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第十单元
生物技术与工程
考查内容
1.阐明动物细胞培养是从动物体获得相关组织，分散成单个细胞后，在适宜的培养条件下让细胞生长和增殖的过程(生命观念)
2.阐明动物细胞核移植一般是将体细胞核移入一个去核的卵母细胞中，并使其发育成动物个体的过程(生命观念)
3.阐明动物细胞融合是指通过物理、化学或生物学等手段，使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程(生命观念、科学思维)
4.概述细胞融合技术是单克隆抗体制备的重要技术(生命观念、科学思维)
5.简述干细胞在生物医学工程中有广泛的应用价值(科学思维、社会责任)
考点一　动物细胞培养
1.动物细胞培养的条件和原理
2.动物细胞培养的过程(以贴壁细胞为例)
3.原代培养和传代培养
4.细胞系和细胞株
类型 表述方法
原代培养 细胞悬浮液第一次在瓶中培养，没有分瓶培养之前的细胞培养
传代培养 细胞悬浮液培养一段时间后，分瓶再进行的细胞培养
种类 来源 特点
细胞系 有限
细胞系 不能连续培养下去的细胞系 有接触抑制；不能连续培养
连续
细胞系 由传代细胞连续培养形成的细胞系 发生了转化；有些具有异体致瘤性；有些具有不死性，但保留接触抑制，不致癌
细胞株 有限
细胞株 通过一定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞 可传代次数有限 一般具有恒定的染色体组型、病毒敏感性或抗性及其他生化特性
连续
细胞株 可连续多次传代
5.细胞克隆
(1)概念：把一个单细胞从群体中分离出来单独培养，使之繁衍成一个新的细胞群体的技术，其基本要求是必须肯定所建成的克隆来源于单个细胞。
(2)培养结果：细胞克隆的基因型一致，遗传性状均一，称为纯系。
(3)应用：①分离出缺乏特殊基因的突变细胞系；②研究遗传规律和生理特性的重要材料。
6.动物细胞培养的价值
(1)研究价值：可用于生理、病理、药理等方面的研究。例如，____________的检测等。
(2)应用价值：用于烧伤患者的____________和损伤组织器官的修复；获得动物疫苗、干扰素、______________等生物制品。
有毒物质
皮肤移植
单克隆抗体
√

[自我诊断]正确的打“√”，错误的打“ ”。
1.恶性细胞系具有异体致瘤性，有的不死性细胞系保留接触抑制现象。(　 　)
2.克隆培养前必须保证分离出来的细胞是一种类型的多个细胞，而不是多种类型的细胞。
(　 　)
3.动物细胞培养时，通入CO2的目的是刺激细胞呼吸。(　 　)
4.培养保留接触抑制的细胞在培养瓶壁上可形成多层细胞。(　 　)
5.(真题节选)二倍体细胞的传代培养次数通常是无限的。(　 　)
6.(真题节选)培养心肌细胞的时候既需要氧气也需要二氧化碳，器具和试剂都要先进行高压蒸汽灭菌。(　 　)
7.(真题节选)某兴趣小组开展小鼠原代神经元培养的研究，结果发现其培养的原代神经元生长缓慢，其可能的原因是所使用的培养基呈弱酸性。(　 　)




√
例 1
(2024·浙江1月选考)某动物细胞培养过程中，细胞贴壁生长至接触抑制时，需分装培养，实验操作过程如图所示。下列叙述中，错误的是(　 　)
A.①加消化液的目的是使细胞与瓶壁分离
B.②加培养液的目的是促进细胞增殖
C.③分装时需调整到合适的细胞密度
D.整个过程需要在无菌、无毒条件下进行
【解析】②吸除消化液、加培养液的目的是终止消化，对细胞加以稀释，使细胞密度合适，便于分瓶培养，B错误。
B
例 2
(2025·广东卷)将人眼睑成纤维细胞传代培养后，再培养形成支架，在该支架上接种人口腔黏膜上皮细胞，培养一段时间后分离获得上皮细胞片层，可用于人工角膜的研究。上述过程不涉及(　 　)
