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(共47张PPT)
第十单元
生物技术与工程
考查内容
1.阐明基因工程是一种重组DNA技术，实现需要利用限制酶、DNA连接酶和载体三种基本工具(生命观念、科学思维)
2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤(生命观念、科学思维)
3.举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改善了人类的生活品质(生命观念、科学思维、社会责任)
4.概述人们根据基因工程原理，进行蛋白质设计和改造，可以获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质(生命观念、科学思维)
5.举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程(生命观念、科学思维、社会责任)
考点一　活动：DNA的粗提取与鉴定
1.实验原理
2.方法步骤
3.DNA与蛋白质在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同
项目 溶解规律 2 mol/L
NaCl溶液 0.14 mol/L
NaCl溶液
DNA
__________ 析出
蛋白质 NaCl溶液物质的量浓度从2 mol/L逐渐降低的过程中，蛋白质溶解度逐渐增大 部分发生
盐析沉淀 溶解
溶解
[自我诊断]正确的打“√”，错误的打“ ”。
1.DNA在物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液中溶解度大。(　 　)
2.可选用滤纸过滤洋葱研磨液以除去其中的杂质。　(　 　)
3.可用猪血代替香蕉作为DNA粗提取和鉴定的实验材料。(　 　)
4.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA。 (　 　)

√

√
例 1
(2025·金华十校模拟)关于“DNA的粗提取和鉴定”实验，下列叙述中，正确的是
(　 　)
A.研磨时倒入的研磨液，是为了破坏细胞壁
B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C.在DNA提取物中加入二苯胺，迅速呈现蓝色
D.提取DNA时要用玻璃棒沿一个方向缓缓搅动
【解析】研磨液是用于破坏细胞结构和细胞膜的试剂，其作用是将细胞破坏，释放出细胞内的DNA，A错误；离心研磨液是为了加速细胞膜、细胞器、一些较大杂质等的沉淀，B错误；DNA与二苯胺的反应需要沸水浴加热才可以呈现蓝色，C错误；提取DNA时要用玻璃棒沿一个方向缓缓搅动，这样做是为了使DNA分子不断裂，D正确。
D
考点二　活动：PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定
1.实验原理
(1)使用PCR技术扩增酵母细胞中编码核糖体RNA的DNA部分片段，再通过__________ ________进行鉴定。
(2)使用____________对凝胶进行染色，再用______________以及__________脱色，观察并分析琼脂糖凝胶中DNA条带。
琼脂糖凝
胶电泳
亚甲基蓝
75%酒精
蒸馏水
2.实验步骤
[自我诊断]正确的打“√”，错误的打“ ”。
1.应用DNA探针技术，可检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达。
(　 　)
2.PCR实验中使用的微量离心管、枪头等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌。(　 　)
3.(真题节选)琼脂糖凝胶电泳法可用于PCR产物的检测。(　 　)
4.转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测。(　 　)

√
√

例 2
(2025·浙江浙南名校联盟一联)DNA在生活中有多方面的应用。下列关于DNA粗提取、扩增和电泳鉴定的叙述，正确的是(　 　)
A.利用DNA在酒精中溶解度较大的原理来提取DNA
B.PCR体系中加入dNTP可为DNA扩增提供原料和能量
C.DNA电泳鉴定时，可加入二苯胺使DNA显色再观察条带
D.DNA的片段大小与在琼脂糖凝胶电泳中的迁移距离呈正相关
【解析】DNA的粗提取与鉴定实验中利用DNA不溶于酒精、但某些蛋白质溶于酒精的原理，可以初步分离DNA与蛋白质，A错误；PCR扩增反应体系中的dNTP水解释放能量，产生脱氧核糖核苷酸，既可以为扩增即DNA复制提供原料，也可以为子链的合成提供能量，B正确；进行DNA片段凝胶电泳时，可使用亚甲基蓝对DNA染色，观察分析凝胶中DNA条带，C错误；在琼脂糖凝胶电泳中，DNA片段的迁移速率与其大小呈负相关，即DNA片段越长，迁移速率越慢，迁移距离越短，D错误。
