和时间）→ 染色观察（紫外灯下显带）。
（4）迁移规律：DNA 片段分子量越小，迁移速度越快；相同分子量下，线性 DNA 迁移速度＞环状 DNA。
1．PCR 技术解题大招
（1）引物相关计算：引物长度通常 15-30 个核苷酸，需与模板两端反向互补，解题时可根据模板序列直接写出引物序列（注意方向 5’→3’）。
（2）扩增产物计算：若初始模板为n个，循环n次后，理论上产物量为 n×2 （不考虑引物二聚体等杂质），实际产量略低。
（3）条件分析题：题干中出现“耐高温”“快速扩增”，直接关联Taq 酶；出现 “特异性差”，优先考虑引物设计不合理（如引物互补、引物自身折叠）。
2．电泳结果解题大招
（1）片段大小判断：对照 Marker（标准分子量 DNA），迁移距离与 Marker 比对，快速确定目的片段大小。
（2）异常结果分析：无条带可能是模板量不足、引物失效；条带模糊可能是凝胶浓度不当、电压过高；杂带多可能是 PCR 特异性差或电泳污染。
（3）应用场景对应：基因克隆中筛选阳性克隆→电泳检测插入片段；遗传病诊断→PCR 扩增后电泳判断片段有无/大小异常。
【典例1】（2025·黑吉辽蒙）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。

(1)可从________中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入________和________限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用________连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。
(2)进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有________的污染。初步判断实验组________（从“1~4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是________。
(3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有________。
a：5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3'
b：5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3'
c：5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3'
d：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3'
(4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的________含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。
【典例2】（2024·湖南，多选）最早的双脱氧测序法是 PCR 反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP 或 ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入 ddATP 的体系为例：若配对的为 ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸（dATP），继续延伸；PCR 产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A. 上述 PCR 反应体系中只加入一种引物
B. 电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢
C. 5'-CTACCCGTGAT-3' 为对照个体的一段序列
D. 患者该段序列中某位点的碱基 C 突变为 G
【典例3】（2024·河北）新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。
回答下列问题：
(1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为________________启动子。Nos为终止子，其作用为________________。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶________和________对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。
(2)利用________方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测________________，通过________技术检测是否翻译出r2HN蛋白。
(3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合体植株的占比为________。选择纯合体进行后续研究的原因是________。
(4)制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的细胞（细胞毒性T细胞）水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的________免疫和________免疫。
(5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是________________________________。（答出两点即可）
易错提醒！！！
1．PCR 与体内 DNA 复制的混淆：PCR 无需解旋酶（高温变性解旋），体内复制用解旋酶；PCR 用 Taq 酶，体内用普通 DNA 聚合酶；PCR 引物是 DNA，体内复制引物是 RNA。
2．电泳迁移方向错误：易误将 DNA 迁移方向记为 “向负极”，实际因 DNA 带负电，向正极移动。
3．凝胶浓度与片段大小匹配错误：片段越大，需用浓度越低的琼脂糖凝胶（如 10kb 片段用 0.8% 琼脂糖，1kb 片段用 1.2% 琼脂糖）。
4．PCR 循环步骤温度记忆混淆：变性（最高温）、复性（中温）、延伸（中高温），易颠倒复性和延伸的温度。
5．电泳加样缓冲液功能混淆：易忽略其 “指示迁移” 功能，仅记住 “沉降样品”，解题时需完整表述。
1．PCR 技术中三个关键步骤的温度设置依次为（ ）
A. 90-95℃（退火）、55-60℃（变性）、72℃左右（延伸）
B. 90-95℃（变性）、55-60℃（退火）、72℃左右（延伸）
C. 72℃左右（延伸）、90-95℃（变性）、55-60℃（退火）
D. 55-60℃（退火）、90-95℃（变性）、72℃左右（延伸）
2．下列关于凝胶电泳的叙述，错误的是（ ）
A. DNA 分子在电场中向正极移动
B. 凝胶浓度越高，对小分子 DNA 的分离效果越好
C. 电泳后需用特定染料染色才能观察到条带
D. 相同条件下，DNA 片段越长，迁移距离越远
3．某同学用 PCR 技术扩增目标基因，反应体系中缺少一种原料，导致扩增失败。该原料最可能是（ ）
A. 解旋酶 B. Taq DNA 聚合酶 C. 脱氧核苷三磷酸（dNTP） D. 引物
考点03 应用拓展
PCR技术和电泳应用拓展是高三生物核心难点，针对性极强！核心结论：PCR 技术和电泳是分子生物学实验的 “黄金搭档”，知识体系围绕 “原理 - 流程 - 应用” 展开，解题关键在 “场景匹配 + 数据解读”，易错点集中在细节辨析。
1．PCR 技术核心知识
本质：体外 DNA 片段快速扩增技术，模拟体内 DNA 复制过程。
关键组件：模板 DNA、引物（一对，分别结合目的基因两端）、Taq 酶（耐高温 DNA 聚合酶）、dNTP（原料）、缓冲液。
基本流程：变性（90-95℃，DNA 双链解旋）→ 复性（55-60℃，引物与模板结合）→ 延伸（72℃，Taq 酶合成子链），循环 25-30 次。
核心特点：特异性（依赖引物设计）、高效性（指数级扩增，2 倍）、特异性（引物互补配对决定）。
2．电泳技术核心知识
本质：利用带电粒子在电场中迁移速率差异分离物质的技术。
常见类型：琼脂糖凝胶电泳（分离 DNA/RNA 片段，依据分子量和构象）、SDS - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE，分离蛋白质，依据分子量）。
迁移规律：DNA 带负电，电场中向正极移动；片段越小，迁移速率越快（琼脂糖凝胶中）。
关键辅助：染色剂（如 EB、SYBR Green，使 DNA 显色）、Marker（分子量标准，用于估算目的片段大小）。
3．二者关联与应用拓展
核心关联：PCR扩增目的基因后，需通过电泳验证扩增产物的存在、大小是否符合预期（“PCR + 电泳”是分子鉴定的基础组合）。
高频应用场景：
3．基因克隆：PCR 扩增目的基因→电泳筛选阳性扩增产物→连接载体。
遗传病诊断：扩增待测个体相关基因片段→电泳对比正常与异常片段（如镰刀型细胞贫血症的基因片段长度差异）。
病原体检测：（如新冠病毒）PCR 扩增病毒特异性基因→电泳或荧光定量 PCR 判断是否感染。
亲子鉴定/法医鉴定：扩增 STR（短串联重复序列）→电泳分离→对比条带匹配度。
基因编辑验证：扩增编辑后的目的基因→电泳或测序验证是否成功编辑。
1．PCR 相关题型解题步骤
大招1：“引物设计与扩增片段计算”—— 引物结合模板链的互补序列，扩增片段长度 = 引物之间的模板 DNA 长度 + 两条引物长度（若题目未提及引物长度，可忽略）。
大招2：“循环次数与扩增数量计算”—— 理想状态下，扩增产物量 = 初始模板量 ×2 （n 为循环次数），注意 “引物对数” 影响：1 对引物仅扩增 1 种目的片段，多对引物可同时扩增多个片段（多重 PCR）。
大招3：“PCR 异常结果分析”—— 无扩增产物（引物设计不合理、Taq 酶失活、退火温度过高）；杂带过多（退火温度过低、引物非特异性结合、模板污染）。
2．电泳相关题型解题步骤
大招1：“条带解读三步法”—— 第一步看 Marker，确定分子量标准；第二步找目的条带，对比 Marker 估算大小；第三步分析条带深浅（琼脂糖电泳中，条带越亮，DNA 含量越多）。
大招2：“蛋白质电泳与 DNA 电泳区分”—— 关键看 “分离依据”：DNA 电泳看 “片段大小 + 构象”，SDS-PAGE 看 “蛋白质分子量”（SDS 使蛋白质带负电且构象一致，消除电荷影响）。
大招3：“应用场景匹配法”—— 看到 “鉴定基因是否扩增成功”→ PCR + 琼脂糖电泳；看到 “分离不同分子量蛋白质”→ SDS-PAGE；看到 “基因分型 / 亲子鉴定”→ PCR+STR 电泳。
3．综合题型（PCR + 电泳）解题关键
核心逻辑：“目的→流程→结果解读”。
示例：若题目要求 “验证转基因水稻是否含目的基因”，解题思路为：提取水稻基因组 DNA→用目的基因特异性引物进行 PCR→琼脂糖凝胶电泳→若出现与预期大小一致的条带，则含目的基因。
【典例1】（2025·山东）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。
(1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为_____。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和_____对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是_____。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶_____进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为_____bp，则一定为正向重组质粒。
(2)为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为_____（填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段_____，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为_____（填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。
(3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，_____（填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。
【典例2】（2024·黑吉辽蒙）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 产物的实验，下列叙述正确的是（ ）
A. 琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离 DNA 片段的大小
B. 凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示 DNA 分子的具体位置
C. 在同一电场作用下，DNA 片段越长，向负极迁移速率越快
D. 琼脂糖凝胶中的 DNA 分子可在紫光灯下被检测出来
【典例3】（2023·重庆）某小组通过 PCR（假设引物长度为 8 个碱基（短于实际长度））获得了含有目的基因的 DNA 片段，并用限制酶进行酶切（如图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是（ ）
A. 其中一个引物序列为 5'-TGCGCAGT-3'
B. 步骤①所用的酶是 SpeⅠ 和 CfoⅠ
C. 用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了 2 个片段
D. 酶切片段和载体连接时，可使用 E.coli 连接酶或 T4 连接酶
易错提醒！！！
1．PCR 技术易错点
易错点1：混淆 “Taq 酶” 与 “普通 DNA 聚合酶”—— Taq 酶耐高温（适应 PCR 变性步骤的高温），普通 DNA 聚合酶在 90℃以上失活，不可替代.
易错点2：误解 “引物的作用”—— 引物是 DNA 合成的起点（提供 3’-OH 末端），不能替代模板；引物必须与模板链互补，且一对引物分别结合两条模板链的 5’端一侧.
易错点3：计算扩增数量时忽略 “初始模板”—— 若初始模板为 1 个双链 DNA，n 次循环后扩增产物为 2 个双链 DNA（而非单链）.