A.制备细胞悬液
B.置于5%的CO2等适宜条件下培养
C.离心收集细胞
D.用胰蛋白酶消化支架后分离片层
【解析】动物细胞培养时，为增大细胞与培养液的接触面积，需要制备细胞悬液，A正确；置于5%的CO2等适宜条件下培养，其中5%的CO2可维持培养液的pH，B正确；在成纤维细胞传代培养过程中需要通过离心收集细胞，C正确；不用胰蛋白酶消化支架，避免将上皮细胞片层分离成单独细胞，D错误。
D
例 3
(2026·绍兴一模)科学家利用患者自身的软骨细胞，在体外经传代扩增后，接种到由胶原蛋白制成的三维支架上培养，形成新的软骨组织，用于关节损伤的修复。下列叙述中，错误的是(　 　)
A.接种前可通过酶解法制备单细胞悬液
B.在胶原支架上培养利用了细胞贴壁生长的特性
C.细胞培养过程的O2浓度需高于大气中的O2浓度
D.软骨细胞体外传代次数会影响软骨组织的形成
【解析】酶解法(如胰蛋白酶处理)可将组织块分散为单个细胞，便于体外培养，A正确；动物细胞具有贴壁生长特性，三维支架模拟细胞贴附的基质环境，B正确；动物细胞培养通常在含95%空气(O2浓度与大气相近)和5% CO2的环境中进行，无须更高氧浓度，C错误；细胞传代次数增多会导致增殖能力下降甚至衰老，影响组织形成，D正确。
C
考点二　动物体细胞核移植技术和克隆动物
1.通过细胞核移植克隆动物
(1)动物难以克隆的根本原因：体细胞中基因______________。
(2)动物细胞核移植
定义 将体细胞核移入一个去核的____________中，并使其发育成动物个体的过程
原理 ________________________________
细胞核移植成功率比较 ________细胞核移植成功率远高于成体细胞；低等动物细胞核移植成功率________高等动物
核移植需借助的设备和技术 精密的显微镜操作仪和高效率的细胞融合法
选择性表达
卵母细胞
动物细胞核具有发育的全能性
胚胎
高于
绵羊“多莉”克隆过程
羊成熟体细胞成功克隆的意义 ①___________的细胞经过一定技术处理， 也可回复到类似________时期的功能，表现出全能性
②在胚胎和个体发育中，细胞质具有__________________的作用
白色芬兰母羊
高度分化
受精卵
调控细胞核发育
(3)克隆技术的应用
应用 举例
探讨胚胎细胞分化问题 童第周等开展的______________等研究
优良种畜的培育和繁殖 我国研究人员在2002年1月，以________________细胞成功克隆出高产奶牛和优质肉用黄牛
药物生产 罗斯林研究所曾培育出一只乳汁中含治疗__________药物原料的转基因羊
异种动物间核移植 1999年，中国科学院动物研究所的陈大元教授等将成年大熊猫的____________移入去核的兔卵中，得到了异种重组细胞发育成的早期胚胎
鱼类核移植
牛耳壳成纤维
血友病
体细胞核
2.动物细胞核移植的应用价值和存在问题
(1)应用价值
①研究胚胎细胞的________问题。
②在药物生产、优良种畜的培育和繁殖、拯救____________、治疗性克隆及________动物间核移植的可能性等方面。
(2)存在问题：__________低、某些克隆动物________等问题。
[自我诊断]正确的打“√”，错误的打“ ”。
1.克隆动物的性状与供体动物完全相同。(　 　)
2.(真题节选)动物细胞核移植的受体细胞必须是卵细胞。(　 　)
3.单独培养蝌蚪肠细胞不能发育成蝌蚪是受某些物质的限制。(　 　)
4.蝌蚪肠细胞的细胞核具有全能性是由于其含有该物种的全套基因。(　 　)
分化
濒危动物
异种
成功率
早衰


√
√
例 4
(2025·山东卷)利用动物体细胞核移植技术培育转基因牛的过程如图所示，下列说法中，错误的是(　 　)
