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(共46张PPT)
第十单元
生物技术与工程
考查内容
1.认识无菌技术是获得微生物培养物的重要方法，尝试配制培养基培养酵母菌，学会无菌操作方法(生命观念、科学探究)
2.认识平板划线法和稀释涂布平板法是分离和纯化微生物的重要方法，尝试分离和纯化酵母菌，学会平板划线法和稀释涂布平板法。设计实验方案，有目的地培养某种微生物(科学探究、科学思维)
3.认识稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的重要方法，尝试分离和计数能分解尿素的微生物，学会利用稀释涂布平板法计数微生物(科学探究、科学思维)
4.举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物(科学思维)
考点一　培养基及灭菌、消毒技术
1.培养基
2.针对目标微生物的代谢特点提供所需的生长条件
(1)异养型微生物培养基中需提供有机碳源；自养型微生物培养基中可以没有有机碳源，但需提供光能或化学反应释放的能量。
(2)需氧型微生物培养需要氧气，可通入无菌空气或振荡培养；厌氧型微生物培养需提供无氧的条件，可静置培养，甚至在培养基表面添加石蜡。
(3)固氮微生物可只提供N2，不提供其他氮源；非固氮微生物不能以N2为氮源。
(4)丧失了合成某种特定化合物能力的微生物：提供该特定的化合物。
3.避免培养物被杂菌污染的注意事项
(1)注意灭菌操作原则，灭菌要彻底，降低环境污染概率，手和实验服要清洁，减少操作时间，胆大心细。
(2)注意微生物的生长条件，如pH、渗透压、温度等。“细菌喜荤，霉菌喜素”，细菌通常在中性偏碱的环境中生长，霉菌通常在中性偏酸的环境中生长。因此，可以根据不同微生物的“喜好”来减少污染。
4.灭菌和无菌操作技术
(1)灭菌
①实验器具与培养基灭菌
②较高温度下会分解的有机化合物的灭菌和使用过的器皿、废弃物的处理
对象 方法
尿素、葡萄糖的灭菌 采用已高压蒸汽灭菌的、孔径最小的__________________进行过滤除菌
对含葡萄糖的培养基 采用适当降低________、________以及延长时间的高压灭菌方法灭菌
所有使用过的器皿、废弃物 先经过____________后再洗涤或倾倒
G6玻璃砂漏斗
温度
压力
高压灭菌
(2)灭菌、消毒和防腐的区别
①
②
③
灭菌的效果比消毒要好。活体生物材料、操作者的手等只能消毒，而不能灭菌。
[自我诊断]正确的打“√”，错误的打“ ”。
1.配制培养基时应根据微生物的种类调整培养基的pH。(　 　)
2.某醋酸菌培养基由蛋白胨、酵母提取物和甘露醇组成。其中甘露醇的主要作用是提供氮源。　(　 　)
3.制备尿素固体培养基时，应先将适宜浓度的尿素溶液用高压蒸汽灭菌过的G6玻璃砂漏斗过滤。(　 　)
4.对培养基进行高压蒸汽灭菌时，灭菌时间应从接通电源时开始计时。(　 　)
5.配制醋酸菌培养基时，应将适量的葡萄糖、KH2PO4、MgSO4溶解并定容，先高压蒸汽灭菌，再调节pH，经冷却后加入3%的无水乙醇。　(　 　)

√

√

C
例 1
培养基是指供给微生物、植物或动物细胞(或组织)生长繁殖的，由不同物质组合配制而成的营养基质。关于表中的三组培养基，下列叙述中，错误的是(　 　)
A.a组培养基可用于醋化醋杆菌的扩大培养，该培养过程需用到磁力搅拌器和摇床
B.b组培养基可用于分离含脲酶的微生物，该实验中需用全营养LB固体培养基作对照
C.c组培养基可用于诱导植物愈伤组织再分化，添加的植物生长调节物质需事先高压蒸汽
灭菌
D.上述培养基不仅要为相应的细胞提供营养物质还要为其生存和繁殖提供适宜的环境
组别 培养基成分
a 蛋白胨、酵母提取物、甘露醇、水
b 葡萄糖、尿素、NaCl、K2HPO4、酚红、琼脂糖