2．电泳技术易错点
易错点1：混淆 “DNA 电泳的迁移方向”—— DNA 带负电，电场中向正极移动，与蛋白质电泳（SDS-PAGE 中蛋白质也向正极移动，但原理不同）区分。
易错点2：误将 “条带位置” 与 “片段大小” 颠倒 —— 琼脂糖凝胶中，离点样孔越远的条带，对应 DNA 片段越小（迁移速率快）。
易错点3：忽略 “电泳缓冲液的作用”—— 缓冲液维持电场稳定和 pH，不能用蒸馏水替代，否则会影响粒子迁移和 DNA 稳定性。
3．关联应用易错点
易错点1：认为 “PCR 扩增后一定能得到目的片段”—— 需通过电泳验证，若未出现条带或杂带过多，说明扩增失败，需调整引物或反应条件。
易错点2：混淆 “PCR 的特异性” 与 “电泳的分离性”—— PCR 决定 “扩增什么片段”（特异性），电泳决定 “能否分离出该片段”（分离性），二者缺一不可。
易错点3：误解 “荧光定量 PCR（qPCR）与普通 PCR 的区别”—— qPCR 可实时监测扩增过程，定量分析模板浓度；普通 PCR 仅能定性（是否扩增出产物），需电泳验证。
1．下列关于 PCR 技术的叙述，错误的是（ ）
A. PCR 扩增时需耐高温的 DNA 聚合酶
B. 每轮 PCR 包括变性、复性、延伸三个阶段
C. 引物与模板结合的温度低于变性温度
D. 扩增过程中 DNA 分子数量呈线性增长
2．利用琼脂糖凝胶电泳分离 PCR 产物时，下列操作或分析正确的是（ ）
A. 电泳时需将样品加在靠近正极的一侧
B. 凝胶中加入 EB 的目的是加快 DNA 迁移速率
C. 电泳后可根据条带位置判断 DNA 片段大小
D. 迁移速率与 DNA 片段的碱基组成密切相关
3．PCR 技术扩增目的基因时，引物的设计至关重要。下列关于引物设计的叙述，错误的是（ ）
A. 引物应与目的基因两端的序列互补
B. 一对引物之间不能存在互补序列
C. 引物长度一般为 15-30 个碱基
D. 引物的 5' 端可引入限制酶识别序列
题型1 基础原理
1．某研究人员用 PCR 技术扩增目的基因，下列关于该过程的叙述，正确的是（ ）
A．PCR 扩增的目的基因片段长度由引物决定
B．每个 PCR 循环都能使目的基因的数量加倍
C．PCR 反应体系中加入的引物越多，扩增效率越高
D．PCR 产物经电泳后，所有条带的 DNA 片段均为目的基因
2．下列关于 PCR 技术和电泳技术在遗传病诊断中应用的叙述，错误的是（ ）
A．PCR 技术可扩增患者体内的致病基因片段
B．电泳可区分正常基因和突变基因（片段大小不同）
C．可通过检测 PCR 产物的电泳条带判断个体是否患病
D．PCR 技术扩增致病基因时，不需要知道致病基因的序列
3．关于凝胶电泳的原理和应用，下列叙述正确的是（ ）
A．DNA 分子带负电，在电场中向正极移动
B．凝胶浓度越高，对 DNA 片段的分离效果越好
C．可通过与标准分子量 DNA 片段对比，确定目标片段的大小
D．适用于 DNA 片段、RNA 片段和蛋白质的分离鉴定
4．为验证某转基因小鼠是否含有目的基因，采用 PCR 技术和凝胶电泳进行检测，实验流程如下：
（1）提取小鼠基因组 DNA，作为 PCR 的________；
（2）设计目的基因的特异性引物，引物的作用是________；
（3）PCR 反应体系中还需加入 Taq 酶、和________等；
（4）PCR 扩增后，将产物与 Marker 一起进行凝胶电泳，若在与 Marker 中预期大小对应的位置出现______________，则证明小鼠含有目的基因。
5．简述 PCR 技术中 “变性 - 复性 - 延伸” 三个阶段的温度范围及核心作用。
题型2 操作细节
6．利用 PCR 技术扩增某一 DNA 片段，下列叙述正确的是（ ）
A. 每次循环后 DNA 片段数量呈线性增加
B. 引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
C. 反应体系中必须加入解旋酶解开双链 DNA
D. 延伸过程中，DNA 聚合酶从引物的 5' 端开始延伸
7．下列关于 PCR 与凝胶电泳结合应用的叙述，错误的是（ ）
A. 电泳可用于鉴定 PCR 产物的分子量大小
B. 若电泳后无目标条带，可能是 PCR 反应中引物设计错误
C. 电泳时，Marker 的作用是作为 DNA 片段分子量的参照标准
D. PCR 产物经电泳后，目标条带越亮，说明扩增效率越低
8（多选）.在 RT-PCR（逆转录 PCR）技术中，下列叙述正确的是（ ）
A. 第一步需用逆转录酶将 RNA 逆转录为 cDNA
B. 反应体系中需加入 RNA 酶抑制剂防止 RNA 降解
C. 后续 PCR 扩增的模板是 RNA
D. 可用于检测 RNA 病毒的感染情况
9．某实验小组用 PCR 技术扩增目的基因，反应条件如下：94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 1min，共 30 个循环。回答下面的问题。
（1）94℃ 30s 的目的是________；
（2）58℃ 30s 的目的是________；
（3）72℃ 1min 的目的是________；
（4）若扩增后的产物经凝胶电泳后，出现多条杂带，可能的原因是________。
10.凝胶电泳中，DNA 分子的迁移速率与________、________和________有关。若要分离分子量差异较大的 DNA 片段，应选择________浓度较低的凝胶；若要分离分子量差异较小的 DNA 片段，应选择________浓度较高的凝胶。
题型3 应用拓展
11.下列关于 PCR 与电泳结合应用的叙述，正确的是（ ）
A. PCR 产物经电泳后，只有目的基因条带会显色
B. 可通过电泳结果判断 PCR 反应是否产生非特异条带
C. 电泳可直接扩增微量的 PCR 产物
D. PCR 扩增的目的基因无需酶切即可通过电泳鉴定
12.某科研团队利用 PCR 技术扩增某病毒的特异性基因，并通过电泳鉴定扩增结果。
（1）PCR 反应体系中，除模板 DNA、引物、Taq 酶外，还需加入________和________。
（2）PCR 反应中，变性阶段的温度为 95℃左右，其目的是________；复性阶段的温度为 55℃左右，其目的是________。
（3）电泳时，若出现与预期大小一致的单一亮条带，说明________；若出现多条条带，可能的原因是________。
13.利用 PCR 技术检测转基因作物中的目的基因时，下列做法错误的是（ ）
A. 设计的引物应特异性结合目的基因序列
B. 可将非转基因作物的 DNA 作为阴性对照
C. PCR 产物电泳后，若出现目标条带则证明转基因成功
D. 需设置空白对照以排除反应体系的污染
14.新冠病毒是一种单链RNA病毒，常用“荧光RT PCR技术”进行检测，方法是取受检者的mRNA逆转录出cDNA，并大量扩增，用荧光标记的新冠病毒核酸探针来检测样品中新冠病毒的核酸含量。请回答下列问题：
(1)“荧光RT PCR技术”所用的试剂盒中通常都应该含有________、________、荧光标记的核酸探针、引物、dNTP、缓冲体系。
(2)如果要同时扩增两种基因，则试剂盒中的引物应该有________种。图1为新冠病毒的“ORFlab”基因对应的cDNA片段结构示意图，则与之对应的引物结合的部位应该是图中的________(子链延伸方向为其自身的5′→3′，用图中数字作答)。若已知该基因的一条引物，________(填“能”或“不能”)依据其碱基序列设计出另一条引物，理由是________________________________________________。
图1
(3)在检测过程中，随着PCR的进行，反应产物不断积累，荧光信号的强度也随之增加。根据荧光强度的变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增曲线(如图2)。
图2
①出现“平台期”最可能的原因是___________________________________。
②理论上，在检测过程中，有荧光信号出现，则说明检测结果呈________(填“阴”或“阳”)性，但为了保证检测结果的准确性，一般要达到或超过阈值时才确诊。现有两个待检样本，检测时都出现了如图2所示的曲线，但甲的A点比乙的A点明显左移。请给这种结果作出科学合理的解释(试剂盒合格且正常，操作过程规范且准确)：_______________________________________________________。
15.简述 PCR 技术与琼脂糖凝胶电泳结合在基因工程中的应用场景（至少 3 点）。
1．利用 PCR 技术和电泳技术鉴定转基因作物，下列实验设计不合理的是（ ）
A．用目的基因的特异性引物扩增，检测是否有预期条带
B．用载体上的标记基因引物扩增，排除假阳性结果
C．仅通过电泳条带大小无法确定扩增产物是否为目的基因
D．若电泳出现多条条带，说明转基因作物含有多种目的基因
2（多选）.某研究小组用 PCR 技术扩增一段长度为 1000bp 的 DNA 片段，下列关于实验结果的分析，正确的是（ ）
A．若 PCR 循环 30 次，理论上目的基因的数量可达到 2^30 个
B．若引物结合位点发生突变，可能导致电泳后无预期条带
C．若延伸时间不足，可能导致扩增产物片段变短
D．若变性温度过低，可能导致电泳出现多条非特异性条带
3（多选）.下列关于 PCR 技术和电泳技术的综合应用，正确的是（ ）
A．可通过 PCR 扩增 + 电泳检测，筛选含有目的基因的重组质粒
B．可通过 PCR 扩增 + 电泳，分析基因的表达水平
C．可通过 PCR 扩增 + 电泳，进行 DNA 指纹鉴定
D．可通过 RT-PCR（逆转录 PCR）+ 电泳，检测 RNA 病毒的存在
4．某遗传病由常染色体隐性基因（a）控制，正常基因为 A。现有一疑似患者，为明确诊断，采用 PCR 技术和凝胶电泳进行检测，已知 A 基因长度为 800bp，a 基因长度为 600bp。
（1）设计引物时，应保证引物能同时结合 A 基因和 a 基因的________序列（填 “相同” 或 “不同”）；
（2）PCR 扩增后，将产物进行凝胶电泳，若电泳结果出现________条带，且条带大小为 600bp，则患者基因型为 aa；
（3）若检测结果出现两条条带（800bp 和 600bp），则该个体的基因型为________，该个体是否患病？，原因是；
（4）若检测结果仅出现 800bp 条带，则该个体的基因型为________。
5．某研究人员在进行 PCR 扩增时，出现了“无扩增产物” 的问题，请从引物、模板、酶、反应条件四个方面分析可能的原因，并给出对应的解决措施。
6（多选）.巢式 PCR 是一种提高扩增特异性的技术，其原理是：先用外侧引物进行第一轮 PCR 扩增，再以第一轮产物为模板，用内侧引物进行第二轮 PCR 扩增。下列叙述正确的是（ ）
A. 巢式 PCR 的特异性高于普通 PCR
B. 第一轮 PCR 的产物可作为第二轮的模板，无需纯化
C. 若第一轮出现非特异性扩增，第二轮可通过内侧引物筛选目标片段
D. 需设计两对引物，内侧引物的结合位点位于外侧引物结合位点之间
7．某研究小组欲用 PCR 技术扩增某一长度为 1000bp 的目的基因，实验流程如下：提取基因组 DNA→设计引物→PCR 扩增→凝胶电泳鉴定。回答下列问题：
（1）设计引物时，需保证引物 1 和引物 2 分别结合于目的基因的________和________（填 “5' 端” 或 “3' 端”），且引物之间不能形成________结构。
（2）PCR 反应体系中，Taq DNA 聚合酶的作用是________，该酶的特点是________。
（3）若 PCR 扩增 30 个循环，理论上目的基因的数量为________个（不考虑引物二聚体等干扰）。
（4）电泳鉴定时，若出现目标条带（1000bp）和一条 500bp 的杂带，可能的原因是什么？
（5）若要获得纯度更高的目的基因，可采取的措施有哪些？
8．PCR是以模拟体内DNA复制的方式在体外选择性地将DNA某个特殊区域进行扩增的技术。DNA扩增过程的产物有长产物片段和短产物片段两种，其形成过程如图1所示。请回答下列问题：
图1
(1)DNA复制时子链延伸的方向是________(填“5′→3′”或“3′→5′”)。由于DNA聚合酶不能直接催化两个单核苷酸之间的反应，因此DNA复制需要一段单链DNA或RNA作为________。
(2)如果扩增序列为图2所示的两段序列之间的DNA片段，请从表中列出的引物中选出一对合适的引物________。
5′→GACCTGTGGAAGC……CATACGGGATTG 3′
3′ CTGGACACCTTCG……GTATGCCCTAAC 5′
图2
引物Ⅰ 引物Ⅱ
甲 5′ GACCTGTGGAAGC A 5′ CATACGGGATTG
乙 5′ CTGGACACCTTCG B 5′ GTATGCCCTAAC
丙 5′ CGAAGGTGTCCAG C 5′ GTTAGGGCTTAC
丁 5′ GCTTCCACAGGTC D 5′ CAATCCCGTATG
(3)下面为某同学利用PCR仪进行PCR的操作步骤，请完善相关步骤内容。
a.按配方准备好各组分。
b.用微量移液器向微量离心管中依次加入各组分：模板DNA，4种脱氧核糖核苷三磷酸、________、引物、缓冲液等。
c.________使反应液聚集在微量离心管底部。
d.将微量离心管放入PCR仪，设定好PCR仪的循环程序。
e.进行PCR反应。
(4)PCR的产物片段中，只有________才是符合要求的目标产物。
9．某同学尝试用 PCR 技术扩增目的基因，多次实验后仍未获得目标产物，可能的原因有哪些？请从引物设计、反应体系、反应条件三个方面分析，并提出对应的解决措施。
10.某研究小组用 PCR 技术和凝胶电泳鉴定转基因小鼠的基因型，转基因小鼠的基因组中整合了绿色荧光蛋白基因（GFP），野生型小鼠无该基因。设计的引物如下：引物 1（针对 GFP 基因）、引物 2（针对小鼠基因组内参照基因）。回答下列问题：
（1）PCR 扩增时，若小鼠为转基因纯合子，电泳结果会出现________条带；若为杂合子，会出现________条带；若为野生型，会出现________条带。
（2）若电泳后，转基因杂合子的样本中未出现 GFP 基因对应的条带，可能的原因是什么？
（3）参照基因的作用是什么？
（4）若要提高 PCR 扩增的特异性，可采取哪些措施？
11.某科研团队欲构建含人胰岛素基因的重组质粒，流程如下：提取人胰岛 B 细胞基因组 DNA→PCR 扩增胰岛素基因→酶切→连接→转化大肠杆菌→筛选鉴定。请回答下列问题：
（1）PCR 扩增胰岛素基因时，需根据________设计特异性引物。若引物 1 的序列为 5'-ATGAAGTTCATCTGTTC-3'，则引物 2 的序列应与胰岛素基因的________（填 “上游” 或 “下游”）序列互补，且方向为________。
（2）将 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，若出现预期大小的条带，能否说明扩增的就是胰岛素基因？请说明理由。
（3）酶切 PCR 产物和质粒时，选用两种不同的限制酶，其目的是________。酶切后的产物经电泳分离后，需回收________（填 “PCR 产物酶切片段” 或 “质粒酶切片段”）与质粒连接。（4）连接后的重组质粒转化大肠杆菌后，需提取质粒进行 PCR 鉴定，电泳结果显示出现预期条带，说明________。