A.对牛乙注射促性腺激素是为了收集更多的卵母细胞
B.卵母细胞去核应在其减数分裂Ⅰ中期进行
C.培养牛甲的体细胞时应定期更换培养液
D.可用PCR技术鉴定犊牛丁是否为转基因牛
【解析】对牛乙注射促性腺激素进行超数排卵，目的是收集更多数量的卵母细胞，以便后续进行核移植操作，A正确；卵母细胞去核应在其减数分裂Ⅱ中期进行，B错误；在培养动物体细胞时，需要定期更换培养液，防止细胞代谢产物的积累对细胞自身造成危害，C正确；PCR技术可以扩增特定的DNA片段，通过检测犊牛丁细胞中是否含有转基因的DNA片段，就可以鉴定犊牛丁是否为转基因牛，D正确。
B
例 5
(2025·浙江会稽联盟联考)中国科学家在世界上首次利用体细胞核移植技术成功实现了对非人灵长类动物进行克隆，获得两只克隆猴——“中中”和“华华”，培育过程如图所示，下列叙述中，错误的是(　 　)
A.①过程需借助精密的显微操作仪进行细胞核移植
B.②过程属于个体发育过程，其细胞的全能性越来越高
C.③过程必不可少的一个操作是胚胎移植
D.与鼠相比，克隆猴更适合作为人类疾病治疗和药物实验的模型动物
【解析】①过程是核移植，通过显微操作取核，再将纤维细胞核注入去核的卵母细胞，A正确；图中②是早期胚胎培养，属于个体发育过程，该过程中细胞的全能性越来越低，B错误；③过程必不可少的一个操作是胚胎移植，胚胎移植是胚胎工程的最后一个环节，其实质是早期胚胎在空间位置上的转移，C正确；猴与人在进化上亲缘关系比鼠与人更近，因此与鼠相比，克隆猴更适合作为人类疾病和进行药物实验的模型动物，D正确。
B
考点三　动物细胞融合和单克隆抗体技术
1.细胞融合
2.单克隆抗体的制备过程
(1)多克隆抗体与单克隆抗体
(2)制备过程
(3)优点：纯度高，可____________，在应用时具有____________、____________的特点。
(4)关键点分析
①细胞融合完成的标志：细胞核融合成一个核。
②最终筛选得到的杂交瘤细胞的特性：既能无限增殖，又能产生大量单一的特异性抗体。
③获取单克隆抗体的场所：若在培养基中进行杂交瘤细胞培养，则从培养液中提取；若在小鼠或其他动物腹腔中培养，则从腹水中提取。
(5)用杂交瘤技术制备单克隆抗体中的几种细胞比较
细胞 特点
B淋巴细胞 能产生单一抗体，但不能无限增殖
骨髓瘤细胞 能无限增殖，不能产生抗体
杂交瘤细胞 既能产生特定的抗体，又能在培养条件下进行无限增殖
大量制备
特异性强
灵敏度高
(6)制备单克隆抗体过程中的两次筛选
项目 第一次筛选 第二次筛选
筛选
原因 诱导融合后得到多种杂交细胞，另外还有未融合的细胞 由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，因此经选择性培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞
筛选
方法 用特定的选择培养基筛选：未融合的细胞和同种细胞融合后形成的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长 用多孔培养皿培养，在每个孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到能产生某种特异性抗体的细胞群
筛选
目的 得到杂交瘤细胞 得到能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
3.单克隆抗体的应用
(1)作为特异性的________，研究相应抗原蛋白的结构、细胞学分布及功能。
(2)可以快捷、准确地诊断和治疗一些疾病。如利用脊髓灰质炎病毒的单克隆抗体做____________，在10分钟内就可以确诊患病儿童是否感染脊髓灰质炎病毒。
