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第十单元
生物技术与工程
考查内容
1.阐明基因工程是一种重组DNA技术，实现需要利用限制酶、DNA连接酶和载体三种基本工具(生命观念、科学思维)
2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤(生命观念、科学思维)
3.举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改善了人类的生活品质(生命观念、科学思维、社会责任)
4.概述人们根据基因工程原理，进行蛋白质设计和改造，可以获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质(生命观念、科学思维)
5.举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程(生命观念、科学思维、社会责任)
考点一　基因工程的工具
1.基因工程的建立
2.限制酶、DNA连接酶与载体
3.与DNA有关的四种酶
项目 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 解旋酶
作用
底物 双链DNA分子 DNA分子片段 脱氧核糖核苷酸 DNA
分子
作用
部位 ________________ ________________ 磷酸二酯键 ________________
模板 不需要 ____________ __________ 不需要
作用
结果 __________________________ 形成重组DNA分子 形成新的DNA分子 形成单链DNA分子
磷酸二酯键
磷酸二酯键
碱基对间的氢键
不需要
需要
形成黏性末端或
平末端
[自我诊断]正确的打“√”，错误的打“ ”。
1.切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。(　 　)
2.载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因。(　 　)
3.(真题节选)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来。(　 　)
4.当作载体的质粒DNA分子上至少含一个限制酶切割位点。(　 　)
5.限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶。(　 　)
6.E.coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。(　 　)
7.限制酶都是从原核生物中分离纯化出来的，它们能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。(　 　)
8.质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体。(　 　)



√



√
例 1
下列关于基因工程的工具及操作的叙述，正确的是(　 　)
A.同种限制性内切核酸酶切出的黏性末端一定相同，不同种限制性内切核酸酶切出的黏
性末端一定不同
B.DNA连接酶能催化任意2个DNA片段之间形成磷酸二酯键
C.通常根据标记基因的产物特征进行筛选含目的基因的受体细胞，根据目的基因的产物
特征判断基因工程是否取得成功
D.质粒、限制性内切核酸酶、DNA连接酶的化学本质都是DNA
【解析】同种限制性内切核酸酶切出的黏性末端相同，不同种限制性内切核酸酶切出的黏性末端也可能相同，A错误；DNA连接酶能将具有末端碱基互补的黏性末端或平末端的2个DNA片段连接在一起，B错误；限制性内切核酸酶、DNA连接酶的化学本质为蛋白质，D错误。
C
基因工程操作过程中需要特殊工具和合适的受体细胞。下列叙述中，错误的是(　 　)
A.DNA连接酶与DNA聚合酶催化合成的化学键相同，但催化反应的底物不同
B.质粒作为载体必须具有特殊的标记基因，以便于重组DNA分子的筛选
C.原核生物中限制酶不切割自身的DNA一定与其DNA中不存在该酶识别序列有关
D.培育转基因高产抗病植物时的受体细胞可以为受精卵或体细胞
【解析】DNA连接酶使DNA片段间形成磷酸二酯键，DNA聚合酶在DNA复制时发挥作用，使单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键，两种酶催化合成的化学键相同，但催化反应的底物不同，A正确；作为载体必须具备的条件之一是具有某些特殊的标记基因，以便重组DNA分子的筛选，B正确；限制酶不切割自身DNA的原因可能是自身的识别序列已经被修饰，C错误；可以用受精卵或体细胞作为受体细胞，再采用植物组织培养技术将受体细胞培育成转基因植株，D正确。
例 2
C
考点二　基因工程的基本操作步骤
1.基因的结构
(1)启动子：位于基因的“上游”，有________________结合的位点，控制转录的开始。
(2)终止子：位于基因末端，当_______________到达时，释放出RNA产物，转录结束。
(3)外显子：编码__________的核苷酸序列。
(4)内含子：外显子之间不能编码蛋白质的序列。外显子和内含子均会被转录成RNA，再经过切去内含子对应部位、连接外显子对应部位等RNA加工过程，形成可以直接用于翻译的____________。
RNA聚合酶
RNA聚合酶
蛋白质
mRNA
2.基因工程的基本操作程序
(1)获取目的基因
①方法
②获取目的基因的方法比较
方法 从基因组文
库中获取 从部分基因文库，
如cDNA文库中获取 化学
合成法 通过PCR
技术体外扩增
过程 供体细胞中的DNA