12.研究发现，增强子是基因转录的调控序列，具有促进启动子表达下游基因的作用；增强子可以位于基因的5′端，也可以位于基因的3′端。人肺特异性X蛋白(LUNX)基因是某种肺癌诊断的标志物，为了研究LUNX基因的增强子是否具有增强基因表达的功能以及其发挥作用的位置是位于启动子的上游还是下游。科研人员从人类全基因组序列数据库中利用生物信息学的方法筛选并利用PCR技术扩增了3个LUNX基因增强子片段(En，表示E1～E3)，分别定向连接到pGL3载体中荧光素酶报告基因(luc＋)启动子(SV40启动子)的上游和下游，如图所示，并通过相关技术检测荧光素酶的活性从而对增强子的功能进行判断，luc＋的表达强度越强，荧光素酶的活性越高。
(1)为了扩增以上3个LUNX基因增强子片段，需要人为设计合适的引物，在上述实验中共需要设计________种引物用于PCR反应体系；为了定向连接到pGL3载体中，在引物5′端需要引入的限制性酶切位点为________种，PCR每次循环一般可以分为________________三步。
(2)以上3个LUNX基因增强子片段经回收、纯化、测序正确后，将双酶切后的PCR产物分别定向连接到用________双酶切和________双酶切的pGL3载体中，构建LUNX基因增强子分别位于报告基因上游和下游的载体，载体中的氨苄青霉素抗性基因Ampr可用来__________________________________________
______________________________________________________________，
画出E1连接到pGL3载体报告基因下游的图谱。
(3)根据相关实验技术对荧光素酶的活性进行检测，结果如图3所示，
图3
根据结果得出的结论是_______________________________________________
___________________________________________________________________。
13.某同学欲利用 PCR 技术扩增某植物的抗虫基因，并通过电泳鉴定扩增效果。请完善实验步骤并回答问题：实验步骤：
（1）配制 PCR 反应体系：向离心管中加入模板 DNA、引物 1、引物 2、Taq 酶、dNTP 混合液、缓冲液，最后加无菌水至总体积 20μL。
（2）设置 PCR 反应程序：95℃预变性 5min；95℃变性 30s，55℃复性 30s，72℃延伸 1min，循环 30 次；72℃后延伸 10min。
（3）电泳鉴定：① 制备 1% 琼脂糖凝胶，待凝胶凝固后放入电泳槽，加入电泳缓冲液，使缓冲液________凝胶表面。② 向 PCR 产物中加入适量载样缓冲液，混匀后加入凝胶的________中。③ 接通电源，调节电压为 5V/cm，电泳 30min。④ 电泳结束后，将凝胶放入 EB 染色液中染色 10min，取出后在________下观察并拍照。问题：（1）步骤（1）中，若未加入 Taq 酶，PCR 反应能否进行？为什么？（2）步骤（2）中，预变性的目的是什么？循环 30 次后，DNA 分子数量理论上为原来的多少倍？（3）若电泳后未观察到任何条带，可能的原因有哪些？（至少答 2 点）
14.CRISPR-Cas9 基因编辑技术中，需通过 PCR 扩增向导 RNA 的编码基因，再构建重组载体。请结合 PCR 和电泳技术，回答下列问题：
（1）PCR 扩增向导 RNA 编码基因时，引物的设计需满足什么条件？（至少答 2 点）
（2）若 PCR 产物经电泳后出现三条条带，其中一条为预期大小，另外两条为非特异条带，如何优化 PCR 反应以获得单一目的条带？（至少答 2 点）
（3）将重组载体导入大肠杆菌后，如何利用 PCR 和电泳技术筛选含有重组载体的菌落？
15.新冠病毒的核酸检测常采用 RT-PCR 技术（逆转录 + PCR），流程为：提取患者咽拭子中的 RNA→逆转录合成 cDNA→PCR 扩增 cDNA→电泳鉴定。请回答下列问题：
（1）RT-PCR 中，逆转录的模板是________，所需的酶是________。
（2）PCR 扩增 cDNA 时，需根据新冠病毒的________基因设计特异性引物。若引物结合效率低，会导致 PCR 产物量少，电泳后条带________。
（3）某患者的检测结果为电泳后出现预期大小的条带，能否确诊该患者感染新冠病毒？请说明理由。
（4）若检测过程中，空白对照的电泳结果出现了条带，该检测结果是否可靠？为什么？21世纪教育网(www.21cnjy.com)
21世纪教育网(www.21cnjy.com)专题19 PCR技术和电泳
考情分析：真题考点分布+命题趋势+备考策略+命题预测
培优讲练：考点梳理+解题秘籍+对点训练
考点01 基础原理
考点02 操作细节
考点03 应用拓展
提升冲关：题型过关练（2大题型）+能力提升练
【高考真题考点分布】
高考考点 三年考情
基础原理 2024·新课标卷，2023·浙江6月，2024·湖南
操作细节 2025·黑吉辽蒙，2024·湖南，2024·河北
应用拓展 2025·山东，2024·黑吉辽蒙，2023·重庆
PCR技术和电泳是高考生物分子生物学的核心考点，命题聚焦“原理应用 + 技术变式 + 情境探究 + 结果分析”，需以“深度理解原理、突破技术变式、强化情境建模”为核心备考。
【命题趋势】
1．考查核心：原理与细节并重
聚焦 PCR 核心步骤（变性、退火、延伸）的温度条件、反应本质，以及电泳中 DNA/蛋白质的迁移规律。
深挖关键要素作用，如 PCR 引物的设计原则、DNA聚合酶的特性，电泳凝胶浓度与片段大小的关系。
2．题型特点：技术变式与情境融合
PCR 技术常考查特殊类型应用，包括 RT-PCR、巢式PCR、降落PCR等变式的原理与优势。
依托真实科研情境命题，如基因编辑、病原体检测、品种培育等，结合实验设计或结果分析设问。
电泳多与 PCR 联动考查，通过电泳图谱分析扩增产物的纯度、大小及实验成败原因。
3．素养导向：凸显科学探究与思维
要求学生根据实验目的选择合适的 PCR 技术或电泳方法，设计引物或优化反应条件。
需解读电泳图谱、温度变化曲线等数据，分析非特异性扩增、无扩增条带等异常结果的成因。
【备考策略】
1．夯实核心知识，构建逻辑网络
梳理 PCR 技术“原理 - 步骤 - 条件 - 变式”逻辑链，明确常规 PCR 与特殊类型的差异，如长片段 PCR 需延长延伸时间，高 GC 含量 PCR 需优化缓冲液成分。
区分两种电泳技术的适用场景：琼脂糖凝胶电泳用于 PCR 产物鉴定，SDS - 聚丙烯酰胺凝胶电泳用于蛋白质分子量测定。
强化关键细节记忆，如引物长度（18-25 个核苷酸）、各步骤温度范围、DNA 迁移速度与分子量的负相关关系。
2．突破技术变式，掌握应用场景
分类总结特殊 PCR 技术的核心优势与适用情境，如巢式PCR 提高特异性，适用于低丰度模板检测；热启动 PCR 减少非特异性扩增。
结合典型例题分析变式技术的命题切入点，如通过流程图考查巢式 PCR 的两轮扩增原理，通过对比表格考查不同 PCR 的条件差异。
3．强化情境建模，提升解题能力
针对“PCR + 电泳”联动题型，构建“实验目的→技术选择→反应条件→结果分析”的解题模型，如根据电泳条带位置判断产物大小，根据条带数量判断扩增特异性。
精选科研情境真题，训练学生从题干中提取关键信息（如引物序列、酶切位点、温度程序）的能力，以及结合原理分析实验结果的逻辑思维。
4．易错点专项突破
纠正认知误区，如引物结合的是模板链的 3' 端一侧、DNA 聚合酶的延伸方向是 5'→3'、电泳时 DNA 向正极移动。
针对高频易错点专项训练，如引物设计的合理性判断、PCR 反应条件的优化分析、电泳异常结果的原因推导。
【命题预测】
1．基础原理类
可能以流程图或表格形式考查 PCR 核心步骤的温度、反应本质及各成分作用，或对比常规 PCR 与 RT-PCR 的过程差异。
电泳部分可能考查迁移规律的应用，如根据片段大小选择凝胶浓度，或分析影响迁移速度的因素。
2．技术变式类
大概率考查巢式 PCR、降落 PCR 或高 GC 含量 PCR 的原理与优势，可能结合实验设计设问，如设计引物组合或优化反应条件。
可能出现 RT-PCR 与病毒检测结合的情境题，考查技术应用与结果分析。
3．情境探究类
热点方向为 “基因编辑 + PCR + 电泳” 联动，如通过 PCR 扩增目标基因，结合酶切与电泳鉴定编辑是否成功。
可能创设未知模板扩增情境，要求根据电泳结果判断实验成败，并分析引物设计、温度设置等方面的问题。
4．素养拓展类
可能结合科研数据（如电泳图谱、PCR 循环曲线），考查学生的数据解读能力与实验推理能力。
或许会出现开放性问题，如设计实验验证某一基因的存在，要求选择合适的 PCR 技术与电泳方法，并说明理由。
考点01 基础原理
高三复习的核心是搭建 “原理→应用→避坑” 的逻辑链！核心结论：PCR 是体外 DNA 扩增技术，电泳是核酸/蛋白质的分离鉴定技术，二者常结合用于分子生物学实验，解题需紧扣 “原理本质 + 实验条件 + 结果分析”。
1． PCR 技术（多聚酶链式反应）
核心原理：模拟体内DNA复制过程，在体外快速扩增特定DNA片段。
关键条件：模板DNA、引物（2 种，分别结合目的基因两端）、Taq酶（热稳定 DNA 聚合酶）、dNTP（原料）、缓冲液。
反应过程：变性（90-95℃，DNA双链解旋）→复性（55-60℃，引物与模板结合）→延伸（72℃，Taq 酶催化子链合成），循环 20-30 次。
结果：目的 DNA 片段呈指数级扩增（2 ，n 为循环次数）。
2．电泳技术（以琼脂糖凝胶电泳为例）
核心原理：利用核酸分子（带负电）在电场中向正极移动，迁移速率与分子大小、构象、电荷有关。
关键条件：琼脂糖凝胶（作为支持介质）、电泳缓冲液、核酸染料（如EB，显色用）、电源（正极接凝胶下游）。
分离规律：分子越小，迁移速率越快，离加样孔越远；环状DNA比线性 DNA迁移快（相同分子量下）。
应用：鉴定PCR产物（是否扩增出目的片段、片段大小是否符合预期）、DNA片段纯化、基因分型等。
解题大招：直击高考题型
1．PCR 相关题型解题大招
大招1：引物设计判断题 —— 紧扣 “引物与模板互补、不自身互补、不形成引物二聚体”，且引物长度通常 15-30 个核苷酸。
大招2：循环次数与扩增倍数计算 —— 若初始模板为 1 个，n 次循环后目的片段数为 2 （仅考虑特异性扩增），若有杂质模板需排除非特异性产物干扰。
大招3：反应条件分析题 ——Taq 酶的作用温度（72℃延伸）、变性/复性温度的影响（如复性温度过高，引物无法结合；过低则非特异性结合增加）。
2．电泳相关题型解题技巧
大招4：电泳结果分析 —— 先看“Marker（标准分子量条带）”，再对比目的条带位置，判断片段大小（迁移距离与分子量呈负相关）。
大招5：电场方向与条带移动 —— 核酸带负电，从“加样孔端（负极）” 向“另一端（正极）”移动，错题常考“方向颠倒”。
大招6：实验异常分析 —— 无条带可能是引物设计错误、Taq 酶失活（PCR 环节）或电泳缓冲液失效、染料未加（电泳环节）；条带模糊可能是凝胶浓度不当（片段小用高浓度凝胶，片段大用低浓度凝胶）。
3．二者结合题型
大招7：“PCR + 电泳” 实验设计/结果解读 —— 先明确实验目的（如“验证目的基因是否导入受体细胞”），再推导逻辑：提取 DNA→PCR 扩增（用目的基因特异性引物）→电泳鉴定→若出现预期大小条带，则证明成功。
【典例1】（2024·新课标卷）某种二倍体植物的P1和P2植株杂交得F1，F1自交得F2。对个体的DNA进行PCR检测，产物的电泳结果如图所示，其中①～⑧为部分F2个体，上部2条带是一对等位基因的扩增产物，下部2条带是另一对等位基因的扩增产物，这2对等位基因位于非同源染色体上。下列叙述错误的是（ ）
A．①②个体均为杂合体，F2中③所占的比例大于⑤
B．还有一种F2个体的PCR产物电泳结果有3条带
C．③和⑦杂交子代的PCR产物电泳结果与②⑧电泳结果相同
D．①自交子代的PCR产物电泳结果与④电泳结果相同的占
【答案】D
【解析】由题可知，这2对等位基因位于非同源染色体上，假设A/a为上部两条带的等位基因，B/b为下部两条带的等位基因，由电泳图可知P1为AAbb，P2为aaBB，F1为AaBb，F2中①AaBB②Aabb都为杂合子，③AABb占F2的比例为1/8，⑤AABB占F2的比例为1/16，A正确；电泳图中的F2的基因型依次为：AaBB、Aabb、AABb、aaBB、AABB、AAbb、aabb、AaBb，未出现的基因型为aaBb，其个体PCR产物电泳结果有3条带，B正确；③AABb和⑦aabb杂交后代为Aabb、 AaBb，其PCR产物电泳结果与②⑧电泳结果相同，C正确；①AaBB自交子代为，AABB（1/4）、AaBB（1/2）、aaBB（1/4），其PCR产物电泳结果与④aaBB电泳结果相同的占1/4，D错误。
【典例2】（2023·浙江6月）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠 Gata3 基因一端，如图甲所示（注：图甲中启动子位于 Gata3 基因左侧，GFP 基因整合在 Gata3 基因右侧，两者串联）。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各 1 只，交配以期获得 Gata3-GFP 基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的 4 只新生小鼠的基因型，设计了引物 1 和引物 2 用于 PCR 扩增，PCR 产物电泳结果如图乙所示（注：图乙中条带 1 为大片段，条带 2 为小片段）。下列叙述正确的是（ ）
A．Gata3 基因的启动子无法控制 GFP 基因的表达
B．翻译时先合成 Gata3 蛋白，再合成 GFP 蛋白
C．2 号条带的小鼠是野生型，4 号条带的小鼠是 Gata3-GFP 基因纯合子
D．若用引物 1 和引物 3 进行 PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
【答案】B
【解析】启动子可启动下游串联基因的转录，Gata3 基因的启动子能控制 GFP 基因的表达，A 错误；基因转录和翻译均沿 5'→3' 方向，Gata3 基因位于左侧，先被翻译，故先合成 Gata3 蛋白，再合成 GFP 蛋白，B 正确；整合 GFP 基因后，DNA 片段变长，PCR 扩增后大片段对应 Gata3-GFP 基因，小片段对应野生型 Gata3 基因，2 号小鼠只有大片段，为 Gata3-GFP 纯合子；4 号只有小片段，为野生型，C 错误；引物 1 和引物 3 若均能扩增两种基因型的片段，则无法区分杂合子和纯合子，D 错误。
【典例3】（2024·湖南，多选）最早的双脱氧测序法是在 PCR 反应体系中，分别加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP 或 ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸遵循碱基互补配对原则。以加入 ddATP 的体系为例：若配对的为 ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸（dATP），继续延伸。PCR 产物变性后电泳检测，通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示（注：电泳图中条带位置代表片段长度，从下到上片段逐渐变长）。下列叙述正确的是（ ）
