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第三章 第2节 基因工程的基本操作程序
第1课时：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建
从社会中来
国产转基因抗虫棉新闻
从社会中来
你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？
培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤呢？
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。
非转基因抗虫棉
转基因抗虫棉
培育转基因抗虫棉的四个步骤
与载体拼接
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
（有抗虫特性）
导入
抗虫基因
重组DNA分子
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的 检测与鉴定
基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？
过渡
目 录
一、目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建
1
目的基因的筛选与获取
2
基因表达载体的构建
标记基因
启动子
插入目的基因
终止子
复制原点
目的基因的筛选与获取
一
目的基因
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
2.实例：
主要指的是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。
1.概念：
(抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因)
资料：
一、目的基因的筛选与获取
苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。
苏云金芽孢杆菌
产生
Bt基因
伴胞晶体蛋白
(Bt抗虫蛋白)
表达
破坏鳞翅目昆虫的消化系统
杀死棉铃虫
导入
抗虫棉
培育
棉花细胞
这里的“杀虫基因”就是目的基因，那么，如何筛选目的基因呢？
过渡
目的基因
核DNA
从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。
DNA测序仪
核苷酸序列比对
氨基酸序列比对
美国国家生物信息中心
利用序列数据库（如GenBank）、序列对比工具（如BLAST）等，找到合适的目的基因
筛选适合的目的基因
1
(1)明确目的基因的方法：
①通过构建基因文库来获取目的基因
前提：
DNA合成仪
基因比较小、核苷酸序列已知
通过DNA合成仪用化学方法直接合成
③利用PCR特异性地快速扩增目的基因
②人工合成目的基因
方法：
筛选适合的目的基因
1
(2)获取目的基因的方法
提取
？
苏云金芽孢杆菌
抗虫基因
快速获得大量抗虫基因
3
（1）PCR——聚合酶链式反应的概念、原理
利用PCR获取和扩增目的基因
PCR需要什么条件呢？先来回顾DNA的复制！
过渡
PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，通过在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
模板：
游离的脱氧
核苷酸(A、T、G、C)
体内DNA复制要点回顾
(1)条 件
酶：
能量：
(2)复制原则：
碱基互补配对原则
（保证复制的准确进行）
DNA聚合酶
DNA解旋酶
复制分叉
子链
DNA模板链
DNA聚合酶
DNA模板链
子链
DNA
DNA的两条链
原料：
ATP
DNA解旋酶
DNA聚合酶等
利用PCR获取和扩增目的基因需要哪些条件？
PCR反应的基本过程是怎样的 ？
【自主学习】
任务一
阅读教材P77-79，结合图3—5，回答以下问题：
3
利用PCR获取和扩增目的基因
DNA模板
引物(2种)
四种脱氧核苷酸
(2)基本条件
3
利用PCR获取和扩增目的基因
引物
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸
(dNTP)
提供DNA复制的模板
合成子链DNA的原料
脱氧核糖
磷酸基团
含N碱基
Taq DNA聚合酶
稳定的缓冲溶液
(2)基本条件
激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶
3
利用PCR获取和扩增目的基因
使耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
提供合适的酸碱度和离子，DNA聚合酶需要Mg2＋激活
一般添加Mg2+
耐高温的DNA聚合酶
催化形成磷酸二酯键，进而合成DNA子链
(3) PCR反应过程
3
利用PCR获取和扩增目的基因
5'
3'
3'
5'
5'
3'
5'
3'
变性
复性
延伸
90℃以上，双链DNA解聚为单链
50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。
5'
3'
5'
3'
待扩增的DNA片段（模板）
4种脱氧核苷酸（DNTP）
Taq酶
引物1
引物2
(4)PCR的结果：
由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。
即成 形式扩增（约为 ，其中n为扩增循环的次数）
指数
2n
(5)PCR产物的鉴定：
常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。
变性
90℃以上
延伸
72℃左右
复性
50℃左右
基本过程
3
利用PCR获取和扩增目的基因
视频：PCR反应过程
1.利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？
思考 讨论
利用PCR获取和扩增目的基因
2.用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。
第3轮
单链RNA
逆转录酶
核酸酶H
DNA聚合酶
杂交双链
单链DNA
双链DNA
RNA链
DNA链
3.要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？
要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。
4.如果循环n次，则共需消耗多少对引物？
共需消耗2n－1对引物
思考 讨论
利用PCR获取和扩增目的基因
引物
DNA母链
脱氧核苷酸
4. PCR技术与DNA复制过程比较？
PCR技术 DNA复制
相同点 原则 原料 条件 不同点 解旋方式
场所
酶
结果
碱基互补配对
四种脱氧核苷酸
模板、能量、酶