c 矿质元素、蔗糖、维生素、甘氨酸、水、琼脂
【解析】a组培养基可用于醋化醋杆菌的扩大培养，磁力搅拌器和摇床都是扩大菌落与其所需要的营养物质的接触面积，有利于菌落的培养，A正确；b组培养基以尿素作为唯一氮源，含脲酶的微生物在该培养基上能生长，其他微生物在该培养基上因缺乏氮源而不能生长，可用于分离含脲酶的微生物，该实验中需用全营养LB固体培养基作对照，通过对照可以判断选择培养基的选择作用，B正确；c组培养基可以用于诱导植物愈伤组织再分化，添加的植物生长调节物质不能高压蒸汽灭菌，易被分解，C错误。
例 2
在生产、生活和科研实践中，经常通过无菌操作技术避免杂菌的污染。下列关于无菌操作技术的叙述，错误的是(　 　)
A.当超净工作台处于紫外灯和过滤风打开状态时，人必须离开
B.高压蒸汽灭菌时，只要压力达到设定要求锅内就可达到相应温度
C.密闭空间内可采用紫外线照射消毒，在照射前可喷洒消毒液
D.用乙醇和次氯酸钠处理过的外植体需经无菌水清洗后才可用于组培
【解析】当超净工作台处于紫外灯和过滤风打开状态时，人必须离开，以免造成伤害，A正确；使用高压蒸汽灭菌锅对培养基进行灭菌时，需要将灭菌锅内的冷空气排尽后，才能关闭排气阀，以保证锅中的高压只来自水蒸气，从而能随着加热的进行将压力达到设定要求；若未将锅内冷空气排尽，则会出现锅内压力达到要求，而温度并没有达到相应要求的现象，B错误；紫外线能破坏DNA结构，照射前，适量喷洒消毒液，可强化消毒效果，C正确；用乙醇和次氯酸钠处理过的外植体需经无菌水多次冲洗后才可用于组培，D正确。
B
考点二　微生物的分离纯化和计数
1.对目标微生物的分离和纯化
(1)纯种和接种
①利用微生物需要使用纯种的原因：保证实验的可________性和结果的________性。
②人为接种：挑取目标微生物的纯种将其转移到液体培养基培养；在斜面培养基上____________用于保存菌种；在固体培养基上采用划线或____________的方法接种。
重复
可靠
连续划线
稀释涂布
(2)两种纯化方法的比较
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
主要步骤 用接种环在固体培养基表面进行连续________划线、________划线和多次连续平行划线 系列梯度稀释操作和涂布平板操作
接种工具 ____________ ____________
能否用
于计数 不能计数 可以计数，但是操作复杂，需涂布多个平板
培养结果

共同点 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征
平行
扇形
接种环
涂布器
2.微生物的筛选与鉴别方法
(1)微生物的筛选方法
(2)微生物的鉴别方法
单菌落挑取法 利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体平板培养基表面，直接根据微生物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物
选择培养法 利用选择培养基对微生物进行选择培养，直接获得目的微生物
鉴别培养法 利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现易于区分的特征，然后筛选目的微生物
菌落特征鉴别法 根据微生物在固体平板培养基表面形成的菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴别
指示剂鉴别法 如培养基中加入酚红指示剂，培养某种微生物后，培养基变红说明该种微生物能够分解尿素
染色鉴别法 如利用刚果红染色法，根据培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈来筛选分解纤维素的微生物
3.统计菌落数目的方法
(1)利用稀释涂布平板法测定微生物的数量