B
例 3
下列关于“PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定”的叙述，错误的是(　 　)
A.PCR引物要根据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设计
B.制备的凝胶放入电泳槽内时，要将加样孔一端朝向正极
C.染色后要用75%的酒精和冷的蒸馏水进行脱色
D.可根据已知DNA Marker每个条带的位置和长度推测PCR产物长度
【解析】制备的凝胶放入电泳槽内时，要将加样孔一端朝向负极，B错误。
B
考点三　筛选含有目的基因的受体细胞和产物检测用到的技术
1.DNA杂交鉴定
从受体细胞中提取DNA分子，并合成与目的基因序列互补的探针(基因探针就是用放射性同位素或荧光分子标记的含目的基因的单链DNA片段)，进行核酸分子杂交(如图所示)。
2.检测目的基因的有无
鉴定该DNA分子中是否有目的基因，用限制性内切核酸酶进行酶切，做酶切图谱鉴定。
3.利用重组质粒上的抗性基因、显色反应、噬菌斑、营养缺陷型等进行鉴定
(1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图所示，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。
(2)被转化的细菌有三种：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含质粒的细菌。
(3)筛选方法：将转化后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含质粒的细菌，如图中1、2、3、4、5菌落，再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上。如图所示，其中能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，即图中的1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
4.目的基因及其表达产物的检测
(1)使用“目的基因”作探针，运用核酸分子杂交技术检测目的基因是否转录出特定mRNA。
(2)采用抗原－抗体杂交技术，从转基因生物中提取蛋白质(作抗原)与相应抗体杂交，依据是否出现杂交带确认目的基因是否“指导”特定蛋白质的合成。
(3)采用抗虫、抗病毒等接种实验进行目的基因是否成功表达的个体生物学水平的检测。
例 4
丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域。兴趣小组在已改造的大肠杆菌中引入合成丁二醇的关键基因X，以提高丁二醇的产量。请回答下列问题：
(1)扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶，原因是_____________________ _________________________________________________________________________________________________________________________________。
(2)使用BamHⅠ和 SalⅠ限制酶处理质粒和X基因，连接后转化大肠杆菌，并涂布在无抗生素平板上(如图所示)。在此基础上，进一步筛选含目的基因菌株的实验思路是_______ ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
在 PCR 反应中，需要利用高温使DNA双链解旋，普通的DNA聚合酶在高温下会变性失活，而Taq DNA聚合酶能够耐高温，在高温条件下依然具有活性
在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成
(3)研究表明，碳源和氮源的种类、浓度及其比例会影响微生物生长和发酵产物积累。如果培养基中碳源相对过多，容易使其氧化不彻底，形成较多的__________________，引起发酵液pH值下降。兴趣小组通过单因子实验确定了木薯淀粉和酵母粉的最适浓度分别为100 g·L－1和15 g·L－1。在此基础上，设置不同浓度的木薯淀粉(90 g·L－1、100 g·L－1、110 g·L－1)和酵母粉(12 g·L－1、15 g·L－1、18 g·L－1)筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，以获得较高发酵产量，理论上应设置______(填数字)组实验(重复组不计算在内)。
(4)大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高，其原因是__________________ _______________________。