A. 上述 PCR 反应体系中只加入一种引物
B. 电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢
C. 5'-CTACCCGTGAT-3' 为对照个体的一段序列
D. 患者该段序列中某位点的碱基 C 突变为 G
【答案】CD
【解析】双脱氧测序依赖 PCR 扩增，需一对引物（上游和下游）才能扩增特定片段，A 错误；DNA 片段越小，在凝胶中的阻力越小，迁移速率越快，条带越靠下，B 错误；电泳条带从下到上对应子链从 5' 到 3' 的序列，结合双脱氧核苷酸的终止作用，对照个体的序列为 5'-CTACCCGTGAT-3'，C 正确；对比患者与对照的电泳条带，某一位点的条带位置改变，说明该位点碱基发生替换，即 C 突变为 G，D 正确。
易错提醒！！！
1．PCR 技术易错点
易错1：混淆“Taq 酶”与“普通 DNA 聚合酶”——Taq 酶耐高温，普通 DNA 聚合酶在变性温度下失活，无法用于PCR。
易错2：认为“PCR 需要解旋酶”——PCR 通过高温变性解旋，无需解旋酶；体内 DNA 复制需解旋酶和ATP。
易错3：引物结合位置错误 —— 引物结合的是目的基因的“互补链”，而非直接结合目的基因的编码链，解题时需注意碱基互补配对。
易错4：扩增倍数计算忽略“初始模板数量”—— 若初始模板为m个，n次循环后为 m×2n，而非单纯2n。
2． 电泳技术易错点
易错1：核酸电荷判断错误 ——DNA/RNA 均带负电，电泳时向正极移动，而非负极。
易错2：凝胶浓度与片段大小的关系颠倒 —— 片段越小，需用越高浓度的凝胶（如 100bp 片段用 2% 琼脂糖凝胶，1000bp 片段用 1% 琼脂糖凝胶）。
易错3：混淆“条带亮度”与“片段数量”—— 条带亮度反映 DNA 含量（含量越高越亮），与片段大小无关。
易错4：认为 “电泳能分离蛋白质和核酸的原理相同”—— 蛋白质电泳还与等电点有关（如 SDS-PAGE 中 SDS 使蛋白质带负电，消除电荷差异，仅按分子量分离）。
3．二者结合易错点
易错1：PCR 产物电泳无条带，仅考虑 PCR 环节 —— 还可能是电泳时加样孔端接反（条带跑出凝胶）、染料未正确添加（无法显色）。
1．下列关于 PCR 技术和琼脂糖凝胶电泳的叙述，正确的是（ ）
A．PCR 技术中，复性温度过低会导致引物非特异性结合
B．PCR 反应的延伸阶段，DNA 聚合酶催化磷酸二酯键的断裂
C．电泳时，DNA 分子的迁移速率仅与分子大小有关
D．电泳后，DNA 分子需用健那绿染液染色才能观察到
【答案】A
【解析】复性温度过低时，引物会与非目标 DNA 序列结合，导致非特异性扩增，A 正确；延伸阶段 DNA 聚合酶催化磷酸二酯键的形成，而非断裂，B 错误；DNA 分子的迁移速率与凝胶浓度、分子大小、构象均有关，C 错误；DNA 分子需用溴化乙锭染色，在紫外灯下观察，健那绿用于线粒体染色，D 错误。
2．利用 PCR 技术扩增某一 DNA 片段，下列关于实验条件的叙述，错误的是（ ）
A．需要四种游离的脱氧核苷三磷酸作为原料
B．需要一对特异性引物引导子链合成
C．反应体系中需加入解旋酶解开双链 DNA
D．反应过程中需控制温度的周期性变化
【答案】C
【解析】PCR 的原料是 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 四种游离脱氧核苷三磷酸，A 正确；一对引物（上游和下游）分别结合模板链的两端，引导子链延伸，B 正确；PCR 通过高温变性（90-95℃）解开双链 DNA，无需解旋酶，C 错误；PCR 反应需经历 “变性 - 复性 - 延伸” 的温度循环（90-95℃→55-60℃→72℃），D 正确。
3．PCR 技术可快速扩增特定 DNA 片段，其基本过程包括变性、复性和延伸。
（1）变性阶段的温度为 90-95℃，目的是将双链 DNA 解旋为________；
（2）复性阶段的温度为 55-60℃，此时________与模板 DNA 的特定序列结合；
（3）延伸阶段的温度为 72℃，需用到的酶是________，该酶的特点是________；
（4）将 PCR 产物进行凝胶电泳，若出现预期条带，说明扩增成功，条带的位置反映了 DNA 片段的________。
【答案】（1）单链 DNA
（2）引物
（3）Taq 酶（热稳定 DNA 聚合酶） 耐高温
（4）大小
【解析】（1）变性的核心是破坏碱基对间的氢键，使双链 DNA 解旋为单链，为引物结合做准备。
（2）复性阶段引物与模板 DNA 的互补序列特异性结合，保证扩增的特异性。
（3）延伸阶段需用热稳定的 Taq 酶，其能在 72℃下催化脱氧核苷酸聚合，且耐高温，适应 PCR 的高温变性步骤。
（4）电泳中 DNA 片段越小，迁移速率越快，条带越靠下，故条带位置反映片段大小。
考点02 操作细节
操作细节对于提高解题能力很关键！核心结论：PCR 技术聚焦 “反应条件、过程逻辑、引物设计”，电泳操作紧扣 “凝胶类型、迁移规律、结果分析”，解题需抓 “原理 - 操作 - 应用” 的链条，避开 “条件混淆、迁移方向判断错误” 等陷阱。
1．PCR 技术核心知识
（1）定义：体外快速扩增特定 DNA 片段的分子生物学技术，依赖 DNA 聚合酶的催化作用。
（2）反应条件：模板 DNA、引物（两种反向互补）、Taq 酶（耐高温 DNA 聚合酶）、dNTP（原料）、缓冲液（维持 pH）。
（3）反应过程：变性（90-95℃，DNA 双链解旋）→ 复性（55-60℃，引物与模板结合）→ 延伸（72℃，Taq 酶合成子链），循环 25-30 次。
（4）关键特性：特异性由引物决定，高效性来自循环扩增，忠实性依赖 Taq 酶的保真性。
2．电泳操作核心知识
（1）分类：琼脂糖凝胶电泳（分离 DNA 片段，依据分子量和构象）、聚丙烯酰胺凝胶电泳（分离小分子 DNA/蛋白质，分辨率更高）。
（2）原理：带电粒子在电场中向相反电极迁移，DNA 带负电，向正极移动。
（3）操作流程：制胶（加入 EB 或荧光染料，便于观察）→ 点样（加样缓冲液，使样品沉降并指示迁移位置）→ 电泳（控制电压和时间）→ 染色观察（紫外灯下显带）。
（4）迁移规律：DNA 片段分子量越小，迁移速度越快；相同分子量下，线性 DNA 迁移速度＞环状 DNA。
1．PCR 技术解题大招
（1）引物相关计算：引物长度通常 15-30 个核苷酸，需与模板两端反向互补，解题时可根据模板序列直接写出引物序列（注意方向 5’→3’）。
（2）扩增产物计算：若初始模板为n个，循环n次后，理论上产物量为 n×2 （不考虑引物二聚体等杂质），实际产量略低。
（3）条件分析题：题干中出现“耐高温”“快速扩增”，直接关联Taq 酶；出现 “特异性差”，优先考虑引物设计不合理（如引物互补、引物自身折叠）。
2．电泳结果解题大招
（1）片段大小判断：对照 Marker（标准分子量 DNA），迁移距离与 Marker 比对，快速确定目的片段大小。
（2）异常结果分析：无条带可能是模板量不足、引物失效；条带模糊可能是凝胶浓度不当、电压过高；杂带多可能是 PCR 特异性差或电泳污染。
（3）应用场景对应：基因克隆中筛选阳性克隆→电泳检测插入片段；遗传病诊断→PCR 扩增后电泳判断片段有无/大小异常。
【典例1】（2025·黑吉辽蒙）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。

(1)可从________中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入________和________限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用________连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。
(2)进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有________的污染。初步判断实验组________（从“1~4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是________。
(3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有________。
a：5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3'
b：5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3'
c：5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3'
d：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3'
(4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的________含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。
【答案】(1)基因数据库/序列数据库 Xho Ⅰ Xba Ⅰ DNA 连接酶
(2)外源DNA 1 目的基因N大小为2.3kb
(3)GCC
(4)香树脂醇
【解析】（1）GenBank是目前国际上广泛使用 的序列数据库之一，它的数据主要是各国的 实验室、测序机构等发布的序列信息。利用这个数据库，我们可以便捷地检索到基因和蛋白质的序列信息；故可从序列数据库或基因数据库中查询基因N的编码序列，设计特定引物。保证基因N与质粒pYL正确连接，需要使用双酶切法，为了目的基因能正确表达，目的基因需要插入质粒的启动子和终止子之间，且质粒和目的基因需要使用相同的酶或能产生相同黏性末端的酶；分析图1可知，质粒pYL应该选用Spe Ⅰ和Xho Ⅰ酶切，由于目的基因N含有Spe Ⅰ识别序列，故N基因不能使用Spe Ⅰ酶切，但Xba Ⅰ与其具有相同的黏性末端，基因N酶切时可以用Xba Ⅰ替换Spe Ⅰ，即N基因两端应该含有Xba Ⅰ和Xho Ⅰ识别序列；题干信息：N基因a链为转录模板链，才有引物1和引物2扩增N基因，则扩增后模板链的5'端含有引物1序列，而编码链的5'端含有引物2序列，结合质粒pYL上的启动子和终止子方向，可知应该在引物2需要5'端添加Xba Ⅰ、引物1 5'端添加Xho Ⅰ识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用DNA连接酶连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。
（2）构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变，而质粒pYL本身7.2kb，可知目的基因N大小为2.3kb；分析电泳图可知，初步判断实验组1的质粒中成功插入了基因N。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应体系是否存在污染，即检验PCR反应中是否有外源DNA污染。
（3）编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA；密码子位于mRNA上，mRNA上的序列与编码链序列相似，而a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），可知a引物延伸后的序列为编码链；b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同，分析题图bcd序列可知c是诱变第243位苯丙氨酸的引物，且c引物延伸后的序列为编码链，根据a引物5'-端首位GCA为240位，则c引物5'-端GCC为243位，故据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有GCC。
（4）题干研究目的是通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇；由此可知，进一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。
【典例2】（2024·湖南，多选）最早的双脱氧测序法是 PCR 反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP 或 ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入 ddATP 的体系为例：若配对的为 ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸（dATP），继续延伸；PCR 产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A. 上述 PCR 反应体系中只加入一种引物
B. 电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢
C. 5'-CTACCCGTGAT-3' 为对照个体的一段序列
D. 患者该段序列中某位点的碱基 C 突变为 G
【答案】ACD
【解析】双脱氧测序法中，模板为单链 DNA，故 PCR 反应体系只需加入一种引物即可启动子链延伸，A 正确；电泳时 DNA 片段越小，受到的凝胶阻力越小，迁移速率越快，B 错误；根据电泳条带从下到上（片段从短到长）对应序列从 5' 到 3'，结合碱基互补配对原则；可推断对照个体序列为 5'-CTACCCGTGAT-3'，C 正确；对比患者与对照个体的电泳条带，某位点条带位置改变，说明该位点碱基发生替换，结合测序原理可判断为 C 突变为 G，D 正确。
【典例3】（2024·河北）新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。
回答下列问题：
(1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为________________启动子。Nos为终止子，其作用为________________。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶________和________对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。
(2)利用________方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测________________，通过________技术检测是否翻译出r2HN蛋白。
(3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合体植株的占比为________。选择纯合体进行后续研究的原因是________。
(4)制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的细胞（细胞毒性T细胞）水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的________免疫和________免疫。