许多DNA片段

载体

受体菌群(基因组文库)

目的基因 目的基因的mRNA

单链DNA

双链DNA

载体

受体菌群(cDNA文库)
目的基因 蛋白质的氨
基酸序列

mRNA的核
苷酸序列

结构基因的核
苷酸序列

目的基因 变性
退火
延伸
(2)构建重组DNA分子
①载体种类和重组DNA分子构建过程
②重组DNA分子的组成和作用
③启动子、起始密码子、终止子、终止密码子的区别
在构建重组DNA分子时，若考虑两两相连，则DNA连接酶连接DNA片段会出现三种情况：①目的基因与目的基因的连接；②目的基因与质粒的连接；③质粒与质粒的连接。因此需筛选出重组质粒。
(3)将目的基因导入受体细胞
①细菌：使用______________溶液制备感受态细胞。
②
③
CaCl2
1.转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。
2.农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入：
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。
(4)检测目的基因及其表达产物
检测DNA、RNA、蛋白质属于分子水平，检测个体性状属于个体水平。
[自我诊断]正确的打“√”，错误的打“ ”。
1.外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。(　 　)
2.检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原－抗体杂交技术。(　 　)
3.表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制起点。(　 　)



1.PCR引物设计的基本原则
考向1　PCR中有关引物设计、选择与数量计算的解题建模
2.PCR引物选择的基本原则
3.PCR中有关引物的计算规律
注：假定PCR开始时只有1个模板DNA分子。
循环次数 1 2 3 n
产物DNA分子数 2 4 8 2n
含引物的DNA分子数 2 4 8 2n
含有引物A(或B)的DNA分子数 1 3 7 2n－1
同时含有引物A和B的DNA分子数 0 2 6 2n－2
消耗引物数量 2 6 14
两条链等长的DNA分子数　 0 0 2 2n－2n
例 3
(2023·浙江6月选考)某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3－GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。
甲 乙
下列叙述中，正确的是(　 　)
A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达
B.翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白
C.2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3－GFP基因纯合子
D.若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
【解析】由图甲可知，Gata3基因与GFP基因共用一个启动子，且由题干可知，两基因能正常表达出相关蛋白质，A错误；由于启动子在左侧，基因在右侧，转录基因时，先转录Gata3基因，再转录GFP基因，由于转录和翻译的方向均是沿mRNA的5'→3'，因此翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确；由图乙可知，大片段包含GFP基因编码区片段，小片段不包含GFP基因编码区片段，则2号小鼠是Gata3－GFP基因纯合子，4号小鼠是野生型，C错误；若用引物1和引物3进行PCR，杂合子和Gata3－GFP基因纯合子均能扩出条带，仅有Gata3基因时无法扩出条带，不利于区分杂合子和纯合子，D错误。