(5)发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经____________________，最终获得发酵产品。
乳酸或有机酸
9
大肠杆菌进行细胞
呼吸时会释放大量热量
提取、分离、纯化
【解析】(2)据图可知，使用BamHⅠ和 SalⅠ限制酶处理质粒和X基因，四环素抗性基因被破坏，氯霉素抗性基因保留，因此能在含氯霉素的培养基上生存，不能在含四环素的培养基上生存的大肠杆菌即是含目的基因菌株，因此实验思路为：在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落即导入目的基因的菌株。
(3)碳源是微生物生长所需的主要能量来源，而氮源则是构成细胞物质和合成蛋白质、核酸等生物大分子的基本原料。当培养基中碳源相对过多时，微生物可能会优先利用碳源进行能量代谢，而氮源的消耗相对较慢。这会导致碳源氧化不完全，形成较多的乳酸或有机酸。这些乳酸或有机酸会在溶液中解离，使发酵液的pH值下降。因为要筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，木薯淀粉浓度有3种，酵母粉浓度也有3种，因此理论上应设置3×3=9组实验。
(4)大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量能量，绝大多数以热能形式释放，因此大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高。
(5)发酵工程一般包括菌种的选育，扩大培养，培养基的配制、灭菌，接种，发酵，产品分离、提纯等方面，因此发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经提取、分离、纯化，最终获得发酵产品。
例 5
为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：
图1
(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有___________，扩增程序中最主要的不同是______________。
(2)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无须使用的酶主要有____________ __________________。
(3)转化后的大肠杆菌需选择培养基进行筛选，下列叙述中，错误的有__________。
A.是否产生氨苄青霉素可作为筛选大肠杆菌是否转化的依据
B.转化后的大肠杆菌需培养一段时间后接种至选择培养基进行筛选
C.将梯度稀释后的菌液用接种环在培养基表面进行划线获得单菌落
D.选择培养基上常常会出现大量杂菌形成的菌落
模板、引物
引物的设计
限制酶、
(T4)DNA连接酶
ACD
(4)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板、用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图2所示。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有______________。
图2
(5)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是____________________________________________。
P3、P4
电泳只能测大小(长度)，无法确定具体序列　
【解析】(1)PCR反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg2＋)。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时， 配制的两个反应体系中不同的有模板(片段F1、片段F2)、引物。引物设计是决定PCR反应成败的最重要因素，因此扩增程序中最主要的不同是引物的设计。
(2)传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，由于PCR产物片段与线性质粒载体具有同源序列，可通过重组酶形成环化质粒，不需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)和(T4)DNA连接酶。
(3)根据图1可知，重组质粒中含有氨苄青霉素抗性基因，可作为筛选大肠杆菌是否转化的依据，而非产生氨苄青霉素，A错误；稀释涂布平板和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，平板划线法获得单菌落时不用将菌液进行梯度稀释，而使用稀释涂布平板分离纯化细菌时才需要将菌液进行梯度稀释，C错误；转化后的大肠杆菌需要采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能在含有抗生素的培养基中形成菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，D错误。
