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第三章 第2节 基因工程
第2课时：将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定
Ti质粒
T—DNA
构建基因表达载体
重组
Ti质粒
转入农杆菌
导入植物细胞
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
基因工程的基本操作程序
构建好的Bt基因表达载体通过什么方式导入棉花细胞？
情境导入
用什么方法能直观的检测出目的基因是否表达？
在获得转基因产品的过程中，受体细胞有植物、动物、微生物之分，受体细胞不同，将目的基因导入受体细胞的方法也不完全相同。
1
将目的基因导入受体细胞
2
目的基因的检测与鉴定
目 录
二、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定
3
DNA片段的扩增及电泳鉴定
将目的基因导入受体细胞
一
将目的基因导入受体细胞的方法有哪些？
【归纳概括】
任务一
阅读课本P80-81，归纳概括：
一、将目的基因导入受体细胞
将目的基因导入受体细胞的方法
导入植物细胞
导入动物细胞
导入微生物细胞
农杆菌转化法（常用）
花粉管通道法
——显微注射法
——Ca2+处理法
（我国科学家独创）
在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
(1)花粉管通道法
（我国科学家独创的将Bt基因导入棉花细胞的方法）
操作方式：
1.导入植物细胞
(2)农杆菌转化法
1.导入植物细胞
目的基因进入_________内，并且在受体细胞内__________和_____的过程。
受体细胞
维持稳定
表达
转化的概念
问号素材PPT
农杆菌
Ti质粒
能在自然条件下可侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
①农杆菌的特点：
农杆菌转化法
资料卡
农杆菌细胞内含有 ，当它侵染植物细胞时，Ti质粒的_______可转移至被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的 。
②转化原理：
T-DNA
染色体DNA上
Ti质粒
农杆菌转化法
资料卡
T-DNA
Ti质粒
大型环状DNA
农杆菌
③过程：
表现出新性状的植株
植物组织培养
第一次导入
第二次导入
第一次拼接
第二次拼接
将目的基因拼接到 Ti 质粒的 T-DNA上。
(非人工操作)是指含目的基因的 T-DNA 被拼接到受体细胞的染色体DNA上。
(非人工操作)含目的基因的 T-DNA 导入受体细胞。
将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌。
Ti质粒
T—DNA
目的基因
构建基因表达载体
重组
Ti质粒
转入农杆菌
导入植物细胞
农杆菌转化法
资料卡
目的基因的表达载体提纯
取卵(受精卵)
显微注射
受精卵发育
获得具有新性状的动物
3.导入动物细胞
①个体大，易操作。
②受精卵全能性高，易培养成完整个体。
(1)显微注射法
显微注射法
原因
Ca2+ 处理大肠杆菌细胞，可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
Ca2+处理细胞
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA分子
大肠杆菌细胞
4.导入微生物细胞
(1) Ca2+ 处理法
过渡
目的基因导入受体细胞后，是否能稳定维持和表达遗传特性呢？
目的基因的检测与鉴定
二
Bt基因
mRNA
Bt抗虫蛋白
害虫死亡
抗虫棉
只有一部分Bt基因能成功导入棉花细胞并表达Bt抗虫蛋白,这需要检测和鉴定才能知道,如何进行检测和鉴定呢
请你回顾基因表达的过程,推测可以从哪些方面进行检测与鉴定。
培育转基因抗虫棉的最终目的就是要赋予棉花抗虫特性,怎样检测棉花是否具有抗虫特性呢
【思考讨论】
任务二
阅读课本P82，思考如下问题：
二、目的基因的检测与鉴定
(1)检测目的基因是否导入
如：检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因
——通过PCR等技术检测
提取DNA
PCR操作
是否扩增出目的基因
M：marker；1-阳性质粒；2：原始品系；3-9转Bt品系；
电泳操作
1.分子水平的检测
害虫死亡
抗虫棉
PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果
(2)检测目的基因是否转录
如：检测Bt基因是否翻译出mRNA
——通过PCR等技术检测
Bt
M3
C0
T-9
T-2
T-51
T-5
T-23
T-11
T-20
T-21
T-34
T-10
10个PCR阳性棉花植株中，有四株Bt基因发生转录
1.分子水平的检测
提取mRNA
PCR操作
是否扩增出目的基因
对扩增产物进行检测
害虫死亡
抗虫棉
逆转录
产生DNA
(3)检测目的基因是否翻译
如：检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白
——通过抗原-抗体杂交检测
苏云金芽孢杆菌
提取
Bt毒蛋白
注射小鼠体内
抗体
标记抗体
提取蛋白
电泳分离
抗原
抗体
杂交
1.分子水平的检测
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）接种实验
未染病
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
抗性鉴定、活性鉴定等
2.个体水平的检测
目的基因的检测与鉴定归纳
类型 检测内容 方法
分子水平的检测
个体生物学水平的鉴定
受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
目的基因是否转录出了mRNA
PCR等技术
目的基因是否翻译成蛋白质
抗原-抗体杂交技术
个体是否具有相应性状
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
本节小结
目的基因的筛选与获取
常用PCR获取和扩增目的基因
将目的基因导入受体细胞
导入植物细胞：
基因表达载体的构建
目的基因的检测与鉴定
导入动物细胞：
导入微生物细胞：
农杆菌转化法、花粉管通道法
显微注射技术
Ca2+处理法
分子水平上的检测,个体生物学水平上的鉴定
1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。 （ ）
（2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶（ ）
（3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功（ ）
√
×
×
教材课后习题·概念检测
2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是（ ）
A. PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B. 变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C. 复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D. 延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸
D
教材课后习题·概念检测
2. 八氢番茄红素合酶(其基因用psy表示)和胡萝卜素脱饱和酶(其基因用crtl表示)参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtl基因转入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡萝卜素，由此生产出的大米称为 “黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。
（1）科学家在培育“黄金大米”时，将ctrⅠ和psy基因导入含pmi基因的质粒中，构建了质粒pSYN12424。该项研究的目的基因是__________________，标记基因是________________，质粒pSYN12424的作用是_________________________。
（2）在构建质粒载体时，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的识别序列？
为什么？
ctrⅠ基因和psy基因
pmi基因
将目的基因送入水稻细胞
不能
若目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，则可能被切断。
教材课后习题·拓展应用
将目的基因导入受体细胞
三
1.实验原理
(1)PCR在体外进行DNA片段的扩增原理
PCR利用了_________________和________________的原理。
DNA的热变性原理
DNA半保留复制
(2)DNA片段电泳鉴定的原理
DNA分子具有____________，在一定的____下，这些基团可以带上______________，在_________的作用下，这些___________会向着__________________的电极移动，这个过程就是_____。
可解离的基团
pH
正电荷或负电荷
带电分子
电泳
与它所带电荷相反
电场
在凝胶中DNA分子的迁移速率与___________、_______________和_____等有关。
凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为______的________下被检测出来。
凝胶的浓度
染色
300nm
紫外灯
DNA分子的大小
构象
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究 实践
(1)试剂
①4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究 实践
2.材料用具
③PCR反应体系的配方(见教材)
②电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等。
①PCR仪 （自动控温，实现DNA的扩增）
②微量离心管 （实际上是进行PCR反应的场所）
③微量移液器 （用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）
④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）
⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
2.材料用具
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究 实践
(1)用具
(1)DNA片段扩增的具体过程
移液
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。
离心
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）。
反应
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。
可根据目的片段长度适当调整延伸时间。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究 实践
3.实验步骤
(2)PCR扩增产物电泳鉴定的具体过程
制备凝胶
电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
进行电泳
将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
观察鉴定
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究 实践
①融化：
②倒模:
③凝固:
①加液：
②加样：
③电泳：
你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带。
该片段大小约为750bp
你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
①如果扩增不成功，可能的原因有：
漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。
②如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：
引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；复性温度过低；DNA聚合酶的质量不好；模板DNA出现污染；Mg2＋浓度过高等。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究 实践
4.实验结果及分析评价
①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
②该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
③在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
④在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
⑤PCR扩增不能随意加大试剂用量。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究 实践
5.注意事项
视频：DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究 实践
本节小结
基因工程的基本操作程序
目的基因的筛选与鉴定
导入植物细胞:农杆菌转化法、花粉管通道法
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
导入动物细胞:显微注射技术
导入微生物细胞:Ca2+处理法
分子水平的检测
个体水平的检测
——通过PCR等技术检测
DNA片段的扩增及电泳鉴定
谢
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