(5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是________________________________。（答出两点即可）
【答案】(1)胚乳特异表达基因的 终止转录 HindIII EcoRI
(2)农杆菌转化 r2HN是否转录 抗原抗体杂交
(3)1/4 纯合体自交后代不发生性状分离
(4)体液 细胞
(5)生产成本低；转基因水稻易获得（或“安全性高”或“种子蛋白易纯化”或“水稻自花传粉不易发生基因污染”）
【解析】（1）利用水稻细胞培育能表达r2HN的水稻胚乳细胞生物反应器，在水稻胚乳特异表达基因的的启动子在水稻胚乳细胞中更容易被RNA聚合酶识别和结合而驱动转录。Nos为终止子，终止子可以终止转录。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。KpnI破坏了启动子序列不能选用，SacI位于终止子序列之外不能选用，则为了将目的基因插入到载体的启动子和终止子之间，则需要用限制酶HindIII和EcoRI对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。
（2）获得水稻愈伤组织后，通过农杆菌的侵染，使目的基因进入水稻细胞并完成转化。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测转录的r2HN是否转录，可从转基因水稻中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交检测是否翻译出r2HN蛋白。
（3）获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。单一位点插入目的基因的植株，则相当于杂合子，杂合子自交，后代含有r2HN基因的纯合子为1/4。由于纯合体自交后代不发生性状分离，具有遗传的稳定性，所以选择纯合体进行后续研究。
（4）据图可知，实验组的抗体水平和CD8+T细胞水平都比对照组高，说明通过体液免疫产生了抗体，通过细胞免疫产生了细胞毒性T细胞，即r2HN疫苗能够成功激活鸡的体液免疫和细胞免疫。
（5）通过水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗具有生产成本低；转基因水稻易获得（或“安全性高”或“种子蛋白易纯化”或“水稻自花传粉不易发生基因污染”）等优点。
易错提醒！！！
1．PCR 与体内 DNA 复制的混淆：PCR 无需解旋酶（高温变性解旋），体内复制用解旋酶；PCR 用 Taq 酶，体内用普通 DNA 聚合酶；PCR 引物是 DNA，体内复制引物是 RNA。
2．电泳迁移方向错误：易误将 DNA 迁移方向记为 “向负极”，实际因 DNA 带负电，向正极移动。
3．凝胶浓度与片段大小匹配错误：片段越大，需用浓度越低的琼脂糖凝胶（如 10kb 片段用 0.8% 琼脂糖，1kb 片段用 1.2% 琼脂糖）。
4．PCR 循环步骤温度记忆混淆：变性（最高温）、复性（中温）、延伸（中高温），易颠倒复性和延伸的温度。
5．电泳加样缓冲液功能混淆：易忽略其 “指示迁移” 功能，仅记住 “沉降样品”，解题时需完整表述。
1．PCR 技术中三个关键步骤的温度设置依次为（ ）
A. 90-95℃（退火）、55-60℃（变性）、72℃左右（延伸）
B. 90-95℃（变性）、55-60℃（退火）、72℃左右（延伸）
C. 72℃左右（延伸）、90-95℃（变性）、55-60℃（退火）
D. 55-60℃（退火）、90-95℃（变性）、72℃左右（延伸）
【答案】B
【解析】PCR 循环包括变性、退火、延伸三个步骤。90-95℃时双链 DNA 解旋为单链（变性）；55-60℃时引物与模板单链特异性结合（退火）；72℃左右时 Taq DNA 聚合酶催化子链延伸，故答案为 B。
2．下列关于凝胶电泳的叙述，错误的是（ ）
A. DNA 分子在电场中向正极移动
B. 凝胶浓度越高，对小分子 DNA 的分离效果越好
C. 电泳后需用特定染料染色才能观察到条带
D. 相同条件下，DNA 片段越长，迁移距离越远
【答案】D
【解析】DNA 分子带负电，在电场中向正极移动，A 正确；凝胶浓度越高，孔隙越小，对小分子 DNA 的筛分效果越好，B 正确；DNA 本身无色，需染色（如 EB 染色）后在紫外线下观察，C 正确；相同条件下，DNA 片段越长，迁移时受到的阻力越大，迁移距离越近，D 错误。
3．某同学用 PCR 技术扩增目标基因，反应体系中缺少一种原料，导致扩增失败。该原料最可能是（ ）
A. 解旋酶 B. Taq DNA 聚合酶 C. 脱氧核苷三磷酸（dNTP） D. 引物
【答案】C
【解析】PCR 反应体系的原料是四种脱氧核苷三磷酸（dNTP），用于合成子链，C 正确；PCR 中高温变性替代解旋酶功能，A 错误；Taq DNA 聚合酶是催化剂，引物是启动子链合成的片段，二者均不属于原料，B、D 错误。
考点03 应用拓展
PCR技术和电泳应用拓展是高三生物核心难点，针对性极强！核心结论：PCR 技术和电泳是分子生物学实验的 “黄金搭档”，知识体系围绕 “原理 - 流程 - 应用” 展开，解题关键在 “场景匹配 + 数据解读”，易错点集中在细节辨析。
1．PCR 技术核心知识
本质：体外 DNA 片段快速扩增技术，模拟体内 DNA 复制过程。
关键组件：模板 DNA、引物（一对，分别结合目的基因两端）、Taq 酶（耐高温 DNA 聚合酶）、dNTP（原料）、缓冲液。
基本流程：变性（90-95℃，DNA 双链解旋）→ 复性（55-60℃，引物与模板结合）→ 延伸（72℃，Taq 酶合成子链），循环 25-30 次。
核心特点：特异性（依赖引物设计）、高效性（指数级扩增，2 倍）、特异性（引物互补配对决定）。
2．电泳技术核心知识
本质：利用带电粒子在电场中迁移速率差异分离物质的技术。
常见类型：琼脂糖凝胶电泳（分离 DNA/RNA 片段，依据分子量和构象）、SDS - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE，分离蛋白质，依据分子量）。
迁移规律：DNA 带负电，电场中向正极移动；片段越小，迁移速率越快（琼脂糖凝胶中）。
关键辅助：染色剂（如 EB、SYBR Green，使 DNA 显色）、Marker（分子量标准，用于估算目的片段大小）。
3．二者关联与应用拓展
核心关联：PCR扩增目的基因后，需通过电泳验证扩增产物的存在、大小是否符合预期（“PCR + 电泳”是分子鉴定的基础组合）。
高频应用场景：
3．基因克隆：PCR 扩增目的基因→电泳筛选阳性扩增产物→连接载体。
遗传病诊断：扩增待测个体相关基因片段→电泳对比正常与异常片段（如镰刀型细胞贫血症的基因片段长度差异）。
病原体检测：（如新冠病毒）PCR 扩增病毒特异性基因→电泳或荧光定量 PCR 判断是否感染。
亲子鉴定/法医鉴定：扩增 STR（短串联重复序列）→电泳分离→对比条带匹配度。
基因编辑验证：扩增编辑后的目的基因→电泳或测序验证是否成功编辑。
1．PCR 相关题型解题步骤
大招1：“引物设计与扩增片段计算”—— 引物结合模板链的互补序列，扩增片段长度 = 引物之间的模板 DNA 长度 + 两条引物长度（若题目未提及引物长度，可忽略）。
大招2：“循环次数与扩增数量计算”—— 理想状态下，扩增产物量 = 初始模板量 ×2 （n 为循环次数），注意 “引物对数” 影响：1 对引物仅扩增 1 种目的片段，多对引物可同时扩增多个片段（多重 PCR）。
大招3：“PCR 异常结果分析”—— 无扩增产物（引物设计不合理、Taq 酶失活、退火温度过高）；杂带过多（退火温度过低、引物非特异性结合、模板污染）。
2．电泳相关题型解题步骤
大招1：“条带解读三步法”—— 第一步看 Marker，确定分子量标准；第二步找目的条带，对比 Marker 估算大小；第三步分析条带深浅（琼脂糖电泳中，条带越亮，DNA 含量越多）。
大招2：“蛋白质电泳与 DNA 电泳区分”—— 关键看 “分离依据”：DNA 电泳看 “片段大小 + 构象”，SDS-PAGE 看 “蛋白质分子量”（SDS 使蛋白质带负电且构象一致，消除电荷影响）。
大招3：“应用场景匹配法”—— 看到 “鉴定基因是否扩增成功”→ PCR + 琼脂糖电泳；看到 “分离不同分子量蛋白质”→ SDS-PAGE；看到 “基因分型 / 亲子鉴定”→ PCR+STR 电泳。
3．综合题型（PCR + 电泳）解题关键
核心逻辑：“目的→流程→结果解读”。
示例：若题目要求 “验证转基因水稻是否含目的基因”，解题思路为：提取水稻基因组 DNA→用目的基因特异性引物进行 PCR→琼脂糖凝胶电泳→若出现与预期大小一致的条带，则含目的基因。
【典例1】（2025·山东）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。
(1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为_____。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和_____对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是_____。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶_____进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为_____bp，则一定为正向重组质粒。
(2)为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为_____（填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段_____，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为_____（填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。
(3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，_____（填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。
【答案】(1)复制原点 XbaI DNA聚合酶 SmaI和SpeI 550bp
(2)4 环化 测序和序列比对
(3)不能
【解析】（1）DNA复制的起点是复制原点，因此Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为复制原点。根据SmaI限制酶识别序列可知，酶切形成的是平末端，若质粒仅用SmaI酶切，抗除草剂基因和质粒可以正向接入也可以反向接入，且无法区分，为了确定是否是正向重组质粒，因此在构建重组质粒时需要用到另一种限制酶，抗除草剂因需要插入到启动子和终止子之间，因此不能选择BamHI，因为该限制酶会破坏终止子，因此可选择XbaI和SmaI进行酶切，XbaI酶切会形成黏性末端，需要用DNA聚合酶聚合脱氧核糖核苷酸单体将产生的黏性末端补平（可使重组质粒最小，同时PstI酶切后产生的黏性末端无法用DNA聚合酶抹平，因为DNA聚合酶只能从3'延伸子链）。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌。重组的T-DNA片段上含有一个SmaI酶切位点和一个SpeI酶切位点，可以选择用SmaI和SpeI进行酶切，转录的方向是从模板的3'→5'，和质粒对应的方向相同，经过两种酶的酶切后并电泳呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为550bp，若反向接，较短的条带长度近似为200bp。
（2）由于后续PCR难以扩增大片段DNA，所以最好选择识别序列为4个碱基的限制酶，原因是识别序列越短，酶切位点越多，切割产生的片段可能越小，更有利于后续的PCR扩增。由于引物是根据已知序列设计的，但此时需要扩增未知序列，因此可以将图乙的片段环化，这样就可以利用现有引物扩增出未知序列。为了确定未知序列是否是同一基因，需要准确比对其上的碱基序列，因此对同一个基因的操作为测序和序列比对。
（3）突变植株成功导入野生型基因，但野生型基因未必可以正常表达，因此不能确定该植株的表型为野生型。
【典例2】（2024·黑吉辽蒙）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 产物的实验，下列叙述正确的是（ ）
A. 琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离 DNA 片段的大小
B. 凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示 DNA 分子的具体位置
C. 在同一电场作用下，DNA 片段越长，向负极迁移速率越快
D. 琼脂糖凝胶中的 DNA 分子可在紫光灯下被检测出来
【答案】A
【解析】琼脂糖凝胶浓度与 DNA 片段分辨率相关，片段越小需浓度越高，反之则越低，A 正确；载样缓冲液中指示剂的作用是指示电泳进程，而非 DNA 具体位置，DNA 需经 EB 染色后在紫外灯下显色，B 错误；DNA 带负电，向正极迁移，且片段越长迁移速率越慢，C 错误；未经染色的 DNA 无法在紫光灯下检测，需染色后在紫外灯下观察，D 错误。
【典例3】（2023·重庆）某小组通过 PCR（假设引物长度为 8 个碱基（短于实际长度））获得了含有目的基因的 DNA 片段，并用限制酶进行酶切（如图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是（ ）
A. 其中一个引物序列为 5'-TGCGCAGT-3'
B. 步骤①所用的酶是 SpeⅠ 和 CfoⅠ
C. 用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了 2 个片段
D. 酶切片段和载体连接时，可使用 E.coli 连接酶或 T4 连接酶
【答案】B
【解析】PCR 引物需与模板链互补，根据目的基因序列可推导其中一个引物为 5'-TGCGCAGT-3'，A 正确；若用 SpeⅠ 和 CfoⅠ 双酶切，会切断目的基因内部序列（结合图解酶切位点分布），步骤①应选用不切割目的基因的两种限制酶，B 错误；载体为环状 DNA，用两种限制酶酶切至少产生 2 个片段，C 正确；E.coli 连接酶可连接黏性末端，T4 连接酶可连接黏性末端和平末端，二者均可用于连接反应，D 正确。
易错提醒！！！
1．PCR 技术易错点
易错点1：混淆 “Taq 酶” 与 “普通 DNA 聚合酶”—— Taq 酶耐高温（适应 PCR 变性步骤的高温），普通 DNA 聚合酶在 90℃以上失活，不可替代.
易错点2：误解 “引物的作用”—— 引物是 DNA 合成的起点（提供 3’-OH 末端），不能替代模板；引物必须与模板链互补，且一对引物分别结合两条模板链的 5’端一侧.
易错点3：计算扩增数量时忽略 “初始模板”—— 若初始模板为 1 个双链 DNA，n 次循环后扩增产物为 2 个双链 DNA（而非单链）.