(3)将____________连接到专门识别某种肿瘤细胞的单克隆抗体上，单克隆抗体就会像“生物导弹”一样携带抗癌药物________地聚集到肿瘤细胞，________地杀死肿瘤细胞。
1.要给小鼠注射特定抗原，目的是能从该小鼠的脾脏中得到可以生产特定抗体的B淋巴细胞。
2.B淋巴细胞与骨髓瘤细胞经诱导融合后，培养基中共有5种细胞；其中融合的细胞有3种(只考虑两两融合)。
3.单克隆抗体的制备，不仅需要应用到动物细胞融合技术，还需要用到动物细胞培养技术。
4.专一抗体检测时和单克隆抗体发挥作用时，都会涉及抗原－抗体特异性结合原理。
5.利用HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞。
探针
诊断试剂
抗癌药物
准确
专一
[自我诊断]正确的打“√”，错误的打“ ”。
1.植物原生质体融合与动物细胞融合原理是相同的。(　 　)
2.在单克隆抗体的制备中，取小鼠的B淋巴细胞之前，一定要给小鼠注射相应的抗原(或相应的疫苗)。(　 　)
3.将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行诱导融合，培养液中融合后的细胞即为杂交瘤细胞。
(　 　)
4.杂交瘤细胞进行体内培养，是为了获得能产生单克隆抗体的胚胎。(　 　)
5.制备单克隆抗体时，取免疫阳性小鼠的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞混合培养，使其融合，最后筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。(　 　)
√
√


√
例 6
(2025·甘肃卷)肿瘤坏死因子α(TNF－α)是一种细胞因子，高浓度时可以引发疾病。研究者利用细胞工程技术制备了TNF－α的单克隆抗体，用于治疗由TNF－α引发的疾病，制备流程如图所示。下列叙述中，正确的是(　 　)
A.①是从小鼠的血液中获得的骨髓瘤细胞
B.②含未融合细胞、同种核及异种核融合细胞
C.③需用特定培养基筛选得到大量的杂交瘤细胞
D.④需在体外或小鼠腹腔进行克隆化培养和抗体检测
B
【解析】骨髓瘤细胞应该从骨髓中获取，A错误；B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合是随机的，可能有些细胞不发生融合，有些两两融合，有些多个融合，有同种核融合细胞，也有异种核融合细胞，B正确；诱导B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞，但不能得到大量的杂交瘤细胞，C错误；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养，抗体检测不是在小鼠腹腔内进行，D错误。
例 7
如图为PML蛋白单克隆抗体制备的部分过程示意图。下列说法中，错误的是(　 　)
注：“＋”表示该孔中存在对应蛋白的抗体，“－”表示没有对应抗体。
A.W细胞是从经PML蛋白免疫的机体中获得的B淋巴细胞
B.可用灭活的病毒诱导W细胞与骨髓瘤细胞融合
C.步骤2是经过克隆化培养和抗体阳性检测筛选杂交瘤细胞
D.应选择孔2中的细胞进行后续处理以制备单克隆抗体
C
【解析】W细胞是先用PML蛋白免疫而获得相应的B淋巴细胞，后通过筛选提取能产生单一抗体的B淋巴细胞，A正确；动物细胞融合常用的诱导融合方法有电融合法、聚乙二醇融合法和灭活病毒诱导法，可用灭活的病毒诱导W细胞与骨髓瘤细胞融合，B正确；根据题意可知步骤1是诱导W细胞与骨髓瘤细胞融合，步骤2是利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞，C错误；根据电泳结果可知应选择孔2中的细胞进行后续处理以制备单克隆抗体，因为孔2中的细胞能特异性产生高密度PML蛋白，D正确。