B
例 4
(2025·温州模拟)人胰岛素分子容易聚合导致药效降低，可采用如图所示的PCR技术来改造人胰岛素基因。下列说法中，错误的是　(　 　)
A.改造前后人胰岛素基因热稳定性基本不变
B.PCR过程经过2轮循环即可得到目标基因
C.图中两条子链的方向不同由引物不同决定
D.通过电泳检测PCR产物不能确定基因是否改造成功
C
【解析】由图可知，人胰岛素改造后原基因的两个C—G碱基对替换成两个A—T碱基对，原基因的两个A—T碱基对替换成两个C—G碱基对，因此改造前后的基因热稳定性基本不变，A正确；PCR过程经过2轮循环即可得到目标基因，B正确；图中两条子链延伸的方向不同不是由引物不同决定的，而是由两条模板链方向不同决定的，C错误；改造前后基因的长度不变，因此通过电泳检测PCR产物不能确定基因是否改造成功，D正确。
考向2　限制酶选取与基因表达载体的构建
例 5
科研人员从某热泉的细菌中发现一种α－淀粉酶(AmyS1)，利用蛋白质工程对其进行改造，获得了具有更高热稳定性和催化效率的重组耐高温α－淀粉酶(AmyS2)。获取AmyS2基因后，构建基因表达载体的过程如图所示。该过程中，将目的基因与原始质粒A构建成质粒B，将质粒B与信号肽(一段能够引导目标蛋白质分泌到细胞外的肽链)基因构建成质粒C。下列分析中，错误的是(　 　)
A.对淀粉酶结构进行改造最终要通过改造或合成基因来完成
B.生产AmyS2是从预期AmyS2功能出发设计其氨基酸序列
C.可以从导入质粒C的工程菌的培养液中提取获得AmyS2
D.构建质粒B和C，选择的限制酶分别是NdeⅠ和EcoRⅠ、BamHⅠ和Eco52Ⅰ
D
【解析】对蛋白质结构进行改造最终要通过改造或合成基因来完成，A正确；α－淀粉酶(AmyS1)的化学本质是蛋白质，蛋白质工程的基本思路是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核糖核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质，B正确；将质粒B与信号肽(一段能够引导目标蛋白质分泌到细胞外的肽链)基因构建成质粒C，可以从导入质粒C的工程菌的培养液中提取获得AmyS2，C正确；构建质粒B时，若用BamH Ⅰ酶进行切割，会导致目的基因结构破坏，因此选择NdeⅠ和EcoRⅠ，既不会破坏目的基因，也能防止目的基因片段反向连接与质粒自身环化等问题；根据质粒C的结构以及信号肽基因上的酶切位点可知，将质粒B与信号肽基因构建成质粒C，应选择的限制酶是MluⅠ和Eco52Ⅰ，D错误。
(2025·绍兴二模)科研人员发现耐盐基因OsCYP2基因在水稻中普遍存在，但在不同品种中表达水平有差异。科研人员将外源OsCYP2基因导入优质水稻品种中，以期实现OsCYP2基因的高表达，获得适宜在盐碱地生长的水稻新品种。请回答下列问题：
(1)科研人员发现水稻品种“吉农大838”遗传性状优良，且外植体的形成率和分化率都很高，说明其________能力强，故选择该水稻细胞作为转基因的____________。
(2)获取耐盐水稻品种“吉农30”的cDNA，根据______________中已发表的稻属OsCYP2基因序列，设计引物，扩增OsCYP2基因。为了让OsCYP2基因和Ti质粒正确连接，合适的引物为________。(填写引物前序号，①②③④为4种引物前12个碱基序列，所用Ti质粒结构及限制酶识别序列如图甲所示，OsCYP2基因两端碱基序列如图乙所示)
例 6
注：bar为抗草铵膦(一种除草剂)基因。
甲
乙
再生
受体细胞
基因数据库
①②