(4)EGFP为720 bp，AnB1为390 bp，二者的总大小为720＋390=1 100 (bp)，用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。
(5)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。
课时作业
答案速对
第十单元　作业52　 DNA提取、核酸分子杂交、抗原－抗体反应、PCR和凝胶电泳等技术
题号 1 2 3 4 5 6 7
答案 A C B B C C A
题号 8 9 10 11
答案 D B 见答案 见答案
A
1.(2025·浙江北斗星盟)下列关于DNA的粗提取和鉴定实验相关试剂的说法，正确的是
(　 　)
A.二苯胺试剂在沸水浴条件下能将DNA染成蓝色
B.研磨液中的EDTA能使核蛋白变性并与DNA分离
C.研磨液中的SDS能抑制DNA酶活性，防止核DNA被酶解
D.DNA在2 mol/L的NaCl溶液中溶解度最低，且Na＋与DNA形成沉淀
2.PCR技术广泛应用于医学诊断、法医鉴定等领域。下列关于PCR过程的叙述，错误的是(　 　)
A.需加入相应引物
B.需对反应液进行离心
C.需加入ATP分子
D.需对DNA进行预变性
【解析】PCR技术不需要加入ATP，PCR需要以dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)为原料合成新的DNA链，这些原料水解时就会释放出能量，C错误。
C
3.下列关于活动“PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定”的叙述，错误的是(　 　)
A.4种脱氧核苷三磷酸为PCR扩增提供原料和能量
B.上样缓冲液中的电泳指示剂可使核酸显色
C.带有负电荷的核酸需要加在电泳槽的负极
D.不同大小的核酸迁移速率不同，从而实现其分离
【解析】脱氧核苷三磷酸有高能磷酸键，发生断裂时可为PCR提供能量，同时形成的脱氧核糖核苷酸可以提供原料，A正确；上样缓冲液中的电泳指示剂(溴酚蓝)仅自身显色，其分子不与核酸结合，不能使核酸显色，它迁移速率较快，在其迁移出凝胶前关闭电泳仪电源，可以保证核酸分子还在凝胶内，B错误；带有负电荷的核酸会向其携带电荷相反的电极迁移，故需要加在电泳槽的负极，使其向正极迁移，C正确；不同大小的核酸其质量不同，在相同电场力的作用下，迁移速率不同，从而实现其分离，D正确。
B
4.DNA提取与PCR扩增等操作是基因工程的基础性工作。下列叙述中，错误的是(　 　)
A.从目标生物中提取DNA时，利用了 DNA与其他物质在NaCl溶液和酒精中溶解度的差
异
B.PCR扩增中会经30多次变性、退火、延伸的循环，单次循环的DNA产生量没有变化
C.PCR扩增说明一些酶可以在细胞外高于60 ℃条件下发挥作用
D.经琼脂糖凝胶电泳后的PCR产物条带位置与DNA片段的长度密切相关
【解析】DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2 mol/L的NaCl溶液，在0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度最低，利用这一特点选择适当的盐浓度，可以达到DNA与其他物质分离的目的；在95%的冷酒精溶液中DNA的溶解度最低，DNA的沉淀量最大，可以进一步对DNA提纯，A正确；PCR扩增一般需要经过30多次循环，每次循环可以分为变性、退火、延伸三步；单次循环的DNA产生量在理论上为模板DNA片段的2倍，因此单次循环的DNA产生量会有变化，但实际过程中并不是每次扩增所有的模板都会与引物结合，再加上模板又会有损耗，则实际的扩增倍数并没有2倍，B错误；PCR扩增是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，DNA在延伸时温度约为72 ℃，因此需要耐高温的Taq DNA聚合酶，C正确；PCR扩增后的产物常用琼脂糖凝胶电泳来鉴定，在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象有关，D正确。
B
5.用于核酸分子杂交的核酸探针，一般有17~20个核苷酸长度。近年来，多肽顺序测定技术进步很大，使利用氨基酸顺序推导探针的核苷酸顺序变得简单易行。为使推导的探针尽可能地与目的基因序列互补性吻合，应尽量使用(　 　)
A.mRNA中含G和C碱基多的片段
B.mRNA中含A碱基多的片段
C.肽链中氨基酸密码子简并性少的片段
D.突变不易发生的DNA片段