课时作业
答案速对
第十单元　作业49 　动物细胞培养、克隆动物和单克隆抗体制备
题号 1 2 3 4 5 6 7
答案 C D B A D B B
题号 8 9
答案 B 见答案
1.动物细胞培养是动物细胞工程的基础，动物细胞培养的基本过程如图甲所示。细胞系(原代培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体)的形成过程如图乙所示。
甲 乙
下列叙述中，正确的是(　 　)
A.a中培养的一般是幼龄动物的器官或组织，原因是其细胞分化程度低
B.在细胞系的形成过程中，传代期细胞传代培养一次，细胞增加一倍
C.原代培养前需将组织用胰蛋白酶等处理，制成细胞悬液
D.为保证无菌、无毒的环境，c、d培养过程必须采用封闭式培养
【解析】a中培养的一般是幼龄动物的器官或组织，原因是其细胞分裂能力强，A错误；分析图乙可知，传代期细胞传代培养一次，细胞数并没有成倍数增加，B错误；原代培养前需要用胰蛋白酶或胶原蛋白酶等处理，将组织分散成单个细胞，制成细胞悬液，C正确；为保证无菌、无毒的环境，需要对培养液和培养用具进行灭菌处理及在无菌条件下操作、定期更换培养液等，c、d培养过程需要在培养箱中进行，提供一定的气体环境，可采用开放式培养的方式，D错误。
C
2.治疗大面积烧伤，常常从患者身上获取少量皮肤样本，并将皮肤细胞在体外培养，逐渐形成的“皮肤”组织用于移植，覆盖在伤口上，实现愈合。下列叙述中，错误的是
(　 　)
A.从患者身上获取皮肤样本的优点是移植后不会产生排斥反应
B.往CO2恒温培养箱中通入5%的CO2是为了调节pH相对稳定
C.为了防止污染，实现无菌培养，可以在培养基中加入抗生素
D.培养过程往往在固体培养基上进行，以便于分离出“皮肤”组织
【解析】因培养的皮肤样本源于患者自身，移植后不会发生排斥反应，A正确；动物细胞培养常用液体培养基，为了调节pH相对稳定，常往CO2恒温培养箱中通入5%的CO2，B正确，D错误；抗生素能抑制细菌生长，可以防止培养液被污染，C正确。
D
3.如图所示为利用体细胞核移植技术克隆优质奶牛的简易流程图，下列叙述中，正确的是(　 　)
A.后代丁的遗传性状由甲和丙的遗传物质共同决定
B.过程①需要提供95%的空气和5%的CO2的混合气体
C.过程②常使用显微操作去核法对受精卵进行处理
D.过程③将激活后的重组细胞培养至原肠胚后移植
【解析】后代丁的细胞核的遗传物质来自甲，细胞质的遗传物质来自乙，则丁的遗传性状由甲和乙的遗传物质共同决定，A错误；动物细胞培养中需要提供95%的空气(保证细胞的需氧呼吸)和5%的CO2(维持培养液的pH)的混合气体，B正确；过程②常使用显微操作去核法对卵母细胞进行处理，C错误；过程③将激活后的重组细胞培养至囊胚或桑葚胚阶段后进行移植，D错误。
B
4.某兴趣小组开展小鼠原代神经元培养的研究，结果发现其培养的原代神经元生长缓慢，其原因不可能是(　 　)
A.实验材料取自小鼠胚胎的脑组织
B.为了防止污染将培养瓶瓶口密封
C.血清经过高温处理后加入培养基
D.所使用的培养基呈弱酸性
【解析】小鼠胚胎脑组织中含有丰富的原代神经元，细胞增殖能力强，不会导致细胞生长缓慢，A符合题意；培养瓶瓶口密封会使培养液中缺氧，影响细胞的需氧呼吸，造成供能不足，可能导致细胞生长缓慢，B不符合题意；血清经过高温处理后，其中活性成分变性，失去原有功能，可能导致细胞生长缓慢，C不符合题意；小鼠的内环境为弱碱性，若所使用的培养基呈弱酸性，会导致细胞的生存环境恶劣，可能导致细胞生长缓慢，D不符合题意。
A
5.2017 年，中国科学家成功克隆出两只猕猴“中中”和“华华”，这一成果在全球引起了广泛关注。下列关于克隆猴相关知识的叙述，正确的是(　 　)