2．电泳技术易错点
易错点1：混淆 “DNA 电泳的迁移方向”—— DNA 带负电，电场中向正极移动，与蛋白质电泳（SDS-PAGE 中蛋白质也向正极移动，但原理不同）区分。
易错点2：误将 “条带位置” 与 “片段大小” 颠倒 —— 琼脂糖凝胶中，离点样孔越远的条带，对应 DNA 片段越小（迁移速率快）。
易错点3：忽略 “电泳缓冲液的作用”—— 缓冲液维持电场稳定和 pH，不能用蒸馏水替代，否则会影响粒子迁移和 DNA 稳定性。
3．关联应用易错点
易错点1：认为 “PCR 扩增后一定能得到目的片段”—— 需通过电泳验证，若未出现条带或杂带过多，说明扩增失败，需调整引物或反应条件。
易错点2：混淆 “PCR 的特异性” 与 “电泳的分离性”—— PCR 决定 “扩增什么片段”（特异性），电泳决定 “能否分离出该片段”（分离性），二者缺一不可。
易错点3：误解 “荧光定量 PCR（qPCR）与普通 PCR 的区别”—— qPCR 可实时监测扩增过程，定量分析模板浓度；普通 PCR 仅能定性（是否扩增出产物），需电泳验证。
1．下列关于 PCR 技术的叙述，错误的是（ ）
A. PCR 扩增时需耐高温的 DNA 聚合酶
B. 每轮 PCR 包括变性、复性、延伸三个阶段
C. 引物与模板结合的温度低于变性温度
D. 扩增过程中 DNA 分子数量呈线性增长
【答案】D
【解析】PCR 需在高温下变性（90-95℃），故需耐高温的 Taq 酶，A 正确；每轮 PCR 的三个阶段依次为变性（解旋）、复性（引物结合）、延伸（合成子链），B 正确；复性温度（55-60℃）低于变性温度，便于引物与模板结合，C 正确；理想条件下，PCR 扩增中 DNA 分子数量呈指数增长（2 ，n 为循环次数），D 错误。
2．利用琼脂糖凝胶电泳分离 PCR 产物时，下列操作或分析正确的是（ ）
A. 电泳时需将样品加在靠近正极的一侧
B. 凝胶中加入 EB 的目的是加快 DNA 迁移速率
C. 电泳后可根据条带位置判断 DNA 片段大小
D. 迁移速率与 DNA 片段的碱基组成密切相关
【答案】C
【解析】DNA 带负电，电泳时向正极迁移，样品应加在靠近负极一侧，A 错误；EB 是 DNA 染料，可与 DNA 结合，便于紫外灯下观察，不影响迁移速率，B 错误；电泳中 DNA 片段迁移速率与长度负相关，可通过与标准条带对比，根据位置判断片段大小，C 正确；迁移速率主要与 DNA 片段长度有关，与碱基组成关系不大，D 错误。
3．PCR 技术扩增目的基因时，引物的设计至关重要。下列关于引物设计的叙述，错误的是（ ）
A. 引物应与目的基因两端的序列互补
B. 一对引物之间不能存在互补序列
C. 引物长度一般为 15-30 个碱基
D. 引物的 5' 端可引入限制酶识别序列
【答案】B
【解析】引物需分别与目的基因两条链的两端序列互补，才能启动子链合成，A 正确；一对引物之间若存在少量互补序列，只要不形成稳定双链，不影响 PCR 反应，并非绝对不能存在，B 错误；引物长度过短特异性差，过长会降低复性效率，一般为 15-30 个碱基，C 正确；可在引物 5' 端引入限制酶识别序列，便于后续酶切连接构建载体，D 正确。
题型1 基础原理
1．某研究人员用 PCR 技术扩增目的基因，下列关于该过程的叙述，正确的是（ ）
A．PCR 扩增的目的基因片段长度由引物决定
B．每个 PCR 循环都能使目的基因的数量加倍
C．PCR 反应体系中加入的引物越多，扩增效率越高
D．PCR 产物经电泳后，所有条带的 DNA 片段均为目的基因
【答案】A
【解析】引物结合模板 DNA 的特定位置，扩增片段的长度由引物之间的距离决定，A 正确；理想条件下每个循环目的基因数量加倍，但实际中因原料、酶活性等限制，不会严格加倍，B 错误；引物过量会导致非特异性结合增加，降低扩增效率，C 错误；电泳后可能出现非特异性条带（引物二聚体等），并非所有条带都是目的基因，D 错误。
2．下列关于 PCR 技术和电泳技术在遗传病诊断中应用的叙述，错误的是（ ）
A．PCR 技术可扩增患者体内的致病基因片段
B．电泳可区分正常基因和突变基因（片段大小不同）
C．可通过检测 PCR 产物的电泳条带判断个体是否患病
D．PCR 技术扩增致病基因时，不需要知道致病基因的序列
【答案】D
【解析】PCR 技术能快速扩增特定致病基因片段，便于后续检测，A 正确；正常基因和突变基因可能因碱基缺失、插入导致片段大小不同，可通过电泳区分，B 正确；若电泳出现致病基因对应的条带，可判断个体携带致病基因或患病，C 正确；设计特异性引物需要知道致病基因的部分序列，否则无法实现特异性扩增，D 错误。
3．关于凝胶电泳的原理和应用，下列叙述正确的是（ ）
A．DNA 分子带负电，在电场中向正极移动
B．凝胶浓度越高，对 DNA 片段的分离效果越好
C．可通过与标准分子量 DNA 片段对比，确定目标片段的大小
D．适用于 DNA 片段、RNA 片段和蛋白质的分离鉴定
【答案】ACD
【解析】DNA 分子因磷酸基团带负电，在电场中向正极移动，A 正确；凝胶浓度过高会导致小分子 DNA 片段迁移困难，分离效果下降，需根据片段大小选择合适浓度，B 错误；电泳时加入标准分子量 DNA 片段（Marker），通过对比条带位置可确定目标片段大小，C 正确；凝胶电泳可用于分离不同大小的 DNA、RNA 片段，也可用于蛋白质分离（如 SDS-PAGE），D 正确。
4．为验证某转基因小鼠是否含有目的基因，采用 PCR 技术和凝胶电泳进行检测，实验流程如下：
（1）提取小鼠基因组 DNA，作为 PCR 的________；
（2）设计目的基因的特异性引物，引物的作用是________；
（3）PCR 反应体系中还需加入 Taq 酶、和________等；
（4）PCR 扩增后，将产物与 Marker 一起进行凝胶电泳，若在与 Marker 中预期大小对应的位置出现______________，则证明小鼠含有目的基因。
【答案】（1）模板
（2）定位目的基因片段，引导子链合成
（3）四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs） 缓冲液
（4）清晰条带
【解析】（1）基因组 DNA 是 PCR 扩增的模板，含目的基因的小鼠 DNA 可被特异性引物扩增。
（2）引物通过碱基互补配对结合目的基因两端，确定扩增范围，并为 DNA 聚合酶提供延伸起点。
（3）PCR 反应体系的核心成分包括模板、引物、Taq 酶、dNTPs（原料）和缓冲液（维持酶活性）。
（4）电泳后若出现与目的基因大小一致的条带，说明扩增成功，小鼠含有目的基因。
5．简述 PCR 技术中 “变性 - 复性 - 延伸” 三个阶段的温度范围及核心作用。
【答案】
变性：温度 90-95℃，核心作用是破坏双链 DNA 之间的氢键，使双链解旋为单链 DNA，为引物结合提供模板。
复性：温度 55-60℃，核心作用是让特异性引物与单链模板 DNA 的互补序列结合，定位扩增片段的两端。
延伸：温度 72℃，核心作用是 Taq 酶以引物为起点，利用 dNTPs 为原料，按碱基互补配对原则合成子链 DNA，使目的基因片段扩增。
【解析】PCR 技术的核心是温度控制下的循环反应，三个阶段的温度和作用相互配合：变性提供单链模板，复性保证扩增特异性，延伸实现目的基因的复制，循环多次后可获得大量目的基因片段。
题型2 操作细节
6．利用 PCR 技术扩增某一 DNA 片段，下列叙述正确的是（ ）
A. 每次循环后 DNA 片段数量呈线性增加
B. 引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
C. 反应体系中必须加入解旋酶解开双链 DNA
D. 延伸过程中，DNA 聚合酶从引物的 5' 端开始延伸
【答案】B
【解析】PCR 每次循环后 DNA 片段数量呈指数增加（2 ），A 错误；引物与模板链的 3' 端特异性结合，遵循碱基互补配对原则，B 正确；高温可使双链 DNA 解旋，无需解旋酶，C 错误；DNA 聚合酶只能从引物的 3' 端延伸子链，D 错误。
7．下列关于 PCR 与凝胶电泳结合应用的叙述，错误的是（ ）
A. 电泳可用于鉴定 PCR 产物的分子量大小
B. 若电泳后无目标条带，可能是 PCR 反应中引物设计错误
C. 电泳时，Marker 的作用是作为 DNA 片段分子量的参照标准
D. PCR 产物经电泳后，目标条带越亮，说明扩增效率越低
【答案】D
【解析】电泳可根据条带位置判断 PCR 产物的分子量，A 正确；引物设计错误会导致无法扩增出目标基因，电泳后无目标条带，B 正确；Marker 是已知分子量的 DNA 片段混合物，可作为参照，C 正确；目标条带越亮，说明扩增出的目标 DNA 越多，扩增效率越高，D 错误。
8（多选）.在 RT-PCR（逆转录 PCR）技术中，下列叙述正确的是（ ）
A. 第一步需用逆转录酶将 RNA 逆转录为 cDNA
B. 反应体系中需加入 RNA 酶抑制剂防止 RNA 降解
C. 后续 PCR 扩增的模板是 RNA
D. 可用于检测 RNA 病毒的感染情况
【答案】ABD
【解析】RT-PCR 先以 RNA 为模板，在逆转录酶作用下合成 cDNA，A 正确；RNA 易降解，需加入 RNA 酶抑制剂保护，B 正确；后续 PCR 扩增的模板是 cDNA，而非 RNA，C 错误；RNA 病毒的遗传物质是 RNA，可通过 RT-PCR 检测，D 正确。
9．某实验小组用 PCR 技术扩增目的基因，反应条件如下：94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 1min，共 30 个循环。回答下面的问题。
（1）94℃ 30s 的目的是________；
（2）58℃ 30s 的目的是________；
（3）72℃ 1min 的目的是________；
（4）若扩增后的产物经凝胶电泳后，出现多条杂带，可能的原因是________。
【答案】（1）使双链 DNA 变性解旋为单链
（2）使引物与模板单链特异性退火结合
（3）Taq DNA 聚合酶催化子链延伸
（4）引物特异性不强（或退火温度过低）
【解析】（1）94℃为变性温度，可使双链 DNA 解旋为单链；
（2）58℃为退火温度，利于引物与模板链结合；
（3）72℃为延伸温度，Taq 酶在此温度下催化子链合成；
（4）杂带出现的原因多为引物特异性差，或退火温度过低导致引物非特异性结合。
10.凝胶电泳中，DNA 分子的迁移速率与________、________和________有关。若要分离分子量差异较大的 DNA 片段，应选择________浓度较低的凝胶；若要分离分子量差异较小的 DNA 片段，应选择________浓度较高的凝胶。
【答案】凝胶浓度 DNA 分子大小 DNA 分子构象 凝胶 凝胶
【解析】DNA 分子的迁移速率受凝胶浓度（浓度越高，孔隙越小，阻力越大）、DNA 分子大小（越小迁移越快）和构象影响；分离分子量差异大的片段需低浓度凝胶（孔隙大，利于大分子迁移），分离差异小的片段需高浓度凝胶（筛分效果更精细）。
题型3 应用拓展
11.下列关于 PCR 与电泳结合应用的叙述，正确的是（ ）
A. PCR 产物经电泳后，只有目的基因条带会显色
B. 可通过电泳结果判断 PCR 反应是否产生非特异条带
C. 电泳可直接扩增微量的 PCR 产物
D. PCR 扩增的目的基因无需酶切即可通过电泳鉴定
【答案】B
【解析】PCR 产物电泳后，目的基因条带和非特异条带都会显色，可通过条带数量判断是否有非特异扩增，A 错误，B 正确；电泳的作用是分离 DNA 片段，不能扩增 DNA，C 错误；PCR 产物需经染色后才能通过电泳鉴定，且酶切后电泳可进一步验证目的基因正确性，D 错误。
12.某科研团队利用 PCR 技术扩增某病毒的特异性基因，并通过电泳鉴定扩增结果。
（1）PCR 反应体系中，除模板 DNA、引物、Taq 酶外，还需加入________和________。
（2）PCR 反应中，变性阶段的温度为 95℃左右，其目的是________；复性阶段的温度为 55℃左右，其目的是________。
（3）电泳时，若出现与预期大小一致的单一亮条带，说明________；若出现多条条带，可能的原因是________。
【答案】（1）4 种脱氧核苷酸（dNTP）；缓冲液
（2）使模板 DNA 双链解旋为单链；使引物与模板 DNA 单链特异性结合
（3）PCR 扩增成功，无明显非特异扩增；引物特异性差或复性温度过低
【解析】（1）PCR 反应体系的基本成分包括模板 DNA、引物、Taq 酶、4 种脱氧核苷酸（原料）和缓冲液（维持反应条件）。
（2）变性阶段高温使 DNA 双链解旋，复性阶段低温使引物与模板互补结合，延伸阶段 Taq 酶催化子链合成。
（3）单一亮条带说明扩增产物单一，符合预期；多条条带可能是引物与非目标序列结合（特异性差）或复性温度过低导致非特异结合。
13.利用 PCR 技术检测转基因作物中的目的基因时，下列做法错误的是（ ）
A. 设计的引物应特异性结合目的基因序列
B. 可将非转基因作物的 DNA 作为阴性对照
C. PCR 产物电泳后，若出现目标条带则证明转基因成功
D. 需设置空白对照以排除反应体系的污染
【答案】C
【解析】引物特异性结合目的基因是 PCR 特异性扩增的关键，A 正确；非转基因作物 DNA 不含目的基因，可作为阴性对照，B 正确；电泳出现目标条带仅说明检测到目的基因，不能证明其已整合到作物基因组并表达，需进一步检测表达产物，C 错误；空白对照（无菌水替代模板）可排除引物、dNTP 等的污染，D 正确。
14.新冠病毒是一种单链RNA病毒，常用“荧光RT PCR技术”进行检测，方法是取受检者的mRNA逆转录出cDNA，并大量扩增，用荧光标记的新冠病毒核酸探针来检测样品中新冠病毒的核酸含量。请回答下列问题：