【解析】因为密码子具有简并性，所以某种氨基酸序列可能对应很多种核苷酸序列，故为使推导的探针尽可能地与目的基因序列互补性吻合，应尽量使用肽链中氨基酸密码子简并性少的片段，以便更能明确氨基酸序列和核苷酸序列的一一对应关系，C正确。
C
6.下列关于核酸分子杂交和抗原－抗体杂交的叙述，正确的是(　 　)
A.核酸分子杂交是指两条脱氧核苷酸链的杂交
B.抗原－抗体杂交的原理为碱基互补配对原则
C.核酸分子杂交可检测目的基因的存在和转录
D.抗原－抗体杂交中目的基因产物常作为抗体
【解析】核酸分子杂交是指两条核苷酸链的杂交，不一定是两条脱氧核苷酸链的杂交，一条脱氧核苷酸链和一条核糖核苷酸链也可以杂交，A错误；抗原－抗体杂交的原理为抗体与抗原特异性结合，B错误；核酸分子杂交技术可利用目的基因制作单链DNA探针，通过碱基互补配对原则，可以检测目的基因的存在，也能检测目的基因是否转录出mRNA，C正确；抗原－抗体杂交中目的基因产物常作为抗原，D错误。
C
7.(2026·金华一模)粪便无创DNA检测技术通过分析粪便中脱落肠道细胞的DNA来评估肠癌发病风险，具有无创、便捷、灵敏度高等优点。该检测需采集粪便样本，进行DNA提取、扩增等过程。下列叙述中，正确的是(　 　)
A.提取DNA时，研磨液经过滤、离心后取上清液，再加入冷酒精
B.随着PCR反应进行，DNA聚合酶、引物、脱氧核苷酸数量逐步减少
C.因粪便中的DNA均源于肠壁脱落细胞，因此该技术的灵敏度高
D.若检测发现原癌基因并未突变，则可判断该检测者未得肠癌
【解析】提取DNA时，需裂解细胞释放DNA，离心后细胞碎片等杂质沉淀，DNA存在于上清液中，加入冷酒精可使DNA析出，A正确；PCR反应中，脱氧核苷酸和引物会被消耗而减少，但耐高温的DNA聚合酶(如Taq DNA聚合酶)在反应中不会被分解，其活性可能随高温循环逐渐降低，但数量不会“逐步减少”，B错误；粪便中的DNA不仅来自肠壁脱落细胞，还可能包含肠道微生物或食物残留的DNA，C错误；癌症发生是多个基因突变(如原癌基因和抑癌基因)共同作用的结果，仅原癌基因未突变不能排除癌症可能，D错误。
A
8.某校学习小组进行PCR实验，甲、乙、丙三名同学分
别以酵母菌为材料，进行PCR扩增，各取20 μL产物进
行凝胶电泳，得到的结果如图所示。下列叙述中，错误
的是(　 　)
A.凝胶a端靠近电泳槽的负极接线柱
B.甲同学设置的PCR循环次数可能比乙同学多
C.丙同学所用的引物可能与甲、乙同学的不一样
D.丙同学扩增得到的片段比甲、乙同学的要大
【解析】点样孔在a端，DNA分子带负电荷，在电场的作用下会向正极移动，故凝胶a端靠近电泳槽的负极接线柱，A正确；甲同学的电泳条带比乙同学的宽，说明甲同学扩增的DNA产物多于乙同学，故甲同学设置的PCR循环次数可能比乙同学多，B正确；由题图可知，丙同学扩增出来的产物与甲、乙同学产物不同，其DNA不同，则碱基序列可能不同，故丙同学所用的引物可能与甲、乙同学的不一样，C正确；丙同学扩增产物的电泳条带比甲、乙条带位置距离点样孔更远，说明丙同学扩增的DNA分子小，移动速率快，D错误。
D
9.(2025·杭州二模)HIV通过细胞膜上的A蛋白侵染人体细胞。欧洲人群中存在A基因的一种突变形式(记为a)，其缺失了32个碱基对导致A蛋白异常，aa个体天然免疫HIV。为了快速辨别甲、乙、丙个体的基因型，用引物F和R分别对甲、乙、丙个体的基因组进行PCR，每组PCR产物都分为两份，一份直接电泳，一份用ApoⅠ切割后电泳，结果如图所示。下列叙述中，正确的是(　 　)
A.甲、丙个体的2号加样孔中的样品被ApoⅠ处理过
B.测序比对3和4号条带可获得a基因缺失的序列
C.乙个体两个加样孔条带一致可能是ApoⅠ失活导致
D.PCR产物直接电泳无法区分AA、Aa和aa个体
B
【解析】A基因和a基因碱基对数量不同，电泳形成两种条带，根据图示可知，A基因具有ApoⅠ酶切位点，A基因被酶切后经过电泳会形成两个条带，a基因不能被酶切，因此PCR产物直接电泳最多有两个条带，用ApoⅠ切割后电泳最多有三个条带，而甲的1号加样孔有三个条带，说明1号加样孔是用ApoⅠ切割后电泳结果，2号加样孔是直接电泳的结果，即甲、丙个体的2号加样孔中的样品没有被ApoⅠ处理过，A错误；相比A基因，a基因缺失了32个碱基对，因此4是a基因，3是A基因，测序比对3和4号条带可获得a基因缺失的序列，B正确；根据乙的1号加样孔可知，该个体的基因型为aa，由于a基因不能被ApoⅠ酶切，因此出现乙个体两个加样孔条带一致的情况，C错误；2号加样孔是直接电泳的结果，AA直接电泳的结果是只有条带3，aa直接电泳的结果是只有条带4，Aa直接电泳的结果是同时有条带3和4，因此PCR产物直接电泳可以区分AA、Aa和aa个体，D错误。　
10.(2025·杭州模拟)为筛选出能与SARS病毒(单链RNA)的S蛋白特异性结合的受体蛋白，研究人员欲在S蛋白末端添加TAP标签(能特异性地与哺乳动物体内IgG类抗体结合)形成S－TAP融合蛋白，再利用该标签在病毒敏感细胞中纯化出S蛋白及其相互作用的蛋白质，请据图回答下列问题：