(3)冻存的成功导入重组Ti质粒的农杆菌使用时需在固体平板上划线分离培养，________后接种至液体培养基________，备用。将水稻愈伤组织浸泡在农杆菌悬液中，经抑菌培养基抑菌后再转移至含__________(填筛选试剂)的筛选培养基上，每两周用筛选培养基________培养一次，2~3次后再转入分化培养基中培养，获得抗性植株。根据____________________(填“OsCYP2基因”或“bar基因”)序列设计引物，通过PCR检测确认抗性植株是否为外源基因成功导入的阳性植株。
(4)根据下表的实验结果分析，实验中筛选试剂适合的浓度为__________________。理由是__________________________________________________________。
筛选试剂浓度 外植体数 获得抗性植株数 阳性植株数
5 mg/L 30 28 16
10 mg/L 30 17 16
15 mg/L 30 0 0
活化
扩增
草铵膦
继代
OsCYP2基因
10 mg/L
能筛选出抗性植株，且筛选出的抗性植株中阳性植株的比例高
【解析】(1)外植体的形成率和分化率都很高，说明“吉农大838”的再生(或脱分化和再分化)能力强。因为植物组织培养过程中，外植体需要经过脱分化形成愈伤组织，再经过再分化形成完整植株，外植体形成率和分化率高体现了其再生能力强。由于要将外源基因导入该水稻细胞，所以选择该水稻细胞作为转基因的受体细胞。
(2)获取耐盐水稻品种“吉农30”的cDNA，根据基因数据库中已发表的稻属OsCYP2基因序列，设计引物，扩增OsCYP2基因。基因数据库中保存了各种生物的基因序列信息，是获取目的基因序列的重要来源。为了让OsCYP2基因和Ti质粒正确连接，需要在引物两端添加与Ti质粒上限制酶识别序列相同的碱基序列。Ti质粒上有BglⅡ(识别序列为
5'-AGATCT-3')和NheⅠ(识别序列为5'-GCTAGC-3')两种限制酶识别位点，分析OsCYP2基因两端碱基序列和引物序列，合适的引物为①(5'-AGATCTATGTCT-3')和②
(5'-GCTAGCCTAGGA-3')，因为①引物含有BglⅡ的识别序列，②引物含有NheⅠ的识别序列，能保证目的基因和Ti质粒通过相应限制酶切割后正确连接。
(3)冻存的成功导入重组Ti质粒的农杆菌使用时需在固体平板上划线分离培养，待活化后接种至液体培养基扩大培养(扩增)，以获得足够数量的农杆菌用于后续实验。Ti质粒上含有bar基因(抗草铵膦基因)，所以将水稻愈伤组织浸泡在农杆菌悬液中，经抑菌培养基抑菌后再转移至含草铵膦的筛选培养基上，这样只有成功导入重组Ti质粒的细胞才能在含草铵膦的培养基上存活。每两周用筛选培养基继代培养一次，目的是保持筛选压力，及时去除死亡细胞和代谢废物等，有利于抗性细胞的生长。据OsCYP2基因序列设计引物，通过PCR检测确认抗性植株是否为外源基因成功导入的阳性植株。
(4)筛选试剂浓度为5 mg/L时，虽然获得抗性植株数较多，但阳性植株数与10 mg/L时相同；而筛选试剂浓度为15 mg/L时，没有获得抗性植株和阳性植株。10 mg/L的筛选试剂浓度既能保证有一定数量的阳性植株，又能对非转基因植株起到较好的筛选作用，避免筛选试剂浓度过低导致假阳性植株过多，浓度过高导致无法获得抗性植株。
课时作业
答案速对
第十单元　作业51 　基因工程的原理和操作过程
题号 1 2 3 4 5 6 7
答案 A B D B C C 见答案
1.(2025·浙江精诚联盟)限制酶和DNA连接酶是重组DNA技术常用的工具酶，限制酶通常将DNA分子切割成带有黏性末端的DNA片段，而DNA连接酶可缝合带有黏性末端的DNA片段。下列分析中，错误的是(　 　)
甲　 　乙　 　丙
A.图示三个黏性末端一定由两种不同的限制酶切割产生
B.图示中共有两种黏性末端，其中甲与乙黏性末端相同
C.a点核苷酸之间通过磷酸二酯键连接，b处核苷酸之间通过氢键连接
D.催化甲形成的限制酶有可能不识别由甲、乙形成的重组DNA分子
A