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
体外复制
细胞内（主要在细胞核内）
耐高温的DNA聚合酶
解旋酶、DNA聚合酶
大量的DNA片段
形成整个DNA分子
思考 讨论
利用PCR获取和扩增目的基因
基因表达载体的构建
二
【合作探究】
二、基因表达载体的构建
任务二
阅读教材P80，思考讨论以下问题：
获得了足量的Bt基因后，是否能直接将Bt基因导入棉花细胞呢？
将Bt基因送人受体细胞的载体需要具备什么条件
要使Bt基因在受体细胞中稳定存在，并能够表达 和发挥作用，载体还需要哪些结构？
不能。游离的DNA进入受体细胞，一般会直接被分解，即使可以转录翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。
获得了足量的Bt基因后，是否能直接将Bt基因导入棉花细胞呢？
因此，获取Bt基因后，还需要借助载体将其导入棉花细胞，才能使棉花植株获得抗虫特性。
1
基因表达载体的目的
(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；
(2)使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。
将Bt基因送人受体细胞的载体需要具备什么条件
2
基因表达载体的组成
RNA聚合酶识别和结合的部位；驱动基因转录出mRNA。
基因的尾端能终止转录
作用是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而筛选出含有目的基因的受体细胞
抗生素抗性基因，荧光蛋白基因等。
如
Bt基因在受体细胞中稳定存在，并表达和发挥作用，载体需要哪些结构？
标记基因
启动子
插入目的基因
终止子
复制原点
限制酶切割位点
项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
本质 ______ _____ _______ _______
位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
功能 ________________________________________________ ____________________________ _____________________ ________________________
DNA
DNA
mRNA
mRNA
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
使转录在所需要的地方停下来
翻译的起始信号(编码氨基酸)
翻译的结束信号(不编码氨基酸)
启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
基因表达载体构建模式图
载体
（质粒）
DNA分子
（含目的基因）
限制酶处理
带有黏性末端或平末端的切口
带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段
DNA连接酶
重组DNA分子（重组质粒）
同一种
2
基因表达载体的构建
载体
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接 反向连接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
1.使用一种DNA限制酶进行切割，共有几种连接情况
思考 讨论
基因表达载体的构建
启动子下游和终止子上游。因为只有插入在启动子和终止子之间，目的基因才可以正常表达
2.构建基因表达载体时目的基因插入的位置应该在哪里？为什么？
思考 讨论
基因表达载体的构建
标记基因
启动子
插入目的基因
终止子
复制原点
限制酶切割位点
3. 限制酶的选择原则
如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SamⅠ。
所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
(1)不破坏目的基因原则：
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：
思考 讨论
基因表达载体的构建
通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；
为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接（或为了保证目的基因和质粒发生定向连接）可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种不同的限制酶分别切割目的基因和质粒。
(3)确保出现相同黏性末端原则：
思考 讨论
基因表达载体的构建
3. 限制酶的选择原则
本节小结
目的基因的筛选与获取
从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选
利用PCR获取和扩增目的基因
基因表达载体的构建
目的基因
标记基因
启动子
终止子
复制原点
1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。 （ ）
2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是（ ）
A. PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B. 变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C. 复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D. 延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸
√
D
概念检测
1.下列有关PCR技术的说法，错误的是
A.PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术
B.PCR技术的原理是DNA半保留复制
C.PCR的特异性主要取决于引物的碱基序列特异性
D.PCR扩增中需要解旋酶解开双链DNA
√
体悟巩固
（1）构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？
不能
因为SmaⅠ切割会破坏质粒的抗生素抗性基因。
2.请结合下图，回答问题：
质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。
体悟巩固
（2）与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？
①可以防止质粒、目的基因的自身环化连接；
②还可以防止目的基因与载体的反向连接。
2.请结合下图，回答问题：
体悟巩固

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