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个__________，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
②计算公式：每毫升菌液中微生物细胞的数量=某一稀释倍数下至少______个培养皿的平均菌落数÷菌液稀释液体积×稀释倍数。
③减小误差的两个方面：a.在保证能准确计数的前提下________稀释度；b.将相同稀释度下的多组数值取__________后再进行计算。
(2)利用显微镜计数法测定微生物的数量
①原理：利用特定________________，在显微镜下计算一定体积的样品中微生物的数量。
单菌落
3
减小
平均值
血细胞计数板
②实验步骤
③计算公式：酵母细胞个数/mL=_______________________________________________
(3)稀释涂布平板法和显微镜计数法的比较：
①稀释涂布平板法：计数的是培养基上的菌落数，是活菌。当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，导致计数数值比实际值小。
②显微镜计数法：计数的是菌体本身，死菌、活菌都计算在内，导致计数值比实际值偏大。
80个小方格细胞总数/80×400×10 000×稀释倍数　
4.活动：配制可用于培养酵母菌的马铃薯蔗糖培养基
5.活动：接种、培养并分离酵母菌
(1)目的要求
①用____________法或稀释涂布平板法接种酵母菌。
②用________培养基大量扩增酵母菌。
平板划线
液体
(2)方法步骤
(3)实验结果的分析
①培养未接种的培养基的目的是检查培养基制备是否合格。未接种的培养基表面若有菌落生长，则说明培养基被污染，应该重新制备；若无菌落生长，则说明未被污染。
②在接种酵母菌的固体培养基上可观察到独立的菌落，这些菌落在颜色、形状和大小上相似，酵母菌菌落一般表面光滑，多呈乳白色。
③若在固体培养基中观察到不同形态的菌落，原因可能是菌液不纯，混入其他杂菌，或在实验操作过程中被杂菌污染。
6.活动：能分解尿素的微生物的分离与计数
(1)实验原理
(2)方法步骤
[自我诊断]正确的打“√”，错误的打“ ”。
1.对细菌进行计数可以采用稀释涂布平板法和平板划线法。(　 　)
2.筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源。(　 　)
3.除第一次划线外，每一次划线的起点都是第一次划线的末端。(　 　)
4.倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上。(　 　)
5.(真题节选)测定植物原生质体的密度时，可用血细胞计数板。(　 　)

√

√

例 3
(2025·舟山选考模拟)微生物的纯培养操作中，如图所示为划线接种(甲)和培养结果(乙)，a、b、c、d是划线的四个区域。下列叙述中，错误的是(　 　)
A.每次划线前后都要对接种环灼烧灭菌
B.连续划线的目的是获得单个微生物纯培养形成的纯培养物
C.图甲中的a区域为划线的起始区域
D.蘸取菌液和划线要在酒精灯火焰旁进行
【解析】图甲中a对应的区域出现了单个菌落，d区域菌落最多，因此a区域应该为划线的最终区域，d区域为划线的起始区域，C错误。
C
例 4
如图所示为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。据图分析，下列说法中，错误的是(　 　)
A.某一稀释度下至少涂3个平板，该实验方法统计得到的结果常会比实际活菌数目少
B.3号试管中的样品溶液稀释倍数为104倍
C.5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×108个