A.克隆猴的成功，体现了细胞核对细胞质的调控作用
B.克隆猴培育时，从母猴卵巢中取出的卵母细胞可直接作为受体细胞
C.克隆猴的培育过程中使用了核移植技术，该技术的原理是动物细胞具有全能性
D.克隆猴的成功培育，为人类疾病研究、药物研发等提供了更为理想的动物模型
【解析】克隆猴的成功体现的是动物体细胞核具有全能性，而非细胞核对细胞质的调控作用，A错误；从母猴卵巢中取出的卵母细胞需要培养到中期Ⅱ去核才能作为受体细胞，不能直接使用，B错误；克隆猴的培育过程中使用核移植技术，该技术的原理是动物体细胞核具有全能性，强调的是体细胞核，不是动物细胞具有全能性(动物细胞的全能性受到限制，而动物体细胞核具有全能性)，C错误；克隆猴的成功培育，为人类疾病研究、药物研发等提供了更为理想的动物模型，因为克隆猴遗传背景相同等特点有利于相关研究，D正确。
D
6.(2026·浙江湖丽衢一模)肺器官芯片是用于模拟人体肺部生理结构和功能的体外模型，其腔室的纵向截面如图所示，使用时，上、下通道可分别监测气体、液体的成分和含量变化，用于分析生理活动。下列叙述中，正确的是(　 　)
A.模型构建时，培养基中的血清需高压蒸汽灭菌
B.模型构建时，薄膜用于肺泡上皮细胞贴壁生长
C.模型运行时， 上通道模拟了人体内环境
D.模型运行时，下通道培养基可检测到氧气量下降
【解析】血清中含有蛋白质，高温会破坏蛋白质的空间结构，因此，模型构建时，培养基中的血清不能用高压蒸汽灭菌，A错误；肺泡上皮细胞具有贴壁生长的特点，因此，模型构建时，薄膜用于肺泡上皮细胞贴壁生长，B正确；上通道模拟了腔室，与外界环境相通，不属于人体内环境，C错误；模型运行时，下通道培养基接收肺毛细血管运输的氧气，可检测到氧气量上升，D错误。
B
7.(2025·五校联盟金华一中卷)细胞直接共培养是指将两种或两种以上的细胞接种在同一孔中进行培养，以达到模拟体内不同种类的细胞直接接触来探究它们信息交流方式的目的，具体操作如图所示。下列分析中，错误的是(　 　)
A.成块的组织中细胞与细胞靠在一起，在培养前需先将组织块分散成单个细胞
B.细胞培养过程需要对培养液进行灭菌，对所有培养用具进行消毒，以保证无菌无毒的
培养环境
C.推测第二种细胞会贴壁到无细胞区，当两种细胞分裂生长到表面相互接触时停止分裂
D.通过检测混合培养液中是否存在信息类物质可初步推测两种细胞间的信息交流方式
B
【解析】成块的组织中细胞与细胞靠在一起，在培养前需用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，将组织块分散成为单个细胞后才能进行培养，A正确；细胞培养过程需要对培养用具进行高压蒸汽灭菌，培养液一般采用过滤除菌的方法，向其中添加抗生素防止细菌污染，定期更换培养液以防止细胞代谢产物造成毒害，B错误；体外培养的动物细胞往往具有贴壁生长和接触抑制等特点，由此推测第二种细胞会贴壁到无细胞区，当两种细胞分裂生长到表面相互接触时停止分裂，C正确；细胞膜表面上可能存在接收邻近细胞信号的受体，以完成细胞间的信息交流，通过检测混合培养液中是否存在信息类物质可初步推测两种细胞间的信息交流方式，D正确。
8.(2025·绍兴模拟)羊乳因其营养成分最接近人乳，且不含牛乳中的某些可致过敏的异性蛋白质而受到消费者的青睐，但市场上存在着用牛乳冒充羊乳欺骗消费者的现象。对此，研究人员开发制备了羊乳asl－酪蛋白单克隆抗体检测试剂盒。如图所示为制备asl－酪蛋白单克隆抗体的示意图，1~5代表相关过程。
下列叙述中，正确的是(　 　)
A.为制备单克隆抗体，应确保图中两处小鼠注射同种抗原
B.过程2可以用灭活的病毒处理
C.过程3表示用HAT培养基筛选得到单一的杂交瘤细胞
D.过程5可以从小鼠血浆中分离得到特异性强的单克隆抗体