注：XhoⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、BamH Ⅰ表示限制酶识别序列，各限制酶识别序列及切割后产生的DNA末端均不同；F、R表示引物；T7表示启动子；Kozak序列是调控基因表达的重要序列且不含限制酶识别序列。
(1)SARS病毒基因组序列有______个游离的磷酸基团，为构建pcDNA3.1－S－TAP重组质粒，需先利用__________酶获得S基因的cDNA，PCR扩增时Taq DNA聚合酶沿着模板链的______________(填“5'→3'”或“3'→5'”)方向移动，设置PCR扩增程序时，在30轮循环后通常在72 ℃条件下处理10 min的目的是_________________________________ _______________________________。
(2)引物F设计的依据有添加____________________、Kozak序列和___________________ ___________________________，引物R不能包含S基因终止密码子的编码序列，否则将导致______________________________________________。
1
逆转录
3'→5'
有利于子链充分延伸/使延伸反应更彻底，从而获得高能量扩增产物
SmaⅠ识别序列
S基因上游碱基序列/
与模板链互补配对的序列
翻译提前终止，无法表达出S－TAP融合蛋白
(3)使用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物时，DNA分子的迁移速率与__________有关(填选项)。
A.DNA分子量的大小、构象
B.电泳时的电场强度
C.琼脂糖凝胶的浓度
D.DNA分子的碱基序列
(4)构建重组质粒时应选用的限制酶有________________________，在重组质粒pcDNA3.1－S－TAP中还应该有的结构有____________________。
(5)将重组质粒pcDNA3.1－S－TAP导入受体细胞时采用____________法。为检测转染细胞中是否表达出了S－TAP融合蛋白，科研人员将转染细胞置于载玻片，洗涤、固定后，滴加带有荧光标记的________________稀释液，荧光显微镜下观察，若出现荧光标记，则说明转染细胞中表达出了S－TAP融合蛋白。
ABC
Sma Ⅰ和BamH Ⅰ
终止子、标记基因
显微注射
IgG类抗体
【解析】(1)SARS病毒为RNA病毒，遗传物质为单链RNA，SARS病毒基因组序列有1个游离的磷酸基团；mRNA在逆转录酶的催化下可以形成cDNA；PCR是体外DNA复制技术，DNA复制的方向是新链的5'→3'，故Taq DNA聚合酶沿着模板链的3'→5'方向移动；在30轮循环后通常在72 ℃条件下处理10 min的目的是使子链充分延伸。
(2)依题意，Kozak序列是调控基因表达的重要序列且不含限制酶识别序列，T7表示启动子，根据构建的重组质粒图示可分析，在S基因的上游加入了Kozak序列以调控S基因表达，故要在F引物的5'端外侧添加Kozak序列，目的基因和质粒要连接构成表达载体，根据T7启动子的方向及质粒上的酶切位点可知，S基因上游不能用XhoⅠ(S基因会被XhoⅠ酶切)，应该有用SmaⅠ酶切，故F引物的5'端外侧还要添加SmaⅠ酶识别序列；引物F应包含S基因上游碱基序列。引物R不能包含S基因终止密码子的编码序列，否则将导致翻译停止，而不能表达出S－TAP蛋白。
(3)PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，而与DNA分子的碱基序列无关，D错误，A、B、C均正确。
(4)构建重组质粒时应选用的限制酶有SmaⅠ和BamHⅠ，限制酶对质粒和目的基因进行切割，形成相同的黏性末端，DNA连接酶将切割后的质粒和目的基因连接形成重组质粒；依题意，T7表示启动子，启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。基因表达载体是载体的一种，包含目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点等。结合图示可知，基因表达载体中已有启动子、目的基因、复制原点，还应有的结构是终止子、标记基因。
(5)将重组质粒导入动物细胞常采用显微注射法；依题意，S蛋白末端添加TAP标签能特异性地与哺乳动物体内IgG类抗体结合，若要检测转染细胞中是否表达出了S－TAP融合蛋白，可滴加带有荧光标记的IgG类抗体稀释液，置荧光显微镜下观察，若出现荧光标记，则说明转染细胞中表达出了S－TAP融合蛋白。