D.该实验需设置牛肉膏蛋白胨培养基作对照，用以判断选择培养基是否有选择作用
C
【解析】设置重复组，可以增强实验的说服力与准确性，故某一稀释度下至少涂3个平板；稀释涂布平板法得到的菌落可能存在两个或多个细菌细胞长成一个菌落的情况，使该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目少，A正确；据图可知，将10 g土样用无菌水定容至100 mL后，此时土样稀释倍数为10倍，再经3次10倍稀释得到3号试管中的样品，故3号试管中样品的稀释倍数是104倍，B正确；由5号试管进行稀释涂布平板法计数的结果可知，每克土壤中的菌株数约为(168＋175＋167)÷3×106÷0.1=1.7×109(个)，C错误；要判断选择培养基是否起到了选择作用，需设置接种了的牛肉膏蛋白胨培养基作对照，若牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落种类数目多于选择培养基上的，则说明起到了选择作用，D正确。
例 5
(2026·绍兴一模)噻虫啉是杀虫剂中的有效成分，是一种含氮有机物，在环境中残留易对生态环境造成污染。研究人员筛选噻虫啉高效降解菌的流程如图所示，其中甲、乙、丙培养基均以噻虫啉为唯一氮源。下列叙述中，正确的是　(　 　)
A.噻虫啉污染使菌株出现噻虫啉降解能力
B.甲培养基可增加培养液中目标菌的比例
C.乙培养基上生长的单菌落均为目标菌株
D.丙1、2、3是重复实验，以减少实验误差
B
【解析】菌株的噻虫啉降解能力源于基因突变，基因突变是随机发生的，并非由噻虫啉污染诱导产生，噻虫啉的作用是作为选择压力，筛选出原本就具有降解能力的菌株，而非导致菌株出现该能力，A错误；甲培养基以噻虫啉为唯一氮源，只有能产生降解噻虫啉酶、利用其作为氮源的菌株才能存活繁殖，其他不能降解噻虫啉的菌株因缺乏氮源无法生长。该过程可增加培养液中目标菌(噻虫啉降解菌)的比例，为后续分离纯化奠定基础，B正确；乙培养基为固体选择培养基，其作用是分离单菌落，但无法排除假阳性情况——可能存在其他可利用噻虫啉作为氮源，但不具备高效降解能力的菌株，或杂菌污染导致的单菌落。因此乙培养基上的单菌落需进一步验证，并非均为目标菌株，C错误；丙1、2、3的处理是对不同单菌落的分别培养，目的是筛选出高效降解的目标菌株，而非重复实验。重复实验是对同一处理进行多次操作以减少误差，二者实验设计目的不同，D错误。
课时作业
答案速对
第十单元　作业46 　微生物的培养和利用
题号 1 2 3 4 5 6 7 8
答案 C D C A D D D 见答案
1.培养基可为目标微生物提供适宜的生长环境，下列叙述中，错误的是(　 　)
A.在LB培养基中加入甘露醇可为醋化醋杆菌提供碳源
B.在LB培养基中加入较高浓度氯化钠可筛选嗜盐细菌
C.将蔗糖豆芽汁培养基的pH调成碱性有利于霉菌生长
D.尿素固体培养基的尿素可为目标微生物提供氮源
C
2.(2025·衢州模拟)无菌操作是微生物培养过程中的关键环节，下列叙述中，错误的是
(　 　)
A.煮沸可以杀死微生物细胞和一部分芽孢，达到消毒目的
B.培养真菌时，在培养基中加入青霉素可抑制某些细菌的生长
C.在酒精灯火焰旁操作可以减少空气中微生物落入培养基的可能性
D.含葡萄糖的培养基需在121 ℃(1 kg/cm2)条件下高压蒸汽灭菌20 min
D
C
3.稀释涂布平板法和平板划线法是分离和纯化微生物两种重要的方法，关于对二者的比较，下列说法中，错误的是(　 　)
A.稀释涂布平板法易形成单菌落并可对微生物进行计数
B.利用稀释涂布平板法进行统计数据时应选择相同稀释度下的培养基
C.平板划线中用蘸有菌液的接种环划一条线后，再次蘸取菌液继续划线
D.二者接种菌液时分别需要用到的工具是涂布器和接种环
4.某兴趣小组测定土壤中尿素分解菌的数量，对土样进行稀释的流程如图所示。摇匀C试管，从C试管中取0.1mL菌液进行接种，在适宜条件下培养一段时间，测得平板中的平均菌落数为38。