【解析】切割产生甲的限制酶的识别序列为5'-GAATTC-3'，切割产生乙的限制酶的识别序列为5'-CAATTG-3'，切割产生丙的限制酶的识别序列为5'-CTTAAG-3'，由此可见，甲、乙、丙的黏性末端是由三种限制酶切割产生的，A错误；由图可知，甲、乙的黏性末端相同，均为5'-AATT-3'，丙的黏性末端为5'-TTAA-3'，因此图示中共有两种黏性末端，B正确；a点两个核苷酸之间通过磷酸二酯键连接成链，b点两条链之间的核苷酸通过氢键相连，C正确；切割甲的限制酶的识别序列为5'-GAATTC-3'，而甲、乙片段形成的重组DNA分子序列为5'-GAATTG-3'，因此切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子，D正确。
2.双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了如图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析中，错误的是(　 　)
注： 启动子， 终止子；LUC基因编码荧光素酶，可催化底物产生荧光；GUS基因编码β－葡萄糖苷酶，催化底物生成蓝色物质。
A.可用农杆菌转化法将构建好的表达载体导入植物细胞
B.为连入GUS基因，需用Sal Ⅰ和Sph Ⅰ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒
C.在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞
D.可通过观察是否出现荧光和蓝色物质确认双向启动子的作用
B
【解析】将基因表达载体导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，A正确；如果用SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒时就会破坏LUC基因，B错误；如果成功导入含有壮观霉素抗性基因的基因表达载体，受体细胞就具有抗壮观霉素的能力，在含有壮观霉素的培养基上能生存，因此可以筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞，C正确；双向启动子如果正常表达，就会合成荧光素酶和β－葡萄糖苷酶，催化底物分别产生荧光或生成蓝色物质，从而确定双向启动子的作用，D正确。
3.某转基因植物培育过程如图所示。
下列叙述中，错误的是(　 　)
A.重组Ti质粒的浓度和质量会影响其导入农杆菌的效率
B.与机械法相比，酶解法获得单细胞的效率更高
C.农杆菌的浓度和状态会影响目的基因导入植物细胞的效率
D.前置筛选和后置筛选所依据的指标是相同的
D
【解析】重组Ti质粒的浓度、质量和农杆菌的浓度都会影响其导入农杆菌的效率，A正确；与机械法相比，酶解法的优点是不会伤害原生质体，获得的原生质体数量多，获得单细胞的效率更高，B正确；农杆菌的浓度较高，状态好，会提高基因导入植物细胞的效率，C正确；前置筛选是分子水平上的检测，以便确定目的基因是否导入受体细胞，后置筛选是检测植株是否有相对应的性状，D错误。
4.(2025·金华选考模拟)大肠杆菌的质粒上含有青霉素抗性基因和Lac Z基因，Lac Z基因编码的产物β－半乳糖苷酶能催化无色的X－gal生成蓝色沉淀，使菌落呈现蓝色，目的基因插入Lac Z基因中则菌落呈现白色，该过程称为蓝白斑筛选。下列叙述中，正确的是
(　 　)
A.蓝白斑筛选属于个体水平上的操作
B.CaCl2溶液处理的大肠杆菌能吸收周围DNA从而完成转化
C.平板中加入青霉素可以筛选出成功导入重组质粒的大肠杆菌
D.将完成转化的大肠杆菌涂布到平板上将产生蓝色斑菌落