【解析】左侧注射抗原是为了使小鼠产生更多的B淋巴细胞，右侧注射的是杂交瘤细胞，使其在小鼠腹腔的腹水中生长，A错误；过程2为B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合，可以用灭活的病毒处理，B正确；过程3表示用HAT培养基筛选杂交瘤细胞，需要进一步通过克隆培养和抗体检测，才能得到分泌特定抗体的单一杂交瘤细胞，C错误；过程5可以从小鼠腹水中分离得到特异性强的单克隆抗体，D错误。
B
9.某抗膜蛋白治疗性抗体药物研发过程中，需要表达N蛋白胞外段，制备相应的单克隆抗体，增加其对N蛋白胞外段特异性结合的能力。N蛋白胞外段单克隆抗体制备，流程如图所示。
(1)与骨髓瘤细胞融合前，已免疫的脾细胞(含效应B细胞)__________(填“需要”或“不需要”)通过原代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合，该过程中PEG对细胞膜的作用是使细胞接触处的________分子重新分布，使细胞膜打开，细胞发生融合。
(2)在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基(如HAT培养基)，该培养基对__________(填“融合”或“未融合”)的亲本细胞和融合的具有__________(填“同种核”或“不同种核”)的细胞生长具有抑制作用。
(3)用N蛋白胞外段作为抗原对小鼠进行免疫后，取小鼠脾组织用胶原蛋白酶或__________酶等消化处理，制成细胞悬液，置于含有混合气体的________________中培养，经离心收集小鼠的B淋巴细胞，与骨髓瘤细胞进行融合。
(4)用选择培养基对融合后的细胞进行筛选，获得杂交瘤细胞，将其接种到96孔板，进行杂交瘤选择培养。用__________________技术检测每孔中的抗体，筛选既能产生N蛋白胞外段抗体，又能大量增殖的单克隆杂交瘤细胞株，经体外扩大培养，收集______________，提取单克隆抗体。
不需要
磷脂
未融合
同种核
胰蛋白
CO2培养箱
抗原－抗体杂交
细胞培养液
【解析】(1)已免疫的脾细胞(含效应B细胞)本身数量相对较多，且在后续与骨髓瘤细胞融合等操作中会有进一步的处理和筛选，所以不需要通过原代培养扩大细胞数量。脂溶性物质PEG促进细胞融合的作用机制是使细胞接触处的磷脂分子重新分布，从而使细胞膜打开，细胞发生融合。
(2)在杂交瘤细胞筛选过程中，特定的选择培养基(如HAT培养基)对未融合的亲本细胞(即未与骨髓瘤细胞融合的B淋巴细胞和未与B淋巴细胞融合的骨髓瘤细胞)生长具有抑制作用。同时，对融合的具有同种核的细胞(如B淋巴细胞－B淋巴细胞融合细胞、骨髓瘤细胞－骨髓瘤细胞融合细胞)生长也具有抑制作用，只允许B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成的具有不同种核的杂交瘤细胞生长。
(3)用N蛋白胞外段作为抗原对小鼠进行免疫后，取小鼠脾组织，常用胰蛋白酶或胶原蛋白酶等消化处理，将组织分散成单个细胞，制成细胞悬液。然后将细胞悬液置于含有混合气体(通常是95%空气和5%CO2)的CO2培养箱中培养，经离心收集小鼠的B淋巴细胞，与骨髓瘤细胞进行融合。
(4)用选择性培养基对融合后的细胞进行筛选，获得杂交瘤细胞，将其接种到96孔板，进行杂交瘤选择培养。用抗原－抗体杂交技术检测每孔中的抗体，因为抗原－抗体杂交具有特异性，能检测出是否产生针对N蛋白胞外段的抗体。筛选出既能产生N蛋白胞外段抗体，又能大量增殖的单克隆杂交瘤细胞株，经体外扩大培养，收集细胞培养液，因为单克隆抗体是由杂交瘤细胞分泌到培养液中的，所以从细胞培养液中提取单克隆抗体。

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