①取土样的工具必须灭菌　②需用空白培养基倒置培养作对照　③可用牛肉膏蛋白胨培养基培养　④接种时采用涂布平板法　⑤接种时可采用平板划线法　⑥每克土样中尿素分解菌的数量至少是3.8×106个　⑦每克土样中尿素分解菌的数量至少是3.8×105个。关于本实验，以上说法正确的是(　 　)
A.①②④⑥ B.②④⑤⑥
C.②③⑤⑦ D.①③④⑥
A
【解析】取土样用的铁铲和取样袋在使用前都需要进行灭菌，①正确；需用空白培养基倒置培养作对照，用于检测培养基是否被污染，②正确；不可用牛肉膏蛋白胨培养基培养，因为牛肉膏蛋白胨培养基含有氮源，不具有选择作用，无法筛选出尿素分解菌，③错误；接种时采用涂布平板法，适合用于计数，④正确；该实验需要进行计数，平板划线法不能计数，⑤错误；据图可知，菌液在接种前到C试管，被稀释了104倍，因此每克土样中纤维素分解菌的数量，应该为38÷0.1×104=3.8×106(个)，⑥正确，⑦错误。综上，①②④⑥正确，A符合题意。
5.(2025·浙江A9协作体返校联考)嗜热菌又称高温细菌，是一类生活在高温环境中的微生物。研究者从温泉中筛选高效产生高温淀粉酶的嗜热菌，其筛选过程如图1所示。将得到的菌悬液转接于同时含有葡萄糖和淀粉作碳源的固体培养基上培养，得到若干菌落后用碘液作显色处理，结果如图2所示。下列说法中，正确的是(　 　)
图1 图2
A.甲、乙试管为液体培养基，液体培养基能分离获得嗜热菌单菌落
B.只有能产生淀粉酶的微生物才能在Ⅰ、Ⅱ号培养基上生长
C.丙试管中嗜热菌数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和室温条件
D.图2中周围不显蓝色的菌落含有所需的嗜热菌
D
【解析】甲、乙试管为液体培养基，液体培养基不能分离出单菌落，A错误；结合题干可知，Ⅰ、Ⅱ号培养基均同时含有葡萄糖和淀粉，因此并非只有能产生淀粉酶的微生物才能在Ⅰ、Ⅱ号培养基上生长，B错误；结合题干可知，丙中嗜热菌数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和高温条件，C错误；图2中周围不显蓝色的菌落，说明其产生的淀粉酶可以在高温下分解淀粉，所以周围不显蓝色的菌落含有所需的嗜热菌，D正确。
6.(2025·绍兴模拟)尿素是一种重要的农业肥料，经细菌分解后能更好地被植物利用。某生物兴趣小组开展“土壤中分解尿素的细菌分离与计数”的实验的具体操作流程如图所示。下列叙述中，错误的是(　 　)
A.分解尿素的细菌能合成脲酶，脲酶能将尿素分解成NH3和CO2
B.振荡可使土样中的微生物均匀分布在无菌水中
C.稀释涂布平板法既能分离微生物，也能统计样品中活菌的数目
D.图中纯化培养得到的微生物均具有分解尿素的能力
【解析】分解尿素的细菌能合成脲酶，在脲酶的催化下能将尿素分解成NH3和CO2，A正确；振荡可使土样中的微生物均匀分布在无菌水中，有利于后续的梯度稀释，B正确；稀释涂布平板法既能分离微生物，也能统计样品中活菌的数目，一般情况下该方法统计的活菌数目比实际值偏低，C正确；图中纯化培养得到的微生物未必都具有分解尿素的能力，因此还需要对得到的微生物进行鉴定，D错误。
D
7.(2026·宁波一模)安莎霉素由深海中某种赖氨酸缺陷型放线菌产生，可治疗结核分枝杆菌引起的肺部感染。科研人员用紫外线诱变深海放线菌后选育高产菌株，实验的部分流程如图所示。
注：原位影印可确保在一系列平板培养基的相同位置上接种并培养出相同菌落。
下列叙述中，正确的是(　 　)
A.含有琼脂的培养基为②③④，含有赖氨酸的培养基为④
B.培养基①灭菌后还需根据放线菌生长特点调节pH
C.用涂布器蘸取菌液在②培养基表面均匀涂布，待菌液吸收后倒置
D.由培养结果推断，乙菌落不能产生安莎霉素
D