【解析】根据题意可知，蓝白斑筛选是通过菌落呈现的颜色进行筛选，因此不属于个体水平的筛选，而属于种群水平的筛选，A错误；转化过程中，大肠杆菌通常用CaCl2溶液处理，可以增强其捕获外源DNA的能力，从而完成转化，B正确；依题意，大肠杆菌的质粒上含有青霉素抗性基因，平板中加入青霉素筛选出来的菌落可能是含有重组质粒的菌落，也可能是只含大肠杆菌质粒的菌落，C错误；完成转化的菌落是带有目的基因的菌落，目的基因的插入破坏了Lac Z基因，因此，完成转化的大肠杆菌涂布到平板上将产生白色斑菌落，D错误。
B
5.(2025·杭州二模)同尾酶指识别位点不同但能切出相同黏性末端的限制酶；同裂酶指具有相同识别序列的限制酶(切割位点相同或不同均可)。几种基因工程中常用的限制酶如表所示。下列叙述中，错误的是(　 　)
A.HinPⅡ和HhaⅠ为同裂酶，切出的黏性末端不同
B.HinPⅡ和HpaⅡ切割的产物连接后，其序列不能被GlaⅠ切割
C.HinPⅡ和NarⅠ为同尾酶，它们切割的产物连接后的序列不能被GlaⅠ切割
D.某质粒仅含1个GlaⅠ的识别位点，则该质粒能被NarⅠ切割的概率为1/16
限制酶的名称 识别和切割位点
HinPⅡ 5'-G↓CGC-3'
GlaⅠ 5'-GC↓GC-3'
HhaⅠ 5'-GCG↓C-3'
HpaⅡ 5'-C↓CGG-3'
NarⅠ 5'-GG↓CGCC-3'
C
【解析】同裂酶是指具有相同识别序列的限制酶。HinP Ⅱ识别和切割位点是5'-G↓CGC-3'，HhaⅠ识别和切割位点是5'-GCG↓C-3'，二者识别序列均为5'-GCGC-3'，所以HinPⅡ和HhaⅠ为同裂酶。黏性末端是指凸出的单链部分，HinPⅡ酶切后产生的黏性末端为5'-CG-3'，HhaⅠ酶切后产生的黏性末端为3'-GC-5'，这两个黏性末端是不同的，前者凸出来的部位是5'端，后者是3'端，A正确；HinPⅡ识别和切割位点是5'-G↓CGC-3'，HpaⅡ识别和切割位点是5'-C↓CGG-3'，二者切割产物连接后的序列为5'-GCGG-3'。GlaⅠ识别和切割位点是5'-GC↓GC-3'，连接后的5'-GCGG-3'序列不能被Gla Ⅰ识别和切割，B正确；同尾酶是指识别位点不同但能切出相同黏性末端的限制酶。HinPⅡ识别和切割位点是5'-G↓CGC-3'，Nar Ⅰ识别和切割位点是5'-GG↓CGCC-3'，二者切割后产生的黏性末端均为5'-CG-3'，所以HinP Ⅱ和Nar Ⅰ为同尾酶。分析连接后的序列能否被Gla Ⅰ切割：HinP Ⅱ和Nar Ⅰ切割产物连接后的序列为5'-GCGC-3'，Gla Ⅰ识别和切割位点是5'-GC↓GC-3'，该序列能被GlaⅠ识别和切割，C错误；GlaⅠ识别和切割位点是5'-GC↓GC-3'，NarⅠ识别和切割位点是5'-GG↓CGCC-3'，可以看出NarⅠ识别位点包含了GlaⅠ的识别位点。在仅含1个GlaⅠ识别位点的情况下，该质粒能被NarⅠ切割的概率为1/16(因为在GlaⅠ识别位点基础上，前后各增加一个碱基，共有16种可能的情况，其中有一种是NarⅠ的识别位点)，D正确。
6.(2026·浙江Z20名校联盟第一次联考)黄瓜花叶病毒能感染多种植物。研究人员欲培育具有抗黄瓜花叶病毒感染能力的番茄植株，如图为主要过程示意图，最终对再生番茄植株进行鉴定和筛选后获得抗黄瓜花叶病毒番茄植株。下列叙述中，错误的是(　 　)
A.农杆菌经①接种至液体培养基，培养基中含有分化程度相对较低的番茄组织
B.浸泡番茄外植体的培养基中含有特定的抗生素用以去除转化番茄细胞的农杆菌
C.③接种的培养基中含适宜浓度的Kan，目的是杀死没有导入重组质粒的番茄细胞
D.图示愈伤组织再分化形成抗Kan再生番茄植株经器官发生途径和体细胞胚发生途径均可
C