(1)“荧光RT PCR技术”所用的试剂盒中通常都应该含有________、________、荧光标记的核酸探针、引物、dNTP、缓冲体系。
(2)如果要同时扩增两种基因，则试剂盒中的引物应该有________种。图1为新冠病毒的“ORFlab”基因对应的cDNA片段结构示意图，则与之对应的引物结合的部位应该是图中的________(子链延伸方向为其自身的5′→3′，用图中数字作答)。若已知该基因的一条引物，________(填“能”或“不能”)依据其碱基序列设计出另一条引物，理由是________________________________________________。
图1
(3)在检测过程中，随着PCR的进行，反应产物不断积累，荧光信号的强度也随之增加。根据荧光强度的变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增曲线(如图2)。
图2
①出现“平台期”最可能的原因是___________________________________。
②理论上，在检测过程中，有荧光信号出现，则说明检测结果呈________(填“阴”或“阳”)性，但为了保证检测结果的准确性，一般要达到或超过阈值时才确诊。现有两个待检样本，检测时都出现了如图2所示的曲线，但甲的A点比乙的A点明显左移。请给这种结果作出科学合理的解释(试剂盒合格且正常，操作过程规范且准确)：_______________________________________________________。
【答案】(1)逆转录酶　耐高温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)(两空顺序可颠倒)　
(2)4　4、1 不能　两种引物的碱基序列没有相关性　
(3)①试剂盒中的原料、引物和探针数量一定，超出一定的循环数后，荧光分子不再增加　②阳　甲样本中的新冠病毒核酸含量更高，达到阈值所需的循环数更少
【解析】(1)根据题目信息可知，荧光RT PCR技术基本原理是将新冠病毒RNA逆转录为cDNA，因此荧光RT PCR技术所用的试剂盒中通常都应该含有逆转录酶、耐高温的DNA聚合酶、引物、四种脱氧核苷酸、缓冲体系。
根据PCR的原理，在扩增DNA分子时每一条链均需与相应的引物结合才能进行扩增，因此如果要将两种基因分别扩增出来，则在试剂盒中的引物应该有4种；在利用PCR扩增DNA分子过程中，DNA聚合酶只能从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，又由于DNA的两条链是反向平行的，所以引物与DNA分子单链的3′端(—OH)相结合即图示中的1和4所示部位。由于两段引物的碱基序列没有相关性，既不相同，也不互补，因此不能根据该基因一条引物的碱基序列设计出另一条引物。
(3)①分析荧光扩增曲线图，图中曲线通过荧光强度变化反映产物量的变化，因此曲线中出现“平台期”最可能的原因是试剂盒中的原料和探针数量一定，超出一定的循环数后，荧光强度不再增加。②理论上，在检测过程中，有荧光信号出现，则说明检测结果呈阳性，但为了保证检测结果的准确性，一般要达到或超过阈值时才确诊。检测结果甲的A点比乙的A点明显左移，说明甲样本中的新冠病毒核酸含量更高，达到阈值所需的循环数更少。
15.简述 PCR 技术与琼脂糖凝胶电泳结合在基因工程中的应用场景（至少 3 点）。
【答案】
目的基因扩增后的鉴定，判断是否获得预期大小的目的基因；
转基因生物的筛选与检测，检测受体细胞中是否含有目的基因；
基因编辑结果的验证，判断目标基因是否发生预期突变；
病原体的核酸检测，快速诊断是否感染特定病原体。
【解析】
PCR 可快速扩增目的基因，电泳能分离鉴定产物大小，二者结合是基因工程中目的基因获取后的关键验证步骤。
转基因生物检测中，通过 PCR 扩增目的基因，电泳检测条带可初步判断转化是否成功。
基因编辑后，PCR 扩增目标基因，酶切后电泳，根据条带差异判断是否发生突变。
病原体检测中，利用特异性引物 PCR 扩增病原体核酸，电泳检测条带可快速确诊。
1．利用 PCR 技术和电泳技术鉴定转基因作物，下列实验设计不合理的是（ ）
A．用目的基因的特异性引物扩增，检测是否有预期条带
B．用载体上的标记基因引物扩增，排除假阳性结果
C．仅通过电泳条带大小无法确定扩增产物是否为目的基因
D．若电泳出现多条条带，说明转基因作物含有多种目的基因
【答案】D
【解析】目的基因特异性引物可实现特异性扩增，有预期条带说明含目的基因，A 合理；标记基因引物扩增可验证载体是否整合，排除仅引物结合导致的假阳性，B 合理；可能存在与目的基因大小相同的非特异性片段，需结合测序或探针杂交确认，C 合理；电泳多条条带可能是引物非特异性结合导致的非目标扩增，而非含有多种目的基因，D 不合理。
2（多选）.某研究小组用 PCR 技术扩增一段长度为 1000bp 的 DNA 片段，下列关于实验结果的分析，正确的是（ ）
A．若 PCR 循环 30 次，理论上目的基因的数量可达到 2^30 个
B．若引物结合位点发生突变，可能导致电泳后无预期条带
C．若延伸时间不足，可能导致扩增产物片段变短
D．若变性温度过低，可能导致电泳出现多条非特异性条带
【答案】BCD
【解析】理想条件下每个循环目的基因数量加倍，但实际中因原料消耗、酶活性下降等，30 次循环后数量远低于 2^30，A 错误；引物结合位点突变会导致引物无法结合，无法扩增出目的基因，电泳无预期条带，B 正确；延伸时间不足时，DNA 聚合酶无法完成全长子链合成，扩增产物片段变短，C 正确；变性温度过低会导致双链 DNA 解旋不完全，且引物易非特异性结合，扩增出多种片段，电泳出现多条条带，D 正确。
3（多选）.下列关于 PCR 技术和电泳技术的综合应用，正确的是（ ）
A．可通过 PCR 扩增 + 电泳检测，筛选含有目的基因的重组质粒
B．可通过 PCR 扩增 + 电泳，分析基因的表达水平
C．可通过 PCR 扩增 + 电泳，进行 DNA 指纹鉴定
D．可通过 RT-PCR（逆转录 PCR）+ 电泳，检测 RNA 病毒的存在
【答案】ACD
【解析】重组质粒含目的基因，用特异性引物扩增后，电泳出现预期条带可筛选阳性克隆，A 正确；PCR 扩增检测的是基因的存在与否，无法直接分析表达水平（需检测 mRNA 或蛋白质），B 错误；DNA 指纹鉴定利用个体 DNA 的特异性片段，经 PCR 扩增和电泳形成独特条带图谱，C 正确；RT-PCR 可将 RNA 逆转录为 cDNA，再通过 PCR 扩增和电泳检测，适用于 RNA 病毒的检测，D 正确。
4．某遗传病由常染色体隐性基因（a）控制，正常基因为 A。现有一疑似患者，为明确诊断，采用 PCR 技术和凝胶电泳进行检测，已知 A 基因长度为 800bp，a 基因长度为 600bp。
（1）设计引物时，应保证引物能同时结合 A 基因和 a 基因的________序列（填 “相同” 或 “不同”）；
（2）PCR 扩增后，将产物进行凝胶电泳，若电泳结果出现________条带，且条带大小为 600bp，则患者基因型为 aa；
（3）若检测结果出现两条条带（800bp 和 600bp），则该个体的基因型为________，该个体是否患病？，原因是；
（4）若检测结果仅出现 800bp 条带，则该个体的基因型为________。
【答案】（1）相同
（2）1
（3）Aa 不患病 常染色体隐性遗传病需隐性纯合（aa）才患病
（4）AA
【解析】A 和 a 为等位基因，大部分序列相同，仅突变位点不同，引物需结合两者相同序列，才能同时扩增两种基因。
（2）患者基因型为 aa，PCR 仅扩增出 600bp 的 a 基因片段，电泳出现 1 条 600bp 条带。
（3）两条条带说明同时含有 A 和 a 基因，基因型为 Aa，因该病为隐性遗传病，杂合子不患病。
（4）仅 800bp 条带说明仅含 A 基因，基因型为 AA。
5．某研究人员在进行 PCR 扩增时，出现了“无扩增产物” 的问题，请从引物、模板、酶、反应条件四个方面分析可能的原因，并给出对应的解决措施。
【答案】
引物问题：原因：引物序列错误、引物浓度过低、引物降解；措施：重新设计引物、调整引物浓度、使用新鲜引物。
模板问题：原因：模板 DNA 量不足、模板 DNA 降解、模板中含有抑制剂；措施：增加模板用量、提取高质量模板、去除模板中的抑制剂（如酚、氯仿）。
酶的问题：原因：Taq 酶失活、酶用量不足；措施：更换新鲜 Taq 酶、按说明书调整酶用量。
反应条件问题：原因：变性温度过低（双链未完全解旋）、复性温度过高（引物无法结合）、延伸时间不足；措施：提高变性温度（至 94℃）、降低复性温度（55-60℃）、延长延伸时间（按片段长度调整，1kb 片段约 1 分钟）。
【解析】PCR 无扩增产物的核心是扩增条件未满足特异性结合或酶促反应需求，需从各核心成分的功能和反应条件的适配性分析，针对性解决引物结合、模板质量、酶活性、温度时间控制等问题。
6（多选）.巢式 PCR 是一种提高扩增特异性的技术，其原理是：先用外侧引物进行第一轮 PCR 扩增，再以第一轮产物为模板，用内侧引物进行第二轮 PCR 扩增。下列叙述正确的是（ ）
A. 巢式 PCR 的特异性高于普通 PCR
B. 第一轮 PCR 的产物可作为第二轮的模板，无需纯化
C. 若第一轮出现非特异性扩增，第二轮可通过内侧引物筛选目标片段
D. 需设计两对引物，内侧引物的结合位点位于外侧引物结合位点之间
【答案】ACD
【解析】巢式 PCR 通过两轮扩增和两对引物，特异性更高，A 正确；第一轮产物需纯化去除外侧引物等杂质，避免干扰第二轮反应，B 错误；内侧引物仅结合目标片段，可筛选掉非特异性产物，C 正确；内侧引物结合位点在外侧引物之间，确保扩增目标片段，D 正确。
7．某研究小组欲用 PCR 技术扩增某一长度为 1000bp 的目的基因，实验流程如下：提取基因组 DNA→设计引物→PCR 扩增→凝胶电泳鉴定。回答下列问题：
（1）设计引物时，需保证引物 1 和引物 2 分别结合于目的基因的________和________（填 “5' 端” 或 “3' 端”），且引物之间不能形成________结构。
（2）PCR 反应体系中，Taq DNA 聚合酶的作用是________，该酶的特点是________。
（3）若 PCR 扩增 30 个循环，理论上目的基因的数量为________个（不考虑引物二聚体等干扰）。
（4）电泳鉴定时，若出现目标条带（1000bp）和一条 500bp 的杂带，可能的原因是什么？
（5）若要获得纯度更高的目的基因，可采取的措施有哪些？
【答案】（1）5' 端 3' 端 互补配对（或二聚体）
（2）催化脱氧核苷酸聚合形成子链 耐高温（或耐 90-95℃高温）
（3）2
（4）目的基因内部存在与引物互补的序列，导致引物非特异性结合，扩增出部分片段；或基因组 DNA 中存在同源序列。
（5）优化引物设计（提高特异性）；调整退火温度（适当升高）；采用巢式 PCR；电泳后切取目标条带回收 DNA。
【解析】（1）引物需结合于目的基因两端，分别对应 5' 端和 3' 端，避免引物之间互补配对形成二聚体，影响扩增。
（2）Taq 酶催化子链合成，其耐高温特性适应 PCR 的高温变性步骤。
（3）PCR 呈指数扩增，30 个循环后数量为 2 。
（4）杂带源于引物非特异性结合或基因组同源序列。
（5）通过优化引物、调整温度、巢式 PCR 或凝胶回收可提高纯度。
8．PCR是以模拟体内DNA复制的方式在体外选择性地将DNA某个特殊区域进行扩增的技术。DNA扩增过程的产物有长产物片段和短产物片段两种，其形成过程如图1所示。请回答下列问题：
图1
(1)DNA复制时子链延伸的方向是________(填“5′→3′”或“3′→5′”)。由于DNA聚合酶不能直接催化两个单核苷酸之间的反应，因此DNA复制需要一段单链DNA或RNA作为________。
(2)如果扩增序列为图2所示的两段序列之间的DNA片段，请从表中列出的引物中选出一对合适的引物________。
5′→GACCTGTGGAAGC……CATACGGGATTG 3′
3′ CTGGACACCTTCG……GTATGCCCTAAC 5′
图2
引物Ⅰ 引物Ⅱ
甲 5′ GACCTGTGGAAGC A 5′ CATACGGGATTG
乙 5′ CTGGACACCTTCG B 5′ GTATGCCCTAAC
丙 5′ CGAAGGTGTCCAG C 5′ GTTAGGGCTTAC
丁 5′ GCTTCCACAGGTC D 5′ CAATCCCGTATG
(3)下面为某同学利用PCR仪进行PCR的操作步骤，请完善相关步骤内容。
a.按配方准备好各组分。
b.用微量移液器向微量离心管中依次加入各组分：模板DNA，4种脱氧核糖核苷三磷酸、________、引物、缓冲液等。
c.________使反应液聚集在微量离心管底部。
d.将微量离心管放入PCR仪，设定好PCR仪的循环程序。
e.进行PCR反应。
(4)PCR的产物片段中，只有________才是符合要求的目标产物。
【答案】(1)5′→3′　引物　
(2)甲和D　
(3)耐高温的DNA聚合酶　离心　
(4)双链短产物片段
【解析】(1)DNA复制时子链延伸的方向是5′→3′。由于DNA聚合酶不能直接催化两个单核苷酸之间的反应，因此DNA复制需要一段单链DNA或RNA作为引物，当引物与模板链结合后，单个的脱氧核苷酸才能结合上来。
(2)引物与DNA的模板链的3′端能够配对，如果扩增序列为图2所示的两段序列之间的DNA片段，则根据碱基互补配对原则，最合适的引物为甲和D。
(3)PCR是在体外进行DNA复制的技术。该过程需要模板、原料、引物、耐高温的DNA聚合酶等。离心使反应液聚集在微量离心管底部。
(4)DNA是双链，PCR的产物片段中，只有双链短产物片段才是符合要求的目标产物。