【解析】②③④为固体培养基，固体培养基需要加入琼脂作为凝固剂，该放线菌是赖氨酸缺陷型，自身不能合成赖氨酸，要筛选高产安莎霉素的菌株，需在培养基中添加赖氨酸，这样缺陷型放线菌才能生长，所以含有赖氨酸的培养基为①②④，A错误；培养基的制作流程是：计算→称量→溶化→调节pH→灭菌→倒平板，若先灭菌再调节pH，调节pH时可能会引入杂菌，导致灭菌失去意义。所以应该先调节pH，再灭菌，B错误；用涂布器涂布菌液时，应先将菌液滴加到培养基表面，再用涂布器将菌液均匀涂布，而不是直接用涂布器蘸取菌液涂布，C错误；甲菌落在③中不能生存，在④中可以生存，说明甲菌落只能生活在含有赖氨酸的培养基中，不能生活在缺赖氨酸的培养基中，即甲菌落是赖氨酸缺陷型放线菌菌落，可以产生安莎霉素，而乙菌落在③④中均能生存，即这种微生物在有无赖氨酸条件下均可生存，所以乙菌落不是赖氨酸缺陷型放线菌菌落，不能产生安莎霉素，D正确。　
8.沙门氏菌是影响畜产品品质的重要病原菌之一。若使用庆大霉素(GM)等抗生素治疗，会有细菌耐药性和抗生素残留等问题。如使用植物乳杆菌等益生菌(可分泌抗菌物质)替代治疗，可有效解决上述问题。已知MRS培养基常用于培养植物乳杆菌。请回答下列问题：
(1)为探究LPC(用MRS培养植物乳杆菌后获得的上清液)对沙门氏菌生长的影响，研究人员进行了相关实验，测得不同处理下沙门氏菌的生长曲线如图1所示。需选用物理状态为________(填“液体”或“固体”)的培养基，才能用抽样检测的方法估算沙门氏菌的种群数量。据图1分析，该实验结论为__________________________________________ ______________。若不改变现有条件，沙门氏菌组继续培养72 h后，种群数量不再增加，限制其种群增长的生物因素是__________________。
图1
液体
LPC抑制沙门氏菌的生长(答出“抑制生长”
的意思即可)
种内竞争(加剧)
(2)为进一步研究LPC对沙门氏菌的作用机制，对实验组的LPC进行了如下处理：NaOH－LPC(加入NaOH调节pH至近中性)、Heat－LPC(用100 ℃处理15 min)，再采用________________(方法)接种沙门氏菌进行抑菌圈实验，结果如图2所示。分析设置MRS组的目的是______________________________________________________。根据实验结果分析，LPC的热稳定性______(填“强”或“弱”)，LPC对沙门氏菌发挥作用的机制可能是__________________________________________________________________。
图2
(稀释)涂布平板法
排除植物乳杆菌培养液(MRS培养基)对实验结果的影响
强
LPC中含有酸性物质(pH为酸性)，可以起到抑制沙门氏菌生长的作用
【解析】(1)需选用物理状态为液体的培养基，才能用抽样检测的方法估算沙门氏菌的种群数量，而且液体培养基有利于菌种与营养物质充分混合，利于其繁殖。据图1分析，与对照组相比，LPC组沙门氏菌的数量显著降低，说明LPC抑制沙门氏菌的生长。若不改变现有条件，沙门氏菌组继续培养72 h后，种群数量不再增加，限制其种群增长的生物因素是空间和资源是有限的，种群数量增多，种内竞争加剧。
(2)据图2菌落分布状态可知，采用(稀释)涂布平板法接种沙门氏菌进行抑菌圈实验。设置MRS组的目的是排除植物乳杆菌培养液(MRS培养基)对实验结果的影响，使实验结果更准确。根据实验结果分析，Heat－LPC组与LPC组的抑菌圈大小一致，说明LPC的热稳定强，NaOH－LPC组没有出现抑菌圈，说明中性条件下LPC没有发挥作用，故推测LPC对沙门氏菌发挥作用的机制可能是因为LPC中含有酸性物质(pH为酸性)，可以起到抑制沙门氏菌生长的作用。

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