【解析】农杆菌可以将重组质粒导入到这些分化程度低的组织细胞中，以便后续进行基因转化等操作，A正确；浸泡番茄外植体的培养基中含有特定的抗生素，其目的是去除转化番茄细胞的农杆菌。因为农杆菌在完成基因转化后，如果不将其去除，可能会继续在培养体系中生长繁殖，影响后续番茄细胞的生长和发育，B正确；③接种的培养基中含适宜浓度的Kan(卡那霉素)，由于重组质粒中含有Kanr(卡那霉素抗性基因)，只有导入了重组质粒的番茄细胞才能在含Kan的培养基上生长，而没有导入重组质粒的番茄细胞会因缺乏抗性基因而被杀死，因此③接种的培养基中含适宜浓度的Kan，目的是筛选出导入重组质粒的番茄细胞，而不是杀死没有导入重组质粒的番茄细胞，C错误；愈伤组织再分化形成再生植株，有两种途径：器官发生途径(先分化出芽、根等器官)； 体细胞胚发生途径(形成类似胚的结构，再发育成植株)。因此愈伤组织再分化形成抗Kan再生番茄植株经器官发生途径和体细胞胚发生途径均可，D正确。
7.普通玉米缺乏人体生长发育必需的赖氨酸。科研人员利用基因工程技术将高赖氨酸蛋白基因SBgLR转入玉米细胞获得高赖氨酸玉米新品种，操作流程如图所示，其中强启动子能驱动基因在植物细胞中持续转录，T－DNA区段中的基因在农杆菌中不表达。
请回答下列问题：
(1)获取目的基因：检索生物信息数据库，获取SBgLR基因的编码序列，用______________________方法制备得到。
(2)构建重组质粒：优先选用______________________________两种限制酶分别酶切SBgLR基因和Ti质粒，其优点是____________________________________________、__________________________等。
(3)转化农杆菌：将重组质粒导入__________________处理的农杆菌，以提高转化效率。为筛选已转化的农杆菌，需要在培养基中加入____________。
(4)转化愈伤组织：将转化了的农杆菌与愈伤组织共同培养一段时间，农杆菌Ti质粒中的______________能够将目的基因导入并整合到受体细胞的染色体上。筛选转化的受体细胞时，培养基中需要加入__________。
(5)培养转基因植株：愈伤组织培养形成植株的过程称为__________，此过程需要在培养基上添加____________________________________________________调控其生长发育。整个操作需要在________条件下进行，实现该过程的途径有器官发生途径和____________发生途径。
化学合成(PCR)
BamH Ⅰ和Hind Ⅲ
使目的基因和质粒定向连接(防止自身环化)
驱动目的基因的持续转录
CaCl2溶液
卡那霉素
T－DNA
潮霉素
再分化
植物激素(植物生长调节物质或生长素和细胞分裂素)
无菌
体细胞胚
【解析】(1)已知目的基因的编码序列，可以采用化学合成(PCR)方法制备得到。
(2)由图可知，质粒上没有启动子，而目的基因的上游含有强启动子，所以需要保留，故选择BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶分别酶切SBgLR基因和Ti质粒，其优点是使目的基因和质粒定向连接(防止自身环化)、驱动目的基因的持续转录。
(3)将目的基因导入微生物细胞时，需要用氯化钙(CaCl2)溶液处理，使其成为感受态细胞，容易吸收周围环境中的DNA分子，以提高转化效率。重组质粒上含有卡那霉素抗性基因，且T－DNA区段中的基因在农杆菌中不表达，所以为筛选转化了的农杆菌，需要在培养基中加入卡那霉素。
(4)将转化了的农杆菌与愈伤组织共同培养一段时间，农杆菌Ti质粒中的T－DNA能够将目的基因导入并整合到受体细胞的染色体上。T－DNA上含有潮霉素抗性基因，所以筛选转化的受体细胞时，培养基中需要加入潮霉素。
(5)愈伤组织培养形成植株的过程称为再分化，此过程需要在培养基上添加植物激素(植物生长调节物质或生长素和细胞分裂素)调控其生长发育。整个操作需要在无菌条件下进行，实现该过程的途径有器官发生途径和体细胞胚发生途径。

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