11.(2025·浙江6月选考)玉米(2n=20)雌雄同株异花。从玉米某自交系(甲)中选育出2个雄性不育突变体(乙和丙)。已知雄性不育基因E1、E2由雄性可育基因E突变所致，如图1所示。甲×乙的F2中雄性可育285株、雄性不育94株，甲×丙的F2中雄性可育139株、雄性不育45株。利用引物P1和P2，对甲、乙、丙以及它们之间杂交的后代(丁和戊)基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物经SnaBⅠ完全酶切后电泳，结果如图2所示。
图1 图2
请回答下列问题：
(1)E1基因与E基因相比，由于______________，导致编码的蛋白质中1个氨基酸发生改变。E2基因与E基因相比，由于编码区增加了插入序列，导致__________________，使编码的蛋白质中氨基酸数目减少。
(2)雄性不育对雄性可育是________性状，乙的基因型是____________。甲×丙产生的F1其雌配子有______________种，F2可育植株中纯合子占__________。若甲×戊的F1随机交配，则F2中E1的基因频率是__________。
(3)写出丁×戊获得F1的遗传图解。
【答案】
碱基对替换
终止密码子提前
隐性
E2E2
2或两或二
1/3
1/4
(4)雄性不育突变体不能自交繁殖。为了保存雄性不育突变体，需长期保留含不育基因的杂合子。该杂合子可采用上述“PCR结合限制性内切核酸酶酶切后分析条带”进行鉴定，还可采用的方法有______________________________________(答出两点即可)。
(5)利用引物P1、P2对甲的基因组DNA进行PCR扩增和电泳，下列叙述错误的是_____。
A.PCR反应中Taq DNA聚合酶是沿着模板链的3'端向5'端聚合核苷酸
B.图2中胶板的上端是电泳时的负极，且电泳时DNA片段由负极向正极泳动
C.若用32P标记引物P1，每个DNA分子经4轮PCR循环后，可获得16条含32P标记的DNA单链
D.若用32P标记引物P1，每个DNA分子经4轮PCR循环后，可获得8个含32P标记且长度为b的DNA分子
测交，自交，核酸分子杂交，基因测序
C
【解析】(1)由图1可知，E1基因与E基因相比，由于碱基对替换，导致编码的蛋白质中1个氨基酸发生改变。由图1可知，E2基因与E基因相比，编码区增加了插入序列，结果编码的蛋白质中氨基酸数目减少，说明翻译提前终止，故反推出编码区增加了插入序列，导致mRNA上终止密码子提前。
(2)由题意可知，甲×乙的F2中雄性可育285株、雄性不育94株，即F2中雄性可育∶雄性不育=285∶94≈3∶1，可知雄性不育为隐性性状，雄性可育为显性性状。甲基因型为EE，故图2中b片段对应E基因，E2基因长度大于E1，故a片段为E2，E1内部存在限制酶SnaBⅠ的识别序列，可被切割为c和d，据此可知乙的基因型为E2E2，丙的基因型为E1E1。甲×丙产生的F1的基因型为EE1，故其可产生2种类型的雌配子，分别是E、E1，F1自交，F2中的基因型及比例为EE∶EE1∶E1E1=1∶2∶1，其中EE、EE1雄性可育，因此F2可育植株中纯合子占1/3。由图2可知戊的基因型为E1E2，甲×戊的F1的基因型及比例为EE1∶EE2=1∶1，F1均可育，随机交配，基因频率不变，因此F2中E1的基因频率与F1中的相同，为(1/2)×(1/2)=1/4。　
(3)由图2可知戊的基因型为E1E2，雄性不育，可作母本，产生两种类型的雌配子，分别是E1∶E2=1∶1；丁基因型为EE1，雄性可育，可作父本，产生两种类型雄配子，分别是E∶E1=1∶1，雌雄配子随机结合，F1的基因型为EE1∶EE2∶E1E1∶E1E2=1∶1∶1∶1，其中EE1和EE2为雄性可育，E1E1和E2E2为雄性不育，因此丁×戊获得F1的遗传图解见答图。
(4)鉴定基因的有无常用的方法有PCR技术、核酸分子杂交、基因测序等，同时也可采用自交和杂交的方法进行鉴定，如含不育基因的杂合子EE1或EE2，测交后代雄性可育∶雄性不育=1∶1；自交后代雄性可育∶雄性不育=3∶1。
(5)PCR反应中的引物能使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，故Taq DNA聚合酶是沿着模板链的3'端向5'端聚合核苷酸，A正确；DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，因此若图2中胶板的上端是电泳时的负极，电泳时DNA片段由负极向正极泳动，B正确；在PCR扩增中，1对引物中的每个引物P1和P2分别结合互补的链后进行延伸。每个DNA分子经4轮PCR循环后，可获得24=16个双链DNA分子，其中的15个双链DNA分子都有1条链结合引物P1。若用32P标记引物P1，可获得15条含32P标记的DNA单链，其中第1次扩增时，与P2引物结合的链最终形成的双链DNA分子没有被32P标记。同时获得长度为b，即目的基因片段长度的双链DNA分子为8个。C错误，D正确。

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