9．某同学尝试用 PCR 技术扩增目的基因，多次实验后仍未获得目标产物，可能的原因有哪些？请从引物设计、反应体系、反应条件三个方面分析，并提出对应的解决措施。
【答案】
影响因素 可能原因 解决措施
引物设计 引物与模板结合特异性差 优化引物序列，增加引物长度（18-25bp）
引物之间形成二聚体 调整引物浓度，避免引物互补序列
引物结合位点不存在 重新设计引物（基于正确的基因序列）
反应体系 缺少 dNTP 或引物 补充足量的 dNTP 和引物
Taq 酶失活 更换新的 Taq 酶，低温保存酶制剂
模板 DNA 质量差（降解或杂质多） 重新提取模板，纯化 DNA
反应条件 变性温度过低（双链未完全解旋） 提高变性温度（如 95℃延长时间）
退火温度过低（非特异性结合） 梯度 PCR 筛选最佳退火温度
延伸时间不足（长片段未合成） 延长延伸时间（按 1kb/min 调整）
【解析】PCR 扩增失败需从核心要素分析：引物是特异性的关键，反应体系需保证原料、酶、模板的完整性，反应条件需匹配各步骤的需求，通过针对性调整可提高扩增成功率。
10.某研究小组用 PCR 技术和凝胶电泳鉴定转基因小鼠的基因型，转基因小鼠的基因组中整合了绿色荧光蛋白基因（GFP），野生型小鼠无该基因。设计的引物如下：引物 1（针对 GFP 基因）、引物 2（针对小鼠基因组内参照基因）。回答下列问题：
（1）PCR 扩增时，若小鼠为转基因纯合子，电泳结果会出现________条带；若为杂合子，会出现________条带；若为野生型，会出现________条带。
（2）若电泳后，转基因杂合子的样本中未出现 GFP 基因对应的条带，可能的原因是什么？
（3）参照基因的作用是什么？
（4）若要提高 PCR 扩增的特异性，可采取哪些措施？
【答案】（1）2；2；1
（2）PCR 反应中引物 1 失效；GFP 基因在小鼠基因组中发生缺失；退火温度过高导致引物 1 无法结合。
（3）作为内参，验证 PCR 反应体系正常（排除因体系问题导致的扩增失败）。
（4）优化引物设计（增加特异性序列）；调整退火温度（适当升高）；减少引物浓度；缩短延伸时间。
【解析】
（1）转基因纯合子含 GFP 基因和参照基因，出现 2 条带；杂合子同理也为 2 条带；野生型仅含参照基因，出现 1 条带。（2）未出现 GFP 条带可能与引物、基因缺失或反应条件相关。（3）参照基因可排除体系误差，确保实验可靠性。（4）通过引物优化、温度调整等可提高特异性。
11.某科研团队欲构建含人胰岛素基因的重组质粒，流程如下：提取人胰岛 B 细胞基因组 DNA→PCR 扩增胰岛素基因→酶切→连接→转化大肠杆菌→筛选鉴定。请回答下列问题：
（1）PCR 扩增胰岛素基因时，需根据________设计特异性引物。若引物 1 的序列为 5'-ATGAAGTTCATCTGTTC-3'，则引物 2 的序列应与胰岛素基因的________（填 “上游” 或 “下游”）序列互补，且方向为________。
（2）将 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，若出现预期大小的条带，能否说明扩增的就是胰岛素基因？请说明理由。
（3）酶切 PCR 产物和质粒时，选用两种不同的限制酶，其目的是________。酶切后的产物经电泳分离后，需回收________（填 “PCR 产物酶切片段” 或 “质粒酶切片段”）与质粒连接。（4）连接后的重组质粒转化大肠杆菌后，需提取质粒进行 PCR 鉴定，电泳结果显示出现预期条带，说明________。
【答案】（1）胰岛素基因的核苷酸序列；下游；5'→3'
（2）不能；电泳仅能判断 DNA 片段大小，无法证明其碱基序列是否为胰岛素基因，需进一步进行测序验证
（3）防止目的基因自身环化和质粒自身环化，保证目的基因与质粒正向连接；PCR 产物酶切片段
（4）重组质粒已成功导入大肠杆菌
【解析】（1）引物设计需依据目的基因的核苷酸序列，引物 1 结合上游序列，引物 2 需结合下游序列，且引物合成方向为 5'→3'。
（2）电泳的核心作用是分离不同长度的 DNA 片段，无法检测碱基序列，故需测序验证产物真实性。
（3）双酶切产生不同黏性末端，可避免目的基因和质粒自身环化，提高重组效率，连接时需回收目的基因的酶切片段与质粒结合。
（4）转化后提取质粒进行 PCR 鉴定，出现预期条带，说明大肠杆菌中含有重组质粒，即转化成功。
12.研究发现，增强子是基因转录的调控序列，具有促进启动子表达下游基因的作用；增强子可以位于基因的5′端，也可以位于基因的3′端。人肺特异性X蛋白(LUNX)基因是某种肺癌诊断的标志物，为了研究LUNX基因的增强子是否具有增强基因表达的功能以及其发挥作用的位置是位于启动子的上游还是下游。科研人员从人类全基因组序列数据库中利用生物信息学的方法筛选并利用PCR技术扩增了3个LUNX基因增强子片段(En，表示E1～E3)，分别定向连接到pGL3载体中荧光素酶报告基因(luc＋)启动子(SV40启动子)的上游和下游，如图所示，并通过相关技术检测荧光素酶的活性从而对增强子的功能进行判断，luc＋的表达强度越强，荧光素酶的活性越高。
(1)为了扩增以上3个LUNX基因增强子片段，需要人为设计合适的引物，在上述实验中共需要设计________种引物用于PCR反应体系；为了定向连接到pGL3载体中，在引物5′端需要引入的限制性酶切位点为________种，PCR每次循环一般可以分为________________三步。
(2)以上3个LUNX基因增强子片段经回收、纯化、测序正确后，将双酶切后的PCR产物分别定向连接到用________双酶切和________双酶切的pGL3载体中，构建LUNX基因增强子分别位于报告基因上游和下游的载体，载体中的氨苄青霉素抗性基因Ampr可用来__________________________________________
______________________________________________________________，
画出E1连接到pGL3载体报告基因下游的图谱。
(3)根据相关实验技术对荧光素酶的活性进行检测，结果如图3所示，
图3
根据结果得出的结论是_______________________________________________
___________________________________________________________________。
【答案】(1)12　4　变性、复性和延伸
(2)KpnⅠ/XhoⅠ　BamHⅠ/SalⅠ　重组DNA分子的筛选　见解析图　
(3)增强子E1、E2和E3在启动子的下游都能增强基因表达，其中E1的作用最为显著，E3在启动子的上游和下游都能增强基因表达。
【解析】(1)引物是基因两端的碱基序列，3个LUNX基因，每个基因2条链，每条链的两端各需一种引物，所以扩增以上3个LUNX基因增强子片段需要设计12种引物用于PCR反应体系；目的基因与载体结合前需要用限制酶对两者进行切割，延伸是在引物的3′端延伸，为了保证目的基因的完整性，因此需在引物的5′端加上限制性酶切位点，且为了使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连，常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，即在引物5′端需要引入的限制性酶切位点为4种，PCR每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步。
(2)PCR产物分别用KpnⅠ/XhoⅠ和BamHⅠ/SalⅠ双酶切，为了便于PCR产物与切割后的质粒连接，因此切割质粒也需要KpnⅠ/XhoⅠ和BamHⅠ/SalⅠ，通过题图限制酶切位点可知，KpnⅠ/XhoⅠ和BamHⅠ/SalⅠ双酶切位点符合构建基因表达载体的要求；氨苄青霉素抗性基因Ampr，可作为基因工程的标记基因，只有成功转入的由于有抗性基因而存活，从而找出那些成功转入了表达载体的细菌。E1连接到pGL3载体报告基因下游的图谱为
(3)分析实验结果可知，与对照组相比，增强子E1、E2和E3在启动子的下游都能增强基因表达，其中E1的作用最为显著，E3在启动子的上游和下游都能增强基因表达。
13.某同学欲利用 PCR 技术扩增某植物的抗虫基因，并通过电泳鉴定扩增效果。请完善实验步骤并回答问题：实验步骤：
（1）配制 PCR 反应体系：向离心管中加入模板 DNA、引物 1、引物 2、Taq 酶、dNTP 混合液、缓冲液，最后加无菌水至总体积 20μL。
（2）设置 PCR 反应程序：95℃预变性 5min；95℃变性 30s，55℃复性 30s，72℃延伸 1min，循环 30 次；72℃后延伸 10min。
（3）电泳鉴定：① 制备 1% 琼脂糖凝胶，待凝胶凝固后放入电泳槽，加入电泳缓冲液，使缓冲液________凝胶表面。② 向 PCR 产物中加入适量载样缓冲液，混匀后加入凝胶的________中。③ 接通电源，调节电压为 5V/cm，电泳 30min。④ 电泳结束后，将凝胶放入 EB 染色液中染色 10min，取出后在________下观察并拍照。问题：（1）步骤（1）中，若未加入 Taq 酶，PCR 反应能否进行？为什么？（2）步骤（2）中，预变性的目的是什么？循环 30 次后，DNA 分子数量理论上为原来的多少倍？（3）若电泳后未观察到任何条带，可能的原因有哪些？（至少答 2 点）
【答案】实验步骤（3）：① 没过（覆盖）；② 加样孔；③ 紫外灯
问题（1）不能；Taq 酶是 DNA 聚合酶，能催化脱氧核苷酸聚合形成 DNA 子链，无 Taq 酶则无法进行 DNA 延伸
（2）使模板 DNA 完全解旋为单链；2 倍
（3）模板 DNA 量过少；引物设计不合理，未与模板结合；Taq 酶失活；电泳缓冲液浓度不当；EB 染色未成功
【解析】电泳时缓冲液需没过凝胶，保证电场均匀；样品需加入加样孔，DNA 带负电向正极迁移；EB 染色后需在紫外灯下观察条带。
Taq 酶是 PCR 反应的关键酶，负责子链合成，无酶则反应无法进行；预变性可使模板 DNA 完全解旋，避免残留双链影响扩增；理想条件下 PCR 呈指数增长，30 次循环后为 2 倍。
未观察到条带的原因可从模板、引物、酶、电泳操作、染色等多个环节分析，核心是扩增失败或检测环节出错。
14.CRISPR-Cas9 基因编辑技术中，需通过 PCR 扩增向导 RNA 的编码基因，再构建重组载体。请结合 PCR 和电泳技术，回答下列问题：
（1）PCR 扩增向导 RNA 编码基因时，引物的设计需满足什么条件？（至少答 2 点）
（2）若 PCR 产物经电泳后出现三条条带，其中一条为预期大小，另外两条为非特异条带，如何优化 PCR 反应以获得单一目的条带？（至少答 2 点）
（3）将重组载体导入大肠杆菌后，如何利用 PCR 和电泳技术筛选含有重组载体的菌落？
【答案】（1）① 引物需与向导 RNA 编码基因的两端序列互补；② 一对引物的碱基序列不能互补，避免形成引物二聚体；③ 引物长度适宜（15-30 个碱基），保证特异性；④ 引物的 GC 含量适中（40%-60%），提高复性效率
（2）① 提高复性温度，减少引物与非目标序列的结合；② 优化引物浓度，降低引物二聚体形成概率；③ 更换特异性更强的引物；④ 减少循环次数，避免非特异产物累积
（3）① 挑取单个菌落，接种到液体培养基中培养，提取质粒；② 设计一对特异性引物，其中一条结合载体序列，另一条结合向导 RNA 编码基因序列；③ 以提取的质粒为模板进行 PCR 扩增；④ 对 PCR 产物进行电泳鉴定，若出现预期大小的条带，则该菌落含有重组载体
【解析】（1）引物设计的核心是保证特异性和结合效率，需从互补性、自身结构、长度、GC 含量等方面考虑。
（2）非特异条带的产生与引物非特异结合、反应条件不当有关，优化方向是提高特异性，减少非特异结合。
（3）筛选重组载体需设计 “载体 - 目的基因” 特异性引物，只有重组载体能扩增出预期条带，避免空载体的干扰，电泳鉴定可快速判断结果。
15.新冠病毒的核酸检测常采用 RT-PCR 技术（逆转录 + PCR），流程为：提取患者咽拭子中的 RNA→逆转录合成 cDNA→PCR 扩增 cDNA→电泳鉴定。请回答下列问题：
（1）RT-PCR 中，逆转录的模板是________，所需的酶是________。
（2）PCR 扩增 cDNA 时，需根据新冠病毒的________基因设计特异性引物。若引物结合效率低，会导致 PCR 产物量少，电泳后条带________。
（3）某患者的检测结果为电泳后出现预期大小的条带，能否确诊该患者感染新冠病毒？请说明理由。
（4）若检测过程中，空白对照的电泳结果出现了条带，该检测结果是否可靠？为什么？
【答案】（1）新冠病毒 RNA；逆转录酶（反转录酶）
（2）特异性（如刺突蛋白 S 基因）；暗淡（不清晰）
（3）不能；电泳仅能证明样本中存在与引物互补的核酸序列，可能是既往感染留下的核酸片段，需结合临床症状和其他检测结果综合判断
（4）不可靠；空白对照出现条带说明反应体系受到污染，可能导致假阳性结果
【解析】（1）RT-PCR 先通过逆转录酶将 RNA 转化为 cDNA，再进行 PCR 扩增，逆转录的模板是新冠病毒的 RNA。
（2）引物需结合新冠病毒的特异性基因，保证检测的准确性；引物结合效率低会导致扩增产物减少，电泳条带暗淡。
（3）核酸检测的阳性结果需结合临床症状，因为既往感染可能残留核酸片段，不能单独作为确诊依据。
（4）空白对照出现条带提示污染，会导致假阳性，使检测结果不可靠，需重新检测。21世纪教育网(www.21cnjy.com)
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